JPH11113571A

JPH11113571A - オリゴヌクレオチド及びその利用

Info

Publication number: JPH11113571A
Application number: JP9280655A
Authority: JP
Inventors: Kazuhisa Hatakeyama; 和久畠山; Kouichirou Kuwabara; 孔一朗桑原; Masato Terasawa; 真人寺沢; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1997-10-14
Filing date: 1997-10-14
Publication date: 1999-04-27

Abstract

(57)【要約】【課題】オリゴヌクレオチド及びそれを用いるハイブ
リダイゼーション法による核酸の塩基配列解析の精度を
高めた塩基配列解析法を提供する。【解決手段】特異的領域と、この特異的領域の両末端
の少なくとも一方に連結する１または２の非特異的領域
とを有するオリゴヌクレオチドであって、特異的領域
は、標的配列に対して実質的に相補的であり、かつ、標
的配列中のアデニンと塩基対を形成する塩基として、５
−（１−プロピニル）ウラシル若しくはその同効物、及
び／又は、標的配列中のチミン若しくはウラシルと塩基
対を形成する塩基として、２−アミノアデニン若しくは
その同効物を含有する塩基配列を有し、非特異的領域は
少なくとも一つのヌクレオチドからなり、非特異的領域
の各ヌクレオチドは、通常の核酸を構成する塩基のそれ
ぞれと塩基対を形成することができる他の塩基を有する
ことを特徴とするオリゴヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、オリゴヌクレオチ
ド及び核酸のハイブリダイゼーション法に関し、詳しく
は、核酸の塩基配列決定、感染症や遺伝病の診断、ゲノ
ムマッピング等の核酸の塩基配列解析に使用することが
できるハイブリダイゼーション用プローブに好適に利用
できる新規な構造を有するオリゴヌクレオチド、及びそ
れを用いた塩基配列解析法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ハイブリダイゼーションによる核酸の塩
基配列解析は、例えば塩基配列決定、感染症や遺伝病の
診断、ゲノムマッピング等において広く行われている。
また、ＳＢＨ（sequencing by hybridization）［R. Dr
manac et al., Science, 260,1649(1993)］、すなわち
ハイブリッド形成による塩基配列決定法は、高速かつ低
コストな方法として実用化が期待されている。

【０００３】これらの塩基配列解析においては、ハイブ
リダイゼーション（ハイブリッド形成）によって生じた
プローブと標的配列とのハイブリッドの中で、ミスマッ
チが存在するものと、ミスマッチがなく完全に相補的な
ものとを区別する技術が必要である。

【０００４】ハイブリダイゼーション反応は、反応溶液
のイオン強度、プローブ及びサンプルＤＮＡの塩基構
成、反応温度・時間等多くの要因によって支配される複
雑な反応である。オリゴヌクレオチドを用いるＳＢＨに
おいて問題となる点としては、プローブの末端にミスマ
ッチが存在する場合のミスマッチの判別が難しいこと、
ＡＴ−リッチの二重鎖とＧＣ−リッチの二重鎖で安定性
が異なること、ハイブリダイゼーション効率が十分でな
いことなどが挙げられている（Gene, 188, 45-52(199
7)；蛋白質核酸酵素、１９９３年、３８巻、６４７
−６５７頁）。

【０００５】上記の内、プローブの末端付近にミスマッ
チが存在する場合のハイブリダイゼーションと、ミスマ
ッチを含まないハイブリダイゼーションとを正確かつ高
感度に区別する方法として、既に、核酸の標的配列にハ
イブリダイズするべく特定の塩基配列を有する領域の末
端に、イノシン等のユニバーサル塩基を含む領域が結合
されたオリゴヌクレオチドを用いれば、高感度のハイブ
リダイゼーション結果が得られるとともに塩基対のミス
マッチが高感度で検出可能なことが見いだされている
（特開平８−７０９００）。

【０００６】しかしながら、ＡＴ−リッチの二重鎖とＧ
Ｃ−リッチの二重鎖で安定性を一致させる方法について
は、ハイブリダイゼーション条件としてハイブリダイゼ
ーション後の洗浄を低温で長時間行う方法［DNA and Ce
ll Biology, 9, 527(1990)］、あるいは、テトラアルキ
ルアンモニウム塩を用いる方法が提案されているが（Nu
cl. Acids Res., 9, 527-534(1990)）、十分な結果が得
られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ハイ
ブリダイゼーション法による核酸の塩基配列解析の精度
を高めるために、高感度のハイブリダイゼーション結果
が得られるとともに、ＡＴ−リッチの二重鎖とＧＣ−リ
ッチの二重鎖で安定性を一致させ、同一ハイブリダイゼ
ーション条件下でミスマッチを有するハイブリッドを完
全に相補的なハイブリッドと明確に区別し得るオリゴヌ
クレオチド及びハイブリダイゼーション法を提供するこ
とにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、核酸の標的配列に
ハイブリダイズするべく特定の塩基配列を有する領域
に、５−（１−プロピニル）ウラシル、２−アミノアデ
ニン等の、Ａ・Ｔ結合の安定化によりＤＮＡ二重鎖を安
定化させる塩基を含むオリゴヌクレオチドを用いれば、
高感度のハイブリダイゼーション結果が得られるととも
に、ＡＴ−リッチの二重鎖とＧＣ−リッチの二重鎖で安
定性を一致させ、同一ハイブリダイゼーション条件下で
ミスマッチを有するハイブリッドを完全に相補的なハイ
ブリッドと明確に区別し得ることを見いだし、本発明を
完成するに至った。

【０００９】すなわち本発明は、特異的領域と、この特
異的領域の両末端の少なくとも一方に連結する１または
２の非特異的領域とを有するオリゴヌクレオチドであっ
て、特異的領域は、標的配列に対して実質的に相補的で
あり、かつ、標的配列中のアデニンと塩基対を形成する
塩基として、５−（１−プロピニル）ウラシル若しくは
その同効物、及び／又は、標的配列中のチミン若しくは
ウラシルと塩基対を形成する塩基として、２−アミノア
デニン若しくはその同効物を含有する塩基配列を有し、
非特異的領域は少なくとも一つのヌクレオチドからな
り、非特異的領域の各ヌクレオチドは、通常の核酸を構
成する塩基のそれぞれと塩基対を形成することができる
他の塩基を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド
（以下、本発明のオリゴヌクレオチドともいう）を提供
する。

【００１０】特異的領域は、好ましくは、標的配列中の
アデニンと塩基対を形成する塩基として５−（１−プロ
ピニル）ウラシル、及び／又は、標的配列中のチミン若
しくはウラシルと塩基対を形成する塩基として２−アミ
ノアデニンを含有する塩基配列を有する。非特異的領域
は、好ましくは、特異的領域の５’末端及び３’末端に
連結する。

【００１１】また、本発明は、本発明のオリゴヌクレオ
チドをプローブとして用いてハイブリダイゼーションを
行うことを特徴とするハイブリダイゼーション法を提供
する。

【００１２】さらに、本発明は、本発明のオリゴヌクレ
オチドを試料核酸にハイブリダイズさせるステップと、
そのハイブリダイゼーション強度又はハイブリダイゼー
ションの有無により試料核酸中の標的配列の有無を判定
するステップとを含むことを特徴とする核酸の塩基配列
解析法を提供する。

【００１３】本発明によれば、特異的領域において、Ａ
・Ｔ結合を安定化させることによりＤＮＡ二重鎖を安定
化させる塩基を用いることによって、ＡＴ−リッチの二
重鎖とＧＣ−リッチの二重鎖で安定性を一致させること
ができるので、同一ハイブリダイゼーション条件下でミ
スマッチを有するハイブリッドを完全に相補的なハイブ
リッドと明確に区別し得る。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明についてさらに詳細
に説明する。本明細書においていくつかの術語を用いる
が、ここで用いるときそれらの術語は次の意味を有す
る。

【００１５】「標的配列」とは、オリゴヌクレオチドを
ハイブリダイズさせようとする試料核酸中の配列を意味
する。「試料核酸」とは、塩基配列の解析を目的として
本発明のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる核
酸を意味し、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。
「特異的領域」とは、ハイブリダイズしうる試料核酸中
の標的配列と塩基配列の相補性を有し、特異的に標的配
列と二重鎖を形成しうる領域を意味する。「５−（１−
プロピニル）ウラシルの同効物」とは、アデニンと特異
的に塩基対を形成することができ、かつ、アデニンに対
し５−（１−プロピニル）ウラシル（ｐＵ）と同等の結
合力を有する塩基を意味する。「２−アミノアデニンの
同効物」とは、チミン若しくはウラシルと特異的に塩基
対を形成することができ、かつ、チミン若しくはウラシ
ルに対し２−アミノアデニン（ａＡ）と同等の結合力を
有する塩基を意味する。「通常の核酸を構成する塩基」
とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを構成するヌクレオチドに含ま
れる塩基、すなわちＤＮＡにあってはアデニン（Ａ）、
グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）の４種
類の塩基を、ＲＮＡにあってはＡ、Ｇ、Ｃ及びウラシル
（Ｕ）を意味する。「特異的対合を形成する塩基対」と
は、ＡもしくはａＡと、ＴもしくはｐＵもしくはＵとの
間の塩基対、又はＧとＣとの間の塩基対などの特異的領
域において形成される塩基対を意味する。「ハイブリダ
イゼーション法」とは、ハイブリダイゼーションによる
二重鎖の形成を利用して、目的とするＤＮＡの検索や、
ＤＮＡ又はＲＮＡの異同及び相同性を判定する方法を意
味し、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブ
リダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、
プラークハイブリダイゼーションなどを包含するもので
ある。

【００１６】なお、ｐＵのヌクレオシド及びａＡのヌク
レオシドは、それぞれ、下記式（１）及び（２）で示さ
れる。

【００１７】

【化１】

【００１８】本発明のオリゴヌクレオチドは、特異的領
域と、この特異的領域の両末端の少なくとも一方に連結
する１または２の非特異的領域とを有する。本発明のオ
リゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド
であってもよく、またオリゴリボヌクレオチドであって
もよい。

【００１９】特異的領域は、試料核酸中の標的配列に対
して実質的に相補的な特定の塩基配列を有する。「実質
的に相補的」とは、標的配列に対して完全に相補的であ
る場合の他、少なくとも１塩基のミスマッチが存在する
場合を含むことを意味する。特異的領域の長さは、ハイ
ブリダイゼーションにおいてプローブとして機能しうる
長さであれば特に制限されるものでないが、通常６〜５
０、好ましくは６〜２０塩基対程度の長さが適当であ
る。ハイブリダイゼーション領域ＤＮＡの塩基配列もま
た特に制限されるものでなく、塩基配列の解析対象とな
る試料核酸の塩基配列に応じてその配列を適宜決定する
ことができる。

【００２０】特異的領域は、また、標的配列中のアデニ
ンと塩基対を形成する塩基として、ｐＵ若しくはその同
効物、及び／又は、標的配列中のチミン若しくはウラシ
ルと塩基対を形成する塩基として、ａＡ若しくはその同
効物（以下、まとめてＡ・Ｔ結合安定化塩基ともいう）
を含有する塩基配列を有する。

【００２１】塩基対を形成する塩基間の結合力は、公知
の方法によって評価することができる（例えば、Nuclei
c Acids Research, 1989, Vol.17, No.24, p.10373-103
83参照）。従って、ｐＵと同等のアデニンに対する結合
力を有する塩基、及び、ａＡと同等のチミン若しくはウ
ラシルに対する結合力を有する塩基を選択することは当
業者であれば容易である。

【００２２】特異的領域の塩基配列において、標的配列
におけるアデニン又はチミン若しくはウラシルと塩基対
を形成する塩基は、ＡＴ−リッチの二重鎖とＧＣ−リッ
チの二重鎖との間で安定性が一致する効果が得られる限
り、全てをＡ・Ｔ結合安定化塩基とする必要はない。ま
た、Ａ・Ｔ結合安定化塩基は複数種を組み合わせて用い
てもよい。なお、「安定性が一致する」とは、本発明の
オリゴヌクレオチドを用いるハイブリダイゼーションの
条件下で、ＡＴ−リッチの二重鎖とＧＣ−リッチの二重
鎖との間の安定性の違いにより問題が生じない程度に、
これらの二重鎖の安定性が一致することを意味し、厳密
に塩基対を形成する塩基間の結合力を一致させることに
より安定性を一致させる必要があることを意味するもの
ではない。

【００２３】非特異的領域は、通常の核酸を構成する塩
基のそれぞれと塩基対を形成することができる他の塩基
を有する少なくとも一つのヌクレオチドまたはそのオリ
ゴマーからなる。上記のような塩基としては、通常核酸
を構成する塩基のいずれとも同等に結合するものである
ことが好ましく、さらに、その結合力が特異的対合を形
成する塩基対の結合力よりも弱いことがより好ましい。

【００２４】このような塩基として具体的には、ヒポキ
サンチン、５−ニトロインドール、あるいは、３−ニト
ロピロールのようなユニバーサル塩基（Nucleic Acids
Research, Vol.22, No.20, 4039-4043(1994)；Nucleic
Acids Research, Vol.23, No.13, 2361-2366(1995)）を
例示することができる。また、上記ヌクレオチドの具体
例を、対応するヌクレオシドとして挙げれば、ヒポキサ
ンチンを塩基として有するデオキシリボヌクレオシドで
ある下記式（３）のデオキシイノシン、あるいは、下記
式（４）の５−ニトロインドールを塩基として有するデ
オキシリボヌクレオシド、あるいは、下記式（５）の３
−ニトロピロールを塩基として有するデオキシリボヌク
レオシドが挙げられる。

【００２５】

【化２】

【００２６】非特異的領域を構成するヌクレオチドまた
はそのオリゴマーの数は、特に制限されるものでない
が、通常少なくとも一つ、好ましくは２〜２０、より好
ましくは２〜８とすることができる。

【００２７】非特異的領域が特異的領域に連結する位置
もまた特に制限がなく、特異的領域の５’末端、３’末
端のいずれでもよい。さらに特異的領域の５’末端及び
３’末端の両方に非特異的領域が連結されていてもよ
い。これらの中では後者が好ましい。

【００２８】本発明のオリゴヌクレオチドの合成法につ
いては特に限定されるものではなく、例えば、β−シア
ノエチルホスホアミダイト法［Nucleic Acids Res., 1
2, 4539(1984)］、リン酸トリエステル法［Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 81, 5956(1984)］、ホスホン酸エス
テル法［Nucleic Acids Res., 14, 5399(1986)］が挙げ
られる。特異的領域と非特異的領域との連結は、それぞ
れ別個に合成した後に行ってもよく、特異的領域を合成
した後に非特異的領域を１ヌクレオチドずつ順次付加す
ることにより行ってもよい。また、特異的領域と非特異
的領域を同時に合成してもよい。

【００２９】本発明のオリゴヌクレオチドは、ハイブリ
ダイゼーション用のプローブとして利用する場合には、
不溶性担体に固定化された形態で使用してもよい。不溶
性担体としては、ニトロセルロース、またはナイロンか
らなるフィルター、ガラス板、多孔質ガラス、シリカゲ
ル、ラテックスなどが挙げられる。これらの不溶性担体
に本発明のオリゴヌクレオチドを固定化する方法は、特
に限定されるものではなく、例えば、アミノ修飾したオ
リゴヌクレオチドを用いる場合には、表面に高密度のカ
ルボキシル基を有するナイロンフィルター上にカルボキ
シル基を水溶性カルボジイミドによって活性化し、アミ
ド結合させる手法［J. Org. Chem., 26,2525(1961)］
や、ビオチン修飾したオリゴヌクレオチドの場合にはア
ビジンを表面にコーティングした担体にビオチンーアビ
ジン反応で結合させる方法［Biochemistry, 11, 2291(1
972)］、アミノ修飾したオリゴヌクレオチドをトレシル
基を導入したシリカゲルに固定化する方法［Analytical
Chemistry Symposium Series, 9, 203(1981)］が挙げ
られる。また、フィルター上で固定化されたオリゴヌク
レオチドを作製する方法として、フォトリソグラフィー
を応用した手法によって固相上で多種類のＤＮＡを同時
に合成する方法［Science, 251, 767(1991)］やシール
されたガラス板上にＤＮＡ合成試薬を接触させることに
よる合成法［Nucleic Acids Res., 22, 1368(1994)］等
も使用することができる。

【００３０】上記で詳述した本発明のオリゴヌクレオチ
ドは、ハイブリダイゼーション法、特に核酸の塩基配列
解析に利用することができる。すなわち、本発明のハイ
ブリダイゼーション法は、本発明のオリゴヌクレオチド
をプローブとして用いてハイブリダイゼーションを行う
ことを特徴とする。また、本発明の核酸の塩基配列解析
法は、本発明のオリゴヌクレオチドを試料核酸にハイブ
リダイズさせるステップと、そのハイブリダイゼーショ
ン強度またはハイブリダイゼーションの有無により、前
記試料核酸中における前記オリゴヌクレオチド中の特異
的領域の塩基配列と相補的な配列を有する標的配列の有
無を判定するステップとを含む。

【００３１】本発明の方法により、ハイブリダイゼーシ
ョン感度を上昇させることが可能となるとともに、完全
に相補的なハイブリッドとミスマッチを有するハイブリ
ッド、特に従来法で区別が困難であった末端ミスマッチ
が区別し易くなり、それによってハイブリダイゼーショ
ン法によるＤＮＡ塩基配列解析が容易になる。ＡＴ−リ
ッチの二重鎖と、ＧＣ−リッチの二重鎖で安定性を一致
させ、同一ハイブリダイゼーション条件下でミスマッチ
を有するハイブリッドを完全に相補的なハイブリッドと
明確に区別し得るオリゴヌクレオチド及びハイブリダイ
ゼーション法並びにハイブリダイゼーション法による塩
基配列解析法を提供することが可能となる。

【００３２】次に、本発明のオリゴヌクレオチドを用い
たハイブリッドにおいて、ＡＴ−リッチの二重鎖と、Ｇ
Ｃ−リッチの二重鎖で安定性を一致させ、同一ハイブリ
ダイゼーション条件下でミスマッチを有するハイブリッ
ドを完全に相補的なハイブリッドと、如何にして正確か
つ高感度に区別することができるかを説明する。図１
に、プローブＤＮＡと試料核酸ＤＮＡのハイブリダイゼ
ーションの模式図を示す。上段は、通常のＴ、Ａ、Ｇ、
Ｃの４塩基からなるプローブＤＮＡを用いた場合の、ハ
イブリダイゼーション状態であり、下段は、Ｔ、Ａの代
わりに、ｐＵ、ａＡ塩基を導入したプローブＤＮＡを用
いた場合のハイブリダイゼーション状態である。図に示
すとおり、ｐＵ、ａＡの導入によりＴ：Ａの結合を強化
することによって、ＧＣ含量の高低に関わらず、均等な
結合力を持ったハイブリッドが形成可能なことが判る。
特に、ｐＵ塩基はＲＮＡに対する二重鎖形成を安定化さ
せることが知られていたが（Tetrahedron Letters, 33,
5307-5310(1992)）、今回、本発明においてＤＮＡに対
して二重鎖形成を安定化することが明らかとなった。

【００３３】さらに、本発明のオリゴヌクレオチドの末
端にヒポキサンチン等のユニバーサル塩基を導入するこ
とにより、ミスマッチが存在する場合のハイブリッド
と、ミスマッチを含まないハイブリッドとを、正確かつ
高感度に区別する方法について説明する。図２は、通常
のオリゴヌクレオチドとこのオリゴヌクレオチドにほぼ
相補的であるがミスマッチを含む試料核酸とのハイブリ
ッドを示す模式図である。一般的に、ミスマッチがハイ
ブリッドの中央部に存在する場合にはハイブリッドの安
定性への大きな障害となるが、ハイブリッドの末端付近
にある場合には、中央部に存在する場合に比べて障害は
小さい。一方、上記オリゴヌクレオチドと同一の配列の
特異的領域を有する本発明のオリゴヌクレオチドと上記
試料核酸とのハイブリッドを模式的に図３に示す。図に
おいてＮはヒポキサンチン、あるいは、５−ニトロイン
ドール等のユニバーサル塩基を表す。この図に示される
ように、ユニバーサル塩基はいずれのヌクレオチドとも
塩基対を形成することができるので、非特異的領域の分
だけハイブリッドの長さは延長される。すなわち、通常
のオリゴヌクレオチドではハイブリッドの末端に存在し
ていたミスマッチは、本発明のオリゴヌクレオチドでは
ハイブリッドの中央部に位置することとなる。また、ハ
イブリダイゼーション強度も高くなる。したがって、ミ
スマッチを含まないハイブリダイゼーションとミスマッ
チを含むハイブリダイゼーションを区別することが容易
になる。非特異的領域が特異的領域の５’末端に連結さ
れていれば、特異的領域の５’末端側のミスマッチを検
出しやすくなり、非特異的領域が特異的領域の３’末端
に連結されていれば、特異的領域の３’末端側のミスマ
ッチを検出しやすくなる。さらに、非特異的領域が特異
的領域の５’末端及び３’末端の両方に連結されていれ
ば、特異的領域の５’末端側及び３’末端側のミスマッ
チの両方を検出することが容易となる。

【００３４】本発明のオリゴヌクレオチドをプローブと
して用いるハイブリダイゼーション及び本発明のオリゴ
ヌクレオチドを試料核酸にハイブリダイズさせるステッ
プの条件は、特に限定されるものではなく、試料核酸の
種類や配列、及びオリゴヌクレオチドの配列によって至
適な条件は変化し得る。例えば、比較的短鎖のオリゴヌ
クレオチドを用いた場合は、ハイブリダイゼーション温
度を低温にするなど条件を緩く設定することが望まし
い。またハイブリダイゼーション溶液中に界面活性剤、
例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium Dodecylsulf
ate）、Ｎ-ラウロイルサルコシン酸ナトリウム（Sodium
N-Lauroylsarcosinate）等を添加する方法もハイブリ
ダイゼーション感度の向上に効果的である（特開平８−
７０９００実施例Ｃ参照）。さらに、本発明によればＧ
Ｃ含量の高低に関わらず均等な安定性を持つハイブリッ
ドが形成可能ではあるが、ＤＮＡ塩基配列中にＧＣ残基
が多い場合は、ＡＴ残基が多い場合に比してハイブリッ
ドの安定性は強まるという現象を相殺するためにテトラ
メチルアンモニウムクロライド等のテトラアルキルアン
モニウム塩を用いる方法［Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 82, 1585(1985)］を併用してもよい。

【００３５】ハイブリダイゼーション強度またはハイブ
リダイゼーションの有無により、前記試料核酸中におけ
る前記オリゴヌクレオチド中の特異的領域の塩基配列と
相補的な配列を有する標的配列の有無を判定するステッ
プは、従来の方法と同様にして行うことができる。

【００３６】核酸の塩基配列の解析をハイブリダイゼー
ションによって行う場合、試料核酸または本発明のオリ
ゴヌクレオチドのいずれかが標識されていることが好ま
しい。標識化の方法は特に限定されるものではなく、例
えば、ラジオアイソトープや蛍光色素を用いる手法等を
挙げることができる。ハイブリダイゼーションの結果
は、各種標識法に即した方法によって測定することがで
きる。

【００３７】本発明の塩基配列解析の応用例としては、
ハイブリダイゼーション法を用いたＤＮＡ塩基配列の決
定［Genomics, 13, 1378(1992)］や感染症及び遺伝的疾
患の診等、巨大ゲノムＤＮＡのマッピング等に応用可能
である。感染症の診断法としては、例えば、被験者の血
液等よりＤＮＡを抽出し、そのＤＮＡに対して各種病原
体固有の配列から本発明の方法によりＤＮＡプローブを
作製し、ハイブリダイゼーション反応を行い、病原体の
存在を検出する方法が挙げられる。遺伝的疾患の診断法
としては、遺伝病の原因遺伝子に特異的な配列をもとに
本発明の方法によりオリゴヌクレオチドを作製し、被験
者より得た染色体ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを
行い、その遺伝子中の変異の有無を検出する。巨大ゲノ
ムＤＮＡのマッピングはゲノムＤＮＡ解析プロジェクト
等には必須の技術であるが、ゲノムバンクに対して本発
明の方法で作製した多数のＤＮＡプローブとハイブリダ
イゼーションを行うことで各クローンのゲノム上での配
置が決定できる［第１６回日本分子生物学会年会講演
要旨集１３３４（１９９３）］。

【００３８】以下に、実施例を挙げて本発明をさらに具
体的に説明するが、これらの実施例により本発明は何等
限定されるものではない。

【００３９】

【実施例】５−（１−プロピニル）ウラシル、あるい
は、２−アミノアデニンを含むＤＮＡプローブを用いた
ミスマッチの判別（Ａ）オリゴヌクレオチドの合成パーセプティブ・バイオシステムズ（Perseptive Biosy
stems）社製のＤＮＡ合成機（装置名 Expedite 8909）
を用いて、表１に示す配列を有する本発明のオリゴヌク
レオチド、比較対照用オリゴヌクレオチド、及び試料Ｄ
ＮＡを合成した。固定化用オリゴヌクレオチドの5'-末
端は5'-アミノ修飾C6（グレンリサーチ社製）で修飾し
た。尚、以下のオリゴヌクレオチドNo.は配列表の配列
番号に相当する。

【００４０】

【表１】表１ ──────────────────────────────────── オリコ゛ヌクレオチト゛ No. ヌクレオチド配列備考 ──────────────────────────────────── (1)（比較例1-2） 5'-XIIIITAACTCGCCIIII-3' 完全マッチ (2)（比較例1-2） 5'-XIIIIGAACTCGCCIIII-3' 末端ミスマッチ (3)（比較例1-3） 5'-XIIIITAACGCGCCIIII-3' 中間ミスマッチ (4)（比較例2-1） 5'-XIIIICGCTCGGCCIIII-3' GCリッチ、完全マッチ (5)（比較例2-2） 5'-XIIIIGGCTCGGCCIIII-3' GCリッチ、末端ミスマッチ (6)（比較例2-3） 5'-XIIIICGCTGGGCCIIII-3' GCリッチ、中間ミスマッチ (7)（比較例3-1） 5'-XIIIITTTTTTTCTIIII-3' Tリッチ、完全マッチ (8)（比較例3-2） 5'-XIIIIGTTTTTTCTIIII-3' Tリッチ、末端ミスマッチ (9)（比較例3-3） 5'-XIIIITTTTGTTCTIIII-3' Tリッチ、中間ミスマッチ (10)（比較例4-1） 5'-XIIIIAAACAAAAAIIII-3' Aリッチ、完全マッチ (11)（比較例4-2） 5'-XIIIIGAACAAAAAIIII-3' Aリッチ、末端ミスマッチ (12)（比較例4-3） 5'-XIIIIAAAGAAAAAIIII-3' Aリッチ、中間ミスマッチ (13)（実施例1-1） 5'-XIIIIpUpUpUpUpUpUpUCpUIIII-3' pU導入、完全マッチ (14)（実施例1-2） 5'-XIIIIGpUpUpUpUpUpUCpUIIII-3' pU導入、末端ミスマッチ (15)（実施例1-3） 5'-XIIIIpUpUpUpUGpUpUCpUIIII-3' pU導入、中間ミスマッチ (16)（実施例2-1） 5'-IIIIaAaAaACaAaAaAaAaAIIIIZ-3' aA導入、完全マッチ (17)（実施例2-2） 5'-IIIIGaAaACaAaAaAaAaAIIIIZ-3' aA導入、末端ミスマッチ (18)（実施例2-3） 5'-IIIIaAaAaAGaAaAaAaAaAIIIIZ-3' aA導入、中間ミスマッチ (19)（試料DNA1） 5'-CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT 比較例1用 GATCCCCCAT GTTGTGCAAA-3' (20)（試料DNA2） 5'-AATAAACCAG CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG 比較例2用 CAGAAGTGGT CCTGCAACTT-3' (21)（試料DNA3） 5'-GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT 比較例3、4および ACGCGCAGAA AAAAAGGATC-3' 実施例1、2用 ──────────────────────────────────── 上記配列中、Xは5'-アミノ修飾C6、Zは3'-アミノ修飾C
7、Iはデオキシイノシン、pUは５−（１−プロピニル）
ウラシルのデオキシリボヌクレオシド、aAは２−アミノ
アデニンのデオキシリボヌクレオシドを示す。

【００４１】上記オリゴヌクレオチド及び試料ＤＮＡの
合成は標準のプロトコール通りに行い、５’末端の保護
基であるトリチル基は除かないサイクルにて合成を終了
した。上記（１３）の試料ＤＮＡをPoros Oligo R3（Pe
rSeptive Biosystems社製）を用いて精製を行った。上
記（１）〜（２１）のオリゴヌクレオチド及び試料ＤＮ
Ａを濃縮乾固した後、（１）〜（１８）については０．
５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．４）に、（１
９）〜（２１）についてはＴＥ緩衝液に懸濁し、２６０
ｎｍの吸光度測定により定量し、１ｎｍｏｌ／μｌに調
整した。

【００４２】（Ｂ）オリゴヌクレオチドの固定化オリゴヌクレオチドの固定化は、表面に高密度の陰イオ
ン性カルボキシル基を有するナイロン膜にアミノ修飾オ
リゴヌクレオチドのアミノ基をアミド結合させることに
より、以下の通り行った。

【００４３】バイオダインＣ（商標；ポール社製）膜を
０．１ＮＨＣｌによりすすぎ、酸性化した後、２０％
ＥＤＣ（1-エチル-3-ジメチルアミノプロピルカルボジ
イミド塩酸塩）に室温で１５〜３０分間浸した。脱イオ
ン水及び０．５Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
４）で軽くすすいだ後、ドットブロット装置（Ｂｉｏ−
Ｒａｄ社製）にセットした。０．５Ｍ重炭酸ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８．４）に懸濁されたアミノ修飾オリゴヌ
クレオチドを１５分間室温で膜と反応させた。ＴＢＳ
（Ｔｒｉｓ−緩衝食塩水）／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２
０によりすすいだ膜を、０．１ＮＮａＯＨにて１０分
間処理し、脱イオン水で軽くすすいだ後風乾した。

【００４４】（Ｃ）試料ＤＮＡの標識化試料ＤＮＡの標識化は［γ−³²Ｐ］ＡＴＰによって、
５’末端を放射性ラベルした。反応は、ＤＮＡ５’末端
標識キット（ＭＥＧＡＬＡＢＥＬ^TM；宝酒造（株）製）
により行った。

【００４５】（Ｄ）ハイブリダイゼーション反応前記のオリゴヌクレオチド固定化フィルターと、放射性
標識した試料ＤＮＡとを、３ＭＴＭＡＣ（塩化テトラ
メチルアンモニウム）／７％Ｎ−ラウロイルサルコシ
ン酸ナトリウム／５０ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ８．０
／２ｍＭＥＤＴＡ緩衝液中にて、３５℃で２時間プレ
ハイブリダイゼーションさせた後、３５℃で一晩ハイブ
リダイゼーションさせた。ハイブリダイゼーション反応
後、５×ＳＳＰＥ（０．６ＭＮａＣｌ、４ｍＭリン
酸ナトリウム、０．５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）／
７％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム緩衝液に
て、３５℃、５分間の洗浄を行った後、３ＭＴＭＡＣ
（塩化テトラメチルアンモニウム）／７％Ｎ−ラウロ
イルサルコシン酸ナトリウム／５０ｍＭトリス塩酸塩
ｐＨ８．０／２ｍＭＥＤＴＡにて、３５℃、１時間
の洗浄を行った。風乾した後、オートラジオグラフィー
にて、各ドットの放射線量を測定し、ハイブリダイゼー
ション強度を算出した。

【００４６】その結果を表２に示す。結果は対照とした
比較例1-1のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーシ
ョン強度を１とする相対値で示した。

【００４７】

【表２】表２ ───────────────────────────────── オリコ゛ヌクレオチト゛ No. ヌクレオチド配列ハイフ゛リタ゛イセ゛ーション強度 ───────────────────────────────── (1)（比較例1-1） 5'-XIIIITAACTCGCCIIII-3' 1 (2)（比較例1-2） 5'-XIIIIGAACTCGCCIIII-3' < 0.1 (3)（比較例1-3） 5'-XIIIITAACGCGCCIIII-3' < 0.1 (4)（比較例2-1） 5'-XIIIICGCTCGGCCIIII-3' 1.4 (5)（比較例2-2） 5'-XIIIIGGCTCGGCCIIII-3' < 0.1 (6)（比較例2-3） 5'-XIIIICGCTGGGCCIIII-3' < 0.1 (7)（比較例3-1） 5'-XIIIITTTTTTTCTIIII-3' 0.4 (8)（比較例3-2） 5'-XIIIIGTTTTTTCTIIII-3' 0.2 (9)（比較例3-3） 5'-XIIIITTTTGTTCTIIII-3' 0.2 (10)（比較例4-1） 5'-XIIIIAAACAAAAAIIII-3' 0.2 (11)（比較例4-2） 5'-XIIIIGAACAAAAAIIII-3' 0.2 (12)（比較例4-3） 5'-XIIIIAAAGAAAAAIIII-3' 0.2 (13)（実施例1-1） 5'-XIIIIpUpUpUpUpUpUpUCpUIIII-3' 1.2 (14)（実施例1-2） 5'-XIIIIGpUpUpUpUpUpUCpUIIII-3' 0.2 (15)（実施例1-3） 5'-XIIIIpUpUpUpUGpUpUCpUIIII-3' 0.2 (16)（実施例2-1） 5'-IIIIaAaAaACaAaAaAaAaAIIIIZ-3' 0.6 (17)（実施例2-2） 5'-IIIIGaAaACaAaAaAaAaAIIIIZ-3' < 0.1 (18)（実施例2-3） 5'-IIIIaAaAaAGaAaAaAaAaAIIIIZ-3' < 0.1 ───────────────────────────────── Xは5'-アミノ修飾C6、Zは3'-アミノ修飾C7、Iはデオキ
シイノシン、pUは５−（１−プロピニル）ウラシルのデ
オキシリボヌクレオシド、aAは２−アミノアデニンのデ
オキシリボヌクレオシドを示す。

【００４８】（Ｅ）ミスマッチ判別能の計算ハイブリダイゼーション反応によって得られた結果よ
り、ミスマッチ判別能を算出した。ミスマッチ判別能と
は、下記のＤ値(Discrimination value)を指標とする概
念であり、ミスマッチの区別し易さをさす。

【００４９】

【数１】

【００５０】試料ＤＮＡと完全に相補的な配列のハイブ
リダイゼーション量とは、対照例の配列のハイブリダイ
ゼーション量を指し、ミスマッチを有する配列のハイブ
リダイゼーション量とは、その対照例に対応する比較例
あるいは実施例の配列のハイブリダイゼーション量を指
す。Ｄ値は、対照例の配列に対する比較例あるいは実施
例の配列のハイブリダイゼーション量の比である。即
ち、対照例の配列のＤ値は１であり、比較例及び実施例
に関してはＤ値が高ければその配列が対照例の配列と区
別し易い（ハイブリダイゼーション量が対照例に対して
小さい）ことを表す。

【００５１】表３に各配列のＤ値を示す。このように、
Ｔ残基、あるいは、Ａ残基の代わりに、ｐＵ残基、ある
いは、ａＡ残基を導入することにより、ＧＣ含量の高い
組成をもつオリゴヌクレオチドプローブを用いた場合と
同一のハイブリダイゼーション条件下で、完全マッチの
ハイブリッドとミスマッチハイブリッドの判別が可能と
なることが判る。

【００５２】

【表３】表３ミスマッチ判別能（Ｄ値） ──────────────────────────────────── オリコ゛ヌクレオチト゛ No. ヌクレオチド配列Ｄ値 ──────────────────────────────────── (2)（比較例1-2） 5'-XIIIIGAACTCGCCIIII-3' > 10 (3)（比較例1-3） 5'-XIIIITAACGCGCCIIII-3' > 10 (5)（比較例2-2） 5'-XIIIIGGCTCGGCCIIII-3' > 10 (6)（比較例2-3） 5'-XIIIICGCTGGGCCIIII-3' > 10 (8)（比較例3-2） 5'-XIIIIGTTTTTTCTIIII-3' 2 (9)（比較例3-3） 5'-XIIIITTTTGTTCTIIII-3' 2 (11)（比較例4-2） 5'-XIIIIGAACAAAAAIIII-3' 1 (12)（比較例4-3） 5'-XIIIIAAAGAAAAAIIII-3' 1 (14)（実施例1-2） 5'-XIIIIGpUpUpUpUpUpUCpUIIII-3' 6 (15)（実施例1-3） 5'-XIIIIpUpUpUpUGpUpUCpUIIII-3' 6 (17)（実施例2-2） 5'-IIIIGaAaACaAaAaAaAaAIIIIZ-3' > 6 (18)（実施例2-3） 5'-IIIIaAaAaAGaAaAaAaAaAIIIIZ-3' > 6 ──────────────────────────────────── Xは5'-アミノ修飾C6、Zは3'-アミノ修飾C7、Iはデオキ
シイノシン、pUは５−（１−プロピニル）ウラシルのデ
オキシリボヌクレオシド、aAは２−アミノアデニンのデ
オキシリボヌクレオシドを示す。

【００５３】

【発明の効果】本発明によれば、ハイブリダイゼーショ
ン法による核酸の塩基配列解析の精度を高めるために、
高感度のハイブリダイゼーション結果が得られるととも
に、ＡＴ−リッチの二重鎖とＧＣ−リッチの二重鎖で安
定性を一致させ、同一ハイブリダイゼーション条件下で
ミスマッチを有するハイブリッドを完全に相補的なハイ
ブリッドと明確に区別し得るオリゴヌクレオチド及びハ
イブリダイゼーション法並びにそのハイブリダイゼーシ
ョン法による塩基配列解析法を提供できる。

【００５４】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNTAACTC GCCNNNN 17

【００５５】配列番号：2 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNGAACTC GCCNNNN 17

【００５６】配列番号：3 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNTAACGC GCCNNNN 17

【００５７】配列番号：4 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNCGCTCG GCCNNNN 17

【００５８】配列番号：5 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNGGCTCG GCCNNNN 17

【００５９】配列番号：6 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNCGCTGG GCCNNNN 17

【００６０】配列番号：7 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNTTTTTT TCTNNNN 17

【００６１】配列番号：8 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNGTTTTT TCTNNNN 17

【００６２】配列番号：9 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴ
ヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNTTTTGT TCTNNNN 17

【００６３】配列番号：10 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNAAACAA AAANNNN 17

【００６４】配列番号：11 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNGAACAA AAANNNN 17

【００６５】配列番号：12 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 配列 NNNNAAAGAA AAANNNN 17

【００６６】配列番号：13 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 特徴を表す記号：modified base 存在位置：5..10, 13 他の情報：N=５−（１−プロピニル）ウリジン配列 NNNNNNNNNN NCNNNNN 17

【００６７】配列番号：14 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 特徴を表す記号：modified base 存在位置：6..10, 13 他の情報：N=５−（１−プロピニル）ウリジン配列 NNNNGNNNNN NCNNNNN 17

【００６８】配列番号：15 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 特徴を表す記号：modified base 存在位置：5..8, 10, 11, 13 他の情報：N=５−（１−プロピニル）ウリジン配列 NNNNNNNNGN NCNNNNN 17

【００６９】配列番号：16 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 特徴を表す記号：modified base 存在位置：5..7, 9..13 他の情報：N=５−アミノアデノシン配列 NNNNNNNCNN NNNNNNN 17

【００７０】配列番号：17 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 特徴を表す記号：modified base 存在位置：6, 7, 9..13 他の情報：N=５−アミノアデノシン配列 NNNNGNNCNN NNNNNNN 17

【００７１】配列番号：18 配列の長さ：17 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列の特徴特徴を表す記号：modified base 存在位置：1..4, 14..17 他の情報：N=i 特徴を表す記号：modified base 存在位置：5..7, 9..13 他の情報：N=５−アミノアデノシン配列 NNNNNNNGNN NNNNNNN 17

【００７２】配列番号：19 配列の長さ：50 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT GTTGTGCAAA 50

【００７３】配列番号：20 配列の長さ：50 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 AATAAACCAG CCAGCCGGAA GGGCCGAGCG CAGAAGTGGT CCTGCAACTT 50

【００７４】配列番号：21 配列の長さ：50 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成オリゴヌクレオチド配列 GGTGGTTTTT TTGTTTGCAA GCAGCAGATT ACGCGCAGAA AAAAAGGATC 50

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＵおよびａＡを導入したオリゴヌクレオチ
ドと試料核酸とのハイブリッドを示す模式図。

【図２】通常のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイブ
リッドを示す模式図。

【図３】本発明のオリゴヌクレオチドと核酸とのハイ
ブリッドを示す模式図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央八丁目３番１号三菱化学株式会社筑波研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特異的領域と、この特異的領域の両末端
の少なくとも一方に連結する１または２の非特異的領域
とを有するオリゴヌクレオチドであって、特異的領域
は、標的配列に対して実質的に相補的であり、かつ、標
的配列中のアデニンと塩基対を形成する塩基として、５
−（１−プロピニル）ウラシル若しくはその同効物、及
び／又は、標的配列中のチミン若しくはウラシルと塩基
対を形成する塩基として、２−アミノアデニン若しくは
その同効物を含有する塩基配列を有し、非特異的領域は
少なくとも一つのヌクレオチドからなり、非特異的領域
の各ヌクレオチドは、通常の核酸を構成する塩基のそれ
ぞれと塩基対を形成することができる他の塩基を有する
ことを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項２】特異的領域が、標的配列中のアデニンと
塩基対を形成する塩基として５−（１−プロピニル）ウ
ラシル、及び／又は、標的配列中のチミン若しくはウラ
シルと塩基対を形成する塩基として２−アミノアデニン
を含有する塩基配列を有することを特徴とする請求項１
のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】非特異的領域が、特異的領域の５’末端
及び３’末端に連結していることを特徴とする請求項１
又は２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】請求項１〜３のいずれか一項に記載のオ
リゴヌクレオチドをプローブとして用いてハイブリダイ
ゼーションを行うことを特徴とするハイブリダイゼーシ
ョン法。
【請求項５】請求項１〜３のいずれか一項に記載のオ
リゴヌクレオチドを試料核酸にハイブリダイズさせるス
テップと、そのハイブリダイゼーション強度又はハイブ
リダイゼーションの有無により試料核酸中の標的配列の
有無を判定するステップとを含むことを特徴とする核酸
の塩基配列解析法。