JPH11124399A

JPH11124399A - プロテインｃインヒビターとプロテアーゼの複合体測定用モノクローナル抗体

Info

Publication number: JPH11124399A
Application number: JP28808697A
Authority: JP
Inventors: Toshitaka Sato; 俊孝佐藤; Toru Naraki; 徹楢木; Koji Suzuki; 宏治鈴木
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1997-10-21
Filing date: 1997-10-21
Publication date: 1999-05-11

Abstract

(57)【要約】【課題】血液凝固・線溶系の状態を知る指標として有用
な、プロテインＣインヒビターとプロテアーゼの複合体
を、短時間で簡便に測定するためのモノクローナル抗
体、その測定法および測定試薬を提供する。【解決手段】プロテインＣインヒビターと活性化プロテ
アーゼの複合体（ＣＩＣ）に特異的に反応し、プロテア
ーゼ前駆体、活性化プロテアーゼ、インタクトプロテイ
ンＣインヒビターとは反応しないモノクローナル抗体を
精製した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はプロテアーゼインヒビタ
ーとプロテアーゼの複合体測定用モノクローナル抗体、
その測定方法および測定用試薬に関する。

【０００２】

【従来の技術】血液凝固・線溶系はプロテアーゼ前駆体
の活性化とそのインヒビターによって制御されている。
これらの因子、特に活性化されたプロテアーゼを検出す
ることによって、種々の疾患における凝固・線溶系の状
態を知ることができる。しかしながら、活性化プロテア
ーゼは特異性の高いインヒビターによって中和されるた
め、その活性を正確に測定するのは困難である。そこで
通常は活性化プロテアーゼとインヒビターの複合体を測
定する方法が用いられ、臨床検査の現場ではトロンビン
−アンチトロンビンIII複合体(Thrombin-antithrombin
three、ＴＡＴ)およびプラスミン−プラスミンインヒビ
ター複合体(Plasmin-plasmin inhibitor complex、ＰＩ
Ｃ)が測定されている。しかしこれらの複合体の測定に
は、測定サンプル採取後の保存状態に左右され、測定値
の変動が大きいという欠点がある。プロテインＣ(Prote
in C、以下ＰＣ)は、血管内皮細胞に存在するトロンボ
モジュリンに結合したトロンビンによって活性化プロテ
インＣ(Activated proteinC、以下ＡＰＣ)に変換され、
凝固反応の補酵素である活性化第Ｖ因子および活性化第
VIII因子を分解することによって凝固反応を制御してい
る。ＡＰＣは血漿中に存在するプロテインＣインヒビタ
ー(Protein C inhibitor、以下ＰＣＩ)およびα₁-アン
チトリプシンによって中和される。ＰＣＩはヘパリン依
存性のセリンプロテアーゼインヒビターでありセルピン
(Serpin)の一種である。ＰＣＩは分子量57,000の一本鎖
糖タンパク質で血漿以外にも尿、精漿、滑液等に存在し
ていることから、血液凝固系の制御のみならず、多彩な
生理機能があると考えられ注目されている。また、ＰＣ
ＩはＡＰＣ以外にも、トロンビン、第Ｘa因子、第XIa因
子、カリクレイン、ウロキナーゼ、組織中プラスミノー
ゲン活性化因子(Tissue plasminogen activator)等も阻
害すると報告されている(Suzuki, K., Methodsin Enzym
ology, 222, 385-399, 1993)。また、ＰＣＩによるＡＰ
Ｃやトロンビンの阻害速度は、ヘパリンや陰性荷電デキ
ストラン硫酸の存在下で著しく促進されることが明らか
になっている(Laurell, M., Carlson, T. H. and Stenf
lo, J., Thrombosis and Haemostasis, 60, 334-339, 1
988)。ＰＣＩのプロテアーゼ阻害機構はＡＰＣを用いて
詳細に解析されており、活性化プロテアーゼとインヒビ
ターが１：１のアシル結合複合体を形成することによ
る。したがって、血液中のＡＰＣとＰＣＩの複合体(Act
ivated protein C−Protein C inhibitor complex、以
下ＣＩＣ)を測定することは、血液凝固系制御能を知る
指標となりうる。また、ＣＩＣの血液凝固・線溶カスケ
ードにおける位置付けからすると、ＴＡＴよりも早期に
出現すると考えられるため、凝固亢進状態の出現を予知
する目的にも使用できる可能性がある。さらに、汎発性
血管内凝固(Disseminated intravascular coagulatio
n、ＤＩＣ)(Espana, F., et al., Thrombosis Res., 5
9, 593-608, 1990)、糖尿病(Gabazza, E. C., et al.,
Diabetologia, 39, 1455-1461, 1996)、深部静脈血栓(D
eep Vein Thrombosis、ＤＶＴ)(Yamada, N., et al., B
lood coagulation and Fibrinolysis, 6, 627-633, 199
5)等の血液凝固・線溶系に障害を示す患者では、血漿中
ＣＩＣは高値を示すと報告されている。従来行われてき
たＣＩＣの測定方法は、ＰＣに対する抗体およびＰＣＩ
に対する抗体を組み合わせて測定するものであるが、測
定サンプルの前処理が必要であったり、測定に長時間か
かる等の欠点があった。また、ローレルらはＰＣＩに対
するモノクローナル抗体を作製し、ＣＩＣを測定する方
法を開示している(Laurel, M., Carlson, T. H. and St
enflo, J., Thrombosis and Haemostasis, 60, 334-33
9, 1988)。しかし、この抗体はＣＩＣだけではなくＰＣ
Ｉも認識するため、正確にＣＩＣ量を測定できるもので
はない。また、ここに開示されている方法では、ＰＣに
対する抗体を固相抗体としているため、この方法を臨床
応用した場合には、ここで測定されるＣＩＣ定量値はＣ
ＩＣそのものの量的変動を捉えているだけでなく、ＰＣ
の量的変動によっても影響を受けると考えられる。この
ように、ＰＣＩとプロテアーゼの複合体を測定する方法
で実用的なものは未だ無く、早急な開発が待たれている
ところである。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ＰＣ
Ｉとプロテアーゼの複合体を短時間で正確、簡便に測定
するモノクローナル抗体、その測定方法および測定試薬
を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
な背景から鋭意研究を重ねた結果、プロテアーゼとイン
ヒビターの複合体に特異的に反応し、ＰＣ、ＡＰＣ、Ｐ
ＣＩ等とは反応しないモノクローナル抗体の作製に成功
した。さらに、この抗体はＡＰＣ以外の種々のプロテア
ーゼとの複合体をも認識することが明らかとなり、本発
明を完成するに至った。すなわち、本発明はプロテイン
Ｃインヒビターとプロテアーゼの複合体を認識するモノ
クローナル抗体であって、インタクトのプロテインＣイ
ンヒビターは実質的に認識せず、該複合体中のプロテイ
ンＣインヒビターを認識するモノクローナル抗体、該モ
ノクローナル抗体を使用したプロテインＣインヒビター
と活性化プロテアーゼの複合体の測定方法、およびその
測定試薬である。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明においてインタクトとは、生体内に本来存在する
形であり、その構造や機能に変化を受けていないもので
あることを意味する。本発明に係るプロテインＣインヒ
ビターとプロテアーゼの複合体を認識するモノクローナ
ル抗体の作製は、該複合体を抗原として、通常行われる
免疫学的方法で実施すればよい。免疫に使われる動物は
特に限定されないがマウス、ラット、モルモットなどは
いずれも使用できる。接種は皮下、筋肉内、腹腔内に、
完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュ
バントと混和して行う。投与は２〜５週間ごとに実施す
る。免疫した動物から脾臓またはリンパ節を採取し、脾
臓またはリンパ細胞を腫瘍細胞と融合し、ハイブリドー
マとして単離する。腫瘍細胞は一般に抗体産生細胞と同
一種であることが望ましいが、異種間でも可能な場合も
ある。細胞融合法は一般に行われている方法、たとえば
ケーラーとミルステインの方法(Kohler, G. and Milste
in, C., Nature, 256, 495-497, 1975)で実施すればよ
い。融合促進剤としては、センダイウイルスや平均分子
量1000〜6000のポリエチレングリコールなどが挙げられ
る。通常20〜50％程度の濃度のポリエチレングリコール
を用いて、20〜40℃、好ましくは30〜37℃で、抗体産生
細胞数と腫瘍細胞数の比、１：１〜10：１程度、１〜10
分間程度反応させることによって実施する。ハイブリド
ーマのスクリーニングは、種々の免疫化学的方法で実施
することができる。例えばエライザ法(Enzyme-linked i
mmunosorbent assay、以下ＥＬＩＳＡ)等の酵素標識法
(Enzyme immunoassay、以下ＥＩＡ)、ウェスタンブロッ
ト法、組織染色法などが挙げられる。本発明の場合には
プロテインＣインヒビターとプロテアーゼの複合体に反
応し、インタクトのＰＣＩやプロテアーゼには実質的に
反応しないクローンを選択する。このような方法で抗体
産生を確認した後、例えば、限界希釈法によってクロー
ンを得る。ハイブリドーマの選別、育種は通常ＨＡＴ
(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加し
て、10〜20％のウシ胎児血清を含む動物細胞用培地で行
われる。このようにして得られたクローンは、あらかじ
めプリスタンを投与したBALB/Cマウスの腹腔内に移植
し、10〜14日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹
水を採取し、抗体を精製するための原料とする。また、
該クローンを培養し、培養物を原料とすることもでき
る。モノクローナル抗体の回収は、既知の免疫グロブリ
ン精製法を用いればよく、例えば、硫安分画法、ポリエ
チレングリコール(Polyethylene glycol、ＰＥＧ)分画
法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、アフィ
ニティクロマトグラフ法等により実施することができ
る。

【０００６】このようにして得られたＰＣＩとプロテア
ーゼの複合体を認識するモノクローナル抗体を使用し
て、生体試料中のＰＣＩとプロテアーゼの複合体の定性
・定量が可能である。その方法としては、試料の種類に
よって適切な方法を採用すればよく特に限定されない
が、例えば、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、凝集
法、競合法、サンドイッチ法などが挙げられる。免疫組
織染色法は例えば、標識化抗体を使用する直接法、該抗
体に対する標識抗体を用いる間接法により実施できる。
標識物としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色
素などを使用することができる。生体試料中のＰＣＩと
プロテアーゼ複合体の測定法の例として、免疫学的サン
ドイッチ法によるＣＩＣ(ＰＣＩとＡＰＣの複合体)の定
量法を以下に説明する。まず、本発明のモノクローナル
抗体を固相化する。固相体としてはマイクロタイターウ
ェル、マイクロ磁気ビーズなどを選択し、常法により固
相化する。該固相化モノクローナル抗体と生体試料とを
反応させ、モノクローナル抗体とＣＩＣを結合させ、免
疫反応物を生成させる。洗浄後、抗ＰＣ抗体もしくは抗
ＡＰＣ抗体(標識第二抗体)と反応させ、さらに洗浄後、
標識第二抗体を定量することにより、生体試料中のＣＩ
Ｃ量を測定することができる。また、ＰＣＩはＡＰＣの
みならず血漿カリクレイン、第Ｘa因子、第XIa因子、ト
ロンビン、ウロキナーゼ、組織中プラスミノーゲン等種
々のプロテアーゼとも反応するため、これらとの複合体
も測定可能である。適用できる生体試料は特に限定され
ず、臓器組織、細胞、血漿、血清、尿、漿液、髄液等い
ずれの生体試料であっても、適切な前処理を行うことに
よって適用可能である。

【０００７】本発明に係る測定試薬は、ＰＣＩとプロテ
アーゼ複合体を認識するモノクローナル抗体を必須構成
成分とし、標識抗体、標準抗原、酵素および基質等を含
むものからなる。該モノクローナル抗体と酵素が同時に
含まれる場合には両者が結合した状態であってもよい。
また、測定の都合により、適切な抗原希釈液、反応希釈
液、基質溶解液、反応停止液等が含まれていてもよい。

【０００８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１抗ＣＩＣモノクローナル抗体の作製および同
抗体の特異性の検討 1)プロテインＣの精製操作は全て４℃で実施した。新鮮血漿4.4リットルに、
塩酸ベンズアミジン(10mM；最終濃度、以下同様)、ジイ
ソプロピルフルオロフォスフェイト(Diisopropyl fluor
ophosphate、ＤＦＰ)(1mM)、フェニルメチルスルフォニ
ルフルオライド(Phenylmethylsulfonyl fluoride、ＰＭ
ＳＦ)(1mM)および大豆トリプシンインヒビター(50mg/リ
ットル)を加えた後、1Mの塩化バリウムを350ml滴下し
た。混合液を１時間攪拌後、5000rpm/minで30分間遠心
し、沈殿を採取した。沈殿に5mMの塩酸ベンズアミジン
を含む0.15Mの塩化ナトリウム(pH7.4)を700ml加えて２
回洗浄した。バリウム塩に吸着したタンパク質は、5mM
の塩酸ベンズアミジンおよび0.1mMのＤＦＰを含む0.2M
のＥＤＴＡ(pH7.4)を660ml添加して溶出した。懸濁液を
１時間攪拌後、5000rpm/minで30分間遠心し、沈殿を除
去した。上清を1mMの塩酸ベンズアミジンを含む0.1Mの
リン酸緩衝液(pH6.0)に透析した後、同一の緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥ-Sephacelカラムにかけ、0.1Mから0.7
Mまでの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配、1mMの塩酸ベ
ンズアミジンを含む0.1Mのリン酸緩衝液(pH6.0)で溶出
しＰＣ画分を採取した。採取液を1mMの塩酸ベンズアミ
ジンを含む0.05Mトリス塩酸緩衝液(pH8.0)に対して透析
した。その後、ＤＦＰおよびＰＭＳＦを、それぞれ1mM
および0.1mMの濃度になるように添加した。1mMの塩酸ベ
ンズアミジンを含む0.05Mのトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で
平衡化したＤＥＡＥ-Sephacelカラムにかけ、0.1Mから
0.5Mまでの塩化ナトリウムの直線的濃度勾配、1mMの塩
酸ベンズアミジンを含む0.05Mのトリス塩酸緩衝液(pH8.
0)および2mMの塩化カルシウムで溶出し、ＰＣ画分を採
取した。採取液を1mMの塩酸ベンズアミジンを含む0.05M
イミダゾール緩衝液(pH6.0)に対して透析した。透析に
より生じた沈殿を2000rpm/minで10分間遠心分離し、除
去した。上清に塩化カルシウムを1mMになるように加
え、1mMの塩酸ベンズアミジンおよび2mMの塩化カルシウ
ムを含む0.05Mのイミダゾール緩衝液(pH6.0)で平衡化し
たHeparin Sepharoseカラムにかけ、0.0Mから0.8Mまで
の直線的濃度勾配、1mMの塩酸ベンズアミジンを含む0.0
5Mのイミダゾール緩衝液(pH6.0)で溶出し、精製ＰＣ画
分を採取した。回収率は25％であった。

【０００９】2)プロテインＣインヒビターの精製操作は全て４℃で実施した。新鮮血漿４リットルに、塩
酸ベンズアミジン(10mM；最終濃度、以下同様)、ＤＦＰ
(1mM)、ＰＭＳＦ(1mM)および大豆トリプシンインヒビタ
ー(50mg/リットル)を加え、1Mの塩化バリウムを320ml滴
下した。混合液を１時間攪拌後、5000rpm/minで30分間
遠心し、上清を採取し、固形ＰＥＧ6000を60g/リットル
になるように加えた。１時間攪拌後、5000rpm/minで30
分間遠心し、沈殿を除去した。上清にはさらに固形ＰＥ
Ｇ6000を60g/リットルになるように加え、１時間攪拌
後、5000rpm/minで30分間遠心して沈殿を採取した。沈
殿に0.1Mの塩化アンモニウム、10mMの塩酸ベンズアミジ
ン、1mMのＤＦＰおよび1mMのＰＭＳＦを含む0.05Mのト
リス塩酸緩衝液(pH7.5)を加えて溶解した。同一の緩衝
液で平衡化したＤＥＡＥ-Sepharose CL-6Bカラムにか
け、素通り画分を採取した。採取液に硫酸アンモニウム
粉末を加えて50％飽和とし、１時間攪拌後、8000rpm/mi
nで15分間遠心し、上清を採取した。さらに硫酸アンモ
ニウム粉末を加えて50％飽和とし、１時間攪拌後8000rp
m/minで15分間遠心し、上清を採取した。沈殿に0.1Mの
塩化ナトリウム、1mMの塩酸ベンズアミジン、0.1mMのＤ
ＦＰおよび0.1mMのＰＭＳＦを含む0.05Mのトリス緩衝液
(pH6.0)を加えて溶解し、同一緩衝液に対して透析し
た。デキストラン硫酸アガロースカラムにかけ、ＰＣＩ
画分に硫酸アンモニウム粉末を加えて80％飽和させた。
10000rpm/minで15分間遠心し沈殿を採取して、溶解可能
な最小液量の0.15Mの塩化ナトリウムを含む0.05Mのトリ
ス塩酸緩衝液(pH7.5)に溶解した後、Ultrogel AcA44カ
ラムにかけ、ＰＣＩ画分を集めて0.05Mのトリス塩酸緩
衝液(pH9.0)に透析した。その後ＤＥＡＥ-Sephacelにか
け精製ＰＣＩを得た。回収率は９％であった。

【００１０】3)ＣＩＣの調製 1mg/mlの精製ＰＣ溶液100μlに100U/mlのトロンビン溶
液50μlを加え、１時間反応させた後、5U/mlのヘパリン
存在下にアンチトロンビンIII(0.1μg/ml)を150μl加え
て反応を停止させた。上記方法で調製したＡＰＣ溶液(5
μg/ml)1mlと精製ＰＣＩ溶液(1mg/ml)15μlを、2mMのＥ
ＤＴＡ、5U/mlのへパリン存在下で混合し、37℃で30分
間インキュベートした。合成基質S-2366(第一化学薬品
社製)を使用してＡＰＣ活性を測定したところ、残存活
性はなかった。

【００１１】4)抗ＣＩＣモノクローナル抗体の作製 100μgのＣＩＣを含む溶液を同容量のフロイント完全ア
ジュバントとともに、BALB/cマウスの腹腔内に２週間間
隔で５回投与した。マウスの血清中に抗体が産生してい
ることを確認後、100μgのＣＩＣを含む溶液を尾静脈内
に投与した。３日後に脾臓を摘出し、ケーラーおよびミ
ルステインの方法によって、ポリエチレングリコール15
00を使用して脾臓細胞をミエローマ細胞P3UIと細胞融合
させた。その後、ＰＣ、ＰＣＩおよびＣＩＣを抗原とし
て、ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを実施した。限界希
釈法によって、ＰＣおよびＰＣＩとは反応せず、ＣＩＣ
のみに対して特異的に反応するモノクローナル抗体を得
た。

【００１２】5)抗ＣＩＣモノクローナル抗体の反応特異
性トロンビンとＰＣＩを5U/mlヘパリン存在下でインキュ
ベートし、経時的にサンプリングを行い、ウエスタンブ
ロット法で上記のモノクローナル抗体の反応性を検討し
た。その結果、本抗体はＰＣＩとは実質的に反応せず、
トロンビンとＰＣＩの複合体、およびトロンビンとの反
応の結果生成した修飾型ＰＣＩと反応した(図１)。この
ことから本抗体は、複合体の形成によりＰＣＩに出現す
る新しいエピトープを認識することが予想された。

【００１３】実施例２ＰＣＩ−ウロキナーゼ複合体に
対する抗ＣＩＣモノクローナル抗体の反応性実施例１と同様の方法で、ＰＣＩ−２本鎖ウロキナーゼ
複合体と抗ＣＩＣモノクローナル抗体の反応性をウェス
タンブロット法で検討した。その結果、ＰＣＩ−ウロキ
ナーゼ複合体のみにバンドが発現し、ＰＣＩ、２本鎖ウ
ロキナーゼではバンドはみられなかった。

【００１４】実施例３ＰＣＩ−血漿カリクレイン複合
体に対する抗ＣＩＣモノクローナル抗体の反応性実施例１と同様の方法で、ＰＣＩ−血漿カリクレイン複
合体と抗ＣＩＣモノクローナル抗体の反応性をウェスタ
ンブロット法で検討した。その結果、ＰＣＩ−血漿カリ
クレイン複合体のみにバンドが発現し、ＰＣＩ、血漿カ
リクレインではバンドはみられなかった。

【００１５】実施例４健常人における血漿中ＣＩＣの
測定 1)抗ＰＣモノクローナル抗体の作製実施例１と同様の方法によって精製した100μgのＰＣを
含む溶液を、同容量のフロイント完全アジュバントとと
もに、BALB/cマウスの腹腔内に２週間間隔で５回投与し
た。血清中の抗ＰＣ抗体を確認した後、100μgのＰＣ溶
液を尾静脈内に投与した。３日後に脾臓を摘出し、ケー
ラーおよびミルステインの方法で、ポリエチレングリコ
ール1500を使用して脾臓細胞をミエローマ細胞P3UIと細
胞融合させた。その後、ＰＣおよびＣＩＣを抗原とし
て、ＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを実施した。限界希
釈法によって、両方の抗原に対して反応するモノクロー
ナル抗体を得た。

【００１６】2)抗ＣＩＣ抗体固相化ビーズの調製実施例１で得た精製抗ＣＩＣ抗体を、0.15Mの塩化ナト
リウムを含む0.15Mのリン酸緩衝液(pH7.8)で0.5mg/mlの
濃度になるように調製し、抗体溶液1mlと30mgのDynabea
ds M450 Uncoated(ダイナール社)を混合し、室温で一夜
混和した。１％のＢＳＡおよび0.15Mの塩化ナトリウム
を含む0.15Mのリン酸緩衝液(pH7.8)で洗浄した後、同溶
液に懸濁して保存した。

【００１７】3)標識抗体の作製標識用の抗体には前記の抗ＰＣ抗体を用いた。抗体を0.
15Mの塩化ナトリウムを含む0.15Mのリン酸緩衝液(pH7.
8)で、2mg/mlの濃度になるように調製した。この抗体溶
液0.5mlとジメチルスルホキサイドに溶解した標識プロ
ーブである、[4-(N-サクシミジルオキシ-カルボニルプ
ロピル)-4'-メチル-2,2'-ビピリジン]ビス(2,2'-ビピリ
ジン)ルテニウム(II)ジヘキサフルオロフォスフェイト
溶液35μlを混合し、室温で30分間攪拌した。2Mのグリ
シン溶液を10μl加え、さらに室温で10分間攪拌し、反
応を停止させた。その後ゲル濾過によって標識抗体を精
製した。

【００１８】4)測定方法健常人81例から得た血漿および標準抗原を、それぞれ、
0.15Mの塩化ナトリウム、5mMのＥＤＴＡを含む30mMのリ
ン酸緩衝液(pH6.5)、および7％ウシ血清アルブミンを含
む50mMのリン酸緩衝液(pH6.5)で希釈した。標識抗体は1
0％の正常ウサギ血清を含む50mMのリン酸緩衝液(pH6.5)
で希釈した。抗ＣＩＣ抗体固相化ビーズは反応溶液に懸
濁させた。サンプル溶液200μlにビーズ懸濁液を25μl
を加えて攪拌後、室温で４分間反応させた。さらに同様
の操作を行った後、磁気ラックを用いてビーズを集め、
上清をデカントによって除去し、ビーズを0.15Mの塩化
ナトリウムおよび0.01％のTween20を含む10mMのトリス
塩酸緩衝液(pH7.5)で洗浄した。次に標識抗体溶液200μ
lを加えて攪拌後、室温で４分間反応させた。さらに同
様の操作を行った後、磁気ラックを用いてビーズを集
め、上清をデカントによって除去した。ビーズを洗浄
後、0.05％のTween20および50mMのトリプロピルアミン
を含む0.15Mのリン酸緩衝液(pH7.5)を300μl加えて、ビ
ーズを懸濁し電気化学発光測定法(ＥＣＬ法)で測定し
た。その結果、健常人81例の血漿中ＣＩＣ濃度は1.56±
0.48(平均±標準偏差)ng/mlであった。

【００１９】実施例５人工透析患者における血漿中Ｃ
ＩＣの測定実施例４と同様の方法で、人工透析を受けている患者18
例の血漿中ＣＩＣ濃度を測定した。その結果、血漿中Ｃ
ＩＣ濃度は4.00±2.67(平均±標準偏差)ng/mlであっ
た。また、同時にＥＬＩＳＡ法(特開平２−２３６４５
２)によって、血漿中ＣＩＣ濃度を測定し上記結果と比
較した。その結果、ＥＣＬ法とＥＬＩＳＡ法による測定
値の間には、相関係数0.87と高い相関関係がみられた
(図２)。

【００２０】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰＣＩとトロンビンをインキュベート後、抗Ｃ
ＩＣ抗体に対する反応性をウェスタンブロッティング法
で確認した結果を示した図である。

【図２】ＥＣＬ法とＥＬＩＳＡ法による血漿中ＣＩＣ濃
度の相関関係を示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プロテインＣインヒビターとプロテアーゼ
の複合体を認識するモノクローナル抗体であって、イン
タクトのプロテインＣインヒビターを実質的に認識せ
ず、該複合体中のプロテインＣインヒビターを認識する
モノクローナル抗体。
【請求項２】プロテアーゼが活性化プロテインＣ、血漿
カリクレイン、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、トロンビ
ン、ウロキナーゼまたは組織中プラスミノーゲン活性化
因子である請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】プロテアーゼが活性化プロテインＣである
請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】プロテインＣインヒビターとプロテアーゼ
の複合体を測定する方法であって、（１）生体試料中の
プロテインＣインヒビターとプロテアーゼの複合体と請
求項１記載のモノクローナル抗体を含むものからなる試
薬を混合し、免疫反応物を生成させる工程、（２）上記
免疫反応物を分離した後、複合体中のプロテアーゼを認
識する標識抗体と反応させる工程、（３）複合体に結合
した標識抗体を測定する工程、からなる測定方法。
【請求項５】プロテアーゼが活性化プロテインＣであ
り、標識抗体が標識抗活性化プロテインＣ抗体または標
識抗プロテインＣ抗体である請求項４に記載のプロテイ
ンＣインヒビターとプロテアーゼの複合体を測定する方
法。
【請求項６】プロテインＣインヒビターとプロテアーゼ
の複合体を認識するモノクローナル抗体であって、イン
タクトのプロテインＣインヒビターは実質的に認識せ
ず、該複合体中のプロテインＣインヒビターを認識する
モノクローナル抗体を構成成分とするプロテインＣイン
ヒビターとプロテアーゼの複合体の測定試薬。
【請求項７】プロテインＣインヒビターとプロテアーゼ
の複合体を認識するモノクローナル抗体であって、イン
タクトのプロテインＣインヒビターは実質的に認識せ
ず、該複合体中のプロテインＣインヒビターを認識する
モノクローナル抗体と、複合体中のプロテアーゼを認識
する抗体を構成成分とするプロテインＣインヒビターと
プロテアーゼの複合体の測定試薬。
【請求項８】プロテインＣインヒビターとプロテアーゼ
の複合体を認識するモノクローナル抗体であって、イン
タクトのプロテインＣインヒビターは実質的に認識せ
ず、該複合体中のプロテインＣインヒビターを認識する
モノクローナル抗体と、抗活性化プロテインＣ抗体また
は抗プロテインＣ抗体を構成成分とするプロテインＣイ
ンヒビターとプロテアーゼの複合体の測定試薬。