JPH11140097A - 界面活性剤を含有する金コンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 コロイド粒子と生体分子とのコンジュゲ
ートを安定な形態で提供する。 【解決手段】 表面に生体分子を吸着させたコロイド粒
子を含有する組成物であって、界面活性剤をさらに含有
する該組成物；該組成物の製造方法；検出試薬としての
該組成物の使用；コロイド粒子および生体分子より構成
されるコンジュゲートを安定化させる方法；および、上
記組成物を検出試薬として含む、免疫学的検出法のため
の試験キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、表面に生体分子を
吸着させたコロイド粒子を含有する組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質または核酸等の生体分子とコ
ロイド粒子とのコンジュゲートは、例えば、シグナル伝
達物質として、および／または診断法および治療法にお
ける捕獲試薬として、広く使用されている。これらは、
例えば免疫検定法等の検出手法におけるマーカーとして
または遺伝子導入用のマイクロプロジェクタイル(micro
projectile)として作用する。使用可能な粒子は、金属
および金属化合物（例えば、金属酸化物、金属水酸化
物、金属塩）の粒子、並びに金属または金属化合物で被
覆したポリマーコアである［例えば、US-A-4,313,734；
Leuveringら, J. Immunoassay 1 (1980), 77-91; Leuve
ring Dissertation (1984), Sol Particle Immunoassay
(SPIA): The use of Antibody Coated Particles as L
abelled Antibodies in Various Types of Immunoassa
y; Udaら, Anal. Biochem. 218 (1994), 259-264, DE-O
S 41 32 133, 3頁16〜18行（マーカーとしての用途につ
いて）及びTangら, Nature 356 (1992), 152-154; Eise
nbraunら, DNA and Cell Biology 12 (1993), 791-797;
Williamsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991),
2726-2730（遺伝子導入用途について）参照］。さら
に、炭素粒子等の非金属性コロイド粒子が使用できるこ
とも公知である［van Amerongen, Anabiotic '92 (199
3), 193-199］。現在、コロイド金粒子が最も頻繁に用
いられている。

【０００３】生体分子−金コンジュゲートを製造するに
は、まず、テトラクロロ金(III)酸を還元することによ
り常法にて金ゾルを調製する。次いで、各場合に望まれ
る生体分子（例えば、抗体、プロテインＡ、プロテイン
Ｇ、ストレプトアビジン等のタンパク質）を金ゾルにロ
ーディング（負荷）する。各々のローディング条件（p
H、緩衝液、生体分子の濃度等）は、生体分子の等電
点、MPA （minimal protecting amount：最小保護量）
および／またはコンジュゲートの特定用途により決まる
［例えば、De Mey, The Preparation and Use of Gold
Probes: Immunocytochemistry, J. M. PolakおよびS.V.
Noorden発行,115〜145頁, Wright, Bristol1986; J.
E. Beesley, Colloidal Gold: A New Perspective for
CytochemicalMarking, Microscopy Handbooks 17, Oxfo
rd University Press, 1989,特に1〜14頁; G. Frens, N
ature Physical Science, 241 (1973) 20-22; J.Roth,
The Colloidal Gold Marker System for Light and Ele
ctron Microscopic Cytochemistry: Immunocytochemist
ry 2 (1983) 218-284参照］。詳しくは、これらの文献
の記載を参照されたい。

【０００４】コロイド粒子に各々所望の生体分子をロー
ディングした後で、コンジュゲートを安定化させる必要
がある。この安定化は、粒子の凝集を減少させ、吸着を
受け易い残りのフリー表面(free surfaces)を飽和させ
ることを意図している。現段階の技術で使用されている
安定化剤は、例えばウシ血清アルブミン、代用血液混合
物等の不活性なタンパク質、ポリエチレングリコール
（分子量20,000D）、ポリビニルピロリドン、ポリビニ
ルアルコール、ポリビニルスルフェート、デキストラン
およびゼラチン等の水溶解性テクニカル・ポリマーであ
る［例えば、De Mey, 前掲; Beesley,前掲; Behnke, Eu
r. J. Cell Biol. 41 (1986), 326-338; DE 24 20 531
C3; およびMeiselら, J. Phys. Chem. 85 (1981), 179-
187参照］。さらに、ホスファン(phosphane)錯体配位子
による金ゾルの安定化の可能性も記載されている［Schm
idら, Z. Naturforsch. 45b (1994), 989-994］。

【０００５】コロイド金粒子にローディングする際の手
順としては、通常、金へ吸着させるタンパク質の溶液並
びに金ゾルを該タンパク質の等電点(IP)付近のpHへ調整
する。この点については、現段階の技術では、タンパク
質溶液が可能ならば添加剤を含んではならず、例えばイ
オン強度が10mMを超えてはならないことが、良好なロー
ディングを行なうのに必須であると認められている。ロ
ーディングを行なう場合、攪拌下でタンパク質溶液を金
ゾルへ添加するか、または攪拌下で金ゾルをタンパク質
溶液へ添加する。タンパク質が金粒子に結合した後、適
切な安定化剤の溶液を添加する。次いで、場合によって
は、形成したコンジュゲートを、例えば超遠心分離また
はゲル濾過によって精製する。

【０００６】現段階の技術に従って使用される安定化剤
は、金属粒子のフリー表面に吸着結合する。長期保存
や、試料（血液、血清、血漿、尿）との接触による試験
時に発生するような周囲条件の変化、試験片（ストリッ
プ）フリースへのコンジュゲートの取り込み等により、
安定化剤が多少なりとも該表面から脱離したり置き換わ
ったりすることがある。これは、凝集安定性の低下を招
き、非特異的反応性の増加を招く。さらに、使用される
安定化剤の大部分は、場合によっては品質が変化し易
い、特性のはっきりしない生成物である（例えば、ウシ
血清アルブミン、ゼラチン）。このことは、安定化効果
を変動させる原因でもある。

【０００７】粒子表面での吸着過程は非常に複雑であ
り、現在まで、ごく一部しか解明されていない。吸着は
静電的相互作用、ファンデルワールス力および疎水的相
互作用の組み合わせによるものと考えられる（Beesley,
前掲）。この方法では、吸着した生体分子の種類に応じ
て、あるタイプまたは他のタイプの結合が優勢となり得
る。

【０００８】凝集体は、公知の技術によるタンパク質−
金コンジュゲートではある程度生成するものである。こ
れらの望ましくない凝集体は、安定化剤を添加する前
に、既に高い頻度で生成している。凝集体が生成する理
由は、例えば、「粘着性」のタンパク質（即ち、疎水性
表面を有するタンパク質）が互いに結合し、その結果、
該タンパク質とコンジュゲートを形成している金粒子が
架橋されるためと考えられる。従って、例えば、金へ結
合させる前に超遠心分離によってIgG調製物から凝集体
を除かなければならないことが記載されている［W. D.
Geoghegan, G. A.Ackerman, J. Histochem. Cytochem.
25 (1977), 1187-1200］。さらに、タンパク質によって
被覆されていない貴金属粒子（特に金粒子）表面の疎水
性パッチが互いに相互作用し、粒子凝集体を形成し得る
可能性がある。望ましくない凝集体が生成するもう１つ
の原因としては、タンパク質によって被覆されていない
貴金属表面の疎水性パッチが、近隣の金粒子に結合して
いるタンパク質の疎水性パッチと相互作用し、その結果
金粒子同士が架橋することも考えられる。

【０００９】タンパク質−金コンジュゲート同士の二次
架橋もしばしば観察される。この二次架橋は、該コンジ
ュゲートが既に安定化剤で飽和されている場合にも生成
する。これはおそらく、従来の安定化剤を作用させて
も、疎水性パッチが金表面および／または吸着結合して
いるタンパク質に残存するため、タンパク質−金粒子が
遅い速度で何の制御も受けずに凝集するという事実によ
る。これらの問題は、金粒子を含むコンジュゲートで起
こるだけでなく、他の固体（特に、他の金属）で作製さ
れた粒子でも起こる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、コロイド粒子と生体分子とのコンジュゲートを安定
な形態にて提供することである。本発明によるコンジュ
ゲートは、現段階の技術が抱える欠点を克服する。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
の本発明の第１の態様は、表面に生体分子を吸着させた
コロイド粒子を含有する組成物であって、界面活性剤を
さらに含有する上記組成物である。上記の組成物におい
て、界面活性剤はエトキシレート界面活性剤であり得
る。また、上記の組成物において、界面活性剤は0.0001
〜１mMの濃度であり得る。上記の組成物において、上記
粒子は貴金属粒子であり得る。上記の組成物において、
上記コロイド粒子の平均直径は１nm〜1000nmの範囲であ
り得る。上記の組成物において、上記生体分子は、タン
パク質、糖タンパク質、ペプチド、核酸、ペプチド核
酸、サッカリド、抗原およびハプテンからなる群から選
択され得る。

【００１２】本発明のもう１つの態様は、上記のいずれ
かの組成物の製造方法であって、界面活性剤を、生体分
子をローディングする前にコロイド粒子へ添加するか、
および／または生体分子を含む溶液をコロイド粒子にロ
ーディングする前におよび／またはローディングする間
に該生体分子を含む溶液へ添加する上記方法である。

【００１３】本発明のさらにもう１つの態様は、検出試
薬としての、上記のいずれかの組成物の使用である。本
発明のさらにもう１つの態様は、コロイド粒子および生
体分子より構成されるコンジュゲートを安定化させる方
法であって、界面活性剤を、ローディング前にコロイド
粒子へ添加するか、および／または生体分子を含む溶液
をコロイド粒子にローディングする前におよび／または
ローディングする間に該生体分子を含む溶液へ添加する
上記方法である。上記の方法において、コンジュゲート
形成の完了後に追加の安定化剤を添加し得る。

【００１４】本発明のさらにもう１つの態様は、免疫学
的検出法のための試験キットであって、上記のいずれか
の安定化された組成物を検出試薬として含む上記キット
である。

【００１５】

【発明の実施の形態】驚くべきことに、界面活性剤が生
体分子−粒子コンジュゲートを安定化させるのに非常に
適していることが見出された。従って、本発明の主題の
一つは、表面に生体分子を吸着させたコロイド粒子を含
む組成物であって、界面活性剤をさらに含有する前記組
成物である。

【００１６】界面活性剤を、生体分子をローディングす
る前にコロイド粒子（例えば、金ゾル）へ添加すること
により、および／またはコロイド粒子にローディングす
る前におよび／またはローディングしている間に生体分
子を含む溶液へ添加することにより、粒子への生体分子
の結合が、当業者が予測していたよりも遥かに少ない程
度しか妨げられないことが見出された。このことはいく
つかの点で驚くほど有利である。本発明に従って界面活
性剤を添加することにより、既に従来の安定化剤ではコ
ンジュゲート形成の前や再ローディングの前に発生して
しまう凝集過程が防止される。これにより、コンジュゲ
ートの製造過程の再現性が向上し、コンジュゲートの粒
度分布がより均一になる（即ち、単分散性が増大す
る）。

【００１７】現段階の技術の安定化剤に比べて、コンジ
ュゲートの安定性が実質的に改善される。特に、既に安
定化させた生体分子−粒子コンジュゲートがゆっくりと
後凝集(after-aggregation)するのを抑制する（この後
凝集は、従来の組成物を用いた場合に発生するものであ
る）。これにより、長期安定性が向上し、溶液中での凝
集傾向が低減し、周囲条件の変化に対する安定性が向上
し、試験機能（例えば、クロマトグラフ特性）が向上す
る。界面活性剤の添加によって、試験時の生体分子−粒
子コンジュゲートの機能（特に、生体分子−金コンジュ
ゲートの機能）が非常に改善される。従って、例えば、
試験時のブランク読みに相当する非特異的な結合が減少
する。

【００１８】前記改善が、例えば、生体分子の界面活性
剤による置換によってまたは生体分子もしくはコロイド
粒子と界面活性剤との可能な相互作用によってコンジュ
ゲートの機能に負の影響を及ぼすことなく達成し得たの
は、特に驚くべきことであった。

【００１９】本発明の組成物は、水性懸濁液として存在
することができ、また、例えば吸収紙（ろ紙）等のクロ
マトグラフ用の材料上に固定化することもできる。

【００２０】上記粒子は、金属性の粒子または炭素粒子
等の非金属性の粒子のいずれでもよい。金属性の粒子が
好ましく、例えば、金属、金属酸化物、金属水酸化物、
金属化合物の粒子または金属もしくは金属化合物で被覆
された粒子などが挙げられる。金属粒子が特に好適であ
る。金属粒子は、好ましくは貴金属粒子（例えば、金、
銀、銅、白金、パラジウムおよびこれらの混合物からな
る群から選択される金属の粒子）である。金粒子が特に
好適である。

【００２１】粒子の平均直径は、現段階の技術では常の
ことであるが、１〜1000nmの範囲であり、使用目的に応
じて変えることができる。粒子の平均直径は、好ましく
は２〜200nmの範囲であり、特に好ましくは２〜100nmの
範囲である。

【００２２】粒子の表面に吸着させる生体分子は、好ま
しくは、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド、核酸、
ペプチド核酸(peptidic nucleic acid)、サッカリド、
抗原およびハプテンからなる群から選択される。生体分
子は、特に好ましくは、抗体、抗体断片、レクチン、酵
素、ストレプトアビジン、アビジン、プロテインＡ、抗
原、例えば、組換えポリペプチドまたは多重抗原(multi
ple antigen)(WO96/03652参照)、例えば、ポリハプテン
（デキストランまたはタンパク質等の担体に結合した数
種類のハプテンまたはペプチド）、ペプチドおよびハプ
テン（ビオチン、フルオレセインまたはジゴキシゲニン
等の好ましくはMWが1500以下の低分子量物質）からなる
群から選択される。これらの生体分子を金粒子へ吸着さ
せるための厳密な条件については、上述のDe Meyおよび
Beesleyの文献を参照されたい。

【００２３】本発明によれば、使用可能な界面活性剤
は、アニオン性、カチオン性、両性または非イオン性界
面活性剤である。本発明の組成物は、界面活性剤とし
て、好ましくはエトキシレート界面活性剤、特に好まし
くはポリエトキシソルビタンラウレートおよび／または
ポリエトキシソルビタンオレエートおよび／またはラウ
リルポリエチレングリコールエーテルを含有する。これ
らの界面活性剤はTWEEN（登録商標）およびBrij（登録
商標）の商品名で市販されている（例えば、TWEEN80、T
WEEN20、Brij35）。

【００２４】界面活性剤は、好ましくは臨界ミセル濃度
を超えない濃度で使用する。この点については、臨界ミ
セル濃度は、界面活性剤分子から高次凝集体(higher ag
gregate)（いわゆるミセル）が形成される濃度と理解さ
れている。臨界ミセル濃度に到達したかどうかは、例え
ば表面張力、浸透圧、当量導電率、界面張力および／ま
たは密度等の物理的特性の急激な変化(jump)によって容
易に決定することができる。これらのパラメーターの各
々は、既知の方法で測定することができる。

【００２５】最適な界面活性剤濃度は、吸着結合させる
生体分子の各特性に依存し、各生体分子について個別に
決定しなければならない。生体分子の適切量がコロイド
粒子の表面に結合する一方で非特異的な疎水的相互作用
が実質的に抑制される場合には、最適な界面活性剤濃度
といえる。界面活性剤は、好ましくは0.0001〜１mM、特
に好ましくは0.001〜0.1mMの濃度である（コンジュゲー
ト調製物中の最終濃度）。

【００２６】本発明の組成物は、界面活性剤を、生体分
子をローディングする前にコロイド粒子へ添加するか、
および／または生体分子を含む溶液をコロイド粒子にロ
ーディングする前におよび／またはローディングしてい
る間に該生体分子を含む溶液へ添加することにより調製
することができる。

【００２７】本発明の組成物は検出試薬として、特に免
疫学的検出試薬として使用することができる。第一の好
適な実施態様では、この検出試薬を免疫検定法［即ち、
標識されたアナライト類似体または標識されたアナライ
ト特異的受容体（例えば、抗体）を用いる競合検定法、
あるいは標識されたアナライト特異的受容体または該ア
ナライト特異的受容体に結合可能な標識された別の受容
体を用いるサンドイッチ検定法等の免疫学的方法によっ
て試料液体中のアナライトを測定する方法］で使用す
る。好適例は、妊娠テスト（例えば、ヒト絨毛性性腺刺
激ホルモン(HCG)を検出する試験）、またはコカインも
しくはアンフェタミン等の薬物、ヒト血清アルブミン、
トロポニンＴ、ミオグロビンおよび抗HIV抗体等の免疫
グロブリンの検出法である。特に好適な適用形態は、定
量すべき試料を、検出試薬を含有する吸着材料（例え
ば、試験片）に適用する迅速試験である。本発明の安定
化された組成物を使用できる二番目に特に好適な実施態
様は、組織切片の染色である。

【００２８】さらに本発明の組成物は、生体分子−粒子
コンジュゲートについて公知の他の全ての用途（例え
ば、遺伝子導入）にも勿論使用することができる。

【００２９】さらに、本発明の別の主題は、コロイド粒
子と生体分子とのコンジュゲートを安定化させる方法で
あって、界面活性剤を、ローディング前にコロイド粒子
（特に、金ゾル）へ添加するか、および／または該生体
分子を含む溶液をコロイド粒子へローディングする前お
よび／またはその途中に該生体分子を含む溶液へ添加す
るものである。このようにして、コンジュゲートの長期
安定性の増加、並びにpH安定性の向上および他の物質の
存在に対する安定性の向上を達成することが可能とな
る。これらの適用では、界面活性剤は、好ましくは該ミ
セル濃度を超えない量で使用する。界面活性剤は、好ま
しくは最終濃度が0.0001〜１mM、好ましくは0.001〜0.1
mMとなる量で使用する。

【００３０】さらに、ローディング後に、不活性なタン
パク質（例えば、ウシ・アルブミン）および／またはポ
リエチレングリコール等の当技術分野で公知の追加の安
定化剤を使用することも可能である。

【００３１】さらに、本発明は、本発明に従って安定化
した組成物を検出試薬として含む免疫学的検出法のため
の試験キットにも関する。

【００３２】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明す
る。 ［実施例１（比較例）］ タンパク質−金コンジュゲートの調製：金粒子に吸着さ
せるタンパク質の溶液は、好適なローディング用緩衝液
で透析するか、もしくはローディング用緩衝液で希釈し
た。続いて、形成したであろう凝集体を、遠心分離また
は0.2μｍのフィルターで濾過することによって除去し
た。コロイド金粒子を含有する溶液のpHを、K₂CO₃を用
いて該タンパク質の溶液のpHに調整した。次に、該タン
パク質溶液を該コロイド金溶液に攪拌しながら添加し
た。この場合、タンパク質とコロイド金溶液との体積比
は１：10であった。

【００３３】このようにして調製したタンパク質−金コ
ンジュゲートを、現段階の技術に従い、BSA（ウシ血清
アルブミン）溶液を最終濃度0.01％〜３％（w/v）まで
添加するか、もしくはポリエチレングリコール溶液を最
終濃度0.01％〜0.1％（w/v）まで添加することによって
安定化した。続いて、このタンパク質−金コンジュゲー
トを精製し、濃縮して、所望の保存緩衝液条件（例えば
20mM Tris、100mM NaCl pH ８、１％ BSAおよび／また
は0.01％〜0.1％ PEG、NaN₃）に設定した。

【００３４】［実施例２］ PAB＜ジゴキシン＞S-IgG（IS）（説明：ヒツジ由来のポ
リクローナル抗ジゴキシン抗体、免疫吸着IgG調製物）
と20nm金ゾルとのコンジュゲート形成における界面活性
剤の添加時間の影響：

【００３５】疎水性抗体PAB＜ジゴキシン＞S-IgG（IS）
と粒径20nmの金ゾルとのコンジュゲートを形成させた。
このコンジュゲート形成は、pH8.5の溶液中で行った。M
843と呼ばれる金ゾルを出発物質として用い、上記疎水
性抗体を最終濃度５μg/mlで添加して、タンパク質−金
コンジュゲートを形成した。これに関して、実験調製物
2aとは、界面活性剤を添加せずに、現段階の技術に従っ
て調製したコンジュゲートである。0.04mM Brij 35を実
験調製物2b〜2eに種々の時間において添加した。550nm
と600nmとにおけるＯＤの各々の比率を表１に示す。こ
の値は、粒度分布の均一性のパラメーターである。この
値が低い程、凝集体の比率は高く、コンジュゲート粒子
の粒度分布はより不均質である。したがって、可能な限
り高いＯＤ550/600値を有することが望ましい。表１に
は、さらに、光子相関分光法（photon correlation spe
ctroscopy）（PCSと呼ぶ）により測定したコンジュゲー
ト粒子の平均直径を示してある。コンジュゲート粒子の
直径、したがってPCSの値は可能な限り低いものでなけ
ればならない。

【００３６】一般に、手順としては、まず最初に、ロー
ディングされていない金ゾルをIgGと混合して、生体分
子−金コンジュゲートを形成した。IgG溶液を金ゾルに
添加した後、該コンジュゲートに安定化剤としてのBSA
を再ローディングした。実験調製物2bでは、界面活性剤
は、IgG（IgG溶液は金ゾルに添加する際に、１：10に希
釈した）を添加する前に金溶液に添加した。実験調製物
2cでは、界面活性剤はIgG溶液に添加した。実験調製物2
dでは、界面活性剤は、IgG溶液を金ゾルに添加した直後
であるがBSAを再ローディングする前に添加した。実験
調製物2eでは、界面活性剤は、BSAによる再処理が完了
した後で添加した。

【００３７】

【表１】 PAB＜ジゴキシン＞S-IgG（IS；07）−金コンジュゲート 実験調製物 IgG濃度 ＯＤ PCS 備考 [μg/ml 550/600 [nm] ──────────────────────────────────── M843 − 3.94 21.5±3.7 金ゾル 2a 5 3.87 107±42 （比較例） 2b 5 4.08 65±33 ＝2a, ただし、 IgG の前に0.04mM Brij 35 を添加 2c 5 4.06 58±30 ＝2a,ただし、 IgG溶液中に 0.4 mM Brij 35 を添加 2d 5 3.9 100±46 ＝2a,ただし、 IgGの後で0.04 mM Brij 35を添加 2e 5 3.8 94±46 ＝2a,ただし、 BSAの後で0.04m MBrij 35を添加

【００３８】表１からもわかるように、実験調製物2bお
よび2cは最も好ましい特性を有する。得られたコンジュ
ゲートは、現段階の技術と比較して、非常に改善された
直径および高いＯＤ550/600値（すなわち、比較的均一
な粒度分布）を有する。したがって、疎水力に基づくPA
B−PAB、金−金および非特異的PAB−金の相互作用は、
金ゾルをローディングする前および／またはローディン
グしている間に界面活性剤を添加することによって、最
も良く抑制される。

【００３９】［実施例３］ 組換えHIV抗原p24と40nm金ゾルとのコンジュゲート形成
における界面活性剤の添加時間の影響：平均粒径が40nm
の金ゾル（M825）に、５μg/mlの濃度で組換えHIV抗原p
24をローディングした。該溶液のpHは、いずれの場合も
8.0に調整した。手順は、実施例２に記載したものと同
様であった。抗原p24を金ゾルに添加することによっ
て、p24−金コンジュゲートが形成された。続いて、BSA
を安定化剤として添加することにより再ローディングを
行った。実験調製物3bでは、p24を添加する前に、0.04m
MのBrij 35を金ゾルにさらに添加した。実験調製物3cで
は、0.4mMのBrij 35をp24溶液に添加した（このp24溶液
は、続いて行われる金ゾルへの添加の際に１：10に希釈
した）。実験調製物3dでは、BSAの再ローディングが完
了した後で、0.04mMのBrij 35を添加した。

【００４０】

【表２】 p24(02)−金コンジュゲート 実験調製物 備考 収率 ＯＤ PCS [%] 550/600 [nm] ────────────────────────────────── M825 金ゾル 100 2.41 43±24 3a （比較例） 78 2.06 83±45 3b =3a、但し、p24添加前 93 2.12 63±36 に0.04mM Brij 35を添加 3c =3a、但し、p24溶液中 92 2.13 63±35 に0.4mM Brij 35を添加 3d =3a、但し、BSA添加後 85 2.01 67±24 に0.04mM Brij 35を添加

【００４１】この場合も、Brij 35が添加されていない
実験調製物3aと比較して、パラメーターＯＤ550/600お
よびPCSの大きな改善が見られた。

【００４２】［実施例４］ MAB＜PSA＞M-10-IgG（マウス・モノクローナル抗PSA抗
体No.10、IgG調製物）と20nm金ゾルとのコンジュゲート
形成における種々の界面活性剤濃度の添加の影響：MAB
＜PSA＞M-10-IgGを20nmの金ゾルに添加することによ
り、MAB＜PSA＞M-10-IgG−金コンジュゲートを形成し
た。界面活性剤は、下記の濃度でMAB＜PSA＞M-10-IgG溶
液に添加した。結果を表３に示す。 MAB＜PSA＞M-10-IgGでは、Brijの最終濃度は0.005〜0.0
1mMが最適であることが判明した。全体的に、あまり疎
水性でないタンパク質の場合よりも、疎水性が高いタン
パク質の場合では、より高い界面活性剤濃度が必要であ
ることがわかった。

【００４３】

【表３】 MAB＜PSA＞M-10-IgG−金 （20nm金ゾルから） ローディング混合物中のBrij 35の濃度の最適化 実験 添加IgG Brij35 上清中のIgG ＯＤ PCS (nm) 備考 調製物 ( μg/ml) (mM) (添加IgG 500/600による直径 の％) (nm) ──────────────────────────────────── 4a ２ ０ 0.1 2.60 57 現段階の技術 、試験片にお いて不適当 4b 2 0.005 3 3.53 32 試験片におい て適当 4c 2 0.01 6 3.57 30 試験片におい て適当 4d 4 0.005 9 3.42 30 試験片におい て適当

【００４４】［実施例５］ コンジュゲートの安定性：本発明に従って調製した金コ
ンジュゲートの安定性を、従来の方法により調製した金
コンジュゲートと比較して調べた。2種の調製物では、
同じ手順により、いずれの場合も同じMAB＜HCG＞−IgG
および40nm金ゾルを出発物質として用いて、MAB＜HCG＞
IgG−金コンジュゲートを調製した。調製物5aでは、界
面活性剤を添加せずに、タンパク質溶液を金ゾルに添加
することによって調製を行った。調製物5bでは、金ゾル
にローディングするのに用いたIgG溶液は0.1mM Brij 35
を含有していた。それぞれの場合において、コンジュゲ
ートを調製した直後に（すなわち、安定化剤としてBSA
を添加した後）、そして27週間までの一定の時間間隔で
４℃にて保存した後に、特徴的なパラメーターであるＯ
Ｄ550/600および直径PCSを調べた。調製物5aでは、保存
の間に粒径は非常に増大し、ＯＤ550/600の値は減少し
た。一方、本発明による調製物5bでは、それら両方のパ
ラメーターは、わずかに変化しただけであった。このこ
とから、本発明によるタンパク質−金コンジュゲート
は、現段階の技術によるタンパク質−金コンジュゲート
よりも非常に安定なことがわかる。

【００４５】

【表４】 MAB＜HCG＞−IgG−金 （40nm金ゾルから） 長期保存（+4℃）における金コンジュゲートの安定性の試験 調製物 IgG溶液中の ＯＤ550/600 PCSによる直径(nm) Brij 35(mM) 調製直後 +4℃で27週後 調製直後 +4℃で27週後 ──────────────────────────────────── 5a 0 2.35 1.92 61 105 5b 0.1 2.37 2.26 58 62

【００４６】［実施例６］ トロポニン試験片における金コンジュゲートの使用：MA
B＜トロポニンＴ＞M-11-7-IgGと40nm金ゾルとから成る
一連のコンジュゲートを、Trop T試験片におけるそれら
の機能について比較した。調製物6aおよび調製物6b〜6g
において調製したコンジュゲートは、主に、調製物6aで
は、界面活性剤を用いずにローディングを行ったが、調
製物6b〜6gでは0.075mM Brij 35を含むIgG溶液を用いた
点において異なるものであった。

【００４７】表５の最後の欄からもわかるように、従来
の方法により調製した金コンジュゲートを用いた試験片
では非特異的なブランクが生じ、それは非常に高いもの
であったので、この場合には、このコンジュゲートは用
いることができない。これに対して、Brijの存在下で被
覆された本発明によるコンジュゲートは、ブランクを全
く生じなかったか、もしくはわずかなブランクを生じた
だけであり、したがって、試験片として好適であった。

【００４８】

【表５】 MAB＜TN-T＞M-11-7-IgG−金コンジュゲート 調製物 PCSサイズ ＯＤ 試験片の評価 試験片の評価 試験片好適性 [nm] 550/600 （ブランク= (カットオフ) 非特異的結合 /ブランク） ──────────────────────────────────── 6a 54 2.26 強いブランク 測定不能 ブランク のため不合格 6b 54 2.26 僅かな 0.05ng/ml 合格 ブランク (20分後） 6c 50 2.17 殆ど 0.05ng/ml 合格 ブランクなし （20分後） 6d 57 2.31 僅かな 0.05ng/ml 合格 ブランク (30分後) 6e 51 2.11 僅かな 0.05ng/ml 合格 ブランク (30分後) 6f 56 2.31 ブランクなし 0.05ng/ml 合格 6g 52 2.27 ブランクなし 0.05ng/ml 合格

【００４９】

【発明の効果】上記したように、本発明による生体分子
−金コンジュゲートは、界面活性剤を含有させることに
より、凝集体の形成が低減し、安定な形態で提供され
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５ Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２５Ｗ 33/553 33/553 // Ｃ０７Ｋ 103:00

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 粒子表面に生体分子を吸着させたコロイ
   ド粒子を含有する組成物であって、界面活性剤をさらに
   含有することを特徴とする前記組成物。
2. 【請求項２】 前記界面活性剤がエトキシレート界面活
   性剤であることを特徴とする請求項１記載の組成物。
3. 【請求項３】 界面活性剤を0.0001〜１mMの濃度で含有
   することを特徴とする請求項１または２記載の組成物。
4. 【請求項４】 前記粒子が貴金属粒子であることを特徴
   とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
5. 【請求項５】 前記コロイド粒子の平均直径が１nm〜10
   00nmの範囲であることを特徴とする請求項１〜４のいず
   れか一項に記載の組成物。
6. 【請求項６】 前記生体分子が、タンパク質、糖タンパ
   ク質、ペプチド、核酸、ペプチド核酸、サッカリド、抗
   原およびハプテンからなる群から選ばれることを特徴と
   する請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか一項に記載の組
   成物の製造方法であって、生体分子をローディングする
   前にコロイド粒子へ界面活性剤を添加するか、および／
   または生体分子を含む溶液をコロイド粒子にローディン
   グする前および／または途中に該生体分子を含む溶液へ
   界面活性剤を添加することを特徴とする前記方法。
8. 【請求項８】 検出試薬としての、請求項１〜６のいず
   れか一項に記載の組成物の使用。
9. 【請求項９】 コロイド粒子と生体分子とから構成され
   るコンジュゲートを安定化させる方法であって、生体分
   子をローディングする前にコロイド粒子へ界面活性剤を
   添加するか、および／または生体分子を含む溶液をコロ
   イド粒子にローディングする前および／または途中に該
   生体分子を含む溶液へ界面活性剤を添加することを特徴
   とする前記方法。
10. 【請求項１０】 コンジュゲート形成の完了後に追加の
    安定化剤を添加することを特徴とする請求項９記載の方
    法。
11. 【請求項１１】 免疫学的検出法のための試験キットで
    あって、請求項１〜６のいずれか一項に記載の安定化さ
    れた組成物を検出試薬として含むことを特徴とする前記
    キット。