JPH11127862A

JPH11127862A - 標的核酸の検出方法

Info

Publication number: JPH11127862A
Application number: JP9300943A
Authority: JP
Inventors: Tomohiro Suzuki; 智博鈴木; Hisashi Okamoto; 尚志岡本; Nobuko Yamamoto; 伸子山本; Mitsuhiko Shiotani; 光彦塩谷
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1997-10-31
Publication date: 1999-05-18

Abstract

(57)【要約】【課題】少なくとも２種の標識物質で標識系を形成し
て、これら標識物質間での電子を移動を、標的核酸とプ
ローブ核酸とから形成されるハイブリッド体の二重らせ
ん構造を介して行わせて、それに伴うこれら標識物質の
少なくとも１種における変化を検出することで、標的核
酸の有無を調べる方法における操作を簡易化する。【解決手段】少なくとも２種の標識物質をリンカーで
連結した標識化ユニットを用意し、これを標的核酸とプ
ローブ核酸との反応系に加えることで、標識化ユニット
に結合した標識物質間における電子移動を標的核酸とプ
ローブ核酸とから形成されたハイブリッド体を介して行
わせ、それに伴うこれら標識物質の少なくとも１種にお
ける変化を検出して、標的核酸の有無を調べる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は特定の塩基配列を有
する標的核酸を検出する技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】特定の塩基配列を有する標的核酸の検出
方法としては、これまで様々な技術が提案されてきてお
り、一部実用化されているものもある。最も代表的な技
術は、ＤＮＡプローブを用いた固相ハイブリダイゼーシ
ョン法である。固相ハイブリダイゼーション法の問題点
としては、固相への標的核酸もしくはプローブ核酸のト
ラップの効率が悪い、標的核酸とハイブリッドを形成し
たプローブ核酸と、ハイブリッドを形成しなかったプロ
ーブ核酸を分離する処理（Ｂ／Ｆ分離）が必要である、
またＢ／Ｆ分離の際の洗浄の条件に厳密性を要求される
等の点が挙げられ、これらの問題点を解決すべく数多く
の技術の提案がなされてきている。その例としては、プ
ローブ核酸が標的核酸の一本鎖とハイブリッドを形成し
た際に、蛍光物質を標識したプローブの蛍光の偏向特性
が変化することを利用した蛍光偏向解消法、同様に、ス
ピンラベルしたＥＳＲ（電子スピン共鳴）特性が変化す
ることを利用するスピン解消法等が挙げられる。

【０００３】また近年では、プローブ核酸が標的核酸と
ハイブリッドを形成した際に、プローブ核酸の両末端に
結合した蛍光物質が立体的に近い位置に配置され、その
近接効果で、一方の蛍光物質を励起した場合に、他方の
蛍光物質にエネルギーが移動し、その結果後者の蛍光物
質が発光することを利用したエネルギー移動法が提案さ
れており、これに類する技術に関する特許出願も多い。

【０００４】また、近年核酸の二重らせん構造内部の、
核酸塩基対のつながりの中を電子が比較的流れやすいと
いう報告があり（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９
２，１１４，３６５６−３６６０）、それを利用して、
例えば、プローブ核酸が標的核酸とハイブリッドを形成
した際に、プローブ核酸の一方の末端に結合した電子供
与体から他方の末端に結合した電子受容体に電子が移動
し、その結果としての電子供与体及び電子受容体の少な
くとも一方の変化を検出することにより、標的核酸の存
在を検出する方法が特開平６−１５３９９９号公報に開
示されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】ここでハイブリッド体
の有無の正確な検出、さらにはハイブリッド体中のミス
マッチの正確な検出の為には電子供与体と電子受容体と
の距離を制御することが好ましい。そして該電子供与体
と電子受容体との距離を制御する具体的な方法として
は、例えばこれらの物質をプローブ核酸の所定の位置に
各々結合させておく方法がある。しかしこの方法におい
ては、各塩基配列に対応したプローブ核酸それぞれに対
し、電子供与体あるいは電子受容体などの標識物質を結
合しなくてはならないことにある。プローブ核酸は検出
におけるターゲットである標的核酸の認識すべき塩基配
列に対して相補的な塩基配列を持つ必要があることか
ら、標的核酸が異なればそれに対応したプローブ核酸の
塩基配列もその都度変えなければならない。プローブ核
酸に標識物質を結合するには様々な方法があり、プロー
ブ核酸の結合に望ましい位置、化学構造、標識物質の化
学構造に応じて結合操作における難易度も様々である
が、特に、プローブ核酸の二ヶ所以上にそれぞれ異なる
物質を結合する場合には難しさも当然増してくることに
なる。このプローブ核酸の合成を標的核酸の各塩基配列
ごとに行うことは非常に手間のかかる操作となり、それ
にともなう検出コストも上昇することになる。

【０００６】本発明の目的は、上述した少なくとも２種
の標識物質から標識系を形成して、標的核酸とプローブ
核酸とのハイブリッド体を検出する方法における上述し
た問題点を解決することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の検出方法は、サ
ンプル中の標的核酸とプローブ核酸とのハイブリッド体
の存在の有無を検出する方法であって、ハイブリッド体
との共存下においてその二重らせん構造中を電子が流れ
る現象によって相互作用可能である第１及び第２の標識
物質を、リンカーを介して結合した標識化ユニットを用
意する工程；該標的核酸の塩基配列と相補的な塩基配列
を有するプローブ核酸を該サンプル中に加え、次いで該
サンプルを該標的核酸と該プローブ核酸とがハイブリッ
ド体を形成可能な条件下に置く工程；及び該ハイブリッ
ド体が形成されている可能性のあるサンプルと該標識化
ユニットを混合し、該標識化ユニットの第１の標識物質
及び第２の標識物質の少なくとも一方の該相互作用に基
づく変化の有無を検出し、該サンプル中のハイブリッド
体の存在の有無を検出する工程、を有することを特徴と
する。

【０００８】本発明の方法は、プローブ核酸に標識物質
を予め結合させた状態でこれを標的核酸に作用させる代
りに、プローブ核酸と標的核酸とのハイブリッド体を形
成させた後に、リンカーで連結した少なくとも２種の標
識物質を該ハイブリッド体に作用させて、これを検出す
るものであり、本発明によれば、各プローブ核酸ごとに
標識物質を選定して、結合させるという煩雑な操作を省
略して、操作の簡便化と測定効率の簡便化を図ることが
可能となる。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明において用いられる標識物
質は、リンカーで結合された状態で標的核酸とプローブ
核酸とのハイブリッド体の検出に用いられる。この標識
物質としては、少なくとも２種の物質で、これらの物質
間における電子移動に伴って検出可能な変化を生じるこ
とのできる標識系を形成できるものを用いることができ
る。例えば、電子供与体と電子受容体の組合せなどを用
いることができる。電子供与体及び電子受容体として
は、これらの機能を有する各種色素を挙げることができ
る。具体例としては、リンカーの両末端に電子供与性の
色素（ドナー）と電子受容性の色素（アクセプター）を
結合させておき、ドナーからアクセプターへの電子の移
動を、光励起によるドナー色素の消光現象あるいはアク
セプター色素の発光現象により検出する方法が挙げられ
る。更に、ＴＥＭＰＯ（２，２，６，６−ｔｅｔｒａｍ
ｅｔｈｙｌ−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｙｌｏｘｙ；ｆｒｅｅ
ｒａｄｉｃａｌ）のようなスピントラップ剤を用いて
電子の移動を捕らえてこれを検出する方法も利用でき
る。

【００１０】本発明におけるリンカーは、複数の標識物
質を連結した状態で検出系へ添加するための標識化ユニ
ットの骨格を形成するもので、このリンカー自体を介し
て電子移動が生じないものであって、しかも、ハイブリ
ッド体の二重らせん構造との標識物質が結合した状態に
おいて、検出に必要な変化をハイブリッド体を介した電
子移動によって生じる程度に適当な間隔で複数の標識物
質を連結できるような材質及び構造を有するものが利用
される。

【００１１】なお、本発明で利用される標識物質間での
電子移動による変化は、標識化ユニットがハイブリッド
体に結合していない状態と、結合している状態との間で
検出可能な程度に十分なものであればよく、標識化ユニ
ットがハイブリッド体に結合して初めて電子移動が可能
となるような標識物質の組合せを用いるのが、検出精度
を高める上でより好ましい。

【００１２】標識物質をリンカーで連結して形成した標
識化ユニットは、標的核酸、プローブ核酸、及び標的核
酸とプローブ核酸とのハイブリッド体が可溶な溶媒に可
溶であることが望ましく、この溶媒としては、例えば、
核酸等の生体分子を取り扱う際と同様の、水系の緩衝液
を好適に用いることができる。

【００１３】リンカーの構造は、上記の条件を満たすも
のであれば特に限定されず、例えば、単一または複数の
構成要素からなるオリゴマーまたはポリマー等を用いる
ことができる。リンカーを構成する要素としては、アミ
ノ酸、リン酸、ヌクレオチド、糖、エステル、グリコー
ル、イミド等が挙げられるが、ハイブリッド体との反応
の条件を考慮すれば、水溶性の化合物であることが望ま
しい。特に、α−ヘリックス構造を有する水溶性のペプ
チドは、長さを安定に維持でき、また、標識物質の向き
（配向）もある程度制御できることから、より望まし
い。

【００１４】リンカーと標識物質の結合には、種々の結
合様式が利用可能であり、例えば、アミド結合、エステ
ル結合及びチオエーテル結合等を挙げることができる。
リンカーの好ましい長さとしては、二本鎖ＤＮＡの１５
〜２０塩基対に相当する５０Å程度を挙げることができ
る。

【００１５】リンカーに結合した標識物質のハイブリッ
ド体との結合様式は、少なくとも一つの標識物質がハイ
ブリッド体に測定に必要な程度で安定に結合し、その結
果として、少なくとも二つの標識物質間で二重らせん構
造を介した電子移動が可能な状態になる結合様式であれ
ばよく、特に限定されない。物質と二重らせん構造との
結合様式としては、物質が二重らせんの塩基対間に挿入
されるインターカレーションと二重らせん構造によって
形成されている溝に物質が入り込むグルーブバインディ
ングが一般的に知られている。本発明においても、標識
物質と二重らせん構造を有するハイブリッド体との結合
様式として、結合の安定性性等を考慮すると、これらイ
ンターカレーションあるいはグルーブバインディングが
望ましい。

【００１６】標的核酸が二本鎖核酸である場合において
は、片方の一本鎖とプローブ核酸とでハイブリッドを形
成させた後、標識物質を結合させたリンカーと反応させ
るが、その際、このリンカーがハイブリッド体以外の反
応系中に含まれる二本鎖に非特異的に結合して検出に支
障をきたすような場合には、標的核酸を一本鎖化して用
いるとよい。また、標的核酸がＲＮＡなどの一本鎖核酸
ある場合にはこのような問題を考慮する必要はない。

【００１７】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。実施例１［１］ルテニウム錯体及びロジウム錯体を結合したペプ
チドの合成（１）Ｒｕ（ｐｈｅｎ）₂ｐｈｅｎ’²⁺の合成ルテニウム錯体Ｒｕ（ｐｈｅｎ）₂ｐｈｅｎ’²⁺の合成
は、Ａ．Ｍ．Ｐｙｌｅら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ
ｃ．１９８９，１１１，３０５１−３０５８を参考に合
成を行った。ここで、ｐｈｅｎは１，１０−フェナンス
ロリン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）を示し、ｐｈ
ｅｎ’は５−アミノ−１，１０−フェナンスロリンを示
す。（２）固相法によるロジウム錯体を末端に持つペプチド
の合成末端にロジウム錯体［Ｒｈ（ｐｈｉ）₂ｐｈｅｎ］を有
するペプチドはＮｉｒａｎｊａｎＹ．Ｓａｒｄｅｓａ
ｉら（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１９９
５，６，３０２−３１２）に従って合成した。ここでｐ
ｈｉはフェナンスレンキノンジイミンを示す。この文
献に従い、樹脂上において、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成
法により以下の２４のアミノ酸からなる配列（配列番
号：１）を有するペプチドを合成した後、末端のアミノ
基にグルタル酸を介してロジウム錯体を結合させた。ＮＨ₂−Ala-Lys-Leu-Gln-Lys-Ala-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala
-Gln-Lys-Ile-Ala-Ala-Lys-Leu-Val-Ala-Ala-Leu-Lys-G
ly−樹脂なお、ペプチドを構成するアミノ酸はペプチドが両親媒
性となるように疎水性のアミノ酸と親水性のアミノ酸を
分離配置した。（３）ペプチドの樹脂からの切り出し樹脂からのペプチドの切り出しも先に引用したＮｉｒａ
ｎｊａｎＹ．Ｓａｒｄｅｓａｉらの文献に従って行っ
た。切り出した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）にて精製を行い、凍結乾燥により目的物を回収し
た。切り出したペプチドのＣ−末端のカルボン酸基への
ルテニウム錯体との結合は、ＤＭＦ（ジメチルホルムア
ミド）中でＤＣＣカップリング反応を行うことにより行
った。ここでＤＣＣはジシクロヘキシルカルボジイミド
を示す。ルテニウム錯体とＤＣＣ関連試薬（ＤＣＣ及び
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）大過剰の条件でカ
ップリング反応を行い、逆相カラムを用いたＨＰＬＣを
用いて精製を行った後、凍結乾燥によりこれを回収し
た。（４）合成したペプチドのα−ヘリックス形成合成したロジウム錯体及びルテニウム錯体をペプチドで
連結した標識化ユニットの円偏光二色性スペクトルを１
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭＮａＣｌ
／５ｍＭＫＣｌ中で測定した結果２２０ｎｍ付近に
負のピークがあり、標識化ユニットを構成するペプチド
がリン酸緩衝液中でα−ヘリックス構造をとっているこ
とが確認された。［２］オリゴヌクレオチドの合成標的ＤＮＡとしてのＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（一本鎖）の
一部と相補的な以下の塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを
常法により合成し、ＨＰＬＣにより純度を確認してから
プローブ核酸として使用した。５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−
３’（配列番号：２）［３］オリゴヌクレオチドとＭ１３ｍｐ１８ＤＮＡとの
ハイブリッド形成反応上記の２０量体プローブ核酸の０．２μＭと、各濃度の
Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡ（宝酒造社製）を１ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭＮａＣｌ／５ｍＭ
ＫＣｌ中で８０℃まで加熱し、その後、徐々に冷却し
て室温まで温度を下げて、部分的に二本鎖を有するハイ
ブリッド体を作製した。次に、得られたハイブリッド体
に、先に合成した標識化ユニットを最終濃度が０．２μ
Ｍとなるように加えた。［４］蛍光強度の測定蛍光強度の測定は、日立製作所分光蛍光光度計Ｆ−
４０１０を用いて行った。測定には人工石英のセルを使
用し、プローブ核酸と標識化ユニットの濃度を固定し、
標的核酸の濃度を０Ｍから０．２５μＭまで０．０５μ
Ｍずつ変化させ各濃度におけるルテニウム錯体の蛍光強
度の変化を測定した。なお、ルテニウム錯体の励起波長
は４５０ｎｍであり、６００ｎｍにおける蛍光強度を測
定した。図１に各濃度における蛍光強度比（標的核酸を
含有しない場合（０Ｍ）での蛍光強度を１とした場合の
強度比）を示す。図１から、標的核酸であるＭ１３ｍｐ
１８ＤＮＡの濃度が増えるに従って、ルテニウム錯体か
らの蛍光が弱まる様子がわかる。これは、ハイブリッド
体に標識化ユニットが結合した結果、二本鎖ＤＮＡ内部
を電子が流れたことによるものである。このことによ
り、プローブ核酸と標的核酸のハイブリッド体が標識化
ユニットによって検出されたことになる。

【００１８】実施例２プローブ核酸として以下の配列のものを用いる以外は実
施例１と同様にして、各標的核酸濃度における蛍光強度
の変化を調べた。５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−
３’（配列番号：３）この配列は、実施例１の配列と１塩基異なっており、Ｍ
１３ｍｐ１８ＤＮＡとはミスマッチするように設計され
ているものである。得られた結果を図１に示す。図をみ
ると実施例１で見られたような大きな消光現象は認めら
れず、標的核酸の濃度を増やしても蛍光強度に大きな変
化は見られなかった。この結果は、プローブ核酸と標的
核酸の間にミスマッチが生じて正確な二本鎖が形成され
ず、ハイブリッド体を介して電子の移動が起らなかった
ことによるものといえる。

【００１９】実施例３プローブ核酸として以下の配列を有するものを用いる以
外は実施例１と同様にして各標的核酸濃度における蛍光
強度の変化を調べた。５’−ＴＡＴＡＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴ−
３’（配列番号：４）得られた結果を図１に示す。図をみると、実施例２と同
様、消光現象は認められず、標的核酸の濃度を増やして
も大きな変化は見られなかった。この結果は、プローブ
核酸の標的核酸に対する相補性が低いために正確な二本
鎖が形成されず、電子の移動が起らなかったことによる
ものといえる。

【００２０】実施例４標識化ユニットによるｍＲＮＡの検出［１］オリゴヌクレオチドの合成ヒトβ２アドレナリン作用受容体ｍＲＮＡの塩基配列の
一部分に相補的な以下の塩基配列を有する２２量体のプ
ローブ核酸を常法により合成した。５’−ＡＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＧＡＣＧＣＡＣＡＧＣＡ
−３’（配列番号：５）［２］ｍＲＮＡの合成常法によりヒトβ２アドレナリン作用受容体ｃＤＮＡか
らＴ₇ＲＮＡポリメレースを用いてヒトβ２アドレナリ
ン作用受容体ｍＲＮＡを合成し、ＤＮａｓｅ処理後精製
した。［３］プローブ核酸とｍＲＮＡとのハイブリッド形成反
応上記で合成した２２量体オリゴヌクレオチドの０．２μ
Ｍと、ヒトβ２アドレナリン作用受容体ｍＲＮＡの０．
２μＭを１ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）／１４５ｍ
ＭＮａＣｌ／５ｍＭＫＣｌ中で８０℃まで加熱
し、その後、徐々に冷却して室温まで温度を下げて部分
的に二本鎖核酸を有するハイブリッド体を作製した。

【００２１】このハイブリッド体に対して、実施例１と
同様にして、蛍光強度の測定を行うと、ｍＲＮＡが存在
しない時に比べてルテニウム錯体の蛍光強度が大きく減
少した。このことは実施例１と同様ハイブリッド体に金
属錯体を有する標識ユニットが結合した結果、二本鎖Ｄ
ＮＡ内部を電子が流れたことによるものである。これに
より、特定の塩基配列を有するｍＲＮＡが検出できたこ
とになる。

【００２２】実施例５以下の配列を有するプローブ核酸を用いる以外は実施例
４と同様にして、各標的核酸濃度における蛍光強度の変
化を調べた。５’−ＣＧＡＴＡＡＡＴＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＡＴＴＴ
−３’（配列番号：６）なお、このプローブ核酸の配列はヒトβ２アドレナリン
作用受容体ｍＲＮＡの塩基配列と相補的なものではな
い。この塩基配列を有するプローブ核酸を用いた場合で
は、実施例４のような消光現象は認められず、標識化ユ
ニットのみを用いて測定した場合と同じ蛍光強度が測定
された。この結果は、プローブ核酸の塩基配列が標的核
酸に対して相補的でないために、二本鎖核酸が形成され
ず、二本鎖核酸を介した電子移動によるルテニウム錯体
の消光現象が起らなかったためであるといえる。

【００２３】実施例６［１］ルテニウム錯体、ピレン、ＴＥＭＰＯを結合した
ペプチドの合成（１）Ｒｕ（ｐｈｅｎ）₂ｐｈｅｎ''²⁺の合成ルテニウム錯体Ｒｕ（ｐｈｅｎ）₂ｐｈｅｎ''²⁺は、
Ａ．Ｍ．Ｐｙｌｅら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１
９８９，１１１，３０５１−３０５８を参考に合成し
た。ここで、ｐｈｅｎは１，１０−フェナンスロリン
（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）を示し、ｐｈｅｎ''
は５−（アミノグルタリル）−１，１０−フェナンスロ
リン［５−（ａｍｉｎｏｇｌｕｔａｒｙｌ）−１，１０
−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ］を示す。また、ｐｈ
ｅｎ''の合成は、ＮｉｒａｎｊａｎＹ．Ｓａｒｄｅｓ
ａｉら（ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．１９９
５，６，３０２−３１２）に従って行った。（２）ペプチドの合成以下のアミノ酸配列（配列番号：７）を有するペプチド
の合成を、実施例１と同様にＦｍｏｃ固相合成法に従っ
て行った。ＮＨ₂−Ala-Lys-Leu-Gln-Lys-Ala-Ala-Leu-Ala-Leu-Ala
-Gln-Lys-Ile-Ala-Ala-Lys-Leu-Val-Ala-Ala-Leu-Lys-G
ly−樹脂ただし、ペプチドの特定部位の側鎖（Ｎ末端から２番目
のＬｙｓのアミノ基）にＴＥＭＰＯを導入する必要があ
ることから、Ｎ末端に最も近いリジン（Ｌｙｓ）として
は、側鎖のアミノ基をＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙ
ｃａｒｂｏｎｙｌ）基で保護したものを使用し、それ以
外のリジンについてはアミノ基がＣｌＺ（ｃａｒｂｏｂ
ｅｎｚｏｘｙｃｈｌｏｒｉｄｅ）基によって保護され
ているものを使用した。樹脂中のペプチドの含有量は
０．２ｍｍｏｌとして合成を行った。（３）ペプチドと１−ピレン酪酸（１−ｐｙｒｅｎｅｂ
ｕｔｙｒｉｃａｃｉｄ）との結合１−ピレン酪酸２３１ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ
０．８ｍｌに溶かし、１−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌ
ｅ：ＨｏＢｔ）の０．５ＭＤＭＦ溶液１．６ｍｌとジ
イソプロピルカルボジイミド１０１ｍｇ（０．８ｍｍｏ
ｌ）を加え、室温で３０分間攪拌した。このピレンのＨ
ｏＢｔエステルを、脱保護した樹脂上のペプチドに加
え、１０分間反応させた。ニンヒドリン反応等により反
応が完全に進んだことを確認した後、ＤＭＦで洗浄し
た。（４）保護基であるＢｏｃ基の除去及びペプチドの樹脂
からの切り出しペプチドの樹脂からの切り出しは常法に従ってトリフル
オロ酢酸を用いて行った。トリフルオロ酢酸により切り
出しを行ったことで、リジンのアミノ基を保護している
Ｂｏｃ基が除去され、リジンのアミノ基はこの段階で脱
保護された。なお、この段階で保護基であるＣｌＺ基は
脱離しない。得られた生成物はＨＰＬＣで精製し、凍結
乾燥により回収した。（５）ＴＥＭＰＯのペプチドへの結合得られたペプチドを少量のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキ
シド）に溶解させた後、４−イソチオシアネートＴＥＭ
ＰＯ２１ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を加え、一晩反応さ
せた。反応終了後、特に精製は行わずに、ＤＭＳＯ溶液
のまま次の反応に使用した。（６）ルテニウム錯体のペプチドへの結合ピレン及びＴＥＰＯの結合したペプチドの末端のアミノ
基と先に合成したルテニウム錯体Ｒｕ（ｐｈｅｎ）₂ｐ
ｈｅｎ''²⁺のアミノ基を通常のＤＣＣカップリング反応
により結合させた。反応は、ルテニム錯体及びＤＣＣ関
連試薬大過剰の条件で行った。反応後、ＨＰＬＣにより
精製を行い、ピレン、ＴＥＭＰＯ及びルテニウム錯体を
結合した標識化ユニットとしてのペプチドを得た。（７）ＣｌＺ基の除去トリフルオロ酢酸により除去されなかった保護基である
ＣｌＺ基は常法に従ってＴＭＳＯＴｆ／ＴＦＡにより除
去して脱保護を行った。（８）合成したペプチドのα−ヘリックス形成合成した標識化ユニットの円偏光二色性酸スペクルを１
ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）／１４５ｍＭＮａＣ
ｌ／５ｍＭＫＣｌ中で測定した結果２２０ｎｍ付近に
負のピークが現れた。このピークはα−ヘリックス構造
を持つペプチドの典型的なピークであり、標識化ユニッ
トの骨格をなすペプチドがこの緩衝液中でα−ヘリック
ス構造を形成していることが確認された。［２］プローブ核酸及び標的核酸標識化ユニットを上記（１）〜（７）の操作で得られた
ものに代える以外は実施例１の［３］と同様にして反応
を行った。［３］ＥＳＲスペクトルの測定上記［２］の各反応で得られたサンプルについてのＥＳ
Ｒは日本電子社製の装置を利用して行った。測定には、
人工石英の扁平セルを用いた。サンプル調製後、ルテニ
ウム錯体の励起波長である４５０ｎｍの励起光を照射し
て測定に用いた。ＥＳＲ及び光照射装置の設定は以下の
とおりである。

【００２４】

【表１】図２、３に標的核酸の濃度に対するＥＳＲシグナル強度
比及び線幅を示す。図２、３からもわかるように、標的
核酸の濃度を上げていくと、線幅に変化を与えないま
ま、ＥＳＲの強度比が減少している様子がわかる。線幅
に変化が生じないことから、このＥＳＲの強度変化は化
学変化に由来するものでないことがわかる。従って、ペ
プチドの末端に結合したルテニウム錯体からペプチドを
介して反対側に結合したＴＥＭＰＯに電子が流れた結
果、ＴＥＭＰＯのスピンが解消されたことが確認され
た。

【００２５】実施例７プローブ核酸の配列として下記の配列を用いる以外は実
施例６と同様にして各サンプルにおけるＥＳＲの強度を
測定した。５’−ＧＴＴＧＴＡＡＡＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ−
３’（配列番号：８）この配列は、実施例６の配列とは１塩基異なっており、
Ｍ１３ｍｐ１８ＤＮＡとミスマッチするように設計され
たものである。各サンプルのＥＳＲの強度を測定した結
果、実施例６で見られるような標的核酸の濃度に依存し
たＥＳＲシグナルの強度変化は観測されず、プローブ核
酸のみを反応系に用いた（標的核酸は含有しない）場合
と同じ強度であった。このことはミスマッチしたプロー
ブ核酸と標的核酸とのハイブリッド体の場合には正確な
二本鎖が形成されず、電子が移動しなかったためといえ
る。

【００２６】

【発明の効果】本発明の標的核酸の検出方法は、各塩基
配列ごとにプローブ核酸のラベル化などの複雑な合成を
行う必要がないという利点を持つ。また、標識物質をプ
ローブ核酸に結合する方法においてはこれらのマッチン
グにおいて標識として使用できるものに制限が加わる場
合があるが、本発明においては、標識物質とプローブ核
酸との結合におけるマッチングを考慮する必要はなく、
標識物質の選択幅を拡大できる。その結果、各塩基配列
ごとにプローブ核酸を合成するだけで、容易に標的核酸
の検出が可能となる。

【００２７】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Lys Leu Gln Lys Ala Ala Leu Ala Leu Ala Gln Lys Ile 1 5 10 Ala Ala Lys Leu Val Ala Ala Leu Lys Gly 15 20 配列番号：２配列の長さ：２０配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTTGTAAAAC GACGGCCAGT 20 配列番号：３配列の長さ：２０配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTTGTAAAAG GACGGCCAGT 配列番号：４配列の長さ：２０配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TATATAAAAT ATATATATAT 20 配列番号：５配列の長さ：２２配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 ATGCTGGCCG TGACGCACAG CA 22 配列番号：６配列の長さ：２２配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CGATAAATCA GCATTGCTAT TT 22 配列番号：７配列の長さ：２４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Lys Leu Gln Lys Ala Ala Leu Ala Leu Ala Gln Lys Ile Ala Ala Lys 1 5 10 15 Leu Val Ala Ala leu Lys Gly 20 配列番号：８配列の長さ：２０配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTTGTAAAAG GACGGCCAGT

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１〜３において測定した蛍光強度を、標
的核酸を加えない場合の蛍光強度を１とした蛍光強度比
として表わした図であり、●は実施例１で得られた結果
を、×は実施例２で得られた結果を、■は実施例３で得
られた結果をそれぞれ示す。

【図２】実施例６及び７において得られたＥＳＲシグナ
ル強度の経時的変化を、標的核酸を加えない場合の強度
を１とした強度比として表わした図であり、△は実施例
６で得られた結果を、■は実施例７で得られた結果をそ
れぞれ示す。

【図３】実施例６及び７において得られたＥＳＲシグナ
ルの線幅の経時的変化を示す図であり、△は実施例６で
得られた結果を、■は実施例７で得られた結果をそれぞ
れ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者塩谷光彦愛知県岡崎市竜美南２−４−１竜美ヶ丘公務員宿舎２−43

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル中の標的核酸とプローブ核酸と
のハイブリッド体の存在の有無を検出する方法であっ
て、ハイブリッド体との共存下においてその二重らせん構造
中を電子が流れる現象によって相互作用可能である第１
及び第２の標識物質を、リンカーを介して結合した標識
化ユニットを用意する工程；該標的核酸の塩基配列と相
補的な塩基配列を有するプローブ核酸を該サンプル中に
加え、次いで該サンプルを該標的核酸と該プローブ核酸
とがハイブリッド体を形成可能な条件下に置く工程；及
び該ハイブリッド体が形成されている可能性のあるサン
プルと該標識化ユニットを混合し、該標識化ユニットの
第１の標識物質及び第２の標識物質の少なくとも一方の
該相互作用に基づく変化の有無を検出し、該サンプル中
のハイブリッド体の存在の有無を検出する工程、を有す
ることを特徴とする検出方法。
【請求項２】前記電子移動が、前記標識化ユニットの
有する標識物質が前記二重らせん構造に結合した結果は
じめて生じるものである請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】前記標識化ユニットが、前記標的核酸、
前記プローブ核酸、前記ハイブリッド体が可溶な溶媒に
可溶である請求項１に記載の検出方法。
【請求項４】前記溶媒が水系の緩衝液である請求項３
に記載の検出方法。
【請求項５】前記リンカーが水溶性の構成物質からな
るオリゴマーまたはポリマーである請求項１に記載の検
出方法。
【請求項６】前記リンカーの構成要素が、リン酸、ヌ
クレオチド、糖、グリコール、アミノ酸及びイミドの少
なくとも１種を含む請求項５に記載の検出方法。
【請求項７】前記リンカーがα−ヘリックス構造を持
ったペプチドである請求項５に記載の検出方法。
【請求項８】前記標識物質の少なくとも１種と前記二
重らせん構造との結合が、インターカレーションによる
ものである請求項１に記載の検出方法。
【請求項９】前記標識物質の少なくとも１種と前記二
重らせん構造との結合が、グルーブバインディングによ
るものである請求項１に記載の検出方法。
【請求項１０】前記標的核酸が一本鎖核酸である請求
項１に記載の検出方法。
【請求項１１】前記一本鎖核酸がＲＮＡである請求項
１０に記載の検出方法。
【請求項１２】前記ＲＮＡがｍＲＮＡである請求項１
１に記載の検出方法。
【請求項１３】二重らせん構造を有する核酸ハイブリ
ッド中のミスマッチの有無を検出する方法であって、該二重らせん構造中にミスマッチがない場合に生じる、
二重らせん構造中を電子が流れる現象によって相互作用
可能である第１及び第２の標識物質を、リンカーを介し
て結合した標識化ユニットを用意する工程；サンプル中
に含まれる標的核酸の塩基配列と相補的である可能性の
高い塩基配列を有するプローブ核酸を該サンプルと混合
し、次いで該サンプル中で該プローブ核酸と該標的核酸
とをハイブリダイズさせる工程；及び該プローブ核酸と
該標的核酸のハイブリッド体を含むサンプルと該標識化
ユニットとを混合し、該第１及び第２の標識物質の少な
くとも一方の、該相互作用に基づく変化の有無を検出
し、それによって該ハイブリッド体中のミスマッチの有
無を検出する工程、を有することを特徴とする検出方
法。