JPH11103858A - エレクトロポレーションによるｄｎａ導入方法 - Google Patents
エレクトロポレーションによるｄｎａ導入方法Info
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- JPH11103858A JPH11103858A JP9286066A JP28606697A JPH11103858A JP H11103858 A JPH11103858 A JP H11103858A JP 9286066 A JP9286066 A JP 9286066A JP 28606697 A JP28606697 A JP 28606697A JP H11103858 A JPH11103858 A JP H11103858A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 プロトプラスト化せずに、植物細胞にＤＮＡ
を導入できるエレクトロポレーションによるＤＮＡ導入
方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 細胞壁を残したままの植物組織６、器官
又は植物体を、ＤＮＡ又はＤＮＡのベクターを含ませた
緩衝液５に浸漬し、緩衝液にＤＣパルスを印加しＤＮＡ
又はＤＮＡのベクターを植物組織、器官又は植物体を構
成する植物細胞内に導入する。
を導入できるエレクトロポレーションによるＤＮＡ導入
方法を提供することを目的とする。 【解決手段】 細胞壁を残したままの植物組織６、器官
又は植物体を、ＤＮＡ又はＤＮＡのベクターを含ませた
緩衝液５に浸漬し、緩衝液にＤＣパルスを印加しＤＮＡ
又はＤＮＡのベクターを植物組織、器官又は植物体を構
成する植物細胞内に導入する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エレクトロポレー
ションによる植物組織へのＤＮＡ導入方法に関するもの
である。
ションによる植物組織へのＤＮＡ導入方法に関するもの
である。
【０００２】
【従来の技術】植物細胞に、ＤＮＡを導入する方法に
は、間接法と直接法とがあり、さらに、この直接法のう
ち、電気パルスを利用するものとして、エレクトロポレ
ーション法が知られている。
は、間接法と直接法とがあり、さらに、この直接法のう
ち、電気パルスを利用するものとして、エレクトロポレ
ーション法が知られている。
【０００３】さて、植物細胞は、動物細胞と異なり、細
胞膜の外側にセルロースからなる細胞壁を有する。した
がって、細胞壁に包まれた植物細胞内に、ＤＮＡを導入
しようとするなら、ＤＮＡを、細胞膜だけでなく、細胞
壁をも通過させなければならない。そして、従来、電気
パルスのみによって、ＤＮＡを、細胞膜と細胞壁とを一
度に通過させることはできないものと信じられていた。
胞膜の外側にセルロースからなる細胞壁を有する。した
がって、細胞壁に包まれた植物細胞内に、ＤＮＡを導入
しようとするなら、ＤＮＡを、細胞膜だけでなく、細胞
壁をも通過させなければならない。そして、従来、電気
パルスのみによって、ＤＮＡを、細胞膜と細胞壁とを一
度に通過させることはできないものと信じられていた。
【０００４】このため、従来のエレクトロポレーション
法では、まず、ＤＮＡを導入したい植物細胞をプロトプ
ラストにした上で、電気パルスを印加していた。即ち、
従来のエレクトロポレーション法では、プロトプラスト
再分化系が必須のものとなっていた。これにより、形質
転換を植物で作製することが可能になる。
法では、まず、ＤＮＡを導入したい植物細胞をプロトプ
ラストにした上で、電気パルスを印加していた。即ち、
従来のエレクトロポレーション法では、プロトプラスト
再分化系が必須のものとなっていた。これにより、形質
転換を植物で作製することが可能になる。
【０００５】ここで、プロトプラストとは、細胞をばら
ばらにし、植物細胞から細胞壁を取り除き（ペクチナー
ゼ、セルラーゼを用いる）、外部に細胞膜を露呈させた
ものである。そして、このプロトプラストは、植物細胞
が生命活動を維持できる最小の単位である。
ばらにし、植物細胞から細胞壁を取り除き（ペクチナー
ゼ、セルラーゼを用いる）、外部に細胞膜を露呈させた
ものである。そして、このプロトプラストは、植物細胞
が生命活動を維持できる最小の単位である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、このよ
うな技術では、プロトプラストにするための装置や手間
がかかるだけでなく、植物生体の本来の姿から、遠くか
け離れた形態（プロトプラスト）でないと、ＤＮＡを導
入できないことになる。
うな技術では、プロトプラストにするための装置や手間
がかかるだけでなく、植物生体の本来の姿から、遠くか
け離れた形態（プロトプラスト）でないと、ＤＮＡを導
入できないことになる。
【０００７】そこで本発明者は、植物生体の本来の姿に
近い状態で、ＤＮＡ導入を行うことができないものか
と、鋭意研究の結果、本発明を完成するに至ったもので
ある。即ち、本発明は、プロトプラスト化せずに、植物
細胞にＤＮＡを導入できるエレクトロポレーションによ
るＤＮＡ導入方法を提供することを目的とする。
近い状態で、ＤＮＡ導入を行うことができないものか
と、鋭意研究の結果、本発明を完成するに至ったもので
ある。即ち、本発明は、プロトプラスト化せずに、植物
細胞にＤＮＡを導入できるエレクトロポレーションによ
るＤＮＡ導入方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明のエレクトロポレ
ーションによるＤＮＡ導入方法では、細胞壁を残したま
まの植物組織、器官又は植物体を、ＤＮＡ又はＤＮＡの
ベクターを含ませた緩衝液に浸漬し、緩衝液にＤＣパル
スを印加しＤＮＡ又はＤＮＡのベクターを植物組織、器
官又は植物体を構成する植物細胞内に導入する。この構
成により、プロトプラスト化せずに、植物細胞にＤＮＡ
を導入できる。
ーションによるＤＮＡ導入方法では、細胞壁を残したま
まの植物組織、器官又は植物体を、ＤＮＡ又はＤＮＡの
ベクターを含ませた緩衝液に浸漬し、緩衝液にＤＣパル
スを印加しＤＮＡ又はＤＮＡのベクターを植物組織、器
官又は植物体を構成する植物細胞内に導入する。この構
成により、プロトプラスト化せずに、植物細胞にＤＮＡ
を導入できる。
【０００９】
【発明の実施の形態】請求項１記載のエレクトロポレー
ションによるＤＮＡ導入方法では、細胞壁を残したまま
の植物組織、器官又は植物体を、ＤＮＡ又はＤＮＡのベ
クターを含ませた緩衝液に浸漬し、緩衝液にＤＣパルス
を印加しＤＮＡ又はＤＮＡのベクターを植物組織、器官
又は植物体を構成する植物細胞内に導入する。この構成
により、細胞壁を残し、より植物生体に近い状態で、植
物細胞にＤＮＡを導入できる。
ションによるＤＮＡ導入方法では、細胞壁を残したまま
の植物組織、器官又は植物体を、ＤＮＡ又はＤＮＡのベ
クターを含ませた緩衝液に浸漬し、緩衝液にＤＣパルス
を印加しＤＮＡ又はＤＮＡのベクターを植物組織、器官
又は植物体を構成する植物細胞内に導入する。この構成
により、細胞壁を残し、より植物生体に近い状態で、植
物細胞にＤＮＡを導入できる。
【００１０】請求項２記載のエレクトロポレーションに
よるＤＮＡ導入方法では、ＤＣパルスは、パルス幅と電
圧が設定された矩形波である。この構成により、ＤＣパ
ルスのパルス幅と電圧を調整することにより、緩衝液の
成分や植物組織の性質に合わせたパルスを印加できる。
よるＤＮＡ導入方法では、ＤＣパルスは、パルス幅と電
圧が設定された矩形波である。この構成により、ＤＣパ
ルスのパルス幅と電圧を調整することにより、緩衝液の
成分や植物組織の性質に合わせたパルスを印加できる。
【００１１】請求項３記載のエレクトロポレーションに
よるＤＮＡ導入方法では、ＤＣパルスを印加する前後に
おいて、緩衝液のインピーダンスを計測する。この構成
により、インピーダンスの変化を調べて、ＤＣパルスの
最適化を図ることができる。
よるＤＮＡ導入方法では、ＤＣパルスを印加する前後に
おいて、緩衝液のインピーダンスを計測する。この構成
により、インピーダンスの変化を調べて、ＤＣパルスの
最適化を図ることができる。
【００１２】次に図面を参照しながら、本発明の実施の
形態について説明する。図１は、本発明の一実施の形態
におけるＤＮＡ導入装置の概念図である。図１におい
て、１は、透明プラスチックからなるキュベットであ
り、角柱状をなす。２は、キュベット１の上端開口部を
封鎖するふたであり、キュベット１の対向面には、一対
の電極３、４（本形態では、アルミニウム板）が設けて
ある。５は、キュベット１に入れられる緩衝液であり、
通常、２０〜８００μｌ程度の体積で、例えば、マニト
ールやＮａＣｌ液を主材とする。そして、この緩衝液５
には、ＤＮＡ又はＤＮＡのベクターが所定量浸漬され
る。ここで、本形態では、ｐＢＩ２２１を添加してい
る。
形態について説明する。図１は、本発明の一実施の形態
におけるＤＮＡ導入装置の概念図である。図１におい
て、１は、透明プラスチックからなるキュベットであ
り、角柱状をなす。２は、キュベット１の上端開口部を
封鎖するふたであり、キュベット１の対向面には、一対
の電極３、４（本形態では、アルミニウム板）が設けて
ある。５は、キュベット１に入れられる緩衝液であり、
通常、２０〜８００μｌ程度の体積で、例えば、マニト
ールやＮａＣｌ液を主材とする。そして、この緩衝液５
には、ＤＮＡ又はＤＮＡのベクターが所定量浸漬され
る。ここで、本形態では、ｐＢＩ２２１を添加してい
る。
【００１３】６は、細胞壁を残したままの（プロトプラ
ストではない）植物組織である。本形態では、後述する
ように、植物体の器官の切片を用いている。植物組織６
は、少なくともＤＣパルスを印加する前に、キュベット
１の緩衝液５に浸漬される。なお、同様に、植物組織、
器官又は植物体について、本発明を適用できる。７は、
矩形波印加手段である。矩形波印加手段７は、電極３、
４に接続され、緩衝液５にＤＣパルスを印加するもので
あって、１００μｓ〜１０００ｍｓｅｃのパルス幅、１
〜５００ｖの電圧、パルス回数を設定可能なものが望ま
しい。８は、インピーダンス測定手段であり、ＤＣパル
ス印加前後において、電極３、４間（緩衝液５）のイン
ピーダンスを測るものである。
ストではない）植物組織である。本形態では、後述する
ように、植物体の器官の切片を用いている。植物組織６
は、少なくともＤＣパルスを印加する前に、キュベット
１の緩衝液５に浸漬される。なお、同様に、植物組織、
器官又は植物体について、本発明を適用できる。７は、
矩形波印加手段である。矩形波印加手段７は、電極３、
４に接続され、緩衝液５にＤＣパルスを印加するもので
あって、１００μｓ〜１０００ｍｓｅｃのパルス幅、１
〜５００ｖの電圧、パルス回数を設定可能なものが望ま
しい。８は、インピーダンス測定手段であり、ＤＣパル
ス印加前後において、電極３、４間（緩衝液５）のイン
ピーダンスを測るものである。
【００１４】さて、後述するように、本発明者の実験に
より明らかになった点であるが、細胞壁を残したままの
状態でも、緩衝液５にＤＣパルスを印加すると、少なく
とも植物細胞の細胞膜に、微細な小孔があき、この小孔
を介して、細胞外から細胞内へ分子量の大きな物質（例
えば、ＤＮＡやＤＮＡのベクター）の導入が可能にな
る。
より明らかになった点であるが、細胞壁を残したままの
状態でも、緩衝液５にＤＣパルスを印加すると、少なく
とも植物細胞の細胞膜に、微細な小孔があき、この小孔
を介して、細胞外から細胞内へ分子量の大きな物質（例
えば、ＤＮＡやＤＮＡのベクター）の導入が可能にな
る。
【００１５】ここで、この小孔があくということは、細
胞に損傷が起こることに他ならないが、細胞の損傷が過
大でなければ、ＤＣパルスの印加後、細胞の自己修復機
能によって小孔が塞がれて、細胞は生存し続ける。しか
し、ＤＣパルスを強くしてゆくと、ある条件以上では、
細胞の損傷が無視できない程度となり、ＤＣパルスの印
加後に小孔が残ったままの状態となる。その結果、細胞
内の物質が緩衝液５に滲出し、滲出量次第では、細胞が
死に至ることになる。ここで、細胞内の物質が緩衝液５
に滲出すると、緩衝液５の電気化学的特性が変化し、イ
ンピーダンスにも変化があらわれる。
胞に損傷が起こることに他ならないが、細胞の損傷が過
大でなければ、ＤＣパルスの印加後、細胞の自己修復機
能によって小孔が塞がれて、細胞は生存し続ける。しか
し、ＤＣパルスを強くしてゆくと、ある条件以上では、
細胞の損傷が無視できない程度となり、ＤＣパルスの印
加後に小孔が残ったままの状態となる。その結果、細胞
内の物質が緩衝液５に滲出し、滲出量次第では、細胞が
死に至ることになる。ここで、細胞内の物質が緩衝液５
に滲出すると、緩衝液５の電気化学的特性が変化し、イ
ンピーダンスにも変化があらわれる。
【００１６】さて、細胞内にＤＮＡなどを導入しやすく
するには、ＤＣパルスを強くする方が良いが、せっかく
細胞にＤＮＡを導入しても、過大なＤＣパルスによって
細胞が死滅してしまうのでは、本末転倒になってしま
う。そこで、本形態では、ＤＣパルスの印加前後におい
て、インピーダンス測定手段８を用いて、インピーダン
スの変化を繰り返し計測することにより、細胞が死なな
い範囲において、できるだけ大きなＤＣパルスを印加で
きる最適な条件を探している。
するには、ＤＣパルスを強くする方が良いが、せっかく
細胞にＤＮＡを導入しても、過大なＤＣパルスによって
細胞が死滅してしまうのでは、本末転倒になってしま
う。そこで、本形態では、ＤＣパルスの印加前後におい
て、インピーダンス測定手段８を用いて、インピーダン
スの変化を繰り返し計測することにより、細胞が死なな
い範囲において、できるだけ大きなＤＣパルスを印加で
きる最適な条件を探している。
【００１７】以上の前提をふまえた上で、本発明者は、
以下の実験を行った。因みに、ＤＮＡ自体が細胞に導入
されたかどうかを直接測ることは困難であるので、導入
したＤＮＡから細胞内で合成される酵素の活性、ＧＵＳ
酵素活性を示す蛍光強度（３試料の平均値）を計測し
た。また、この蛍光強度は、ＤＮＡが全く導入できてい
なければゼロとなり、導入されたＤＮＡの量が増える
と、より大きな値となる。
以下の実験を行った。因みに、ＤＮＡ自体が細胞に導入
されたかどうかを直接測ることは困難であるので、導入
したＤＮＡから細胞内で合成される酵素の活性、ＧＵＳ
酵素活性を示す蛍光強度（３試料の平均値）を計測し
た。また、この蛍光強度は、ＤＮＡが全く導入できてい
なければゼロとなり、導入されたＤＮＡの量が増える
と、より大きな値となる。
【００１８】（実験１）植物組織６として、ニンジン塊
根切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２
１であり、３００μｌのＨＣＫＭの緩衝液５に４０μｇ
浸漬した。また、パルス回数を５とした。そして、導入
を試みた後、３日間培養し蛍光強度を測定した。なお、
電極３、４には、極性を入れ替えた電圧を２回かけた。
ここで、ＨＣＫＭとは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＋ ５
ｍＭ ＣａＣｌ2 ＋８０ｍＭ ＫＣｌ ＋ ０．４２
５ｍＭ Ｍａｎｎｉｔｏｌ（ｐＨ７．２）である。
根切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２
１であり、３００μｌのＨＣＫＭの緩衝液５に４０μｇ
浸漬した。また、パルス回数を５とした。そして、導入
を試みた後、３日間培養し蛍光強度を測定した。なお、
電極３、４には、極性を入れ替えた電圧を２回かけた。
ここで、ＨＣＫＭとは、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＋ ５
ｍＭ ＣａＣｌ2 ＋８０ｍＭ ＫＣｌ ＋ ０．４２
５ｍＭ Ｍａｎｎｉｔｏｌ（ｐＨ７．２）である。
【００１９】パルス幅（ｍｓｅｃ）と電圧（ｖ）をパラ
メータとした結果は、以下の通りである。 パルス幅 ８０ 電圧 ５０ 蛍光強度 １１ パルス幅 ８０ 電圧 ７０ 蛍光強度 ９５ パルス幅 ８０ 電圧 １１０ 蛍光強度 １４８ パルス幅 ８０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ３７ パルス幅 ４０ 電圧 ５０ 蛍光強度 ７ パルス幅 ４０ 電圧 ７０ 蛍光強度 ５２ パルス幅 ４０ 電圧 １１０ 蛍光強度 ８５ パルス幅 ４０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ８１
メータとした結果は、以下の通りである。 パルス幅 ８０ 電圧 ５０ 蛍光強度 １１ パルス幅 ８０ 電圧 ７０ 蛍光強度 ９５ パルス幅 ８０ 電圧 １１０ 蛍光強度 １４８ パルス幅 ８０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ３７ パルス幅 ４０ 電圧 ５０ 蛍光強度 ７ パルス幅 ４０ 電圧 ７０ 蛍光強度 ５２ パルス幅 ４０ 電圧 １１０ 蛍光強度 ８５ パルス幅 ４０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ８１
【００２０】（実験２）植物組織６として、キャベツ葉
切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２１
であり、３００μｌのＨＣＫＭの緩衝液５に４０μｇ浸
漬した。また、パルス回数を５とした。そして、導入を
試みた後、３日間培養し蛍光強度を測定した。なお、電
極３、４には、極性を入れ替えた電圧を２回かけた。
切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２１
であり、３００μｌのＨＣＫＭの緩衝液５に４０μｇ浸
漬した。また、パルス回数を５とした。そして、導入を
試みた後、３日間培養し蛍光強度を測定した。なお、電
極３、４には、極性を入れ替えた電圧を２回かけた。
【００２１】パルス幅（ｍｓｅｃ）と電圧（ｖ）をパラ
メータとした結果は、以下の通りである。 パルス幅 ８０ 電圧 ５０ 蛍光強度 ９ パルス幅 ８０ 電圧 ７０ 蛍光強度 ２９ パルス幅 ８０ 電圧 １１０ 蛍光強度 ５３ パルス幅 ８０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ４６ パルス幅 ４０ 電圧 ５０ 蛍光強度 ７ パルス幅 ４０ 電圧 ７０ 蛍光強度 １２ パルス幅 ４０ 電圧 １１０ 蛍光強度 １６ パルス幅 ４０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ２１
メータとした結果は、以下の通りである。 パルス幅 ８０ 電圧 ５０ 蛍光強度 ９ パルス幅 ８０ 電圧 ７０ 蛍光強度 ２９ パルス幅 ８０ 電圧 １１０ 蛍光強度 ５３ パルス幅 ８０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ４６ パルス幅 ４０ 電圧 ５０ 蛍光強度 ７ パルス幅 ４０ 電圧 ７０ 蛍光強度 １２ パルス幅 ４０ 電圧 １１０ 蛍光強度 １６ パルス幅 ４０ 電圧 １５０ 蛍光強度 ２１
【００２２】（実験３）植物組織６として、ニンジン塊
根切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２
１であり、緩衝液５に４０μｇ浸漬した。また、パルス
回数を５とした。そして、導入を試みた後、３日間培養
し蛍光強度を測定した。なお、電極３、４には、極性を
入れ替えた電圧１１０（ｖ）をパルス幅８０（ｍｓｅ
ｃ）で、２回かけ、日数毎の経時変化を調べた。
根切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２
１であり、緩衝液５に４０μｇ浸漬した。また、パルス
回数を５とした。そして、導入を試みた後、３日間培養
し蛍光強度を測定した。なお、電極３、４には、極性を
入れ替えた電圧１１０（ｖ）をパルス幅８０（ｍｓｅ
ｃ）で、２回かけ、日数毎の経時変化を調べた。
【００２３】結果は、以下の通りである。 日数 ０ 蛍光強度 ２．５ 日数 １ 蛍光強度 ７ 日数 ２ 蛍光強度 ３７ 日数 ３ 蛍光強度 ８４ 日数 ４ 蛍光強度 ９２ 日数 ５ 蛍光強度 ６１
【００２４】（実験４）植物組織６として、ジャガイモ
塊根切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２
２１である。また、パルス回数を５とした。そして、導
入を試みた後、３日間培養し蛍光強度を測定した。な
お、電極３、４には、極性を入れ替えた電圧１１０
（ｖ）をパルス幅８０（ｍｓｅｃ）で、２回かけ、ＤＮ
Ａの量（μｇ）を変化させて蛍光強度を測定した。
塊根切片を用いた。また、導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２
２１である。また、パルス回数を５とした。そして、導
入を試みた後、３日間培養し蛍光強度を測定した。な
お、電極３、４には、極性を入れ替えた電圧１１０
（ｖ）をパルス幅８０（ｍｓｅｃ）で、２回かけ、ＤＮ
Ａの量（μｇ）を変化させて蛍光強度を測定した。
【００２５】結果は、以下の通りである。 ＤＮＡ量 １０ 蛍光強度 ６ ＤＮＡ量 ２０ 蛍光強度 １９ ＤＮＡ量 ４０ 蛍光強度 ４３ ＤＮＡ量 ８０ 蛍光強度 ９６
【００２６】（実験５）植物組織６として、ペチュニア
茎切片を用いた。導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２１であ
り、緩衝液５に４０μｇ浸漬した。また、電極３、４に
は、極性を入れ替えた電圧１１０（ｖ）をパルス幅８０
（ｍｓｅｃ）で、２回かけ、緩衝液５の種類に対する蛍
光強度の変化を調べた。
茎切片を用いた。導入するＤＮＡは、ｐＢＩ２２１であ
り、緩衝液５に４０μｇ浸漬した。また、電極３、４に
は、極性を入れ替えた電圧１１０（ｖ）をパルス幅８０
（ｍｓｅｃ）で、２回かけ、緩衝液５の種類に対する蛍
光強度の変化を調べた。
【００２７】結果は、以下の通りである。 緩衝液 蒸留水 蛍光強度 ２２ 緩衝液 ＴＥ 蛍光強度 ２５ 緩衝液 ＨＣＭＫ 蛍光強度 ７３ 緩衝液 ＨＣＭＫ＋ＰＥＧ 蛍光強度 ７７ 緩衝液 ＴＥＮＡ 蛍光強度 ４４
【００２８】但し、 ＴＥ ： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＋ １ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８.０） ＰＥＧ ： Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏ
ｌ ８０００ ＴＥＮＡ ： １ｍＭ Ｔｒｉｓ ＋ ２５ｕＭ ＥＤ
ＴＡ＋ １５０ｍＭ ＮａＣｌ
ＴＡ（ｐＨ８.０） ＰＥＧ ： Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏ
ｌ ８０００ ＴＥＮＡ ： １ｍＭ Ｔｒｉｓ ＋ ２５ｕＭ ＥＤ
ＴＡ＋ １５０ｍＭ ＮａＣｌ
【００２９】以上の実験結果から、与えられた植物組織
６に対して、適切な電圧とパルス幅を組み合わせて選択
することにより、細胞壁を残したままの植物組織６中
に、ＤＮＡを導入でき、それが発現して酵素活性が生じ
ることがわかった。また、発現する酵素活性の強さは、
添加するＤＮＡの量と組織の培養時間に依存して増加
し、緩衝液５の種類に、かなり影響されることもわかっ
た。
６に対して、適切な電圧とパルス幅を組み合わせて選択
することにより、細胞壁を残したままの植物組織６中
に、ＤＮＡを導入でき、それが発現して酵素活性が生じ
ることがわかった。また、発現する酵素活性の強さは、
添加するＤＮＡの量と組織の培養時間に依存して増加
し、緩衝液５の種類に、かなり影響されることもわかっ
た。
【００３０】即ち、エレクトロポレーション法を改善し
た本発明の方法を用いて、条件を適切に選べば、細胞壁
を残したまま、即ち、植物生体に近い状態において、効
率的にＤＮＡ導入を行える。
た本発明の方法を用いて、条件を適切に選べば、細胞壁
を残したまま、即ち、植物生体に近い状態において、効
率的にＤＮＡ導入を行える。
【００３１】
【発明の効果】本発明は、以上のように構成したので、
植物生体に近い形態で、ＤＮＡ導入を行うことができ
る。
植物生体に近い形態で、ＤＮＡ導入を行うことができ
る。
【図１】本発明の一実施の形態におけるＤＮＡ導入装置
の概念図
の概念図
１ キュベット ２ ふた ３、４ 電極 ５ 緩衝液 ６ 植物組織 ７ 矩形波印加手段 ８ インピーダンス測定手段
Claims (4)
- 【請求項１】細胞壁を残したままの植物組織、器官又は
植物体を、ＤＮＡ又はＤＮＡのベクターを含ませた緩衝
液に浸漬し、前記緩衝液にＤＣパルスを印加し前記ＤＮ
Ａ又はＤＮＡのベクターを前記植物組織、器官又は植物
体を構成する植物細胞内に導入することを特徴とするエ
レクトロポレーションによるＤＮＡ導入方法。 - 【請求項２】前記ＤＣパルスは、パルス幅と電圧が設定
された矩形波であることを特徴とする請求項１記載のエ
レクトロポレーションによるＤＮＡ導入方法。 - 【請求項３】前記ＤＣパルスを印加する前後において、
前記緩衝液のインピーダンスを計測することを特徴とす
る請求項１記載のエレクトロポレーションによるＤＮＡ
導入方法。 - 【請求項４】前記植物組織は、ニンジン塊根切片、キャ
ベツ葉切片、ジャガイモ塊根切片又はペチュニア茎切片
のいずれかであることを特徴とする請求項１記載のエレ
クトロポレーションによるＤＮＡ導入方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9286066A JPH11103858A (ja) | 1997-10-01 | 1997-10-01 | エレクトロポレーションによるｄｎａ導入方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9286066A JPH11103858A (ja) | 1997-10-01 | 1997-10-01 | エレクトロポレーションによるｄｎａ導入方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11103858A true JPH11103858A (ja) | 1999-04-20 |
Family
ID=17699520
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9286066A Pending JPH11103858A (ja) | 1997-10-01 | 1997-10-01 | エレクトロポレーションによるｄｎａ導入方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11103858A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003520574A (ja) * | 1999-07-21 | 2003-07-08 | ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア | エレクトロポレーションを制御するための電気インピーダンストモグラフィ |
| WO2003070875A3 (de) * | 2002-02-20 | 2004-01-08 | Amaxa Gmbh | Behälter mit zumindest einer elektrode |
| WO2005035755A1 (ja) * | 2003-10-08 | 2005-04-21 | Kyoto University | 核酸導入方法 |
| US8263756B2 (en) * | 2001-04-06 | 2012-09-11 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method of gene transfer via vascular system or ureter |
| JP2013198637A (ja) * | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Toshiyuki Moriizumi | エレクロトポレーター用電源 |
| WO2020075399A1 (ja) * | 2018-10-12 | 2020-04-16 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 植物細胞の核内へのタンパク質導入法 |
-
1997
- 1997-10-01 JP JP9286066A patent/JPH11103858A/ja active Pending
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003520574A (ja) * | 1999-07-21 | 2003-07-08 | ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティー・オブ・カリフォルニア | エレクトロポレーションを制御するための電気インピーダンストモグラフィ |
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| KR100852288B1 (ko) | 2002-02-20 | 2008-08-14 | 아막사 아게 | 적어도 하나의 전극을 구비하는 컨테이너 |
| US7678564B2 (en) | 2002-02-20 | 2010-03-16 | Lonza Cologne Ag | Container with at least one electrode |
| WO2005035755A1 (ja) * | 2003-10-08 | 2005-04-21 | Kyoto University | 核酸導入方法 |
| JP2013198637A (ja) * | 2012-03-26 | 2013-10-03 | Toshiyuki Moriizumi | エレクロトポレーター用電源 |
| WO2020075399A1 (ja) * | 2018-10-12 | 2020-04-16 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 植物細胞の核内へのタンパク質導入法 |
| JPWO2020075399A1 (ja) * | 2018-10-12 | 2021-09-09 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 植物細胞の核内へのタンパク質導入法 |
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