JPH11113592A - Ｄ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】医薬品・化学品・化粧品分野で使用されるD-ア
ミノ酸を対応するアシル化アミノ酸を原料として、Ｄ−
アミノアシラーゼ活性を有する微生物、あるいはその微
生物処理物を作用させることにより、反応液中に、D-ア
ミノ酸を蓄積させる、工業的に実施するのに有利なＤ−
アミノ酸の製造方法を提供する。 【解決手段】新規に見いだされたＤ−アミノアシラーゼ
活性の高い、アースロバクター属、コリネバクテリウム
属、エルビニア属、エセリシア属、フラボバクテリウム
属、ノカルディア属、プロタミノバクター属、ロドコッ
カス属、及びキサントモナス属に属する微生物の培養
液、菌体、菌体処理酵素抽出物をアシルアミノ酸に作用
させ、生成されるＤ−アミノ酸を採取することを特徴と
するＤ−アミノ酸の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は医薬品・化学品・化
粧品分野で使用されるＤ−アミノ酸の製造法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】従来、Ｄ−アミノ酸の製造法として、ア
シル化アミノ酸にＤ−アミノアシラーゼを作用させ、Ｄ
−アミノ酸を得る方法が知られている。Ｄ−アミノアシ
ラーゼの起源としては、シュードモナス（Pseudomona
s）属細菌（特開昭５５−４２５３４）、ストレプトミ
セス（Streptomyces）属細菌（特公昭５３−３６０３
５）また、アルカリゲネス（Alcaligenes）属細菌（特
開昭６４−５４８８）等が知られている。

【０００３】しかしながら、今まで知られているＤ−ア
ミノアシラーゼはいずれも活性が低い欠点を有する。ま
た、活性を高めるために組み換え手法を用い、酵素活性
を増幅して用いる方法も検討されてはいる（Protein Ex
pression and purification第７巻、395頁 1996年）
が、アルカリゲネス属細菌の酵素を大腸菌で発現させる
ものであり、異種遺伝子組み換えによる方法であること
から、汎用性に乏しい。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｄ−アミノ
アシラーゼ活性の高い微生物、あるいはセルフクローニ
ング容易な微生物を検索し、それらのＤ−アミノアシラ
ーゼ活性の高い微生物を用いて工業的に実施するのに有
利なＤ−アミノ酸の製造方法を提供するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の課
題を解決すべくＤ−アミノ酸の製造法について鋭意研究
を重ねた結果、新規に、アースロバクター(Arthrobacte
r )属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、エ
ルビニア（Erwinia）属、エセリシア(Escherichia)属、
フラボバクテリウム(Flavobacterium)属、ノカルディア
(Nocardia)属、プロタミノバクター(Protaminobacter)
属、ロドコッカス(Rhodococcus)属またはキサントモナ
ス(Xanthomonas)属に属する微生物が、Ｄ−アミノアシ
ラーゼ活性を有し、アシルアミノ酸をＤ−アミノ酸に効
率的に変換する能力を有することを見いだし、この知見
に基づいて本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、アシルアミノ酸をＤ
−アミノ酸に変換する能力を有し、アースロバクター(A
rthrobacter)属、コリネバクテリウム（Corynebacteriu
m）属、エルビニア（Erwinia）属、エセリシア（Escher
ichia）属、フラボバクテリウム（Flavobacterium）
属、ノカルディア（Nocardia）属、プロタミノバクター
（Protaminobacter）属、ロドコッカス（Rhodococcus）
属またはキサントモナス（Xanthomonas）属に属する微
生物の培養物、該培養物より分離した微生物菌体もしく
は該微生物菌体の処理物をアシルアミノ酸に作用させ、
生成されるＤ−アミノ酸を採取することを特徴とするＤ
−アミノ酸の製造方法に関するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明において用いられる微生物
は、Ｄ−アミノアシラーゼ活性を有する、すなわちアシ
ルアミノ酸をＤ−アミノ酸に変換する能力を有する、ア
ースロバクター属、コリネバクテリウム属、エルビニア
属、エセリシア属、フラボバクテリウム属、ノカルディ
ア属、プロタミノバクター属、ロドコッカス属、及びキ
サントモナス属に属する微生物であればいずれのもので
もよいが、具体的には、下記に示す微生物を例示するこ
とができる。

【０００８】アースロハ゛クター ハ゜ラフィニス（Arthrobacter paraffineus ） ATCC15590アースロハ゛クター ハ゜ラフィニス（Arthrobacter paraffineus） ATCC15591アースロハ゛クター ハ゜ラフィニス（Arthrobacter paraffineus） ATCC19064アースロハ゛クター ハ゜ラフィニス（Arthrobacter paraffineus） ATCC19065アースロハ゛クター ハイト゛ロカーホ゛ク゛ルタミカス（Arthrobacter hydrocarboglutamicus）ATCC15583コリネハ゛クテリウム アセトアシト゛フィラム（Corynebacterium acetoacidphilum) ATCC373コリネハ゛クテリウム キセロシス（Corynebacterium xerosis) ATCC13870エセリシア コリ（Escherichia coli ） AJ2606(FERM BP-477)エセリシア コリ（Escherichia coli ） ATCC13071エルヒ゛ニア アミロホ゛ア（Erwinia amylovora） IFO12687 フラホ゛ハ゛クテリウム スワネンセ（Flavobacterium sewanense） AJ2476(FERM BP-476)ノカルテ゛ィア アステロイテ゛ス（Nocardia asteroides）ATCC3318フ゜ロタミノハ゛クター アルホ゛フラフ゛ス (Protaminobacter alboflavus) ATCC8458ロト゛コッカス エリスリホ゜ラス (Rhodococcus erythripolis) ATCC11048ロト゛コッカス エスヒ゜ー (Rhodococcus sp.) ATCC15592キサントモナス シトリ (Xanthomonas citri) AJ2785(FERM P-3396) 上記菌株の内、エセリシア コリ（Escherichia coli ） AJ2606
(FERM BP-477)は、国際寄託当局：通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（現、通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所）に昭和４８年４月２５日に寄託
され、昭和５８年４月２５日にブダペスト条約に基づく
国際寄託に移管された受託番号FERM BP-477の菌株であ
り、フラホ゛ハ゛クテリウム スワネンセ（Flavobacterium sewanense）
AJ2476(FERM BP-476)は、同寄託当局に昭和４８年４月
２５日に寄託され、昭和５８年４月２５日にブダペスト
条約に基づく国際寄託に移管された受託番号FERM BP-47
6の菌株であり、キサントモナス シトリ (Xanthomonas citri) AJ
2785(FERM P-3396)は、同寄託当局に昭和５１年１月２
７日に寄託された受託番号FERM P-3396の菌株である。

【０００９】また、当該微生物を親株として人工的に変
異処理、あるいは、組み換えDNA操作を用いることによ
り、Ｌ−アミノアシラーゼ等の夾雑酵素活性を低減、も
しくは失活させた改良株、もしくはＤ−アミノアシラー
ゼ活性を増強した改良株を用いることも可能である。特
に、人工的変異処理により、夾雑酵素であるＬ−アミノ
アシラーゼを失活させた変異株の取得方法は、特開昭62
-126969、または特開昭62-126976に詳細が記載されてお
り、容易に取得することができることから、Ｌ−アミノ
アシラーゼを失活させた変異株を用いることにより、Ｄ
Ｌ体のアシルアミノ酸から光学純度の高いＤ−アミノ酸
製造が可能となる。

【００１０】このような微生物の菌体を得るには、当該
微生物を適当な培地で培養増殖せしめるとよい。そのよ
うな培地には格別の制限はなく、通常の炭素源、窒素
源、無機イオン、更に必要に応じアミノ酸、ビタミン等
の有機栄養源を含む通常の培地でよい。炭素源として
は、グルコース、シュークロース、フラクトース、ガラ
クトース、ラクト−ス等の糖類、これら糖類を含有する
澱粉糖化液、甘藷糖蜜、甜菜糖蜜、ハイテストモラセ
ス、更には酢酸等の有機酸、エタノール等のアルコール
類、グリセリン等も使用される。窒素源としてはアンモ
ニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝
酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば
油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のア
ミノ酸、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキ
ス、ペプトン等のペプチド類等が使用される。無機イオ
ンとしてはリン酸イオン、マグネシウムイオン、カルシ
ウムイオン、鉄イオン、マンガンイオン等が適宜添加さ
れる。また本発明の微生物にアミノ酸等の要求性物質が
ある場合には、その要求物質を添加しなければならな
い。

【００１１】微生物の培養条件にも格別の制限はなく、
例えば、好気的条件下にて、pH５ないし８、温度２５な
いし４０℃の範囲内でpH及び温度を適当に制御しつつ１
２〜４８時間程度培養を行なえばよい。培養液のｐＨ
は、無機あるいは有機の酸、アルカリ性物質、更には尿
素、炭酸カルシウム、アンモニアガスなどによって予め
定められた値に調節すればよい。

【００１２】上記微生物をアシルアミノ酸に作用せしめ
る方法としては、かくして得られる微生物培養物をその
まま用いる方法、微生物培養物から遠心分離等により菌
体を分離し、これをそのままもしくは洗浄した後、緩衝
液、水等に再懸濁したものに、アシルアミノ酸を添加し
反応させる方法等がある。また、微生物菌体の処理物と
しては、菌体破砕物、アセトン処理菌体、凍結乾燥菌
体、あるいは、これらの菌体あるいは菌体処理物をポリ
アクリルアミドゲル法、カラギーナン法、アルギン酸法
等の公知の方法で固定化した菌体を用いることができ
る。更に、微生物菌体処理物としては、菌体抽出物もし
くはこれより公知の方法を組み合わせて精製取得したＤ
−アミノアシラーゼ活性を有する酵素も使用できる。こ
の場合、機械的磨砕菌体、超音波処理破砕菌体あるいは
リゾチーム等で処理して得られた菌体処理物から、Ｄ−
アミノアシラーゼ活性を有する画分を精製して用いれば
良く、その精製法としては、通常の酵素を精製する方
法、すなわち硫安分画、イオン交換クロマト分画、疎水
クロマト分画、アフィニティークロマト分画等を挙げる
ことができる。

【００１３】菌体または菌体処理物の使用量としては、
通常の反応の場合において目的とする効果を発揮する量
（有効量）であればよく、この有効量は当業者であれば
簡単な予備実験により容易に求められるが、例えば、洗
浄湿潤菌体の場合、反応液１リットル当たり１０〜４０
０ｇである。

【００１４】アシルアミノ酸はそのまま、あるいは、水
に溶解し、または反応に影響を与えないような有機溶媒
に溶解したり、界面活性剤等に分散させたりして、反応
始めから一括にあるいは分割して添加して用いても良
い。

【００１５】反応ｐＨはｐＨ３〜９、好ましくはｐＨ５
〜８、反応温度は１０〜６０℃好ましくは２０〜４０℃
の範囲で、１〜１２０時間程度、撹拌下あるいは静置下
で行う。基質の使用濃度は特に制限されないが、１％〜
３０％程度が好ましい。

【００１６】反応終了後、蓄積生成したＤ−アミノ酸
は、反応液から、濃縮晶析、冷却晶析などの晶析方法に
より、晶析分離される。分離した粗Ｄ−アミノ酸は、再
度溶解し、活性炭などで不純物淘汰後、再結精製され
る。

【００１７】以下、実施例にて本発明を詳細に説明す
る。

【実施例】

実施例１：新規Ｄ−アミノアシラーゼ活性する微生物に
よるＤ−フェニルアラニン（D-Phe）の生産 N-アセチル-D-フェニルアラニン（N-Ac-D-Phe）2g/L、
酵母エキスＳ（日本製薬製）10g/L、ポリペプトン（日
本製薬製） 10g/L、KH2PO4 1g/dL、K2HPO4 3g/L、MgSO4
・7H20 0.5g/L、をKOHでpH7.0に調整し、寒天20g/Lを加
えて120℃、15分間殺菌して、調製した平板培地に、あ
らかじめブイヨン寒天培地で30℃にて、24時間培養し
た、表１に示す微生物を接種し、24時間培養した。培養
後、菌体をかき取り、集めた。

【００１８】この菌体を、150mM(31.1mg/L)のN-Ac-D-Ph
eを含む、0.1Mのリン酸緩衝液中(pH7.0)に、湿重量で5%
(w/v)になるように添加し、30℃で42時間反応を行わせ
た。反応液中の生成D-Pheを高速液体クロマトグラフィ
ー(ＨＰＬＣ)で定量し、その結果を表１に示した。比較
例として、公知のＤ−アミノ酸生産菌ストレプトマイセ
ス ツリウス（Streptomyces turius） IFO13418（特開
昭62-12969、または、Agric. Biol. Chem. 44巻 1089
頁、1980)を用いた場合の結果を示したが、今回新規に
見いだされた菌は、いずれも比較例に比べ、D-Phe生産
性が高いことが示された。なお、分析条件は、カラム
nacalaitesque COSMOSIL 5C18 4.6×５０ｍｍ、及び三
菱化成ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＲＳ１０Ｗ（ＤＬＡＡ）４．
６×50mmの直列通液；検出はＵＶ254nm；移動相は、2mM
CuSO4水溶液：メタノール＝85：15；流量、1.0ml/mi
n.；温度、50℃とした。リテンションタイムは、D-Phe
7.5min.、L-Phe 8.8min.である。

【００１９】

【表1】

【００２０】実施例２：各種D-アミノ酸の生産 N-アセチル-D-フェニルアラニン 2g/L、酵母エキスＳ
（日本製薬製）10g/L、ポリペプトン（日本製薬製） 10
g/L、KH2PO4 1g/L、K2HPO4 03g/L、MgSO4・7H200.5g/L、
フマル酸20g/Lを含む培地(pH7.0)を500ml容フラスコに5
0mlいれ、120℃で15分間殺菌した。これにブイヨン寒天
培地で30℃にて、24時間培養した、 アースロバクター
ハイドロカーボグルタミカス ATCC15583を接種
し、24時間培養した。培養後、培養液全量を、同じ培地
2lを張り込み、同様に殺菌された小型発酵槽(5l容）に
移液し、温度30℃、撹拌速度350rpm、通気毎分1リット
ル、培養pH無制御の条件で29時間培養した。培養後、菌
体を遠心分離(10,000Ｇ、15分間)により採取した。

【００２１】菌体（湿重量１ｇ）に9mlの100mMリン酸緩
衝液(pH6.0)を加え、菌体濃厚懸濁液とした。次に各々1
0g/LのN-アセチル-D-アラニン、N-アセチル-D-バリン、
N-アセチル-D-ロイシン、N-アセチル-D-イソロイシン、
N-アセチル-D-トリプトファン、N-アセチル-D-メチオニ
ンを100mMリン酸緩衝液(pH6.0)に溶解した基質液0.5ml
に菌体濃厚懸濁液0.5mlを添加し、30℃、24時間反応を
行った。反応後、反応液中に生成されたD-アミノ酸を実
施例1と同様にHPLCで分析した結果、表２のようにな
り、各アセチルアミノ酸より良好に対応するD-アミノ酸
が得られた。

【００２２】

【表２】

【００２３】実施例３：菌体処理物である、精製酵素に
よるＤ−フェニルアラニンの生産 実施例２と同様に、アースロバクター ハイドロカーボ
グルタミカス ATCC15583を培養し、採取された湿重
量100ｇの菌体ペーストに、20mMリン酸緩衝液を40ml加
え、菌体濃厚懸濁液とした後、ビーズビーター（バイオ
スペック社製、ガラスビーズ直径0.1mmを使用）で5分
間、菌体破砕処理を行った後、20mMリン酸緩衝液(pH7.
0)を加え、全量100mlとした。デカンテーションでガラ
スビーズを除いた菌体破砕液をとり、さらに遠心分離(1
0,000Ｇ、15分間)により未破砕残査を除去した。その
後、得られた遠心分離上清に0.1gのプロタミンを加え、
核酸成分を沈殿除去させた後、これを粗酵素液とした。

【００２４】粗酵素液50mlに氷冷下、硫安を40%飽和に
なるよう添加した。その後、40%硫安飽和20mMリン酸緩
衝液(pH7.0)で平衝化したブチルトヨパール 650M カラ
ム( φ2.5 ×30cm) に通液し、酵素を吸着させた。500m
l の 40%硫安飽和同緩衝液でカラムを洗浄した後、(NH
4)2SO4 飽和度50〜0%のリニアグラジエントで酵素を溶
出させた( 流速70ml/分, 10mlずつ分画) 。活性画分(2
0%〜0%硫安飽和液での溶出画分)200mlを得た。その後、
活性画分を限外濾過膜( 排除分子量MW10,000) を用い
て、10ml に濃縮し、再度20mM リン酸緩衝液 (pH 6.0)
で透析し、精製酵素液とした。

【００２５】20.7g/LのN-アセチル-D,L-フェニルアラニ
ンを100mM リン酸緩衝液(pH6.0)に溶解した基質液 9ml
に精製酵素液 1mlを添加し、30℃で40時間インキュベー
トした。その後、反応液を 100℃ 5分間煮沸することに
により反応を停止させ、実施例１と同じ様に、HPLCで反
応液中のフェニルアラニンの生成量を分析した。その結
果、反応液中に6.4g/LのD-フェニルアラニンが生成して
いた。また、L-フェニルアラニンはほとんど生成しなか
った。

【００２６】

【発明の効果】上記のように、本発明によれば、アシル
アミノ酸から、容易かつ効率的に対応するＤ−アミノ酸
が製造可能となる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｐ 13/22 Ａ Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 13/12 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:06） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:18） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:20） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:06） (72)発明者 横関 健三 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アシルアミノ酸をＤ−アミノ酸に変換する
   能力を有し、アースロバクター(Arthrobacter)属、コリ
   ネバクテリウム（Corynebacterium）属、エルビニア（E
   rwinia）属、エセリシア（Escherichia）属、フラボバ
   クテリウム（Flavobacterium）属、ノカルディア（Noca
   rdia）属、プロタミノバクター（Protaminobacter）
   属、ロドコッカス（Rhodococcus）属またはキサントモ
   ナス（Xanthomonas）属に属する微生物の培養物、該培
   養物より分離した微生物菌体もしくは該微生物菌体の処
   理物をアシルアミノ酸に作用させ、生成されるＤ−アミ
   ノ酸を採取することを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方
   法。