JPH11103898A - Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブ - Google Patents
Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブInfo
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- JPH11103898A JPH11103898A JP9282784A JP28278497A JPH11103898A JP H11103898 A JPH11103898 A JP H11103898A JP 9282784 A JP9282784 A JP 9282784A JP 28278497 A JP28278497 A JP 28278497A JP H11103898 A JPH11103898 A JP H11103898A
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- hepatitis
- virus
- gene
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 臨床症状との相関性が従来の血清学的分類法
による場合よりも高くなるＨＢＶの新規分類方法の提
供。 【解決手段】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の２２ｎ
ｔがシトシンであるか否か、１６６ｎｔがアデニンであ
るか否か、１６９ｎｔがチミンであるか否か、又は１７
６ｎｔがグアニンであるか否かを調べることにより、Ｂ
型肝炎ウイルスのｇｄｗ２型をこれ以外の型から識別す
ることから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法；Ｂ型
肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３９０ｎｔがシトシンであ
るか否か、又は３９２ｎｔがアデニンであるか否かを調
べることにより、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｄｗ１型をこれ
以外の型から識別することから成る、Ｂ型肝炎ウイルス
の型分類方法；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の４０１
ｎｔがアデニンであるか否かを調べることにより、Ｂ型
肝炎ウイルスのｇｙｗ型をこれ以外の型から識別するこ
とから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法；及びその
他のＢ型肝炎ウイルスの型分類方法の提供。
による場合よりも高くなるＨＢＶの新規分類方法の提
供。 【解決手段】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の２２ｎ
ｔがシトシンであるか否か、１６６ｎｔがアデニンであ
るか否か、１６９ｎｔがチミンであるか否か、又は１７
６ｎｔがグアニンであるか否かを調べることにより、Ｂ
型肝炎ウイルスのｇｄｗ２型をこれ以外の型から識別す
ることから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法；Ｂ型
肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３９０ｎｔがシトシンであ
るか否か、又は３９２ｎｔがアデニンであるか否かを調
べることにより、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｄｗ１型をこれ
以外の型から識別することから成る、Ｂ型肝炎ウイルス
の型分類方法；Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の４０１
ｎｔがアデニンであるか否かを調べることにより、Ｂ型
肝炎ウイルスのｇｙｗ型をこれ以外の型から識別するこ
とから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法；及びその
他のＢ型肝炎ウイルスの型分類方法の提供。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス
（以下、「ＨＢＶ」ということがある）の型分類方法並
びにそのためのプライマー及びプローブに関する。
（以下、「ＨＢＶ」ということがある）の型分類方法並
びにそのためのプライマー及びプローブに関する。
【０００２】
【従来の技術】ＨＢＶは世界に２億人の感染者が推定さ
れている、急性又は慢性肝疾患、さらには肝硬変、肝癌
に至る病原ウイルスである。Ｂ型肝炎患者の血清中に
は、小型粒子（２２ｎｍ、表面抗原蛋白粒子）、管状粒
子（小型粒子が連なったもの）、そしてウイルス本体と
考えられるＤａｎｅ粒子（４２ｎｍ）のｖｉｒｉｏｎが
存在している（Dane DS et al., Lancet, i, 659-698,
1970) 。これらは全て、ＨＢｓ抗原と呼ばれる表層蛋白
を持つ（Blum HE et al., Trnds in Genetics, 5,154-1
58, 1989)が、Ｄａｎｅ粒子だけがＤＮＡを有し複製可
能である。
れている、急性又は慢性肝疾患、さらには肝硬変、肝癌
に至る病原ウイルスである。Ｂ型肝炎患者の血清中に
は、小型粒子（２２ｎｍ、表面抗原蛋白粒子）、管状粒
子（小型粒子が連なったもの）、そしてウイルス本体と
考えられるＤａｎｅ粒子（４２ｎｍ）のｖｉｒｉｏｎが
存在している（Dane DS et al., Lancet, i, 659-698,
1970) 。これらは全て、ＨＢｓ抗原と呼ばれる表層蛋白
を持つ（Blum HE et al., Trnds in Genetics, 5,154-1
58, 1989)が、Ｄａｎｅ粒子だけがＤＮＡを有し複製可
能である。
【０００３】現在では、このＨＢｓ抗原は血清学的な手
法を用いて分類されている。最終的には、共通抗原
「ａ」、一対の「ｄ」と「ｙ」、及び一対の「ｗ」と
「ｒ」から成る、ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｗ、ａｙｒの４
つのサブタイプに集約された（Couruce-P AM et al., V
ox Sang, 44, 197-211, 1983) 。
法を用いて分類されている。最終的には、共通抗原
「ａ」、一対の「ｄ」と「ｙ」、及び一対の「ｗ」と
「ｒ」から成る、ａｄｒ、ａｄｗ、ａｙｗ、ａｙｒの４
つのサブタイプに集約された（Couruce-P AM et al., V
ox Sang, 44, 197-211, 1983) 。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記４つのタ
イプに分類されない「ａｄ」及び「ａｗ」の存在が確認
されており、また、臨床との相関性で不都合も生じてい
る。日本では予後良好と考えられているａｄｗ（Guerre
ro E et al., Mol. Immunol. 27, 435-441, 1990）が９
０％以上を占める台湾で、肝硬変、肝癌が多発している
という報告（ChenDS et al., Springer-verlag, 71-80,
1987) がある。従って、同じａｄｗであっても、臨床
症状が著しく異なる場合があることが予想される。
イプに分類されない「ａｄ」及び「ａｗ」の存在が確認
されており、また、臨床との相関性で不都合も生じてい
る。日本では予後良好と考えられているａｄｗ（Guerre
ro E et al., Mol. Immunol. 27, 435-441, 1990）が９
０％以上を占める台湾で、肝硬変、肝癌が多発している
という報告（ChenDS et al., Springer-verlag, 71-80,
1987) がある。従って、同じａｄｗであっても、臨床
症状が著しく異なる場合があることが予想される。
【０００５】従って、本発明の目的は、臨床症状との相
関性が従来の血清学的分類法による場合よりも高くな
る、ＨＢＶの新規な分類方法並びにそれに用いられるプ
ライマー及びプローブを提供することである。
関性が従来の血清学的分類法による場合よりも高くな
る、ＨＢＶの新規な分類方法並びにそれに用いられるプ
ライマー及びプローブを提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本願発明者は、鋭意研究
の結果、ＨＢＶのＳ遺伝子の塩基配列に基づく新たな分
類方を開発し、これによってＨＢＶを４種類のゲノタイ
プに分類することに成功し、かつ、この分類法によれば
臨床症状との相関性も従来の血清学的方法よりも高くな
ることを確認して本発明を完成した。
の結果、ＨＢＶのＳ遺伝子の塩基配列に基づく新たな分
類方を開発し、これによってＨＢＶを４種類のゲノタイ
プに分類することに成功し、かつ、この分類法によれば
臨床症状との相関性も従来の血清学的方法よりも高くな
ることを確認して本発明を完成した。
【０００７】本発明では、ＨＢＶのＳ遺伝子をｇｄｗ
１、ｇｄｗ２、ｇｄｒ、ｇｙｒの４種類に分類する。こ
れによると、従来の血清学的分類法によるａｄｗがｇｄ
ｗ１、ｇｄｗ２及びｄｇｒの３種類に分類され、予後の
良好な沖繩より分離されたＨＩＶはｇｄｗ２、予後の悪
いＨＢＶはｇｄｗ１、ｇｄｒに分類される。
１、ｇｄｗ２、ｇｄｒ、ｇｙｒの４種類に分類する。こ
れによると、従来の血清学的分類法によるａｄｗがｇｄ
ｗ１、ｇｄｗ２及びｄｇｒの３種類に分類され、予後の
良好な沖繩より分離されたＨＩＶはｇｄｗ２、予後の悪
いＨＢＶはｇｄｗ１、ｇｄｒに分類される。
【０００８】すなわち、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスの
Ｓ遺伝子中の２２ｎｔ（「〜ｎｔ」は、第〜番目のヌク
レオチドという意味）がシトシンであるか否かを調べる
ことにより、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｄｗ２型をこれ以外
の型から識別することから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型
分類方法を提供する。また、本発明は、Ｂ型肝炎ウイル
スのＳ遺伝子中の１６６ｎｔがアデニンであるか否かを
調べることにより、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｄｗ２型をこ
れ以外の型から識別することから成る、Ｂ型肝炎ウイル
スの型分類方法を提供する。さらに、本発明は、Ｂ型肝
炎ウイルスのＳ遺伝子中の１６９ｎｔがチミンであるか
否かを調べることにより、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｄｗ２
型をこれ以外の型から識別することから成る、Ｂ型肝炎
ウイルスの型分類方法を提供する。さらに、本発明は、
Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の１７６ｎｔがグアニン
であるか否かを調べることにより、Ｂ型肝炎ウイルスの
ｇｄｗ２型をこれ以外の型から識別することから成る、
Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法を提供する。さらに、本
発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３９０ｎｔが
シトシンであるか否かを調べることにより、Ｂ型肝炎ウ
イルスのｇｄｗ１型をこれ以外の型から識別することか
ら成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法を提供する。さ
らに、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３９
２ｎｔがアデニンであるか否かを調べることにより、Ｂ
型肝炎ウイルスのｇｄｗ１型をこれ以外の型から識別す
ることから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法を提供
する。さらに、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子
中の４０１ｎｔがアデニンであるか否かを調べることに
より、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｙｗ型をこれ以外の型から
識別することから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法
を提供する。さらに、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ
遺伝子中の３３７ｎｔがアデニンであるか否かを調べる
ことにより、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｄｒ型をこれ以外の
型から識別することから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分
類方法を提供する。さらに、本発明は、これらの本発明
の方法に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー、オ
リゴヌクレオチドプローブ及び競合オリゴヌクレオチド
を提供する。
Ｓ遺伝子中の２２ｎｔ（「〜ｎｔ」は、第〜番目のヌク
レオチドという意味）がシトシンであるか否かを調べる
ことにより、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｄｗ２型をこれ以外
の型から識別することから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型
分類方法を提供する。また、本発明は、Ｂ型肝炎ウイル
スのＳ遺伝子中の１６６ｎｔがアデニンであるか否かを
調べることにより、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｄｗ２型をこ
れ以外の型から識別することから成る、Ｂ型肝炎ウイル
スの型分類方法を提供する。さらに、本発明は、Ｂ型肝
炎ウイルスのＳ遺伝子中の１６９ｎｔがチミンであるか
否かを調べることにより、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｄｗ２
型をこれ以外の型から識別することから成る、Ｂ型肝炎
ウイルスの型分類方法を提供する。さらに、本発明は、
Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の１７６ｎｔがグアニン
であるか否かを調べることにより、Ｂ型肝炎ウイルスの
ｇｄｗ２型をこれ以外の型から識別することから成る、
Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法を提供する。さらに、本
発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３９０ｎｔが
シトシンであるか否かを調べることにより、Ｂ型肝炎ウ
イルスのｇｄｗ１型をこれ以外の型から識別することか
ら成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法を提供する。さ
らに、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３９
２ｎｔがアデニンであるか否かを調べることにより、Ｂ
型肝炎ウイルスのｇｄｗ１型をこれ以外の型から識別す
ることから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法を提供
する。さらに、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子
中の４０１ｎｔがアデニンであるか否かを調べることに
より、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｙｗ型をこれ以外の型から
識別することから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法
を提供する。さらに、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ
遺伝子中の３３７ｎｔがアデニンであるか否かを調べる
ことにより、Ｂ型肝炎ウイルスのｇｄｒ型をこれ以外の
型から識別することから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分
類方法を提供する。さらに、本発明は、これらの本発明
の方法に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー、オ
リゴヌクレオチドプローブ及び競合オリゴヌクレオチド
を提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の分類法により分類される
ｇｄｗ２のゲノムの塩基配列はGenBank Accession No.
D00331に記載されている。ｇｄｗ２のＳ遺伝子は、図１
及び図２に示されるように、Ｓ遺伝子の２２ｎｔ、１６
６ｎｔ、１６９ｎｔ及び１７６ｎｔが他の３つの分類型
と異なっている。すなわち、Ｓ遺伝子の２２ｎｔがシト
シン（他の型ではチミン）、１６６ｎｔがアデニン（他
の型ではシトシン）、１６９ｎｔがチミン（他の型では
シトシン）、そして１７６ｎｔがグアニン（他の型では
アデニン）となっている。従って、これら４つの部位の
少なくともいずれか１つの塩基が、ｇｄｗ２に特徴的な
塩基になっているか否かを調べることにより、そのＨＢ
Ｖがｄｇｗ２か否かを識別することができる。
ｇｄｗ２のゲノムの塩基配列はGenBank Accession No.
D00331に記載されている。ｇｄｗ２のＳ遺伝子は、図１
及び図２に示されるように、Ｓ遺伝子の２２ｎｔ、１６
６ｎｔ、１６９ｎｔ及び１７６ｎｔが他の３つの分類型
と異なっている。すなわち、Ｓ遺伝子の２２ｎｔがシト
シン（他の型ではチミン）、１６６ｎｔがアデニン（他
の型ではシトシン）、１６９ｎｔがチミン（他の型では
シトシン）、そして１７６ｎｔがグアニン（他の型では
アデニン）となっている。従って、これら４つの部位の
少なくともいずれか１つの塩基が、ｇｄｗ２に特徴的な
塩基になっているか否かを調べることにより、そのＨＢ
Ｖがｄｇｗ２か否かを識別することができる。
【００１０】本発明の分類法により分類されるｇｄｗ１
のゲノムの塩基配列はGenBank Accession No. X02763に
記載されている。ｇｄｗ１のＳ遺伝子は、図３に示され
るように、Ｓ遺伝子の３９０ｎｔがシトシン（他の型で
はアデニン）及び３９２ｎｔがアデニン（他の型ではシ
トシン）となっている。従って、これら２つの部位の少
なくともいずれか１つの塩基が、ｇｄｗ１に特徴的な塩
基になっているか否かを調べることにより、そのＨＢＶ
がｄｇｗ１か否かを識別することができる。
のゲノムの塩基配列はGenBank Accession No. X02763に
記載されている。ｇｄｗ１のＳ遺伝子は、図３に示され
るように、Ｓ遺伝子の３９０ｎｔがシトシン（他の型で
はアデニン）及び３９２ｎｔがアデニン（他の型ではシ
トシン）となっている。従って、これら２つの部位の少
なくともいずれか１つの塩基が、ｇｄｗ１に特徴的な塩
基になっているか否かを調べることにより、そのＨＢＶ
がｄｇｗ１か否かを識別することができる。
【００１１】本発明の分類法により分類されるｇｙｗの
ゲノムの塩基配列はGenBank Accession No. J02203に記
載されている。ｇｙｗのＳ遺伝子は、図４に示されるよ
うに、Ｓ遺伝子の４０１ｎｔがアデニン（他の型ではチ
ミン）となっている。従って、４０１ｎｔの塩基が、ｇ
ｙｗに特徴的なアデニンになっているか否かを調べるこ
とにより、そのＨＢＶがｇｙｗか否かを識別することが
できる。
ゲノムの塩基配列はGenBank Accession No. J02203に記
載されている。ｇｙｗのＳ遺伝子は、図４に示されるよ
うに、Ｓ遺伝子の４０１ｎｔがアデニン（他の型ではチ
ミン）となっている。従って、４０１ｎｔの塩基が、ｇ
ｙｗに特徴的なアデニンになっているか否かを調べるこ
とにより、そのＨＢＶがｇｙｗか否かを識別することが
できる。
【００１２】本発明の分類法により分類されるｇｄｒの
ゲノムの塩基配列はGenBank Accession No. D12980に記
載されている。ｇｄｒのＳ遺伝子は、図５に示されるよ
うに、Ｓ遺伝子の３３７ｎｔがシトシン（他の型ではア
デニン）となっている。従って、３３７ｎｔの塩基が、
ｇｄｒに特徴的なシトシンになっているか否かを調べる
ことにより、そのＨＢＶがｇｄｒか否かを識別すること
ができる。
ゲノムの塩基配列はGenBank Accession No. D12980に記
載されている。ｇｄｒのＳ遺伝子は、図５に示されるよ
うに、Ｓ遺伝子の３３７ｎｔがシトシン（他の型ではア
デニン）となっている。従って、３３７ｎｔの塩基が、
ｇｄｒに特徴的なシトシンになっているか否かを調べる
ことにより、そのＨＢＶがｇｄｒか否かを識別すること
ができる。
【００１３】従来のＨＢＶの系統分類と、本発明による
分類型との関係を図６に示す。なお、分子系統解析は、
６−パラメーター法（Gojobori, et al., J. Mol. Evo
l. 18, 414-423, 1982)、unweighted pair grouping法
（Nei M., Molecular evolutionary genetics, Columbi
a Univ. Press, 1987)及びNJ methods (Saitou and Ne
i, Mol. Biol. Evol. 4, 406-425 (1987)を用いた。
分類型との関係を図６に示す。なお、分子系統解析は、
６−パラメーター法（Gojobori, et al., J. Mol. Evo
l. 18, 414-423, 1982)、unweighted pair grouping法
（Nei M., Molecular evolutionary genetics, Columbi
a Univ. Press, 1987)及びNJ methods (Saitou and Ne
i, Mol. Biol. Evol. 4, 406-425 (1987)を用いた。
【００１４】上記した、各型に特異的な部位が上記各型
に特異的な塩基になっているか否かは、種々の方法によ
り調べることができ、どのような方法で調べる場合も本
発明の範囲に含まれる。例えば、制限酵素断片長多型を
利用した方法、プローブ法、制限酵素部位導入法、ダイ
レクトシークエンス、TaqManプローブ（商品名）を用い
る方法等を例示することができるがこれらに限定される
ものではない。
に特異的な塩基になっているか否かは、種々の方法によ
り調べることができ、どのような方法で調べる場合も本
発明の範囲に含まれる。例えば、制限酵素断片長多型を
利用した方法、プローブ法、制限酵素部位導入法、ダイ
レクトシークエンス、TaqManプローブ（商品名）を用い
る方法等を例示することができるがこれらに限定される
ものではない。
【００１５】これらのうち、好ましい方法として、制限
酵素断片長多型を利用した方法、プローブ法及び制限酵
素部位導入法を挙げることができる。以下、これらにつ
いて説明する。
酵素断片長多型を利用した方法、プローブ法及び制限酵
素部位導入法を挙げることができる。以下、これらにつ
いて説明する。
【００１６】制限酵素断片長多型を利用した方法（ＲＦ
ＬＰ法）は、上記した、各型に特異的な部位が各型に特
異的な塩基になっているか否かによって、制限酵素によ
り切断されるか否かが異なってくる制限酵素で検体遺伝
子を消化し、消化物の断片の大きさを調べることによ
り、該制限酵素で検体遺伝子が切断されたか否かを調
べ、それによって検体遺伝子がその型であるか否かを判
定する方法である。消化物の断片の大きさは通常、電気
泳動により調べられる。また、判定の感度を高めるため
に、検体遺伝子の消化すべき領域を先ず遺伝子増幅法に
より増幅した後、制限酵素による消化を行うことが好ま
しい（いわゆるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等）。
ＬＰ法）は、上記した、各型に特異的な部位が各型に特
異的な塩基になっているか否かによって、制限酵素によ
り切断されるか否かが異なってくる制限酵素で検体遺伝
子を消化し、消化物の断片の大きさを調べることによ
り、該制限酵素で検体遺伝子が切断されたか否かを調
べ、それによって検体遺伝子がその型であるか否かを判
定する方法である。消化物の断片の大きさは通常、電気
泳動により調べられる。また、判定の感度を高めるため
に、検体遺伝子の消化すべき領域を先ず遺伝子増幅法に
より増幅した後、制限酵素による消化を行うことが好ま
しい（いわゆるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法等）。
【００１７】例えば、ＨＢＶのＳ遺伝子中の２２ｎｔが
シトシンか否かを調べるためには、Ｂ型肝炎ウイルスの
Ｓ遺伝子中の２０ｎｔ〜２４ｎｔを含む領域を増幅し、
増幅産物を制限酵素PleIで消化する方法を挙げることが
できる。この方法によると、２２ｎｔがシトシンの場合
には２０ｎｔ〜２４ｎｔの部分がPleIの認識領域となる
ので、切断が起き、一方、２２ｎｔがチミンの場合には
切断が起きないので、制限酵素消化後の断片長を電気泳
動等で調べることによりｇｄｗ２型か否かを判定するこ
とができる。同様に、Ｓ遺伝子中の１７３ｎｔ〜１７７
ｎｔを含む領域を増幅し、増幅産物を制限酵素BsrIで消
化する方法により、ｇｄｗ２型か否かを判定することが
できる。また、Ｓ遺伝子中の３８８ｎｔ〜３９３ｎｔを
含む領域を増幅し、増幅産物を制限酵素NlaIV で消化す
る方法により、ｇｄｗ１型か否かを判定することができ
る。さらに、Ｓ遺伝子中の３３４ｎｔ〜３３８ｎｔを含
む領域を増幅し、増幅産物を制限酵素AlwIで消化する方
法により、ｇｄｒ型か否かを判定することができる。な
お、本発明におけるＲＦＬＰ法で利用できる制限酵素は
これらに限定されるものではない。
シトシンか否かを調べるためには、Ｂ型肝炎ウイルスの
Ｓ遺伝子中の２０ｎｔ〜２４ｎｔを含む領域を増幅し、
増幅産物を制限酵素PleIで消化する方法を挙げることが
できる。この方法によると、２２ｎｔがシトシンの場合
には２０ｎｔ〜２４ｎｔの部分がPleIの認識領域となる
ので、切断が起き、一方、２２ｎｔがチミンの場合には
切断が起きないので、制限酵素消化後の断片長を電気泳
動等で調べることによりｇｄｗ２型か否かを判定するこ
とができる。同様に、Ｓ遺伝子中の１７３ｎｔ〜１７７
ｎｔを含む領域を増幅し、増幅産物を制限酵素BsrIで消
化する方法により、ｇｄｗ２型か否かを判定することが
できる。また、Ｓ遺伝子中の３８８ｎｔ〜３９３ｎｔを
含む領域を増幅し、増幅産物を制限酵素NlaIV で消化す
る方法により、ｇｄｗ１型か否かを判定することができ
る。さらに、Ｓ遺伝子中の３３４ｎｔ〜３３８ｎｔを含
む領域を増幅し、増幅産物を制限酵素AlwIで消化する方
法により、ｇｄｒ型か否かを判定することができる。な
お、本発明におけるＲＦＬＰ法で利用できる制限酵素は
これらに限定されるものではない。
【００１８】本発明におけるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に用い
られる増幅用プライマーの好ましい例として、配列番号
１〜１０に記載の塩基配列を有するものを挙げることが
できる。これらが、ＨＢＶ遺伝子とハイブリダイズする
ＨＢＶ遺伝子上の領域を下記表１に示す。
られる増幅用プライマーの好ましい例として、配列番号
１〜１０に記載の塩基配列を有するものを挙げることが
できる。これらが、ＨＢＶ遺伝子とハイブリダイズする
ＨＢＶ遺伝子上の領域を下記表１に示す。
【００１９】
【表１】 ＊：HPBCG accession No. D12980上の位置（Ｓ遺伝子の
１ｎｔを１とした）
１ｎｔを１とした）
【００２０】配列番号１で表わされる塩基配列を有する
オリゴヌクレオチド（以下、配列番号〜で表わされる塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドを簡単のため、「配
列番号〜」と記載することがある）又は配列番号２をリ
バース側プライマーとして用い、配列番号６又は７をフ
ォワード側プライマーとして用いて増幅を行った場合、
制限酵素PleIで消化すると、ｇｄｗ２型の場合には、図
７に示すように、７７ｂｐの特異的バンドが現れる。Al
wIで消化すると、ｇｙｒ型の場合には、図８に示すよう
に、２９３ｂｐに特異的バンドが現れ、ｇｄｒ型の場合
には８２２ｂｐ、１０５８ｂｐ及び１２４７ｂｐに特異
的バンドが現れる。また、NlaIV で消化すると、図９に
示すように、ｇｄｗ１型の場合には２４９ｂｐに特異的
バンドが現れる。
オリゴヌクレオチド（以下、配列番号〜で表わされる塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドを簡単のため、「配
列番号〜」と記載することがある）又は配列番号２をリ
バース側プライマーとして用い、配列番号６又は７をフ
ォワード側プライマーとして用いて増幅を行った場合、
制限酵素PleIで消化すると、ｇｄｗ２型の場合には、図
７に示すように、７７ｂｐの特異的バンドが現れる。Al
wIで消化すると、ｇｙｒ型の場合には、図８に示すよう
に、２９３ｂｐに特異的バンドが現れ、ｇｄｒ型の場合
には８２２ｂｐ、１０５８ｂｐ及び１２４７ｂｐに特異
的バンドが現れる。また、NlaIV で消化すると、図９に
示すように、ｇｄｗ１型の場合には２４９ｂｐに特異的
バンドが現れる。
【００２１】また、配列番号８及び１０を用いてＨＢＶ
遺伝子を増幅した場合、AlwIで消化すると、ｇｄｒ型で
ある場合には、図１０に示すように、４４０ｂｐ又は４
００ｂｐ＋４４ｂｐの特異的バンドが現れる。NlaIV で
消化すると、ｇｄｗ１型の場合には、図１１に示すよう
に２６２ｂｐ＋１８２ｂｐの特異的バンドが現れる。ま
た、BsrIで消化すると、ｇｄｗ２型の場合には、図１２
に示すように７９ｂｐ＋３６５ｂｐの特異的バンドが現
れる。これら３種類の制限酵素のいずれで消化しても上
記のいずれの特異的バンドも現れない場合には、ｇｙｗ
型と判定できる。
遺伝子を増幅した場合、AlwIで消化すると、ｇｄｒ型で
ある場合には、図１０に示すように、４４０ｂｐ又は４
００ｂｐ＋４４ｂｐの特異的バンドが現れる。NlaIV で
消化すると、ｇｄｗ１型の場合には、図１１に示すよう
に２６２ｂｐ＋１８２ｂｐの特異的バンドが現れる。ま
た、BsrIで消化すると、ｇｄｗ２型の場合には、図１２
に示すように７９ｂｐ＋３６５ｂｐの特異的バンドが現
れる。これら３種類の制限酵素のいずれで消化しても上
記のいずれの特異的バンドも現れない場合には、ｇｙｗ
型と判定できる。
【００２２】次にプローブ法について説明する。上記し
た、その型であるか否かを判定すべき型に特異的な塩基
を含む領域と相補的な塩基配列を有し、かつ標識された
オリゴヌクレオチドプローブを検体遺伝子とハイブリダ
イズさせ、前記標識されたオリゴヌクレオチドプローブ
がハイブリダイズするか否かを調べることにより、その
型か否かを判定することができる。オリゴヌクレオチド
を標識することはこの分野において周知であり、各種蛍
光標識、放射標識、ビオチン標識等を用いることができ
る。オリゴヌクレオチドプローブのサイズは特に限定さ
れないが、通常、１５〜５０塩基程度が好ましく、さら
には２０〜３５塩基程度が好ましい。なお、プローブ法
自体は周知であるので、ハイブリダイズしたか否かの判
定等は常法により行うことができる。
た、その型であるか否かを判定すべき型に特異的な塩基
を含む領域と相補的な塩基配列を有し、かつ標識された
オリゴヌクレオチドプローブを検体遺伝子とハイブリダ
イズさせ、前記標識されたオリゴヌクレオチドプローブ
がハイブリダイズするか否かを調べることにより、その
型か否かを判定することができる。オリゴヌクレオチド
を標識することはこの分野において周知であり、各種蛍
光標識、放射標識、ビオチン標識等を用いることができ
る。オリゴヌクレオチドプローブのサイズは特に限定さ
れないが、通常、１５〜５０塩基程度が好ましく、さら
には２０〜３５塩基程度が好ましい。なお、プローブ法
自体は周知であるので、ハイブリダイズしたか否かの判
定等は常法により行うことができる。
【００２３】さらに判定の精度を高めたプローブ法とし
て、競合プローブを用いる方法がある。すなわち、その
型であるか否かを判定すべき型に特異的な部位を含む領
域と相補的な塩基配列を有し、かつ標識されたオリゴヌ
クレオチドプローブと、判定すべき型以外の型の当該領
域と相補的な塩基配列を有し、かつ標識されていない競
合オリゴヌクレオチドとを競合的に検体遺伝子とハイブ
リダイズさせ、前記標識されたオリゴヌクレオチドプロ
ーブがハイブリダイズするか否かを調べる方法である。
この方法によれば、オリゴヌクレオチドプローブと競合
オリゴヌクレオチドが競合的にハイブリダイズしようと
するので、完全に相補的な方のみがハイブリダイズし、
１塩基でも相補的でない塩基を含む方はハイブリダイズ
することができない。従って、この方法によれば、オリ
ゴヌクレオチドプローブのみを用いる通常のプローブ法
に比べて判定の精度が高まる。
て、競合プローブを用いる方法がある。すなわち、その
型であるか否かを判定すべき型に特異的な部位を含む領
域と相補的な塩基配列を有し、かつ標識されたオリゴヌ
クレオチドプローブと、判定すべき型以外の型の当該領
域と相補的な塩基配列を有し、かつ標識されていない競
合オリゴヌクレオチドとを競合的に検体遺伝子とハイブ
リダイズさせ、前記標識されたオリゴヌクレオチドプロ
ーブがハイブリダイズするか否かを調べる方法である。
この方法によれば、オリゴヌクレオチドプローブと競合
オリゴヌクレオチドが競合的にハイブリダイズしようと
するので、完全に相補的な方のみがハイブリダイズし、
１塩基でも相補的でない塩基を含む方はハイブリダイズ
することができない。従って、この方法によれば、オリ
ゴヌクレオチドプローブのみを用いる通常のプローブ法
に比べて判定の精度が高まる。
【００２４】なお、この方法で用いることができるオリ
ゴヌクレオチドプローブ及び競合オリゴヌクレオチドの
好ましい例として下記表２に示すものを挙げることがで
きる（なお、「判別できる型」が「コンセンサス」のも
のは、型判別に用いることはできない）。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、全てＳ遺伝子のセンス鎖に結合する
ものである。また、オリゴヌクレオチド名の先頭に大文
字のＣが付くものは、競合オリゴヌクレオチドである。
ゴヌクレオチドプローブ及び競合オリゴヌクレオチドの
好ましい例として下記表２に示すものを挙げることがで
きる（なお、「判別できる型」が「コンセンサス」のも
のは、型判別に用いることはできない）。これらのオリ
ゴヌクレオチドは、全てＳ遺伝子のセンス鎖に結合する
ものである。また、オリゴヌクレオチド名の先頭に大文
字のＣが付くものは、競合オリゴヌクレオチドである。
【００２５】
【表２】 ＊：GenBank Accession No. D12980のＳ遺伝子の１番目
の塩基を１として表示
の塩基を１として表示
【００２６】なお、ゲノム上の領域から明らかなよう
に、配列番号１１と１２、１３と１４、１５と１６、１
７と１８がそれぞれ対として用いられる。
に、配列番号１１と１２、１３と１４、１５と１６、１
７と１８がそれぞれ対として用いられる。
【００２７】次に、制限酵素部位導入法について説明す
る。この方法では、その型であるか否かを判定すべき型
に特異的な部位を含む領域が制限酵素認識領域となるよ
うに人為的にミスマッチを導入したミスマッチプライマ
ーを用いて検体遺伝子を増幅する。そうすると、増幅産
物は、判定すべき型か否かによって、制限酵素認識領域
を含んでいたり含んでいなかったりする。よって、該増
幅産物を該制限酵素で消化し、断片の長さを調べること
によりその型か否かを判定することができる。
る。この方法では、その型であるか否かを判定すべき型
に特異的な部位を含む領域が制限酵素認識領域となるよ
うに人為的にミスマッチを導入したミスマッチプライマ
ーを用いて検体遺伝子を増幅する。そうすると、増幅産
物は、判定すべき型か否かによって、制限酵素認識領域
を含んでいたり含んでいなかったりする。よって、該増
幅産物を該制限酵素で消化し、断片の長さを調べること
によりその型か否かを判定することができる。
【００２８】例えば、配列番号２４（Ｓ遺伝子上の位置
は−６〜２１）のプライマーをフォワード側プライマー
として用いて増幅を行うと、Ｓ遺伝子中の２２ｎｔがシ
トシンであるかチミンであるかによって、制限酵素ScaI
又はRsaIで消化した場合に切断が起きるか否かが変わっ
てくるので、ｇｄｗ２型か否かの判定を行うことができ
る。すなわち、例えば、配列番号２４のプライマーをフ
ォワード側プライマーとし、配列番号２５（Ｓ遺伝子上
の位置は６３〜８７）のプライマーをリバース側プライ
マーとして用いると、図１３に示すように、ｇｄｗ２型
の場合には６７ｂｐのバンドが現れ、それ以外の型の場
合には９３ｂｐのバンドが現れる。
は−６〜２１）のプライマーをフォワード側プライマー
として用いて増幅を行うと、Ｓ遺伝子中の２２ｎｔがシ
トシンであるかチミンであるかによって、制限酵素ScaI
又はRsaIで消化した場合に切断が起きるか否かが変わっ
てくるので、ｇｄｗ２型か否かの判定を行うことができ
る。すなわち、例えば、配列番号２４のプライマーをフ
ォワード側プライマーとし、配列番号２５（Ｓ遺伝子上
の位置は６３〜８７）のプライマーをリバース側プライ
マーとして用いると、図１３に示すように、ｇｄｗ２型
の場合には６７ｂｐのバンドが現れ、それ以外の型の場
合には９３ｂｐのバンドが現れる。
【００２９】
【実施例】以下、本発明を実施例に基づき、さらに具体
的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定さ
れるものではない。
的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定さ
れるものではない。
【００３０】実施例１ ＨＢＶ−ＤＮＡ陽性血清５５サンプルを用いて本発明の
方法によりゲノタイピングを行った。
方法によりゲノタイピングを行った。
【００３１】ＨＢＶ−ＤＮＡ抽出 血清１００μｌにＰ溶液（50 mM Tris-HCl(pH8.0), 150
mM NaCl, 20 mM EDTA, 0.2% SDS, 5 mg/ml プロテアー
ゼＫ）５００μｌを加え、撹拌後、６０℃で１６時間イ
ンキュベートした。
mM NaCl, 20 mM EDTA, 0.2% SDS, 5 mg/ml プロテアー
ゼＫ）５００μｌを加え、撹拌後、６０℃で１６時間イ
ンキュベートした。
【００３２】水飽和フェノール６００μｌを加え撹拌
後、12000 rpm 、室温、１５分間遠心し、上清を別のチ
ューブに移し、６００μｌのクロロフォルムを加え、撹
拌後、さらに12000 rpm 、室温、１５分間遠心し、上清
を別のチューブに移し、６００μｌのイソプロピルアル
コール、２０ｍｇのグリコーゲンを加え、撹拌後、1200
0 rpm 、４℃、３０分間遠心し、沈殿を乾燥させ精製Ｄ
ＮＡを得た。
後、12000 rpm 、室温、１５分間遠心し、上清を別のチ
ューブに移し、６００μｌのクロロフォルムを加え、撹
拌後、さらに12000 rpm 、室温、１５分間遠心し、上清
を別のチューブに移し、６００μｌのイソプロピルアル
コール、２０ｍｇのグリコーゲンを加え、撹拌後、1200
0 rpm 、４℃、３０分間遠心し、沈殿を乾燥させ精製Ｄ
ＮＡを得た。
【００３３】ＰＣＲ 配列番号２及び７のプライマーをそれぞれ１０ｐｍｏｌ
用いてＰＣＲを行った。条件は、変性９５℃３０秒間、
アニール５０℃６０秒間、伸長７２℃６０秒間で、合計
５０μｌとし、１．２５Ｕ AmpliTaq（商品名、日本ロ
シュ）を使用し、４０サイクルのＰＣＲを行った。
用いてＰＣＲを行った。条件は、変性９５℃３０秒間、
アニール５０℃６０秒間、伸長７２℃６０秒間で、合計
５０μｌとし、１．２５Ｕ AmpliTaq（商品名、日本ロ
シュ）を使用し、４０サイクルのＰＣＲを行った。
【００３４】ＰＣＲ産物１０μｌをそれぞれ１０ＵのAl
wI（new England Biolabs)、PleI（new England Biolab
s)又はNlaIV （new England Biolabs)で、それぞれ添付
バッファーを用いて、３７℃、３時間反応させ、０．５
μｇ／ｍｌ、エチジウムブロミドの３％アガロースゲル
で電気泳動後、紫外線照射下で写真撮影を行い、上記の
とおり検出バンドで各タイプに判定、分類した。結果を
下記表３に示す。
wI（new England Biolabs)、PleI（new England Biolab
s)又はNlaIV （new England Biolabs)で、それぞれ添付
バッファーを用いて、３７℃、３時間反応させ、０．５
μｇ／ｍｌ、エチジウムブロミドの３％アガロースゲル
で電気泳動後、紫外線照射下で写真撮影を行い、上記の
とおり検出バンドで各タイプに判定、分類した。結果を
下記表３に示す。
【００３５】
【表３】 $: 血清よりＤＮＡを精製後、ＨＢＶのＳ遺伝子を増幅し、ベクター（pUC18)に クローニングし、塩基配列を決定し、gdw1+gdw2 の混在を確認した。
【００３６】実施例２ nested-PCRによるＨＢＶのタイピング ＨＢＶ−ＤＮＡ陽性血清５５サンプルを用いて、本発明
の方法によりゲノタイピングを行った。ＤＮＡの抽出操
作は実施例１と同様に行った。
の方法によりゲノタイピングを行った。ＤＮＡの抽出操
作は実施例１と同様に行った。
【００３７】配列番号３、５をそれぞれ１０ｐｍｏｌ用
いてsemi-nested PCR によりＨＢＶ−ＤＮＡを増幅し
た。条件は、変性９５℃３０秒間、アニール５０℃６０
秒間、伸長７２℃６０秒間で、合計５０μｌとし、１．
２５Ｕ AmpliTaq（商品名、ロッシュ）を使用し、４０
サイクルのＰＣＲを行った。２回目に、配列番号３、４
を用いて、さらに同条件で、１回目の１μｌを用いてＰ
ＣＲを行った。
いてsemi-nested PCR によりＨＢＶ−ＤＮＡを増幅し
た。条件は、変性９５℃３０秒間、アニール５０℃６０
秒間、伸長７２℃６０秒間で、合計５０μｌとし、１．
２５Ｕ AmpliTaq（商品名、ロッシュ）を使用し、４０
サイクルのＰＣＲを行った。２回目に、配列番号３、４
を用いて、さらに同条件で、１回目の１μｌを用いてＰ
ＣＲを行った。
【００３８】ＰＣＲ産物１０μｌをそれぞれ１０ＵのAl
wI（new England Biolabs)、PleI（new England Biolab
s)及びNlaIV （new England Biolabs)で、それぞれ添付
バッファーを用いて、３７℃、３時間反応させ、０．５
μｇ／ｍｌ、エチジウムブロミドの３％アガロースゲル
で電気泳動後、紫外線照射下で写真撮影を行い、検出バ
ンドで各タイプに判定（上記方法１）、分類した。結果
を下記表４に示す。
wI（new England Biolabs)、PleI（new England Biolab
s)及びNlaIV （new England Biolabs)で、それぞれ添付
バッファーを用いて、３７℃、３時間反応させ、０．５
μｇ／ｍｌ、エチジウムブロミドの３％アガロースゲル
で電気泳動後、紫外線照射下で写真撮影を行い、検出バ
ンドで各タイプに判定（上記方法１）、分類した。結果
を下記表４に示す。
【００３９】
【表４】
【００４０】実施例３ 日本人、ＨＢＶ−ＤＮＡ陽性血清サンプル５１例を用い
て、本発明の方法によりゲノタイピングを行った。
て、本発明の方法によりゲノタイピングを行った。
【００４１】１）ＤＮＡの抽出と増幅 実施例１と同じ方法により行った。
【００４２】２）ＤＮＡ増幅 １）で得たＤＮＡを１０μｌの滅菌精製水で溶解し、そ
の２μｌを配列番号８、９のプライマー各１０ｐｍｏｌ
で１回目のＰＣＲを行った。１回目の１μｌを用いて、
配列番号８、１０を用いて、同条件でＰＣＲを行った。
の２μｌを配列番号８、９のプライマー各１０ｐｍｏｌ
で１回目のＰＣＲを行った。１回目の１μｌを用いて、
配列番号８、１０を用いて、同条件でＰＣＲを行った。
【００４３】ＰＣＲ条件は、９５℃３０秒間、５０℃３
０秒間、７２℃３０秒間、４０サイクルで、５０μｌの
反応系で1.25U AmpliTaq DNAポリメラーゼ（商品名、日
本ロシュ）を用い、サーマルサーキュラーＰＪ９６００
（商品名、パーキンエルマー）で増幅を行った。
０秒間、７２℃３０秒間、４０サイクルで、５０μｌの
反応系で1.25U AmpliTaq DNAポリメラーゼ（商品名、日
本ロシュ）を用い、サーマルサーキュラーＰＪ９６００
（商品名、パーキンエルマー）で増幅を行った。
【００４４】ＰＣＲ産物１０μｌをそれぞれ１ＵのAlwI
（new England Biolabs)、PleI（new England Biolab
s)、NlaIV （SIGMA)で、それぞれ添付バッファーを用い
て、３７℃、３時間反応させ、０．５μｇ／ｍｌ、エチ
ジウムブロミドの３％アガロースゲルで電気泳動後、紫
外線照射下で写真撮影を行い、ＤＮＡサイズマーカーと
比較し、上記の通り遺伝子型を判定した、分類した。結
果を下記表５に示す。
（new England Biolabs)、PleI（new England Biolab
s)、NlaIV （SIGMA)で、それぞれ添付バッファーを用い
て、３７℃、３時間反応させ、０．５μｇ／ｍｌ、エチ
ジウムブロミドの３％アガロースゲルで電気泳動後、紫
外線照射下で写真撮影を行い、ＤＮＡサイズマーカーと
比較し、上記の通り遺伝子型を判定した、分類した。結
果を下記表５に示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】従来不明確であった血清学的分類型（セロ
タイプ）「ａｗ」と「ａｄ」は、ゲノタイプでは計３例
がｇｄｗ２と判定された。
タイプ）「ａｗ」と「ａｄ」は、ゲノタイプでは計３例
がｇｄｗ２と判定された。
【００４７】さらに、臨床症状（Ｂ型慢性肝炎かＨＢＶ
無症候性キャリアー）とゲノタイプとの関係を調べた。
結果を下記表６に示す。
無症候性キャリアー）とゲノタイプとの関係を調べた。
結果を下記表６に示す。
【００４８】
【表６】
【００４９】gdr はgdw2に比べＢ型慢性肝炎になりやす
いと考えられた。
いと考えられた。
【００５０】さらに、セロタイプがａｄｗであるものに
ついて、ゲノタイプと臨床症状の関係を下記表７に示
す。
ついて、ゲノタイプと臨床症状の関係を下記表７に示
す。
【００５１】
【表７】
【００５２】血清学的分類でのａｄｗは、ゲノタイプで
はｇｄｒ、ｇｄｗ１、ｇｄｗ２の３つに分類され、ｇｄ
ｒ＞ｄｇｗ１＞ｇｄｗ２の順に慢性肝炎の率が上昇して
いた。
はｇｄｒ、ｇｄｗ１、ｇｄｗ２の３つに分類され、ｇｄ
ｒ＞ｄｇｗ１＞ｇｄｗ２の順に慢性肝炎の率が上昇して
いた。
【００５３】このように、本発明のＨＢＶタイピングは
肝炎発症の予防、予後予測に有用であることが示され
た。
肝炎発症の予防、予後予測に有用であることが示され
た。
【００５４】実施例４ 実施例２と同じ検体を用いて実験を行った。実施例１と
同様に、配列番号８、９、１０を用いてＨＢＶ遺伝子を
増幅し、NlaIV 、BsrI及びNlaIIIで処理し、上記の通り
型判別を行った。なお、ｇｄｗ１、ｇｄｗ２及びｇｙｗ
以外のものをｇｄｒとした。検出結果は実施例２と同じ
であった。
同様に、配列番号８、９、１０を用いてＨＢＶ遺伝子を
増幅し、NlaIV 、BsrI及びNlaIIIで処理し、上記の通り
型判別を行った。なお、ｇｄｗ１、ｇｄｗ２及びｇｙｗ
以外のものをｇｄｒとした。検出結果は実施例２と同じ
であった。
【００５５】実施例５ 日本人、ＨＢＶ−ＤＮＡ陽性血清２４サンプルを用いて
ゲノタイピングを行った。
ゲノタイピングを行った。
【００５６】１）ＤＮＡの抽出と増幅 実施例１と同じ方法により行った。
【００５７】２）ＤＮＡ増幅 １）で得たＤＮＡを１０μｌの滅菌精製水で溶解し、そ
の２μｌについて、配列番号８、１０のプライマーを用
いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は実施例３と同じであ
った。
の２μｌについて、配列番号８、１０のプライマーを用
いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は実施例３と同じであ
った。
【００５８】３）ＰＣＲ産物の変性 ＰＣＲ産物５０μｌにアルカリ変性液（０．１Ｎ Ｎａ
ＯＨ）を５０μｌ加え、撹拌後、室温で１０分間放置し
た。
ＯＨ）を５０μｌ加え、撹拌後、室温で１０分間放置し
た。
【００５９】４）検出プローブ溶液の作製 各タイプ別に、それぞれを検出するプローブ（配列番号
１１、１３、１５、１７のそれぞれの３’末端をジゴキ
シゲニンで標識）とその競合プローブ（配列番号１２、
１４、１６、１８）をそれぞれ２：１００の割合で混合
し、最終濃度５１ｎｇ／μｌの濃度となるようＨ溶液
（1M NaCl, 0.5 mM Tris-HCl(pH6.8), 5 mM EDTA, 0.1%
Ficoll type 400, 0.1%ポリビニルピロリドン、0.1% B
SAフラクションＶ）、ヒト胎盤より抽出したＤＮＡを最
終濃度２００ｎｇ／μｌ）で調整した。各タイプ検出プ
ローブは、合成の際に３’末端をジゴキシゲニン標識
し、競合プローブは標識しなかった。コンセンサスプロ
ーブは、３’末端をジゴキシゲニン標識し、最終濃度１
０ｎｇ／μｌになるよう同様にＨ溶液で調整した。これ
らをそれぞれタイプ及びコンセンサスの検出プローブ溶
液とした。
１１、１３、１５、１７のそれぞれの３’末端をジゴキ
シゲニンで標識）とその競合プローブ（配列番号１２、
１４、１６、１８）をそれぞれ２：１００の割合で混合
し、最終濃度５１ｎｇ／μｌの濃度となるようＨ溶液
（1M NaCl, 0.5 mM Tris-HCl(pH6.8), 5 mM EDTA, 0.1%
Ficoll type 400, 0.1%ポリビニルピロリドン、0.1% B
SAフラクションＶ）、ヒト胎盤より抽出したＤＮＡを最
終濃度２００ｎｇ／μｌ）で調整した。各タイプ検出プ
ローブは、合成の際に３’末端をジゴキシゲニン標識
し、競合プローブは標識しなかった。コンセンサスプロ
ーブは、３’末端をジゴキシゲニン標識し、最終濃度１
０ｎｇ／μｌになるよう同様にＨ溶液で調整した。これ
らをそれぞれタイプ及びコンセンサスの検出プローブ溶
液とした。
【００６０】５）各型及びコンセンサスプレートの検出 ４）で調製した検出プローブ溶液を、それぞれストレプ
トアビジンコーティングマイクロタイタープレート（商
品名、ベーリンガーマンハイム）の別々のウェルに２０
０μｌずつ加えた。撹拌後、３０分間室温で放置した。
トアビジンコーティングマイクロタイタープレート（商
品名、ベーリンガーマンハイム）の別々のウェルに２０
０μｌずつ加えた。撹拌後、３０分間室温で放置した。
【００６１】６）ハイブリダイゼーション それぞれの検出プローブ溶液の入ったウェルに、３）の
変性したＰＣＲ産物を５０μｌずつ加え、シール後、撹
拌し、３０分間、５０℃でインキュベートし、その後、
３７℃にインキュベーターの温度設定を変更し、３時間
インキュベーションした。ウェルをからにし、洗い液
（150 mM NaCl 、15 mM クエン酸ナトリウム、0.3% Twe
en20) ３５０μｌで各ウェルを３回洗った。
変性したＰＣＲ産物を５０μｌずつ加え、シール後、撹
拌し、３０分間、５０℃でインキュベートし、その後、
３７℃にインキュベーターの温度設定を変更し、３時間
インキュベーションした。ウェルをからにし、洗い液
（150 mM NaCl 、15 mM クエン酸ナトリウム、0.3% Twe
en20) ３５０μｌで各ウェルを３回洗った。
【００６２】７）検出 検出には、DIG Detection ELISA(ABTS) （商品名、ベー
リンガーマンハイム）を使用した。発色強度は、プレー
トリーダーで４０５ｎｍ（４９２ｎｍをリファレンスと
した）を測定し、各型に対応するウェルで吸光度０．５
以上をその型陽性とした。結果を下記表８に示す。
リンガーマンハイム）を使用した。発色強度は、プレー
トリーダーで４０５ｎｍ（４９２ｎｍをリファレンスと
した）を測定し、各型に対応するウェルで吸光度０．５
以上をその型陽性とした。結果を下記表８に示す。
【００６３】
【表８】
【００６４】実施例６ 実施例５と同じ検体を用いて、遺伝子型特異的プローブ
による検出を行った。検体からのＤＮＡ抽出は実施例１
と同様に行った。
による検出を行った。検体からのＤＮＡ抽出は実施例１
と同様に行った。
【００６５】抽出したＤＮＡ２μｌに下記ＰＣＲmix を
加え、増幅後、ABI7700 （パーキンエルマー）で検出し
た。ＰＣＲ条件は、９５℃、１２分の後、９４℃、３０
秒、６０℃、３０秒のサイクルを４０回繰返し、最後に
２５℃で３０分間保温を行った。
加え、増幅後、ABI7700 （パーキンエルマー）で検出し
た。ＰＣＲ条件は、９５℃、１２分の後、９４℃、３０
秒、６０℃、３０秒のサイクルを４０回繰返し、最後に
２５℃で３０分間保温を行った。
【００６６】 検出用ＰＣＲmix （総量５０μｌ） 10 x PCRバッファー ５μｌ 2.0 mM dNTP ５μｌ AmpliTaqGold（商品名） 2.5 単位 配列番号８ 30 pmol 配列番号９ 30 pmol
【００６７】ｇｄｒ型プローブとして、配列番号２０
（Ｓ遺伝子上の位置は309-328 ）の５’末端を６−カル
ボキシフルオレッセインで標識し、３’末端を６−カル
ボキシ−N,N,N',N'-テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲ
Ａ）で標識したもの、ｇｙｗ型プローブとして、配列番
号２１（Ｓ遺伝子上の位置は382-401 ）の５’末端を６
−カルボキシ−4,7,2',4',5',7'-ヘキサクロロフルオレ
ッセインで標識し、３’末端をＴＡＭＲＡで標識したも
の、ｇｄｗ２型プローブとして、配列番号２２（Ｓ遺伝
子上の位置は157-176 ）の５’末端を６−カルボキシ−
4,5-ジクロロ-2,7- ジメトキシフルオレッセインで標識
し、３’末端をＴＡＭＲＡで標識したもの、ｇｄｗ１型
プローブとして、配列番号２３（Ｓ遺伝子上の位置は37
3-392 ）の５’末端を６−カルボキシ−4,7,2',7' −テ
トラクロロフルオレッセインで標識し、３’末端をＴＡ
ＭＲＡで標識したものを用い、常法に従ってハイブリダ
イズさせ、標識を検出したところ、実施例５と同様な結
果が得られた。
（Ｓ遺伝子上の位置は309-328 ）の５’末端を６−カル
ボキシフルオレッセインで標識し、３’末端を６−カル
ボキシ−N,N,N',N'-テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲ
Ａ）で標識したもの、ｇｙｗ型プローブとして、配列番
号２１（Ｓ遺伝子上の位置は382-401 ）の５’末端を６
−カルボキシ−4,7,2',4',5',7'-ヘキサクロロフルオレ
ッセインで標識し、３’末端をＴＡＭＲＡで標識したも
の、ｇｄｗ２型プローブとして、配列番号２２（Ｓ遺伝
子上の位置は157-176 ）の５’末端を６−カルボキシ−
4,5-ジクロロ-2,7- ジメトキシフルオレッセインで標識
し、３’末端をＴＡＭＲＡで標識したもの、ｇｄｗ１型
プローブとして、配列番号２３（Ｓ遺伝子上の位置は37
3-392 ）の５’末端を６−カルボキシ−4,7,2',7' −テ
トラクロロフルオレッセインで標識し、３’末端をＴＡ
ＭＲＡで標識したものを用い、常法に従ってハイブリダ
イズさせ、標識を検出したところ、実施例５と同様な結
果が得られた。
【００６８】実施例６ 塩基配列を決定し、Ｓ遺伝子の２２番目の塩基配列がシ
トシンである血清５例と、チミンである血清５例を用い
て実験を行った。
トシンである血清５例と、チミンである血清５例を用い
て実験を行った。
【００６９】血清１００μｌにＳｏｌｎＭ（0.5% SDS,
150 mM NaCl, 50 mM Tris(pH8.0),10 mM EDTA, 100 mg
プロテアーゼＫ）５００μｌを加え、撹拌後、６０℃で
１時間インキュベーションし、フェノール・クロロフォ
ルムと１ｇのブルーエキストラン２０００（商品名、フ
ァルマシア）と混ぜ、５分間放置後、12000 rpm 、２０
分間、４℃で遠心し、沈殿を７５％エタノールで洗い、
さらに乾燥し精製ＤＮＡを得た。これを滅菌蒸留水１０
μｌに溶解し、ＰＣＲに用いた。
150 mM NaCl, 50 mM Tris(pH8.0),10 mM EDTA, 100 mg
プロテアーゼＫ）５００μｌを加え、撹拌後、６０℃で
１時間インキュベーションし、フェノール・クロロフォ
ルムと１ｇのブルーエキストラン２０００（商品名、フ
ァルマシア）と混ぜ、５分間放置後、12000 rpm 、２０
分間、４℃で遠心し、沈殿を７５％エタノールで洗い、
さらに乾燥し精製ＤＮＡを得た。これを滅菌蒸留水１０
μｌに溶解し、ＰＣＲに用いた。
【００７０】感度を上げるため、１回目のＰＣＲでは配
列番号２４と配列番号２６（Ｓ遺伝子上の位置は171-19
4)を用いて行った。上記ＤＮＡ溶液を反応液（10 mM Tr
is-HCl(pH8.3), 1.5 mM MgCl2 、50 mM KCl 800 μＭ d
NTP 、1.25単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼ（商品名、
日本ロシュ）、配列番号２４と２６がそれぞれ１０ｐｍ
ｏｌで２回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、変
性９４℃３０秒間、アニーリング５５℃３０秒間、伸長
７２℃３０秒間であり、３０サイクル行った。
列番号２４と配列番号２６（Ｓ遺伝子上の位置は171-19
4)を用いて行った。上記ＤＮＡ溶液を反応液（10 mM Tr
is-HCl(pH8.3), 1.5 mM MgCl2 、50 mM KCl 800 μＭ d
NTP 、1.25単位のAmpliTaq DNAポリメラーゼ（商品名、
日本ロシュ）、配列番号２４と２６がそれぞれ１０ｐｍ
ｏｌで２回目のＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ条件は、変
性９４℃３０秒間、アニーリング５５℃３０秒間、伸長
７２℃３０秒間であり、３０サイクル行った。
【００７１】ＰＣＲ産物をSCAI又はRSAIで切断し、３％
アガロース電気泳動（トリス−ボレートバッファー、
０．５μＧ／ＭＬ臭化エチジウムを含む）で電気泳動し
た。電気泳動後、紫外線照射下でポラロイド撮影を行っ
た。
アガロース電気泳動（トリス−ボレートバッファー、
０．５μＧ／ＭＬ臭化エチジウムを含む）で電気泳動し
た。電気泳動後、紫外線照射下でポラロイド撮影を行っ
た。
【００７２】図１３に示すように、９３ｂｐのバンドが
確認された５例はｇｄｗ２以外の型であった。６７ｂｐ
が確認された５例はｇｄｗ２型であった。
確認された５例はｇｄｗ２以外の型であった。６７ｂｐ
が確認された５例はｇｄｗ２型であった。
【００７３】ＨＢＶ−ＤＮＡ量の同じｇｄｗ２、ｇｄｒ
血清をヤギ血清で希釈し、gdw2:gdr=1:0、1:1 、1:2 、
1:10の比になるように調製し、上記の実験を行った結
果、図のように、比率に応じてバンドの濃さが変化し
た。従って、混在型は両方のバンドを検出し、比率を予
測できた。
血清をヤギ血清で希釈し、gdw2:gdr=1:0、1:1 、1:2 、
1:10の比になるように調製し、上記の実験を行った結
果、図のように、比率に応じてバンドの濃さが変化し
た。従って、混在型は両方のバンドを検出し、比率を予
測できた。
【００７４】
【発明の効果】本発明により、従来の分類よりも臨床症
状と良く合致する新規な分類のためのＨＢＶの型判別方
法並びにそのためのプライマー及びプローブが提供され
た。本発明の方法によれば、簡便に、臨床症状と良く合
致するようにＨＢＶを分類することができる。
状と良く合致する新規な分類のためのＨＢＶの型判別方
法並びにそのためのプライマー及びプローブが提供され
た。本発明の方法によれば、簡便に、臨床症状と良く合
致するようにＨＢＶを分類することができる。
【００７５】
配列番号：１ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GVGTCACMWT WTTCYTGGGA ACAMGRKMTA C 31
【００７６】配列番号：２ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGGTCACCAT ATTCTTGGGA ACAAGAGCTA C 31
【００７７】配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGGTCACCAT ATTCTTGGGA AC 22
【００７８】配列番号：４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAAAGCTTTG ACATACTTTC C 21
【００７９】配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAAAGCTTTG ACATACTTTC CAATC 25
【００８０】配列番号：６ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAAWKCKYTG ACANACTTTC CAATCAATAG G 31
【００８１】配列番号：７ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAAAGCTTTG ACATACTTTC CAATCAATAG G 31
【００８２】配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TAGACTCGTG GTGGACTTCT C 21
【００８３】配列番号：９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAAATGGCAC TAGTAAACTG 20
【００８４】配列番号：１０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CAAATGGCAC TAGTAAACTG AGC 23
【００８５】配列番号：１１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCCCAAATCT CCAGTCA 17
【００８６】配列番号：１２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCCCCAACCT CCAATCA 17
【００８７】配列番号：１３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CTGCTCAAGG CAACTCTA 18
【００８８】配列番号：１４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CTGCTCAAGG AACCTCTA 18
【００８９】配列番号：１５ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCTATGTATC CCTCCTGTT 19
【００９０】配列番号：１６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCTATGTTTC CCTCYTGTT 19
【００９１】配列番号：１７ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTTGTCCTCT ACTTCCAIGA AC 22
【００９２】配列番号：１８ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTTGTCCTCT AATTCCAIGA TC 22
【００９３】配列番号：１９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CATCCTGCTG CTATGCCTCA T 21
【００９４】配列番号：２０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GTTGCCCGTT TGTCCTCTAC 20
【００９５】配列番号：２１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GCTCAAGGAA CCTCTATGTA 20
【００９６】配列番号：２２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 TCGCAGTCCC AAATCTCCAG 20
【００９７】配列番号：２３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 ACGACTCCTG CTCAAGGCAA 20
【００９８】配列番号：２４ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCGAACATGG AGAACATCGC ATCAGTA 27
【００９９】配列番号：２５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CGGTATTGTG AGGATTTTTG TCAAC 25
【０１００】配列番号：２６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 AGGACAAACG GGCAACATAC CTTG 24
【図１】ＨＢＶのＳ遺伝子の１４ｎｔ〜２５ｎｔの領域
の各型の塩基配列を示す図である。
の各型の塩基配列を示す図である。
【図２】ＨＢＶのＳ遺伝子の１６３ｎｔ〜１８２ｎｔの
領域の各型の塩基配列を示す図である。
領域の各型の塩基配列を示す図である。
【図３】ＨＢＶのＳ遺伝子の３８１ｎｔ〜３９４ｎｔの
領域の各型の塩基配列を示す図である。
領域の各型の塩基配列を示す図である。
【図４】ＨＢＶのＳ遺伝子の３９１ｎｔ〜４１０ｎｔの
領域の各型の塩基配列を示す図である。
領域の各型の塩基配列を示す図である。
【図５】ＨＢＶのＳ遺伝子の３１８ｎｔ〜３３８ｎｔの
領域の各型の塩基配列を示す図である。
領域の各型の塩基配列を示す図である。
【図６】従来の分類法によるＨＢＶの系統分類と本発明
の方法による分類系との関係を示す図である。
の方法による分類系との関係を示す図である。
【図７】本発明の一実施例であるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に
おいて、ｇｄｗ２型を制限酵素PleIで消化した場合に得
られる電気泳動パターンの模式図である。
おいて、ｇｄｗ２型を制限酵素PleIで消化した場合に得
られる電気泳動パターンの模式図である。
【図８】本発明の一実施例であるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に
おいて、ｇｙｗ型又はｇｄｒ型を制限酵素AlwIで消化し
た場合に得られる電気泳動パターンの模式図である。
おいて、ｇｙｗ型又はｇｄｒ型を制限酵素AlwIで消化し
た場合に得られる電気泳動パターンの模式図である。
【図９】本発明の一実施例であるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法に
おいて、ｇｄｗ１型を制限酵素NlaIV で消化した場合に
得られる電気泳動パターンの模式図である。
おいて、ｇｄｗ１型を制限酵素NlaIV で消化した場合に
得られる電気泳動パターンの模式図である。
【図１０】本発明の一実施例であるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
において、ｇｄｒ型を制限酵素AlwIで消化した場合に得
られる電気泳動パターンの模式図である。
において、ｇｄｒ型を制限酵素AlwIで消化した場合に得
られる電気泳動パターンの模式図である。
【図１１】本発明の一実施例であるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
において、ｇｄｗ１型を制限酵素AlwIで消化した場合に
得られる電気泳動パターンの模式図である。
において、ｇｄｗ１型を制限酵素AlwIで消化した場合に
得られる電気泳動パターンの模式図である。
【図１２】本発明の一実施例であるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法
において、ｇｄｗ２型を制限酵素BsrIで消化した場合に
得られる電気泳動パターンの模式図である。
において、ｇｄｗ２型を制限酵素BsrIで消化した場合に
得られる電気泳動パターンの模式図である。
【図１３】本発明の一実施例である、ミスマッチプライ
マーを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法において、各型を制限
酵素ScaI又はRsaIで消化した場合に得られる電気泳動パ
ターンの模式図である。
マーを用いたＰＣＲ−ＲＦＬＰ法において、各型を制限
酵素ScaI又はRsaIで消化した場合に得られる電気泳動パ
ターンの模式図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 溝上 雅史 愛知県知立市長田３ー７ー７
Claims (32)
- 【請求項１】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の２２ｎ
ｔがシトシンであるか否かを調べることにより、Ｂ型肝
炎ウイルスのｇｄｗ２型をこれ以外の型から識別するこ
とから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法。 - 【請求項２】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の１６６
ｎｔがアデニンであるか否かを調べることにより、Ｂ型
肝炎ウイルスのｇｄｗ２型をこれ以外の型から識別する
ことから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法。 - 【請求項３】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の１６９
ｎｔがチミンであるか否かを調べることにより、Ｂ型肝
炎ウイルスのｇｄｗ２型をこれ以外の型から識別するこ
とから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法。 - 【請求項４】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の１７６
ｎｔがグアニンであるか否かを調べることにより、Ｂ型
肝炎ウイルスのｇｄｗ２型をこれ以外の型から識別する
ことから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法。 - 【請求項５】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３９０
ｎｔがシトシンであるか否かを調べることにより、Ｂ型
肝炎ウイルスのｇｄｗ１型をこれ以外の型から識別する
ことから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法。 - 【請求項６】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３９２
ｎｔがアデニンであるか否かを調べることにより、Ｂ型
肝炎ウイルスのｇｄｗ１型をこれ以外の型から識別する
ことから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法。 - 【請求項７】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の４０１
ｎｔがアデニンであるか否かを調べることにより、Ｂ型
肝炎ウイルスのｇｙｗ型をこれ以外の型から識別するこ
とから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法。 - 【請求項８】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３２８
ｎｔがシトシンであるか否かを調べることにより、Ｂ型
肝炎ウイルスのｇｄｒ型をこれ以外の型から識別するこ
とから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法。 - 【請求項９】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３３７
ｎｔがアデニンであるか否かを調べることにより、Ｂ型
肝炎ウイルスのｇｄｒ型をこれ以外の型から識別するこ
とから成る、Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法。 - 【請求項１０】 制限酵素断片長多型を調べることから
成る請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の２０
ｎｔ〜２４ｎｔを含む領域を増幅し、増幅産物を制限酵
素PleIで消化し、消化物を電気泳動により分離してその
電気泳動パターンからｇｄｗ２型か否かを判定する請求
項１記載の方法。 - 【請求項１２】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の１７
３ｎｔ〜１７７ｎｔを含む領域を増幅し、増幅産物を制
限酵素BsrIで消化し、消化物を電気泳動により分離して
その電気泳動パターンからｇｄｗ２型か否かを判定する
請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３８
８ｎｔ〜３９３ｎｔを含む領域を増幅し、増幅産物を制
限酵素NlaIV で消化し、消化物を電気泳動により分離し
てその電気泳動パターンからｇｄｗ１型か否かを判定す
る請求項１記載の方法。 - 【請求項１４】 Ｂ型肝炎ウイルスのＳ遺伝子中の３３
４ｎｔ〜３３８ｎｔを含む領域を増幅し、増幅産物を制
限酵素AlwIで消化し、消化物を電気泳動により分離して
その電気泳動パターンからｇｄｒ型か否かを判定する請
求項１記載の方法。 - 【請求項１５】 請求項１ないし９のいずれか１項に記
載された、その型であるか否かを判定すべき型に特異的
な塩基を含む領域と相補的な塩基配列を有し、かつ標識
されたオリゴヌクレオチドプローブを検体遺伝子とハイ
ブリダイズさせ、前記標識されたオリゴヌクレオチドプ
ローブがハイブリダイズするか否かを調べることから成
る、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項１６】 請求項１ないし９のいずれか１項に記
載された、その型であるか否かを判定すべき型に特異的
な塩基を含む領域と相補的な塩基配列を有し、かつ標識
されたオリゴヌクレオチドプローブと、判定すべき型以
外の型の当該領域と相補的な塩基配列を有し、かつ標識
されていない競合オリゴヌクレオチドとを競合的に検体
遺伝子とハイブリダイズさせ、前記標識されたオリゴヌ
クレオチドプローブがハイブリダイズするか否かを調べ
ることから成る、請求項１ないし９のいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項１７】 前記検体遺伝子は、増幅されたもので
ある請求項１５又は１６記載の方法。 - 【請求項１８】 配列表の配列番号１ないし１０のいず
れかに示される塩基配列を有し、請求項１１ないし１４
のいずれか１項に記載の方法における増幅用プライマー
として用いられるオリゴヌクレオチド。 - 【請求項１９】 配列表の配列番号１１に示される塩基
配列を有し、請求項１６記載の方法によりｇｄｗ２型か
否かの判定に用いられる、オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 - 【請求項２０】 配列表の配列番号１２に示される塩基
配列を有し、請求項１６記載の方法によりｇｄｗ２型か
否かの判定に用いられる、競合オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２１】 配列表の配列番号１３に示される塩基
配列を有し、請求項１６記載の方法によりｇｄｗ１型か
否かの判定に用いられる、オリゴヌクレオチドプロー
ブ。 - 【請求項２２】 配列表の配列番号１４に示される塩基
配列を有し、請求項１６記載の方法によりｇｄｗ１型か
否かの判定に用いられる、競合オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２３】 配列表の配列番号１５に示される塩基
配列を有し、請求項１６記載の方法によりｇｙｗ型か否
かの判定に用いられる、オリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項２４】 配列表の配列番号１６に示される塩基
配列を有し、請求項１６記載の方法によりｇｙｗ型か否
かの判定に用いられる、競合オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２５】 配列表の配列番号１７に示される塩基
配列を有し、請求項１６記載の方法によりｇｄｒ型か否
かの判定に用いられる、オリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項２６】 配列表の配列番号１８に示される塩基
配列を有し、請求項１６記載の方法によりｇｄｒ型か否
かの判定に用いられる、競合オリゴヌクレオチド。 - 【請求項２７】 配列表の配列番号２０で示される塩基
配列を有し、請求項１５記載の方法によりｇｄｒ型か否
かの判定に用いられるオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項２８】 配列表の配列番号２１で示される塩基
配列を有し、請求項１５記載の方法によりｇｙｗ型か否
かの判定に用いられるオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項２９】 配列表の配列番号２２で示される塩基
配列を有し、請求項１５記載の方法によりｇｄｗ２型か
否かの判定に用いられるオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項３０】 配列表の配列番号２３で示される塩基
配列を有し、請求項１５記載の方法によりｇｄｗ１型か
否かの判定に用いられるオリゴヌクレオチドプローブ。 - 【請求項３１】 請求項１ないし９のいずれか１項に記
載された、その型であるか否かを判定すべき型に特異的
な部位を含む領域が制限酵素認識領域となるように人為
的にミスマッチを導入したミスマッチプライマーを用い
て検体遺伝子を増幅し、増幅産物を前記制限酵素で消化
し、消化物を電気泳動により分離してその電気泳動パタ
ーンから前記型か否かの判定を行う、請求項１ないし９
のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項３２】 配列表の配列番号２３に示される塩基
配列を有し、請求項３１記載の方法により、Ｂ型肝炎ウ
イルスのＳ遺伝子中の２２ｎｔがシトシンであるか否か
を調べるために用いられるミスマッチプライマー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9282784A JPH11103898A (ja) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9282784A JPH11103898A (ja) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11103898A true JPH11103898A (ja) | 1999-04-20 |
Family
ID=17657046
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9282784A Pending JPH11103898A (ja) | 1997-09-30 | 1997-09-30 | Ｂ型肝炎ウイルスの型分類方法並びにそのためのプライマー及びプローブ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11103898A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005270031A (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Srl Inc | Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプａのサブタイプの判別方法 |
| CN102181584A (zh) * | 2011-05-09 | 2011-09-14 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种基于基因测序法的乙型肝炎病毒基因分型试剂盒 |
-
1997
- 1997-09-30 JP JP9282784A patent/JPH11103898A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005270031A (ja) * | 2004-03-25 | 2005-10-06 | Srl Inc | Ｂ型肝炎ウイルスのジェノタイプａのサブタイプの判別方法 |
| CN102181584A (zh) * | 2011-05-09 | 2011-09-14 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种基于基因测序法的乙型肝炎病毒基因分型试剂盒 |
| CN102181584B (zh) | 2011-05-09 | 2012-12-19 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种基于基因测序法的乙型肝炎病毒基因分型试剂盒 |
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