JPH11113596A

JPH11113596A - 蛋白質分解酵素活性の検出方法

Info

Publication number: JPH11113596A
Application number: JP28347297A
Authority: JP
Inventors: Kahori Yoshinari; 河法吏吉成; Yoshitaka Kagimoto; 佳孝鍵本
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1997-10-16
Filing date: 1997-10-16
Publication date: 1999-04-27

Abstract

(57)【要約】【課題】検体中の微量な蛋白質分解酵素活性を、高感
度に測定する方法を提供する。【解決手段】蛋白質分解酵素に対して感受性の高くか
つ酵素活性または溶血活性などの検出可能な生物活性を
有する実質上純粋な基質を用いて、当該基質に検体を作
用させた後、当該基質の生物活性の変化を検出してなる
検体中の蛋白質分解酵素活性の検出方法。【効果】非常に微量な蛋白分質解酵素活性の検出を酵
素活性または溶血活性などの生物活性的な変化を測定す
ることにより高感度に可能ならしめる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、検体に、蛋白質分
解酵素に対して感受性が高くかつ検出可能な生物活性を
有する実質上純粋な基質に作用させた後、当該基質の生
物活性の変化を検出してなる当該検体中の蛋白質分解酵
素活性の検出方法に関するものであり、検体、例えば、
生体成分中における蛋白質分解酵素や検体中の夾雑蛋白
質分解酵素などの検出に重要な技術である。

【０００２】

【従来の技術】従来、蛋白質分解酵素活性の検出は、当
該蛋白質分解酵素の基質として、合成基質やヘモグロビ
ン（Ａｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．，２２，７９−８９，１９３８）やカゼイン（Ｋｕ
ｎｉｔｚ，Ｍ．、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，３
０，２９１−３１０，１９４７）などの種々の基質を用
いて、行われてきた。その後、古典的なＡｎｓｏｎの方
法を改良しつつ、蛋白質分解酵素活性の検出方法が開発
されてきたが（Ｊ．Ｌａｎｏｅ、Ｊ．Ｄｕｎｎｉｎｇａ
ｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、８９，４６１−４７
１，１９７８；萩原秀昭、宮崎香、松尾雄志、山下仁
平、堀尾武一、蛋白質・核酸・酵素、２５（６）、４３
４−４４６，１９８０；Ｈ．Ｈａｇｉｗａｒａ，Ｋ．Ｍ
ｉｙａｚａｋｉ、Ｙ．Ｍａｔｕｏ，Ｊ．Ｙａｍａｓｈｉ
ｔａ、Ｔ．Ｈｏｒｉｏ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、９４（３）、９８８−９
９５，１９８０など）、基本的な原理は変わらないまま
である。

【０００３】例えば、カゼインを基質として用いた場合
の蛋白質分解酵素活性の検出は下記の如く行われてい
る。即ち、小試験管に検体０．５ｍｌと基質溶液（５０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液に０．６％カゼイン（和光純薬
工業社製）及び１ｍＭのＣａＣｌ₂を添加した溶液、ｐ
Ｈ７．５）２．５ｍｌを分注し、３７℃に加温する。１
０分後、ＴＣＡ緩衝液（トリクロロ酢酸８．９８５ｇ、
酢酸ナトリウム１４．９７ｇ及び酢酸９．９１ｇを精製
水で溶解して全容を５００ｍｌとした緩衝液）２．５ｍ
ｌを加えて混合し、反応を停止させ、３７℃で沈澱を形
成させる。３０分後、濾紙で濾過して濾液を得る。濾液
１ｍｌに０．５５Ｍ炭酸ナトリウム２．５ｍｌとフェノ
ール溶液（フェノール試薬（和光純薬工業社製）４ｍｌ
と精製水８ｍｌを混合した溶液）０．５ｍｌを加えて撹
拌しながら３０℃、３０分間加温して発色させる。３０
分後、６６０ｎｍの吸光度を測定し、濾液中の分解カゼ
イン蛋白質を算出すればよい。

【０００４】また、トリプシンの検出は、基質として、
カゼイン基質、発色性エステル基質等を用いて行われて
いる（臨床酵素ハンドブック、編者、馬場茂明、和田
博、北村元司、奥田潤、ｐ４４１−４４３、１９８２
年；和光ライフサイエンス試薬カタログ、ｐ８０，平成
７年２月１日発行）。例えば、エステル基質として、Ｎ
α−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡ
ＥＥ）（シグマ社製）を用いる場合は、ｐＨ７．６、２
５℃において１分間に吸光度（２５３ｎｍ）を０．００
１だけ増加させる酵素量を１ＢＡＥＥトリプシンユニッ
トとしてトリプシンの酵素活性が測定されている。

【０００５】また、同様に、α−キモトリプシンの検出
は、基質として、カゼイン基質、発色性エステル基質等
を用いて行われている（臨床酵素ハンドブック、編者、
馬場茂明、和田博、北村元司、奥田潤、ｐ４４１−４４
３、１９８２年；和光ライフサイエンス試薬カタログ、
ｐ７７，平成７年２月１日発行）。例えば、エステル基
質として、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−チロシンエチルエステ
ル（ＢＴＥＥ）（シグマ社製）を用いる場合は、ｐＨ
７．０、２５℃において１分間に吸光度（２３７ｎｍ）
を０．００７５だけ増加させる酵素量を１ＵＳＰキモト
リプシンユニットとして、キモトリプシンの酵素活性が
測定されている。

【０００６】以上の如く、従来の蛋白質分解酵素活性の
検出は、基質として合成基質とする発色性エステル基質
やカゼインなどの基質を用いて行われてきたため、その
検出限界により、検体中の微量な蛋白質分解酵素活性の
検出を行うことは非常に困難であった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】このように、検体中の
微量な蛋白質分解酵素活性の検出は、従来の基質では、
非常に困難である。従って、検体、例えば生体成分中に
おける微量な蛋白質分解酵素活性や検体中の微量な夾雑
蛋白質分解酵素活性などの検出において、微量な蛋白質
分解酵素活性の検出を酵素活性または溶血活性などの検
出可能な生物活性を有する実質上純粋な基質を用いて、
高感度に行う方法の開発が本発明の目的である。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、グリセロ−３−リン酸酸化酵素、アスコルビン
酸酸化酵素などの酵素活性を有するかまたはストレプト
リジンＯなどの溶血活性を有する、蛋白質分解酵素に対
して感受性が高くかつ検出可能な生物活性を有する実質
上純粋な基質ものを基質とし、当該生物活性の低下とし
ての変化を検出することにより検体中の微量な蛋白質分
解酵素活性の検出を高感度に可能ならしめることを見い
だした。

【０００９】本発明において、例えば、精製過程のアス
コルビン酸酸化酵素溶液または精製過程のリパーゼ溶液
などを検体として蛋白質分解酵素活性の検出を行うと、
蛋白質分解酵素活性の検出用の基質として、通常のカゼ
イン基質では活性の検出は不可能であったが、種々の検
討を加えた結果、グリセロ−３−リン酸酸化酵素を基質
として用いた場合、精製度と逆相関的に当該グリセロ−
３−リン酸酸化酵素活性の低下が認められ、検体中の微
量な蛋白質分解酵素活性の検出が高感度に可能であるこ
とを見いだした。

【００１０】同様に、蛋白質分解酵素活性の検出用基質
としてストレプトリジンＯを用いて、例えば、精製過程
のアスコルビン酸酸化酵素溶液中の蛋白質分解酵素活性
の検出を行うと、通常のカゼイン基質では活性の検出は
不可能であった検体においても、当該ストレプトリジン
Ｏ基質を用いた場合は、当該ストレプトリジンＯの生物
活性である溶血活性の低下が認められ、検体中の微量な
蛋白質分解酵素活性の検出が高感度に可能であることを
見いだした。

【００１１】さらに、蛋白質分解酵素活性の検出用基質
としてアスコルビン酸酸化酵素を用いて、例えば、精製
過程のリパーゼ酵素溶液中の蛋白質分解酵素活性の検出
を行うと、通常のカゼイン基質では活性の検出は不可能
であったが、当該アスコルビン酸酸化酵素基質を用いた
場合、精製度と逆相関的に当該アスコルビン酸酸化酵素
の酵素活性の低下が認められ、検体中の微量な蛋白質分
解酵素活性の検出が高感度に可能であることを見いだし
た。

【００１２】本発明は上記の知見により完成されたもの
であって、検体に、蛋白質分解酵素に対して感受性が高
くかつ検出可能な生物活性を有する実質上純粋な基質を
作用させた後、当該基質の生物活性の変化を検出するこ
とを特徴とする当該検体中の蛋白質分解酵素活性の検出
方法であって、例えば精製過程のアスコルビン酸酸化酵
素溶液や精製過程のリパーゼ溶液などの検体中の従来法
によって検出し難い微量な蛋白質分解酵素活性の検出に
用いることを可能となし、検体に、蛋白質分解酵素に対
して感受性が高くかつ検出可能な酵素活性や溶血活性な
どの生物活性を有する実質上純粋な基質を作用させた
後、当該基質の生物活性の変化を検出することを特徴と
する当該検体中の蛋白質分解酵素活性の検出方法である
本発明は、精製過程品や生体成分中の微量な蛋白質分解
酵素活性の検出する方法として好適に使用できることを
見出した。

【００１３】本発明における検体としては生体成分が挙
げられ、例えば、血液、尿、糞便、唾液、脊髄液、脳髄
液、骨髄液、胃液、唾液、汗、鼻汁、涙液、痰、精液ま
たはこららの抽出液、組織抽出液、または細胞抽出液な
どが挙げられるが、上記各種の検体の濃縮液であっても
良く、何らこれらに限定されず、蛋白質分解酵素活性の
検定のためのすべての検体を含む。

【００１４】上記精製過程品としての検体としては、例
えば、微生物、動植物細胞、動植物組織、動植物器官な
どの培養液からの精製過程品または最終精製品などの蛋
白質分解酵素活性の検定のための種々のものが挙げられ
るが、何らこれらに限定されない。本発明の蛋白質分解
酵素に対して感受性が高くかつ検出可能な生物活性を有
する実質上純粋な基質としては、好適にはその基質の水
溶液において、当該基質の実体が一定時間，例えば３０
〜３７℃、４８時間保存において、高感度な分析手段、
例えば電気泳動あるいは高速液体クロマトグラフィーな
どの分析手段にて９８％以上の実体を安定に保持する程
度に実質的に精製分離されたものでありかつ生物活性と
して酵素活性や溶血活性を有する検出が簡便なものであ
り、詳しくは例えば、グリセロ−３−リン酸酸化酵素活
性やアスコルビン酸酸化酵素活性やストレプトリジンＯ
溶血活性などが大いに有効であり、検体中の微量な蛋白
質分解酵素活性の検出を高感度になすことが可能であ
り、当該基質としては、これらの基質以外であっても、
何らかの蛋白質分解酵素に対して高い感受性を有する検
出可能な生物活性を有する蛋白質も本発明の基質として
挙げられ、何らこれらに限定されない。

【００１５】グリセロ−３−リン酸酸化酵素は、中性脂
肪の９０％以上を占めるトリグリセリドの酵素的測定法
やリパーゼ活性測定法において重要な酵素である。例え
ば、トリグリセリドの測定は、最初にドリグリセリドを
リパーゼでグリセロールに変換し、その後グリセロール
キナーゼで当該グリセロールをグリセロ−３−リン酸に
変換し、さらにその後当該グリセロ−３−リン酸をグリ
セロ−３−リン酸酸化酵素でジヒドロキシアセトンと過
酸化水素を発生させ、その発生した過酸化水素をパーオ
キシダーゼなどで検出することにより行う。

【００１６】グリセロ−３−リン酸を基質として酸素を
消費してジヒドロキシアセトンと過酸化水素を発生させ
る反応を触媒するグリセロ−３−リン酸酸化酵素として
は、例えばストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ）属由来のグリセロ−３−リン酸酸化酵素（旭化
成工業診断薬用酵素カタログ、Ｔ−６０、ＧＰＯＳＰ）
やアエロコッカス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属由来のグ
リセロ−３−リン酸酸化酵素（旭化成工業診断薬用酵素
カタログ、Ｔ−１５、ＧＰＯ）などが知られている。

【００１７】また、アスコルビン酸酸化酵素はアスコル
ビン酸および１／２酸素からデヒドロアスコルビン酸お
よび水分子を形成する反応を触媒する酵素であり、例え
ば飲食物中の劣化に関与することが知られている酸素の
脱酸素剤（特開平３−２３６７６６号公報）やトリグリ
セリドやクレアチニンなどの酵素的測定時の干渉物質で
あるアスコルビン酸の消去に用いることができる酵素で
あり、例えばキュウリ由来のアスコルビン酸酸化酵素
（旭化成工業診断薬用酵素カタログ、Ｔ−３５、ＡＳＯ
Ｃ）や微生物由来のアスコルビン酸酸化酵素（旭化成工
業診断薬用酵素カタログ、Ｔ−５３、ＡＳＯＭ）などが
知られている。

【００１８】さらに、ストレプトリジンＯは、生体に感
染したＡ群溶血性連鎖球菌から産生される物質の１つで
あり（レンサ球菌感染症［中］−その基礎と臨床−、塩
川優一・吉岡守正・浜田茂幸編集、３１７〜３５９頁、
廣川書店（株）、１９９２年６月２５日発行）、約６
０，０００の分子量をもち、かつ溶血活性をもつ毒素で
ある（Ａｌｏｕｆら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ、５５，１１
８７−１１９３，１９７３；Ｖａｎ・Ｅｐｐｓら、Ｊ．
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１００，５２６−５２７，１９
６９）、例えばストレプトコッカス・ピロゲネス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ・ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）由来の
ストレプトリジンＯ（旭化成工業診断薬用カタログ、Ａ
−１００、ＳＬＯ）などが知られている。

【００１９】そして、検出する蛋白質分解酵素として
は、例えば、トリプシン、キモトリプシン、クロストリ
パイン、サーモリシン、プロテナーゼＫ、スタフィロコ
ッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテアー
ゼ、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ・ｇｒｉｓｅｕｓ）プロナーゼ、スブチリシ
ン、パパイン、チオールプロテアーゼ、ペプシン、エラ
スターゼ、コラーゲナーゼ、フィシン、プロリン特異性
エンドペプチダーゼ、アルミラリ・メルラ（Ａｒｍｉｌ
ｌａｒｉ・ｍｅｌｌａ）プロテアーゼ、ミクソバクター
・ＡＬ−１（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒ・ＡＬ−１）プロテ
アーゼ、リシルエンドペプチダーゼ、アミノペプチダー
ゼ、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダ
ーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、ペニシロカルボ
キシペプチダーゼ、ジペプチジルカルボキシペプチダー
ゼ、ジペプチジルアミノペプチダーゼ、ジペプチダー
ゼ、トロンビンやプラスミンなどの血液凝固線溶系プロ
テアーゼ、レニン、エンテロペプチダーゼ、カテプシ
ン、カリクレイン、ケラチナーゼ（生化学ハンドブッ
ク、ｐ３５９−３６５，編者、井村伸正、大島泰郎、黒
川正則、永井克孝、三浦謹一郎、水島昭二、１９８４年
１月３０日発行、丸善；臨床酵素ハンドブック、編者、
馬場茂明、和田博、北村元司、奥田潤、１９８２年、講
談社サイエンティフィク）などが挙げられるが、これら
以外の蛋白質分解酵素でも何ら差し支えない。

【００２０】以下に、本発明について詳しく説明する
が、特に限定されるものではない。酵素活性を有する実
質上純粋な基質として、例えばグリセロ−３−リン酸酸
化酵素（ＧＰＯ（旭化成工業社診断薬用酵素カタログ、
Ｔ−１５、アエロコッカス・ビリダンス（Ａｅｒｏｃｏ
ｃｃｕｓ・ｖｉｒｉｄａｎｓ）由来）あるいはＧＰＯＳ
Ｐ（旭化成工業社診断薬用酵素カタログ、Ｔ−６０、ス
トレプトコッカス・ｓｐ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
・ｓｐ）由来）を用いて、検体として、例えば精製過程
のアスコルビン酸酸化酵素溶液中の微量な蛋白質分解酵
素活性の検出は、下記の如く行えば良い。即ち、グリセ
ロ−３−リン酸酸化酵素１０〜１０００Ｕ、好ましくは
５０〜８００Ｕを酵素溶解用液（０．０１〜０．１％、
好ましくは０．０５％アジ化ナトリウムを含む１〜１０
００ｍＭ、好ましくは５〜１００ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピ
ペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン
酸））（同仁化学社製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６〜
８、好ましくは６．５〜７．５））１０〜１００ｍｌに
溶解し、グリセロ−３−リン酸酸化酵素溶液０．１〜１
００、好ましくは５〜２０Ｕ／ｍｌを作製する。

【００２１】次いで、検体として、精製過程のアスコル
ビン酸酸化酵素３０〜３０，０００Ｕ、好ましくは３０
０〜１０、０００Ｕを上記酵素溶解用液１〜５０ｍｌで
溶解し、さらにグリセロ−３−リン酸酸化酵素溶液１〜
１００ｍｌを添加し、検品液を調製する。また、対照液
として、グリセロ−３−リン酸酸化酵素溶液１〜１００
ｍｌと酵素溶解用液１〜５０ｍｌの混合液を、検品液と
同様の比率で調製する。検品液と対照液をそれぞれバイ
アル瓶２本に１〜２０ｍｌづつ分注して、ゴム栓をす
る。２０〜５０℃、好ましくは２５〜４０℃、１〜４８
時間インキュベーション後、各バイアル中の残存グリセ
ロ−３−リン酸酸化酵素活性の低下を変化として測定を
行う。

【００２２】残存グリセロ−３−リン酸酸化酵素活性の
測定は、例えば下記の如く行えば良い。即ち、ＰＩＰＥ
Ｓ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォ
ン酸））（同仁化学社製）１〜３０ｇ及びＤＬ−グリセ
ロ−３−リン酸・２Ｎａ（シグマ社製、純度１００％）
１〜５０ｇを精製水１０〜５００ｍｌに溶解した後、１
〜１０ＮのＮａＯＨでｐＨ５．５〜７．５に調製し、そ
の液に１０〜５００Ｕ／ｍｌのパーオキシダーゼ溶液１
〜５０ｍｌ、２〜５０ｍＭの４−アミノアンチピリン溶
液１〜５０ｍｌ、２０〜２００ｍＭのＤＡＯＳ（３，５
−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３
−スルフォプロピル）アニリン）溶液０．５〜１０ｍｌ
及び２〜２０％のトリトンＸ−１００溶液０．２５〜５
ｍｌを加えて混和し、反応試薬混合液を調製する。

【００２３】次に、小試験管に反応試薬混合液０．５〜
５ｍｌづつを分注した後、２０〜４０℃で予備加温す
る。２〜３０分経過後、残存グリセロ−３−リン酸酸化
酵素を含む検体液を酵素溶解希釈用液（１〜１０００ｍ
Ｍ、好ましくは５〜１００ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピペラジ
ン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸））（同
仁化学社製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６〜８、好ましく
は６〜７））で適宜希釈（グリセロ−３−リン酸酸化酵
素活性が０．１〜１０、好ましくは０．２〜５Ｕ／ｍｌ
の濃度となるように適宜希釈する）し、その適宜希釈し
た検品液１０〜１００μｌを加えて混和し、２０〜４０
℃で反応を開始する。盲検は、酵素試料液の代わりに上
記酵素溶解希釈用液を加える。

【００２４】２〜６０分経過後、小試験管に反応停止液
（０．１〜５％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液）０．５
〜１０ｍｌを加えて混和し、反応を停止する。反応停止
後、６００ｎｍにおける吸光度を測定し、検品液と盲検
液との吸光度の差の比較から検体液中の残存グリセロ−
３−リン酸酸化酵素活性を計算して当該活性の変化とし
ての活性の低下の有無を検出し、検体中の蛋白質分解酵
素活性の検出とすればよい。

【００２５】また、酵素活性を有する実質上純粋な基質
として、例えばグリセロ−３−リン酸酸化酵素（ＧＰＯ
（旭化成工業社診断薬用酵素カタログ、Ｔ−１５、アエ
ロコッカス・ビリダンス（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ・ｖｉ
ｒｉｄａｎｓ）由来）あるいはＧＰＯＳＰ（旭化成工業
社診断薬用酵素カタログ、Ｔ−６０、ストレプトコッカ
ス・ｓｐ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ・ｓｐ）由
来））を用いて、検体として、例えば精製過程のリパー
ゼ酵素溶液中の微量な蛋白質分解酵素活性の検出は、下
記の如く行えば良い。即ち、グリセロ−３−リン酸酸化
酵素１０〜１０，０００Ｕを酵素溶解用液２（１〜２０
％ＡＴＰを含む１〜１０００ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピペラ
ジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸））
（同仁化学社製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．０〜７．
５））１〜１００ｍｌに溶解し、グリセロ−３−リン酸
酸化酵素溶液１０〜１，０００Ｕ／ｍｌを作製する。

【００２６】次いで、検体として、精製過程のリパーゼ
酵素１，０００〜１００、０００Ｕを酵素溶解用液１
（１〜１，０００ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，
Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸））（同仁化学社
製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．０〜７．５））１〜２
０ｍｌで溶解した後、、前記したグリセロ−３−リン酸
酸化酵素溶液（１０〜１，０００Ｕ／ｍｌ）１〜２０ｍ
ｌを添加し、検品液とする。対照液は１〜２０ｍｌのグ
リセロ−３−リン酸酸化酵素溶液（１０〜１，０００Ｕ
／ｍｌ）と１〜２０ｍｌの酵素溶解用液１を混合して調
製する。

【００２７】検品液と対照液をそれぞれバイアル瓶２本
に１〜２０ｍｌづつ分注して、ゴム栓をする。２０〜４
０℃、０．１〜６時間インキュベーション後、各バイア
ル中の残存グリセロ−３−リン酸酸化酵素活性の低下を
変化として測定を行う。残存グリセロ−３−リン酸酸化
酵素活性の測定は、同様に行う。さらに、酵素活性を有
する実質上純粋な基質として、例えばアスコルビン酸酸
化酵素（キュウリ由来、旭化成工業社製、診断薬用酵素
カタログＴ−３５、ＡＳＯＣ）を用いて、検体として、
例えば精製過程のリパーゼ酵素溶液中の微量な蛋白質分
解酵素活性の検出は、下記の如く行えば良い。即ち、ア
スコルビン酸酸化酵素（旭化成工業社製、診断薬用酵素
カタログＴ−３５、キュウリ由来ＡＳＯＣ）５０〜１
０，０００Ｕを上記酵素溶解用液２の１〜５０ｍｌに溶
解し、アスコルビン酸酸化酵素溶液１０〜１０，０００
Ｕ／ｍｌを作製する。

【００２８】次いで、検体として、精製過程のリパーゼ
酵素１００〜１００，０００Ｕを上記酵素溶解用液１の
１〜２０ｍｌで溶解した後、、前記したアスコルビン酸
酸化酵素溶液（１０〜１０，０００Ｕ／ｍｌ）１〜２０
ｍｌを添加し、検品液とする。対照液は１〜２０ｍｌの
アスコルビン酸酸化酵素溶液（１０〜１０，０００Ｕ／
ｍｌ）と１〜２０ｍｌの酵素溶解用液１を検品液作製時
と同様の比率で混合して調製する。

【００２９】検品液と対照液をそれぞれバイアル瓶２本
に１〜２０ｍｌづつ分注して、ゴム栓をする。２０〜４
０℃、０．１〜６時間インキュベーション後、各バイア
ル中の残存アスコルビン酸酸化酵素活性の低下を変化と
して測定を行う。残存アスコルビン酸酸化酵素活性の測
定は、下記の如く行う。即ち、反応溶液１（リン酸２水
素１カリウム０．１〜１０ｇ、Ｌ−アスコルビン酸（和
光純薬工業社製）１〜１００ｇ，及びＥＤＴＡ−２Ｎａ
−２Ｈ₂Ｏ（第一化学薬品工業社製）を５〜１０００ｍ
ｌの精製水に溶解した後、１〜１０Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ
４．５〜６．５に調整した溶液）０．０１〜１ｍｌを試
験管に分注し、２０〜４０℃、１〜６０分間、インキュ
ベートする。その後、酵素溶液０．０１〜０．５ｍｌ添
加し、穏和に混和する。２０〜４０℃、２〜６０分間、
インキュベーションした後、反応溶液２（リン酸２水素
１カリウム１〜１００ｇ、ニトロテトラゾリウムブルー
（同人化学社製）０．０１〜１０ｇ及び０．５〜４０ｇ
のトリトンＸ−１００を５〜１０００ｍｌの精製水に溶
解した後、ＮａＯＨでｐＨ６〜９に調整した溶液）０．
１〜１０ｍｌをさらに添加する。２〜６０分後、ＨＣｌ
溶液（０．０１〜１ｇのトリトンＸ−１００を１０〜１
０００ｍｌの０．０１〜１Ｎ−ＨＣｌに溶解した溶液）
０．２５〜２５ｍｌを加える。反応液の５３０ｎｍの吸
光度を測定し、残存アスコルビン酸酸化酵素の活性の低
下の変化から測定を行う。

【００３０】一方、溶血活性を有する実質上純粋な基質
としては、ストレプトリジンやヘモリシンなどが挙げら
れるが、例えばストレプトリジンＯ（旭化成工業社製、
診断薬用酵素カタログＡ−１００、ストレプトコッカス
・ピロゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ・ｐｙｏｇ
ｅｎｅｓ）由来ＳＬＯ）を用いた場合、検体、例えば精
製過程のアスコルビン酸酸化酵素溶液中の微量な蛋白質
分解酵素活性の検出は、下記の如く行えば良い。即ち、
ストレプトリジンＯ（旭化成工業社製）１０〜１００，
０００溶血単位（ＨＵ）をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
−ｂｕｆｆｅｒｅｄ・ｓａｌｉｎｅ）（大日本製薬社
製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６〜８））１〜１０００ｍ
ｌに溶解し、ストレプトリジンＯ溶液１〜１，０００Ｈ
Ｕ／ｍｌを作製する。

【００３１】次いで、検体として、精製過程のアスコル
ビン酸酸化酵素３０〜３００，０００Ｕを上記ＰＢＳ１
〜１００ｍｌで溶解し、さらにＰＢＳ１〜１０００ｍｌ
を添加し、検体液を調製する。当該検体液１〜１００ｍ
ｌに１〜１，０００ＨＵ／ｍｌのストレプトリジンＯ溶
液１〜１００ｍｌを加え、検品液とする。また、対照液
は、当該ストレプトリジンＯ溶液１〜１００ｍｌにＰＢ
Ｓ１〜１，０００ｍｌを加えて、検品液作製時と同様の
比率で調製する。検品液と対照液をそれぞれバイアル瓶
２本に１〜１００ｍｌづつ分注して、ゴム栓をする。２
０〜４０℃、０．１〜２４時間インキュベーション後、
各バイアル中の残存ストレプトリジンＯの溶血活性の低
下を変化として測定する。

【００３２】ストレプトリジンＯの溶血活性の測定は、
例えば下記の如く行えばよい。新鮮なウサギ脱繊維赤血
球（日本バイオテスト研究所（株）製）をＰＢＳにて１
〜１０回遠心洗浄した後、０．１〜１０％赤血球懸濁液
になるようＰＢＳにて調製した液０．１〜５０ｍｌと残
存ストレプトリジンＯ含有検品液をＰＢＳにて等比希釈
した液０．１〜５０ｍｌとをガラス試験管中で混合し、
２０〜４０℃で１０〜１８０分間インキュベートした
後、１００％溶血を示すストレプトリジンＯ含有サンプ
ルの最高希釈倍数を確認し、それをストレプトリジンＯ
含有サンプル１ｍｌあたりのＨＵ値と定める（特開平８
−２５４５３２号公報）。

【００３３】上記のような残存溶血活性の低下を変化と
して測定することにより、検体液中の微量な蛋白質分解
酵素活性の検出が初めて可能になる。以上の如くして調
整された組成物は少なくとも基質を含有する液状組成、
凍結組成、凍乾組成としてもよく、また適宜変化を測定
する試薬組成を添加してもよい。

【００３４】さらに本発明においては、特に酵素活性ま
たは溶血活性を有する基質を２種以上、例えば酵素活性
を有する基質を２種以上、又は、酵素活性を有する基質
と溶血活性を有する基質の２種以上の組合せからなる組
成物とすることにより、基質として用いた生物活性の阻
害剤を含有していたとしても、少なくとも１種の活性の
低下の変化の検出により、正確に蛋白質分解酵素活性の
検出を可能とする。

【００３５】

【発明の実施の形態】つぎに実施例にもとづいて本発明
を説明するが、本発明はこれに限定されるものではな
い。

【００３６】

【実施例１】トリプシンによるグリセロ−３−リン酸酸化酵素基質及
び合成基質を用いた蛋白質分解酵素活性検出比較（１）合成基質を用いたトリプシン酵素活性測定基質として、Ｎα−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチル
エステル（ＢＡＥＥ）（シグマ社製）を用いて、市販ト
リプシン酵素（和光純薬工業社製、１５，６００ＢＡＥ
Ｅユニット／ｍｇ）の活性を測定した。トリプシン６
４．１ｍｇを１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７
５）１０ｍｌに溶解して、溶液Ａ（計算上、約１００Ｂ
ＡＥＥユニット／ｍｌ）を作製し、さらにその溶液を１
０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．７５）で１００倍
希釈し溶液Ｂ（計算上、約１．０ＢＡＥＥユニット／ｍ
ｌ）を調製した。それぞれの溶液に、トリプシンの合成
基質であるＢＡＥＥが１０ｍＭとなるように添加し、２
５℃で反応させ、２５３ｎｍの吸収増加を測定し、レー
トアッセイ法にてトリプシン活性を測定した。活性は、
２５℃において１分間に吸光度（２５３ｎｍ）を０．０
０１だけ増加させる酵素量を１ＢＡＥＥトリプシンユニ
ットとした。

【００３７】その結果、溶液Ａの活性は９８ＢＡＥＥユ
ニット／ｍｌと測定できたが、溶液Ｂの活性は検出限界
以下であったため、０ＢＡＥＥユニット／ｍｌとなっ
た。（２）グリセロ−３−リン酸酸化酵素基質を用いたトリ
プシン酵素活性測定酵素活性を有する実質上純粋な基質として、グリセロ−
３−リン酸酸化酵素（旭化成工業社製、ＧＰＯＳＰ）を
用いて、上記の（１）で使用した溶液Ａ及び溶液Ｂ中の
トリプシン活性の測定を下記の如く行った。即ち、グリ
セロ−３−リン酸酸化酵素（旭化成工業社製、診断薬用
酵素カタログ、Ｔ−６０、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
・ｓｐ由来ＧＰＯＳＰ）５００Ｕを酵素溶解用液（０．
０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭのＰＩＰＥＳ
（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン
酸））（同仁化学社製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．
０））５０ｍｌに溶解し、グリセロ−３−リン酸酸化酵
素溶液１０．０Ｕ／ｍｌを作製した。

【００３８】次いで、検体として、上記の溶液Ａまたは
溶液Ｂ２ｍｌに対し、上記のグリセロ−３−リン酸酸化
酵素溶液１０ｍｌを添加し、検品液を調製した（最終濃
度は、グリセロ−３−リン酸酸化酵素が８．３Ｕ／ｍｌ
である）。また、対照液として、グリセロ−３−リン酸
酸化酵素溶液１０ｍｌと１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７．７５）２ｍｌの混合液を調製した（最終濃度
は、グリセロ−３−リン酸酸化酵素が８．３Ｕ／ｍｌで
ある）。

【００３９】検品液と対照液をそれぞれ８ｍｌのバイア
ル瓶２本に５ｍｌづつ分注して、ゴム栓をした。３０
℃、２４時間インキュベーション後、各バイアル中の残
存グリセロ−３−リン酸酸化酵素活性の測定を行った。
残存グリセロ−３−リン酸酸化酵素活性の測定は、下記
の如く行った。即ち、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，
Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸））（同仁化学社
製）６．０５ｇ及びＤＬ−グリセロ−３−リン酸・２Ｎ
ａ（シグマ社製、純度１００％）９．７２ｇを精製水７
０ｍｌに溶解した後、４ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５（２
５℃）に調製し、その液に１００Ｕ／ｍｌのパーオキシ
ダーゼ溶液（パーオキシダーゼ１，０００単位を精製水
１０ｍｌで溶解した溶液）５．０ｍｌ、１５ｍＭの４−
アミノアンチピリン溶液（４−アミノアンチピリン（ナ
カライテスク社製）３０５ｍｇを精製水で溶解して全容
１００ｍｌとした溶液）１０．０ｍｌ、１００ｍＭのＤ
ＡＯＳ（３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）アニリン）溶液
（ＤＡＯＳ３．４１ｇ（同仁化学社製）を精製水で溶解
して全容１００ｍｌとした溶液）１．０ｍｌ及び５％の
トリトンＸ−１００溶液（トリトンＸ−１００（米山薬
品工業社製）５．００ｇを精製水で溶解して全容を１０
０ｍｌとした溶液）１．０ｍｌを加えて混和し、ｐＨ
６．５（２５℃）を確認した後、精製水で全容１００ｍ
ｌとして、反応試薬混合液を調製した。

【００４０】次に、小試験管に反応試薬混合液１．０ｍ
ｌづつを分注した後、３７℃で予備加温した。５分経過
後、残存グリセロ−３−リン酸酸化酵素を含む検体液を
酵素溶解希釈用液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピペラジン
−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸））（同仁
化学社製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で適宜希釈
（グリセロ−３−リン酸酸化酵素活性が０．４〜０．８
Ｕ／ｍｌの濃度となるように適宜希釈した）し、その適
宜希釈した検品液２０μｌを加えて混和し、３７℃で反
応を開始した。盲検は、酵素試料液の代わりに酵素溶解
希釈用液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，
Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸））（同仁化学社
製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５））を加えた。

【００４１】５分経過後、小試験管に反応停止液（０．
５％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液）２．０ｍｌを加え
て混和し、反応を停止した。反応停止後、６００ｎｍに
おける吸光度を測定し、検品液と盲検液との吸光度の差
の比較から検体液中の残存グリセロ−３−リン酸酸化酵
素活性を計算し、検体中の蛋白質分解酵素活性の検出を
行った。

【００４２】その結果、溶液Ａをグリセロ−３−リン酸
酸化酵素溶液に添加した系では、グリセロ−３−リン酸
酸化酵素の活性が対照液に比して５％までに低下した。
さらに、溶液Ｂをグリセロ−３−リン酸酸化酵素溶液に
添加した系では、グリセロ−３−リン酸酸化酵素の活性
が同様に対照液に比して８５％までに低下した。従っ
て、合成基質を用いた上記（１）の系では検出できなか
った微量のトリプシン活性を、本発明の酵素活性を有す
る基質であるグリセロ−３−リン酸酸化酵素を用いた系
では、微量のトリプシン活性を高感度に有意に検出する
ことが可能となった。

【００４３】

【実施例２】精製過程のアスコルビン酸酸化酵素溶液中の微量な蛋白
質分解酵素活性のグリセロ−３−リン酸酸化酵素基質及
びカゼイン基質を用いた検出比較酵素活性を有する実質上純粋な基質として、グリセロ−
３−リン酸酸化酵素（旭化成工業社製、診断薬用酵素カ
タログ、Ｔ−６０、ストレプトコッカス・ｓｐ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ・ｓｐ）由来ＧＰＯＳＰ）を用い
て、精製過程のアスコルビン酸酸化酵素溶液中の微量な
蛋白質分解酵素活性の検出は、下記の如く行った。即
ち、グリセロ−３−リン酸酸化酵素（旭化成工業社製）
５００Ｕを酵素溶解用液（０．０５％アジ化ナトリウム
を含む５０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−
ビス（２−エタンスルフォン酸））（同仁化学社製）−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０））５０ｍｌに溶解し、グ
リセロ−３−リン酸酸化酵素溶液１０．０Ｕ／ｍｌを作
製した。

【００４４】次いで、検体として、精製過程のアスコル
ビン酸酸化酵素３、０００Ｕを上記酵素溶解用液２ｍｌ
で溶解し、さらにグリセロ−３−リン酸酸化酵素溶液１
０ｍｌを添加し、検品液を調製した（最終濃度は、グリ
セロ−３−リン酸酸化酵素が８．３Ｕ／ｍｌ、アスコル
ビン酸酸化酵素が２５０Ｕ／ｍｌである）。また、対照
液として、グリセロ−３−リン酸酸化酵素溶液１０ｍｌ
と酵素溶解用液２ｍｌの混合液を調製した（最終濃度
は、グリセロ−３−リン酸酸化酵素が８．３Ｕ／ｍｌ、
アスコルビン酸酸化酵素が０Ｕ／ｍｌである）。

【００４５】検品液と対照液をそれぞれ８ｍｌのバイア
ル瓶２本に５ｍｌづつ分注して、ゴム栓をした。３０
℃、２４時間インキュベーション後、各バイアル中の残
存グリセロ−３−リン酸酸化酵素活性の測定を行った。
残存グリセロ−３−リン酸酸化酵素活性の測定は、下記
の如く行った。即ち、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，
Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸））（同仁化学社
製）６．０５ｇ及びＤＬ−グリセロ−３−リン酸・２Ｎ
ａ（シグマ社製、純度１００％）９．７２ｇを精製水７
０ｍｌに溶解した後、４ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５（２
５℃）に調製し、その液に１００Ｕ／ｍｌのパーオキシ
ダーゼ溶液（パーオキシダーゼ１，０００単位を精製水
１０ｍｌで溶解した溶液）５．０ｍｌ、１５ｍＭの４−
アミノアンチピリン溶液（４−アミノアンチピリン（ナ
カライテスク社製）３０５ｍｇを精製水で溶解して全容
１００ｍｌとした溶液）１０．０ｍｌ、１００ｍＭのＤ
ＡＯＳ（３，５−ジメトキシ−Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルフォプロピル）アニリン）溶液
（ＤＡＯＳ３．４１ｇ（同仁化学社製）を精製水で溶解
して全容１００ｍｌとした溶液）１．０ｍｌ及び５％の
トリトンＸ−１００溶液（トリトンＸ−１００（米山薬
品工業社製）５．００ｇを精製水で溶解して全容を１０
０ｍｌとした溶液）を加えて混和し、ｐＨ６．５（２５
℃）を確認した後、精製水で全容１００ｍｌとして、反
応試薬混合液を調製した。

【００４６】次に、小試験管に反応試薬混合液１．０ｍ
ｌづつを分注した後、３７℃で予備加温した。５分経過
後、残存グリセロ−３−リン酸酸化酵素を含む検体液を
酵素溶解希釈用液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピペラジン
−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸））（同仁
化学社製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５）で適宜希釈
（グリセロ−３−リン酸酸化酵素活性が０．４〜０．８
Ｕ／ｍｌの濃度となるように適宜希釈した）し、その適
宜希釈した検品液２０μｌを加えて混和し、３７℃で反
応を開始した。盲検は、酵素試料液の代わりに酵素溶解
希釈用液（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，
Ｎ’−ビス（２−エタンスルフォン酸））（同仁化学社
製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５））を加えた。

【００４７】５分経過後、小試験管に反応停止液（０．
５％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液）２．０ｍｌを加え
て混和し、反応を停止した。反応停止後、６００ｎｍに
おける吸光度を測定し、検品液と盲検液との吸光度の差
の比較から検体液中の残存グリセロ−３−リン酸酸化酵
素活性を計算し、検体中の蛋白質分解酵素活性の検出を
行った。

【００４８】その結果、酵素活性を有する実質上純粋な
基質として、上記のグリセロ−３−リン酸酸化酵素を用
いた系では、グリセロ−３−リン酸酸化酵素活性が対照
液に比して６０％に低下した。また、比較検討として、
通常のカゼイン蛋白質を基質にして、上記の検体液中蛋
白質分解酵素活性の測定を下記の如く行った。

【００４９】即ち、小試験管に検体０．５ｍｌと基質溶
液（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液に０．６％カゼイン
（和光純薬工業社製）及び１ｍＭのＣａＣｌ₂を添加し
た溶液、ｐＨ７．５）２．５ｍｌを分注し、３７℃に加
温した。１０分後、ＴＣＡ緩衝液（トリクロロ酢酸８．
９８５ｇ、酢酸ナトリウム１４．９７ｇ及び酢酸９．９
１ｇを精製水で溶解して全容を５００ｍｌとした緩衝
液）２．５ｍｌを加えて混合し、反応を停止させ、３７
℃で沈澱を形成させた。３０分後、濾紙で濾過して濾液
を得た。濾液１ｍｌに０．５５Ｍ炭酸ナトリウム２．５
ｍｌとフェノール溶液（フェノール試薬（和光純薬工業
社製）４ｍｌと精製水８ｍｌを混合した溶液）０．５ｍ
ｌを加えて撹拌しながら３０℃、３０分間加温して発色
させた。３０分後、６６０ｎｍの吸光度を測定し、濾液
中の分解カゼイン蛋白質を算出した。

【００５０】その結果、カゼインを基質にした測定法で
は、精製過程のアスコルビン酸酸化酵素溶液中の微量な
蛋白質分解酵素活性の検出はできなかった。従って、上
記の精製過程のアスコルビン酸酸化酵素中の微量な蛋白
質分解酵素活性が、従来のカゼイン基質法では検出が不
可能であったが、本発明である酵素活性を有する実質上
純粋な基質としてグリセロ−３−リン酸酸化酵素を用い
ることにより高感度に検出できた。

【００５１】

【実施例３】グリセロ−３−リン酸酸化酵素基質を用いた、精製過程
のリパーゼ酵素溶液中の微量な蛋白質分解酵素活性の検
出グリセロ−３−リン酸酸化酵素（旭化成工業社製、ＧＰ
ＯＳＰ）１，６００Ｕを酵素溶解用液２（５％ＡＴＰを
含む１０ｍＭのＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビ
ス（２−エタンスルフォン酸））（同仁化学社製）−Ｎ
ａＯＨ緩衝液（ｐＨ６．５））１０ｍｌに溶解し、グリ
セロ−３−リン酸酸化酵素溶液１６０Ｕ／ｍｌを作製し
た。

【００５２】次いで、検体として、精製過程のリパーゼ
酵素１６、０００Ｕを酵素溶解用液１（１０ｍＭのＰＩ
ＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスル
フォン酸））（同仁化学社製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
６．５））２ｍｌで溶解した後、、前記したグリセロ−
３−リン酸酸化酵素溶液（１６０Ｕ／ｍｌ）２ｍｌを添
加し、検品液とした。対照液は２ｍｌのグリセロ−３−
リン酸酸化酵素溶液（１６０Ｕ／ｍｌ）と２ｍｌの酵素
溶解用液１を混合して調製した。

【００５３】検品液と対照液をそれぞれ８ｍｌのバイア
ル瓶２本に２ｍｌづつ分注して、ゴム栓をし、２５℃、
１時間インキュベーション後、各バイアル中の残存グリ
セロ−３−リン酸酸化酵素活性の測定を行った。残存グ
リセロ−３−リン酸酸化酵素活性の測定は、実施例１と
同様に行った。比較検討として、カゼイン基質を用い
て、精製過程のリパーゼ酵素１６、０００Ｕ中の蛋白質
分解酵素活性の測定を実施例２と同様に行った。

【００５４】その結果、カゼインを基質として用いた場
合は、蛋白質分解酵素活性の検出はできなかったが、グ
リセロ−３−リン酸酸化酵素を基質として用いた場合
は、残存グリセロ−３−リン酸酸化酵素活性が対照液に
比して９０％に低下した。従って、上記の精製過程のリ
パーゼ中の微量な蛋白質分解酵素活性が、本発明である
酵素活性を有する実質上純粋な基質としてグリセロ−３
−リン酸酸化酵素を用いることにより高感度に検出でき
た。

【００５５】

【実施例４】アスコルビン酸酸化酵素を基質として用いて、精製過程
のリパーゼ酵素溶液中の微量な蛋白質分解酵素活性の検
出アスコルビン酸酸化酵素（旭化成工業社製、診断薬用酵
素カタログＴ−３５、キュウリ由来ＡＳＯＣ）１，００
０Ｕを酵素溶解用液２（５％ＡＴＰを含む１０ｍＭのＰ
ＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンス
ルフォン酸））（同仁化学社製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ６．５））１０ｍｌに溶解し、グリセロ−３−リン酸
酸化酵素溶液１００Ｕ／ｍｌを作製した。

【００５６】次いで、検体として、精製過程のリパーゼ
酵素１６、０００Ｕを酵素溶解用液１（１０ｍＭのＰＩ
ＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスル
フォン酸））（同仁化学社製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
６．５））２ｍｌで溶解した後、、前記したアスコルビ
ン酸酸化酵素溶液（１００Ｕ／ｍｌ）２ｍｌを添加し、
検品液とした。対照液は２ｍｌのアスコルビン酸酸化酵
素溶液（１００Ｕ／ｍｌ）と２ｍｌの酵素溶解用液１を
混合して調製した。

【００５７】検品液と対照液をそれぞれ８ｍｌのバイア
ル瓶２本に２ｍｌづつ分注して、ゴム栓をし、２５℃、
１時間インキュベーション後、各バイアル中の残存アス
コルビン酸酸化酵素活性の測定を行った。残存アスコル
ビン酸酸化酵素活性の測定は、下記の如く行った。即
ち、反応溶液１（リン酸２水素１カリウム０．６８ｇ、
Ｌ−アスコルビン酸（和光純薬工業社製）１７．６ｇ，
及びＥＤＴＡ−２Ｎａ−２Ｈ₂Ｏ（第一化学薬品工業社
製）を８０ｍｌの精製水に溶解した後、４Ｎ−ＮａＯＨ
でｐＨ５．６（２５℃）に調整し、最終的に１００ｍｌ
に調整した溶液）０．１ｍｌを試験管に分注し、３７
℃、３〜４分間、インキュベートした。その後、酵素溶
液０．０２ｍｌ添加し、穏和に混和した。３７℃、５分
間、インキュベーションした後、反応溶液２（リン酸２
水素１カリウム０．６８ｇ、ニトロテトラゾリウムブル
ー（同人化学社製）０．１６４ｇ及び４．０ｇのトリト
ンＸ−１００を８０ｍｌの精製水に溶解した後、４Ｎ−
ＮａＯＨでｐＨ７．６（２５℃）に調整し、最終的に１
００ｍｌに調整した溶液）１．０ｍｌをさらに添加し
た。１５分後、ＨＣｌ溶液（０．１ｇのトリトンＸ−１
００を１００ｍｌの０．１Ｎ−ＨＣｌに溶解した溶液）
２．５ｍｌを加えた。反応液の５３０ｎｍの吸光度を測
定し、アスコルビン酸酸化酵素の活性の検出を行った。

【００５８】比較検討として、カゼインを基質として、
蛋白質分解酵素活性を実施例２と同様に行った。その結
果、カゼインを基質として用いた場合は、蛋白質分解酵
素活性の検出はできなかったが、アスコルビン酸酸化酵
素を基質として用いた場合は、残存アスコルビン酸酸化
酵素活性が対照液に比して７０％に低下した。

【００５９】従って、上記の精製過程のリパーゼ中の微
量な蛋白質分解酵素活性が、本発明である酵素活性を有
する実質上純粋な基質としてアスコルビン酸酸化酵素を
用いることにより高感度に検出できた。

【００６０】

【実施例５】溶血活性を有する実質上純粋な基質として、ストレプト
リジンＯを用いた精製過程のアスコルビン酸酸化酵素溶
液中の微量な蛋白質分解酵素活性の検出ストレプトリジンＯ（旭化成工業社製、診断薬用カタロ
グＡ−１００、ストレプトコッカス・ピロゲネス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ・ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来ＳＬ
Ｏ）１，０００溶血単位（ＨＵ）をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ・ｓａｌｉｎｅ）（大日本
製薬社製）−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０））５０ｍｌ
に溶解し、ストレプトリジンＯ溶液２０ＨＵ／ｍｌを作
製した。

【００６１】次いで、検体として、精製過程のアスコル
ビン酸酸化酵素３、０００Ｕを上記ＰＢＳ２ｍｌで溶解
し、さらにＰＢＳ１０ｍｌを添加し、検体液を調製し
た。当該検体液２ｍｌに２０ＨＵ／ｍｌのストレプトリ
ジンＯ溶液１０ｍｌを加え、検品液とした。また、対照
液は、当該ストレプトリジンＯ溶液１０ｍｌにＰＢＳ２
ｍｌを加えて、調製した。検品液と対照液をそれぞれ８
ｍｌのバイアル瓶２本に５ｍｌづつ分注して、ゴム栓を
し、３７℃、２時間インキュベーション後、各バイアル
中の残存ストレプトリジンＯの溶血活性を測定した。

【００６２】ストレプトリジンＯの溶血活性の測定は、
下記の如く行った。新鮮なウサギ脱繊維赤血球（日本バ
イオテスト研究所（株）製）をＰＢＳにて５回遠心洗浄
した後、１％赤血球懸濁液になるようＰＢＳにて調製し
た液２ｍｌと残存ストレプトリジンＯ含有検品液をＰＢ
Ｓにて等比希釈した液１ｍｌとをガラス試験管中で混合
し、３７℃で３０分間インキュベートした後、１００％
溶血を示すストレプトリジンＯ含有サンプルの最高希釈
倍数を確認し、それをストレプトリジンＯ含有サンプル
１ｍｌあたりのＨＵ値と定めた（特開平８−２５４５３
２号公報）。

【００６３】比較検討として、カゼインを基質として、
蛋白質分解酵素活性を実施例２と同様に行った。その結
果、カゼインを基質として用いた場合は、蛋白質分解酵
素活性の検出はできなかったが、ストレプトリジンＯを
基質として用いた場合は、残存ストレプトリジンＯ溶血
活性が対照液に比して５０％に低下した。

【００６４】従って、上記の精製過程のアスコルビン酸
酸化酵素中の蛋白質分解酵素活性が、本発明である溶血
活性を有する実質上純粋な基質としてストレプトリジン
Ｏを用いることにより高感度に検出できた。

【００６５】

【発明の効果】本発明である酵素活性または溶血活性な
どの生物活性を有する実質上純粋な基質を用いた蛋白質
分解酵素活性の検出方法において、基質としては、上記
したグリセロ−３−リン酸酸化酵素やアスコルビン酸酸
化酵素やストレプトリジンＯなどの他に、蛋白質分解酵
素に対して高い感受性を有しかつ検出可能な生物活性を
有する基質にも適用できるので、種々の生体成分中の微
量な蛋白質分解酵素活性や精製品中の微量な蛋白質分解
酵素活性などの高感度な検出を可能ならしめる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】検体に、蛋白質分解酵素に対して感受性
が高くかつ検出可能な生物活性を有する実質上純粋な基
質を作用させた後、当該基質の生物活性の変化を検出す
ることを特徴とする当該検体中の蛋白質分解酵素活性の
検出方法。
【請求項２】検出可能な生物活性が、酵素活性または
溶血活性である請求項１記載の検出方法。
【請求項３】酵素活性が、グリセロ−３−リン酸酸化
酵素活性またはアスコルビン酸酸化酵素活性である請求
項２記載の検出方法。
【請求項４】溶血活性が、ストレプトリジンＯ溶血活
性である請求項２記載の検出方法。