JPH11140102A - リンゴ酢由来抗腫瘍性多糖、およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 これまで知見されたことのない新たな構造の
抗腫瘍性多糖を、リンゴ酢を原料として抽出、精製しよ
うとするものである。 【解決手段】 分子内にアルファ−１，４−結合および
アルファ−１，６−結合を有し、分子量範囲が、デキス
トラン換算で７０００以上１７０００以下の範囲にある
ところのグルコースを主成分とする多糖であり、リンゴ
酢から抽出、精製され、ガン患者に投与して悪性腫瘍を
治癒できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の目的】この発明は、抗腫瘍性多糖に関するもの
であって、特に青森県特産のリンゴから醸造されたリン
ゴ酢を原料にして抽出、精製して得られるところの抗腫
瘍活性を示す新規な構造からなるリンゴ酢由来抗腫瘍性
多糖を提供しようとするものである。

【０００２】

【従来の技術】北米バーモント地方の人々が好んで飲用
しているバーモント酢、即ち、ティースプーン１杯のリ
ンゴ酢に同じく１杯の蜂蜜を加え、コップ一杯の水で薄
めた飲み物は、バーモント地方の人々が長寿を保てる理
由の一つと考えられていて、非常に健康に良いものとい
われてきているが、その効果を示す生理活性物質の構造
的知見ついて、これまでのところ開示されたという情報
は全くなく、先の事実からして、全国一のリンゴ生産を
誇る特異な地域柄から、その解明は極めて興味深いテー
マの一つとなっていた。

【０００３】現代社会において長寿を全うできる条件と
しては様々な要因を考慮しなければならいが、その中で
も、悪性腫瘍（癌）への罷病率の多寡は、長寿の条件を
判断する上で重要な因子となり得ることが既に周知され
ている。

【０００４】一方、これまでにも、数多くの宿主仲介性
の抗腫瘍性多糖が、穀類や果実等といった種々の材料か
ら見い出されているのも事実であり、例えば、キノコ等
から抽出されたβ−（１，３）（１，６）−グルカンは
非常に有名であり、更に、各糖残基間のグルコシド結合
がアルファ結合をとっている抗腫瘍性多糖のその他の例
としは、例えば、昭和６１年特許公開第１８７２２号公
報に掲載された発明に見られるように、米糠を原料とし
たアルファ−（１，６）−グルカンがあり、また、人参
三七の根から得られるアルファ−（１，４）−グルカン
は、平成１年特許公開第８８６８８号公報の発明として
掲載されており、また、平成６年特許公開第２７９２９
号公報には、貝類を原料としたグリコーゲン、アルファ
−（１，４）（１，６）−グルカンが、分子量１０万以
上の抗腫瘍性多糖として掲載されている。

【０００５】これらのことを類推、勘案した結果、北米
バーモント地方の人々の長寿の要因の一つと考えられて
いるリンゴ酢が、何かある種の抗腫瘍性多糖を含んでい
るのではないかとの予測をたて、この発明では、リンゴ
酢から抗腫瘍性を有する新規な多糖成分を見い出すべ
く、逸早く、慎重な分析、検討を加えてきたところ、遂
に、以下において詳述するとおりの新規な構造からなる
りんご酢由来抗腫瘍性多糖と、それを抽出、精製するた
めの新規な製造方法とを完成、実用化することに成功し
たものである。

【０００６】

【発明の構成】この発明のリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖
は、基本的に以下のとおりの構成を要件とするものであ
る。即ち アルファ−１，４−結合の主鎖にアルファ−
１，６−結合の分岐構造を有するグルコースを主成分と
し、分子量範囲が、デキストラン換算で７０００以上１
７０００以下、平均分子量略１００００のリンゴ酢由来
抗腫瘍性多糖である。

【０００７】上記のとおりの構造を基本とするこの発明
のリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖は、物性からその構成を示
せば、 (a) 分子量範囲がデキストラン換算で７０００
以上１７０００以下であり、セファクリル Ｓ−３００
によるゲル濾過分析によって平均分子量１００００に主
ピークを有すること。 (b) グルコースを主成分とする
多糖であること。 (c) 分子内にアルファ−１，４−結
合およびアルファ−１，６−結合を有すること。以上の
とおりの、少なくとも３要素を備えてなることを特徴を
有するリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖と言うことができる。

【０００８】更に具体的には、次のとおりの物性を特徴
とするリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖であるとしてその構成
を示すことも可能である。即ち、(a) 白色ないし淡褐色
粉末で、水に溶けやすいこと。 (b) 分子量範囲が、デ
キストラン換算で７０００以上１７０００以下であり、
セファクリルＳ−３００によるゲル濾過分析によって平
均分子量１００００に主ピークを有していること。
(c) グルコースを主成分とする多糖であること。 (d)
プロトン−ＮＭＲ（Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ
Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スペクトルを示し、ＮＭＲによ
って糖のみからなるシグナルを示すこと。 (e) 透析膜
を通過しないこと。 (f) フェノール硫酸反応で陽性、
ヨード反応で陽性を示すこと。 (g) 水溶液中における
紫外部吸収極大を示さないこと。 (h) 分子内にアルフ
ァ−１，４−結合およびアルファ−１，６−結合を有し
ていること。の８要素を備えてなるリンゴ酢由来抗腫瘍
性多糖である。

【０００９】

【関連する発明】この発明には、上記したリンゴ酢由来
抗腫瘍性多糖に関連し、以下のとおりの構成からなるリ
ンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の製造方法を包含している。先
ず、リンゴ酢を減圧濃縮後あるいはそのまま蒸留水に対
して透析（例えば、三光純薬株式会社、透析膜３６／３
２、分子量１２０００〜１４０００等）を行い、透析内
液を凍結乾燥する工程。次いで、上記凍結乾燥物をセフ
ァクリル Ｓ−３００ゲルによるゲルロ過クロマトグラ
フィーを行い、デキストラン換算で１０００以上４００
００以下の画分を得た上、脱塩する工程。その後におい
て、弱陰イオン交換クロマトグラフィー、例えばＤＥＡ
Ｅ セファロース ファースト フロー陰イオン交換ゲ
ル（商品名、ファルマシア社製等）を充填したカラムク
ロマトグラフィーに付し、カラム担体容量の少なくとも
２倍量の希薄な中性緩衝液で溶出脱塩後、凍結乾燥する
工程。以上の工程からなるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の
製造方法である。

【００１０】上記透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、
弱陰イオン交換クロマトグラフィー等においては、他の
ゲル濾過担体、イオン交換樹脂、限外濾過膜等を用いて
行うことができる。

【００１１】この発明の方法によって抽出分離精製され
た抗腫瘍性多糖の性質は、化学分析結果から、次のとお
りである。 「平均分子量」図２のセファクリル Ｓ−２００ゲル
（商品名、ファルマシア社製）濾過クロマトグラフィー
による流出パターンから、標準資料の流出液量に対する
それら分子量の片対数プロットに抗腫瘍性多糖の流出液
量を外挿することにより、分子量を推定したところ、リ
ンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の平均分子量１００００である
ことが判明した。

【００１２】「プロトンＮＭＲ」この化学分析は、乾燥
資料２ミリグラムを９９．８％Ｄ２Ｏに溶解し、１２時
間室温で振盪し、重水置換を行い、凍結乾燥した。同様
の操作を９９．８％Ｄ２Ｏおよび９９．９５％Ｄ２Ｏに
て行い、次に９９．９３％Ｄ２Ｏに溶解し、７０°Ｃで
ＮＭＲを測定した。ＮＭＲの測定には、２７０−ＭＨＺ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＪＮＭ ＥＸ−２７０、日本電気製）を
使用した。その結果が、図１のとおりであって、５．３
７３ｐｐｍにα−１，４結合に由来するシグナル、４．
９６３ｐｐｍにα−１，４，６結合に由来するシグナル
を示し、３．４−４．４ｐｐｍに多糖由来と思われるシ
グナルが捕らえられ、糖のみからなるシグナルを示す。

【００１３】「化学成分分析値」糖の組織組成が、次の
分析法によってグルコースのみからなることが判明す
る。即ち、２規定塩酸で２時間加水分解したものをサン
プルとし、ピリジルアミノ化装置（宝酒造株式会社 Ｐ
ＡＬＳＴＡＴＩＯＮ ｍｏｄｅｌ ４０００）でピリジ
ルアミノ化したものを ＰＡＬＰＡＫ ＴｙｐｅＡカラ
ム（４．６×１５０ｍｍ）を用い、溶媒は、０．７Ｍ
カリウム−ホウ酸 緩衝液（ｐＨ９．０）／アセトニト
リル（９０／１０，ｖ／ｖ）、流速は、０．３ミリリッ
トル／分、カラム温度は６５℃、検出は蛍光検出器を用
い励起波長３１０ｎｍ測定波長３８０ｎｍで、ＨＰＬＣ
（Ｈｉｇｈ ｐｅｆｏｒｍａｃｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による糖組成分析した結
果、図３のリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖のピリジルアミノ
化法による糖組成分析による分離パターンが示している
ように、リンゴ酢由来抗腫瘍性多糖は、キシロール、グ
ルコース、マンノースおよびガラクトースからなる多糖
であり、その殆どがグルコース（９．７％）からなる多
糖であることが明らかにされた。以下では、この発明に
おける抗腫瘍性多糖の製造法、および、有効画分の投与
法の例を、更に詳しく説明することにする。

【００１４】

【実施例１】この実施例は、リンゴ酢からの抗腫瘍性多
糖の抽出方法の一事例を示すものであり、リンゴ酢５０
０ミリリットルを１００ミリリットルに減圧濃縮後、蒸
留水７０ミリリットルを加えて全量１７０ミリリットル
にした後、再び減圧濃縮し、凡そ全量１００ミリリット
ルにしたものを、蒸留水に対して透析した。透析内液
（粗抗腫瘍性多糖）は、凍結乾燥後、冷蔵保存した。な
お、透析内液の乾燥重量は、りんご酢乾燥重量の約７％
であった。

【００１５】

【実施例２】次に、分離、精製例を示すと、粗抗腫瘍性
多糖２０ミリグラムを０．１モル塩化ナトリウム水溶液
に溶解し、セファクリル Ｓ−３００ゲル（商品名、フ
ァルマシア社製）、カラム（２．３×１１８ｃｍ）によ
り、溶出液として０．１モルＮａＣｌを用い、流速は、
０．５ミリリットル／分で精製した。各フラクション
（５ミリリットル）をフェノール硫酸法で中性糖を測定
し、流出パターンを図４に示してある。Ｆ１、Ｆ２およ
びＦ３の三つの画分に分け、脱塩後，凍結乾燥した。収
量は、Ｆ１が１．６ミリグラム（１２．８％）、Ｆ２が
３．８ミリグラム（３０．４％），およびＦ３が７．０
ミリグラム（５６．８％）であった。

【００１６】更に、このＦ３を、ＤＥＡＥ セファロー
ス ファースト フロー陰イオン交換ゲル（商品名、フ
ァルマシア社製）を用いた弱陰イオン交換クロマトグラ
フィーによって分画精製した。溶出緩衝液には２０ミリ
モル／リットル トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）を
用い、分離した（図３を参照）。フェノール硫酸法で中
性糖を測定し、３つの画分（ａ・ｂ・ｃ）に分け、透析
後、凍結乾燥した。収量は、ａが３．６ミリグラム（５
６％) 、ｂが１．７ミリグラム（２５％）、およびｃ
１．２ミリグラム（１９％）であった。図中、ａがりん
ご酢由来抗腫瘍性多糖である。

【００１７】

【実施例３】抗腫瘍実験例は、次のとおりである。６週
令メス、平均体重２０グラムのＢＡＬＢ／Ｃ−ＣＲＪマ
ウスに１週間、同系のマウスの腹腔内で継代した癌細胞
Ｍｅｔｈ−Ａを、マウス１匹当たり１×１０５個を腹腔
内に移植し、対照群５匹（１群）と試験群（１群）の計
２群に分けた。

【００１８】癌細胞を移植した２日目、４日目、６日目
に、試験群には、０．６２５ミリグラムの抗腫瘍性多糖
を０．２ミリリットルの生理食塩水に溶解し、腹腔内に
投与した。対照群には、同様にして生理食塩水のみを投
与した。以後、生存日数を６０日まで観察し、延命効果
を次式によって算出した。 延命率（％）＝（試験群の平均生存日数群）／（対照群
の平均生存日数）×１００ 上記方法によって検定したリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の
抗腫瘍効果は、下表のとおりであった。

【００１９】

【表１】

【００２０】

【実施例４】続いて、第２の抗腫瘍実験例を示すと、次
のとおりである。６週令メス、平均体重２０グラムのＢ
ＡＬＢ／Ｃ−ＣＲＪマウスに１週間、同系のマウスの腹
腔内で継代した癌細胞Ｍｅｔｈ−Ａを、マウス１匹当た
り１×１０５個を腹腔内に移植し、対照群５匹（１群）
と試験群（１群）の計２群に分けた。

【００２１】癌細胞を移植した２日目、４日目、６日目
に、試験群には、０．２ミリグラムの抗腫瘍性多糖を
０．２ミリリットルの生理食塩水に溶解し、腹腔内に投
与した。対照群には、同様にして生理食塩水のみを投与
した。以後、生存日数を６０日まで観察し、延命効果を
次式によって算出した。延命率（％）＝（試験群の平均
生存日数群）／（対照群の平均生存日数）×１００上記
方法によって検定したリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の抗腫
瘍効果を示すと、下表のとおりでる。

【００２２】

【表２】

【００２３】

【作用効果】リンゴ酢由来抗腫瘍性多糖を用いた腫瘍に
対する治療法としては、リンゴ酢由来抗腫瘍性多糖を生
理食塩水、あるいは各種塩溶液に溶解の後、病巣部に直
接注射による投与、静脈投与等が可能である。また、本
来生体内に存在する物質と似ているため、毒性は無く、
したがって、その病状により、その投与量を広い範囲で
コントロールし得る。

【００２４】この発明において、その抗腫瘍活性を以下
の方法によって確認することができる。即ち、マウスの
腹腔内に腫瘍細胞を移植し、このマウスにリンゴ酢由来
抗腫瘍性多糖を生理食塩水に溶解させ、投与することに
よって腫瘍を治癒することができた。この実験におい
て、治癒されたマウスに副作用は観察されなかったこと
にから、急性毒性はないものと考えられ、腫瘍に対し大
変有望な物質であることを確認することができた。

【００２５】このような特徴を有する抗腫瘍性多糖とし
ては、キノコ等から抽出されたβ−（１，３）（１，
６）−グルカンが有名であるが、この発明におけるリン
ゴ酢由来抗腫瘍性多糖は、各糖鎖残基間のグリコシド結
合が逆のアルファ結合をとっており、物質的に全く異な
るものである。また、抗腫瘍性活性を示す多糖には、こ
の他にも幾つか存在することが報告されており、これら
多糖のアルファ−グルカンで抗腫瘍性のあるものも知ら
れているが、それらはアルファ−１，４−結合のみから
なるもの（人参三七の根から得られる多糖等）、あるい
はアルファ−１，６−結合のみからなるもの（米糠を原
料とした多糖等）であって、この発明のリンゴ酢由来抗
腫瘍性多糖とは、その構造および分子量が大きく異な
る。

【００２６】また、アルファ−１，４−結合とアルファ
−１，６−結合とを持つグリコーゲン（貝類を原料とし
たグリコーゲン等）も知られているが、この発明のリン
ゴ酢由来抗腫瘍性多糖の分子量が２万以下であるのに対
し、それら公知のものは、分子量１０万以上であって全
く別の物質である。

【００２７】叙述の如く、この発明は、通常食されてい
るリンゴ酢から抗腫瘍多糖を抽出し、且つその得られた
抗腫瘍多糖の抗腫瘍活性に関する開発、研究を継続し、
幾多の試行錯誤を重ねてきた結果、遂にこの発明のリン
ゴ酢由来抗腫瘍多糖には、強い抗腫瘍性があることを確
認することに成功し得たものであり、この固有の特徴
は、この発明のリンゴ酢由来抗腫瘍多糖に細胞毒性が見
られないことにより、免疫機構、つまり、生体の本来持
つべき自己防御機構を活性化して腫瘍細胞に対する抵抗
性を高め、その結果、腫瘍細胞の増殖を抑制するのでは
ないかと考えられるものであり、この有効な特徴によ
り、この地域の特産となっているリンゴが、大いにその
付加価値を高めた活用を可能として地域産業の発展に寄
与できると共に、何よりも人類医学の面で高い評価が得
られるものと予想される。

【図面の簡単な説明】

【図１】リンゴ酢由来抗腫瘍多糖のプロトン−ＮＭＲス
ペクトルである。

【図２】粗抗腫瘍多糖のセファクリル Ｓ−３００ ゲ
ルによるゲル濾過クロマトグラフィー分離パターンであ
る。

【図３】リンゴ酢由来抗腫瘍性多糖のピリジルアミノ化
法による糖組成分析による分離パターンである。

【図４】リンゴ酢由来抗腫瘍多糖のセファクリル Ｓ−
２００ ゲルによるゲル濾過クロマトグラフィー分離パ
ターンである。

【図５】ゲル濾過クロマトグラフィーＦ３画分のＤＥＡ
Ｅ セファロース ファースト フロー 弱陰イオン交
換樹脂によるイオン交換クロマトグラフィー分離パター
ンである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 櫛引 利貞 青森県弘前市蔵主町15番地23号 カネショ ウ株式会社内 (72)発明者 荒井 吏香子 青森県南津軽郡尾上町大字日沼字富田30の ９ 弘前機能性食品開発協同組合内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アルファ−１，４−結合の主鎖にアルフ
   ァ−１，６−結合の分岐構造を有するグルコースを主成
   分とし、分子量範囲が、デキストラン換算で７０００以
   上１７０００以下、平均分子量略１００００のリンゴ酢
   由来抗腫瘍性多糖。
2. 【請求項２】 以下の物性を有することを特徴とするリ
   ンゴ酢由来抗腫瘍性多糖。 (a) 分子量範囲がデキストラン換算で７０００以上１
   ７０００以下であり、セファクリル Ｓ−３００による
   ゲル濾過分析によって平均分子量１００００に主ピーク
   を有すること。 (b) グルコースを主成分とする多糖であること。 (c) 分子内にアルファ−１，４−結合およびアルファ
   −１，６−結合を有すること。
3. 【請求項３】 以下の物性を有することを特徴とするリ
   ンゴ酢由来抗腫瘍性多糖。 (a) 白色ないし淡褐色粉末で、水に溶けやすいこと。 (b) 分子量範囲がデキストラン換算で７０００以上１
   ７０００以下であり、セファクリル Ｓ−３００による
   ゲル濾過分析によって平均分子量１００００に主ピーク
   を有すること。 (c) グルコースを主成分とする多糖であること。 (d) プロトン−Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍａｇｎｅｔｉｃ
   Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（ＮＭＲ）スペクトルを示し、ＮＭ
   Ｒによって糖のみからなるシグナルを示すこと。 (e) 透析膜を通過しないこと。 (f) フェノール硫酸反応およびヨード反応で、夫々陽
   性を示すこと。 (g) 水溶液中における紫外部吸収極大を示さないこ
   と。 (h) 分子内にアルファ−１，４−結合およびアルファ
   −１，６−結合を有すること。
4. 【請求項４】 リンゴ酢を減圧濃縮後あるいはそのまま
   蒸留水に対して透析（透析膜３６／３２、分子量１２０
   ００〜１４０００）を行い、透析内液を凍結乾燥する工
   程、 上記凍結乾燥物をセファクリル Ｓ−３００ゲル
   によるゲルロ過クロマトグラフィーを行い、デキストラ
   ン換算で１０００以上４００００以下の画分を得て脱塩
   する工程、 および、その後、弱陰イオン交換クロマト
   グラフィー、例えばＤＥＡＥ セファロース ファース
   ト フロー陰イオン交換ゲルを充填したカラムクロマト
   グラフィーに付し、カラム担体容量の少なくとも２倍量
   の希薄な中性緩衝液で溶出、脱塩した後、凍結乾燥する
   工程、からなるリンゴ酢由来抗腫瘍性多糖の製造法。