JPH11142401A - 細胞機能測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液を用いる細胞機能測定において、採血し
た血液を測定を行うまで安定に保存することができ、し
かも、精度良く細胞機能測定できる細胞機能測定方法を
提供する。 【解決手段】 血液中の細胞機能測定方法であって、採
血された血液を低温（例えば、０℃以上２１℃未満）で
保存する工程、低温で保存された血液を測定に先立って
体温に近い温度（例えば、２１〜４５℃）に加温する工
程、次いで上記血液中の血液細胞と刺激剤（例、エンド
トキシン）とを反応させて生理活性物質（例、腫瘍壊死
因子α（ＴＮＦα））を産生させる工程、および産生さ
れた生理活性物質量を測定する工程とからなることを特
徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血液中の細胞機能
測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】最近の免疫学の研究により、血液細胞で
ある顆粒球、単球、マクロファージ、リンパ球等の白血
球は、血液中や各臓器、器官において、炎症反応、免疫
反応などの種々の生体防御反応において様々な役割を担
っていることが明らかになってきている。これらの細胞
は、感染症；肝炎や腎炎などの炎症性疾患；慢性関節リ
ウマチや喘息などの免疫・アレルギー性疾患；癌などの
種々の病態において重要な働きをしており、病態の変動
と共にこれらの細胞の機能が抑制されたり、増強された
りすることも知られている。

【０００３】また、これらの疾患の治療に、抗炎症剤、
免疫抑制剤、免疫増強剤、抗癌剤等の種々の薬剤が用い
られており、その際にもこれらの細胞の機能が抑制され
たり、または増強されたりすることもまた知られてい
る。そのため、各種疾患の病態や薬剤の効果あるいは副
作用を把握し、治療指針を決定したり、薬剤の投与量や
タイミングを決定するために、これらの細胞の機能を調
べることが重要である。

【０００４】従来、病院の検査室や検査センターでは、
上記のような理由から、このような細胞機能を測定する
ため、顆粒球貪食機能試験、顆粒球殺菌能（活性酸素産
生能）試験、リンパ球幼若化試験等が行われてきた。ま
た、最近では、フローサイトメトリー装置と各種免疫担
当細胞表面抗原に対する蛍光標識モノクローナル抗体を
用いた表面抗原試験等が行われるようになってきた。し
かしながら、上記の試験法には、細胞分離、細胞培養、
顕微鏡測定等の特殊な技術が要求され、測定に時間がか
かり、ＲＩ施設やフローサイトメトリーなどの高価な装
置が必要であった。

【０００５】最近では、従来法を改良した方法として、
血液や血液から分離した白血球からのサイトカイン産生
機能を調べる種々の方法も報告されている。例えば、特
表平１−５０３３３１号公報、特開平２−１９６９６１
号公報、特開平３−２８５６９２号公報には、血液にリ
ポ多糖（ＬＰＳ）やレクチンを反応させ、産生誘導され
た腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン−１
β（ＩＬ−１β）などのサイトカインを測定する方法が
開示されている。

【０００６】しかしながら、採血した血液を測定を行う
まで安定に保存するために、低温で保存すると、該血液
を刺激剤と反応させた場合、産生される生理活性物質の
量が、血液を保存せずに用いた場合に比較して減少する
という欠点があった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、血液
を用いる細胞機能測定において、採血した血液を測定を
行うまで安定に保存することができ、しかも、精度良く
細胞機能測定できる細胞機能測定方法を提供することに
ある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明の細胞機能測定方
法は、血液中の細胞機能測定方法であって、採血された
血液を低温で保存する工程、低温で保存された血液を測
定に先立って体温に近い温度に加温する工程、次いで上
記血液中の血液細胞と刺激剤とを反応させて生理活性物
質を産生させる工程、および産生された生理活性物質量
を測定する工程とからなることを特徴とする。

【０００９】以下、本発明の細胞機能測定方法につい
て、工程に従って詳しく説明する。まず、本発明で用い
られる血液は、採血後、細胞機能測定を行う前に、低温
で保存される。低温とは、体温よりも低い温度を指し、
好ましくは０℃以上２１℃未満、より好ましくは０〜１
０℃である。保存温度が０℃よりも低くなると、細胞が
凍結してしまい、細胞に凍結障害が発生し易くなる。保
存温度が２１℃以上になると、血液細胞から生理活性物
質が持続的に産生されるため、採血直後と保存後の生理
活性物質の産生量に差がでてしまう欠点がある。

【００１０】低温保存方法としては、血液を０℃以上２
１℃未満に保つことができる方法であれば、特に限定さ
れず、例えば、冷蔵庫内での保存、保冷剤を用いる方
法、保冷箱を用いる方法などが挙げられる。

【００１１】本発明の方法では、低温保存された血液
を、次いで、測定に先立って体温に近い温度に加温す
る。上記体温に近い温度とは、２１〜４５℃が好まし
く、より好ましくは２５〜４０℃である。上記温度が２
１℃未満であると、血液細胞からの生理活性物質の産生
量が採血直後の血液を用いた場合よりも低くなり、４５
℃を超えると血液細胞からの生理活性物質の産生量が減
少する欠点がある。

【００１２】また、上記体温に近い温度に加温する時間
としては、１〜１８０分が好ましく、より好ましくは２
０〜１２０分である。加温時間が１分よりも短くなると
血液細胞からの生理活性物質の産生量が採血直後の血液
を用いた場合よりも少なくなり、１８０分よりも長くな
ると血液細胞からの生理活性物質の産生量が採血直後の
血液を用いた場合よりも多くなる。

【００１３】加温方法としては、血液を２１〜４５℃に
保つことができる方法であれば、特に限定されず、例え
ば、恒温水槽を用いる方法、恒温槽を用いる方法などが
挙げられる。

【００１４】本発明の方法では、測定に先立って体温に
近い温度に加温された血液と刺激剤とを接触させ、上記
血液中の血液細胞と刺激剤とを反応させて生理活性物質
を産生させる。上記刺激剤とは血液細胞と反応し生理活
性物質を産生させる材料のことを言い、例えば、ＢＣＧ
死菌やコリネバクテリウム属などの種々の微生物、微生
物由来の細胞壁多糖（リポポリサッカライド）からなる
エンドトキシン；合成リピドＡ；ピランコポリマー；フ
ィトヘマグルチニン（ＰＨＡ−Ｌ及びＰＨＡ−Ｐ）、コ
ンカナバリンＡ、ポークウィードマイトゲンなどのレク
チン；ポリＩ：ポリＣ；精製無蛋白ツベルクリン；ＯＫ
４３２（ピシバニール）；ＰＳＫ（クレスチン）；レン
チナン；ザイモザン；インターフェロン；インターロイ
キン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−６（ＩＬ−
６）、ＴＮＦなどのサイトカイン；などが挙げられる。
また、これらの材料を種々の天然、合成高分子材料に公
知の固定化方法によって固定化した材料なども用いられ
る。

【００１５】上記刺激剤の形状としては、通常、粉末
状、又は、該刺激剤が水などの溶媒に溶解された液状で
ある。また、繊維状、中空糸状、膜状等いずれの公知の
形状のものでもよい。該刺激剤の反応容器中の存在状態
は、固体状であってもよく、また、ゲル状、液体状であ
ってもよい。該刺激剤は、水溶性の場合、適当な溶媒に
溶解されて反応容器の内壁面に塗布、あるいは添加され
た後、粉末状にされてもよい。

【００１６】上記の溶媒としては、例えば、リン酸緩衝
液、ハンクス緩衝液などの緩衝液やＭＥＭ、ＲＰＭＩ−
１６４０等の通常の培地や注射用水（ＬＰＳフリー水、
大塚製薬社製）、生理食塩水など、いずれも用いること
ができる。

【００１７】この反応で用いられる血液は、採血された
全血の他に、必要に応じて、上記の緩衝液や培地で希釈
されて用いられてもよい。

【００１８】本発明でいう生理活性物質とは、上記に示
した刺激剤で刺激した時、血液細胞から産生されるもの
であり、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＮＦ−γ、
Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＲＡＮＴＥＳなどのサイトカイン；
ＰＧＥ２、ＰＧ１２などのプロスタグランジン；ＬＴＢ
４、ＬＴＣ４などのロイコトリエン；一酸化窒素、活性
酸素、ヒスタミン、血小板活性化因子（ＰＡＦ）などの
種々のケミカルメディエーター；などが挙げられる。ま
た、可溶性ＩＣＡＭＩなどの接着因子；可溶性ＩＬ−２
レセプターなどの可溶性サイトカインレセプター；ｅｏ
ｓｉｎｏｐｈｉｌｅ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ（ＥＣＰ）、ｍａｊｏｒ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ（ＭＢＰ）、ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｅ ｄｅｒｉｖｅ
ｄ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ（ＥＤＮ）、ｅｏｓｉｎｏｐ
ｈｉｌｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＥＰＯ）などの顆粒
タンパク質も挙げられるが、これらに限定されるもので
はない。

【００１９】また本発明の細胞機能測定方法に用いる血
液の採血に際しては、血液が凝固しないように、血液抗
凝固剤を用いる必要がある。

【００２０】上記血液抗凝固剤としては、例えば、ヘパ
リン化合物、クエン酸化合物、シュウ酸化合物などが挙
げられ、ヘパリンナトリウムなどが細胞の生物学的反応
を阻害しないので好ましい。

【００２１】本発明の細胞機能測定方法に用いる血液を
採血する方法としては、真空採血管、注射用シリンジな
どの採血器具が用いられる。また、好ましくは、採血器
具は、血液細胞に非特異的に生理活性物質の産生を誘導
するような物質、例えば、ＬＰＳ（エンドトキシン）、
β−１，３グルカン、抗原などを混入していないものが
よい。

【００２２】上記真空採血管においては、その内部を減
圧に維持するために、通常、栓体が使用される。栓体の
材質としては、例えばブチルゴム、塩素化ブチルゴム、
熱可塑性エラストマー等が挙げられる。

【００２３】本発明の方法における、血液中の血液細胞
と刺激剤とを反応させる工程においては、血液細胞が凝
固しないように、反応容器中に血液抗凝固剤を存在させ
るのが好ましい。血液抗凝固剤としては、上述のものが
挙げられ、例えば、ヘパリンナトリウムの場合であれ
ば、反応容器に血液が収容された時に、その血液を含む
全液中のヘパリンナトリウムの濃度が、低くなると血液
凝固の恐れがあり、高くなると細胞に不測の活性化や不
活性化を起こす恐れがあるので、６〜２０Ｕ／ｍｌにな
るように収容されるのが好ましい。

【００２４】上記血液中の血液細胞と刺激剤とを反応さ
せる工程で使用される反応容器の材質としては、例え
ば、プラスチックまたはガラスが挙げられるが、生理活
性物質の産生反応後、該生理活性物質を測定するための
遠心分離操作に耐えられるだけの強度を有するものが好
ましい。上記プラスチックとしては、熱可塑性樹脂、熱
硬化性樹脂のいずれもが用いられ得る。熱可塑性樹脂と
しては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ
スチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニ
ル、ポリエチレンテレフタレート、スチレン−アクリロ
ニトリル共重合体、スチレン−無水マレイン酸共重合
体、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メチル
メタクリレート共重合体、エチレン−プロピレン共重合
体、エチレン−アクリル酸共重合体、エチレン−アクリ
ル酸エステル共重合体等が挙げられる。熱硬化性樹脂と
しては、例えば、不飽和ポリエステル樹脂、エポキシ樹
脂、エポキシ−アクリレート樹脂等が挙げられる。

【００２５】本発明の方法は、通常、低温保存した血液
を加温した後、刺激剤が所定量収容された反応容器に、
添加して反応させる方法が取られる。上記刺激剤が所定
量収容された反応容器内を予め減圧にし、ゴム栓体など
で密封しておくと、該反応容器内と測定しようとする血
液の入った容器内とをマルチプル注射針などで接続する
ことにより、血液をより安全に該反応容器内に移すこと
ができる。

【００２６】また、本発明の方法で使用される反応容器
として、採血時に用いられた真空採血管がそのまま用い
られてもよい。この場合の一例としては、真空採血管に
血液抗凝固剤を所定量入れておいたものに、血液を採取
し、これを低温で保存しておき、測定の開始に先立って
体温に近い温度に加温した後、これに刺激剤を所定量添
加して反応させる方法が挙げられる。

【００２７】本発明の方法で細胞機能を測定する際の血
液量は、反応容器の容積によって異なるが、通常、４〜
５ｍｌの容積の反応容器を用いる場合であれば、０．５
〜２ｍｌ程度でよい。

【００２８】本発明の方法における、血液中の血液細胞
と刺激剤とを反応させる工程の反応温度は、上記生理活
性物質の産生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起こ
さない温度である１５〜４２℃が好ましく、より、好ま
しくは、３０〜４０℃である。反応時間は、上記生理活
性物質の産生が効率的に行われ、過度の溶血を引き起こ
さない反応時間である１〜４８時間が好ましく、より好
ましくは、２〜２４時間である。上記反応に際しては、
血液、刺激剤および血液抗凝固剤が収容された反応容器
を振とうするのが好ましい。

【００２９】本発明の方法においては、次に、産生され
た生理活性物質量を測定する。産生された生理活性物質
量を測定する方法としては、例えば、測定しようとする
上記生理活性物質に対するモノクローナル抗体もしくは
ポリクローナル抗体、ペルオキシダーゼ、アルカリフォ
スファターゼなどの酵素及び各々の酵素の発色基質を利
用した酵素免疫測定方法；ＨＰＬＣ（高速液体クロマト
グラフィー）方法などが挙げられるが、これに限らず、
それぞれの生理活性物質における公知の測定方法を用い
てもよい。

【００３０】

【発明の実施の形態】次に、本発明の実施例及び比較例
を挙げることにより、本発明をさらに詳細に述べる。本
発明は以下の実施例に限定されるものではない。

【００３１】以下の実施例及び比較例において、刺激剤
としてはエンドトキシン（ＬＰＳ）を用い、血液細胞に
産生させて測定する生理活性物質としてはＴＮＦαと
し、細胞機能測定用反応器の製造方法、および、ＴＮＦ
αの産生反応とその産生量の測定方法は以下の通りとし
た。

【００３２】（１）細胞機能測定用反応器の製造方法 ポリエチレンテレフタレート製のＬＰＳフリー採血管
（積水化学工業社製、12.6φ×75mm）１８本を用意し、
この採血管のそれぞれにＬＰＳ（ＬＢＬ社製）の２００
０ＥＵ（国際エンドトキシンユニット）／ｍｌ生理食塩
水（大塚製薬社製）溶液を０．０５ｍｌ添加し、細胞機
能測定用反応器を製造した。

【００３３】（２）ＴＮＦ−αの産生反応とその産生量
の測定方法 ボランティアＡ、Ｂの２人から、ポリエチレンテレフタ
レート製のＬＰＳフリー採血管（積水化学工業社製、1
2.6φ×75mm）に、それぞれ１０ｍｌずつヘパリン採血
した。採血した血液を、以下に示す各実施例および比較
例の条件で保存したものを、上記の細胞機能測定用反応
器に１ｍｌ添加し、３７℃、４時間、振とう培養した
後、２５００ｒｐｍ×１０分の条件で遠心分離し、上澄
みの血漿を採取した。採取した血漿中のＴＮＦα量をモ
ノクローナル抗体を用いた酵素免疫測定キット（Ｇｅｎ
ｚｙｍｅ社製）を用いて測定した。なお、この測定方法
の検出限界濃度は１６ｐｇ／ｍｌであった。また、この
産生反応は、それぞれの例について繰り返し数３で行っ
た。

【００３４】実施例１ 採血した血液をすぐに４℃で２４時間保存し、次いで、
３７℃で４０分間加温した後、上記のＴＮＦαの産生反
応に用いた。ボランティアＡ、Ｂのそれぞれの血液につ
いて、得られた血漿中のＴＮＦα濃度の平均値、標準偏
差及び変動係数（（標準偏差／平均値）×１００）を表
１に示した。

【００３５】比較例１ 採血した血液を保存せずに、採血直後に、上記のＴＮＦ
αの産生反応に用いた。ボランティアＡ、Ｂのそれぞれ
の血液について、得られた血漿中のＴＮＦα濃度の平均
値、標準偏差及び変動係数（（標準偏差／平均値）×１
００）を表１に示した。

【００３６】比較例２ 採血した血液をすぐに４℃で２４時間保存し、次いで、
加温せずに冷えたままの状態で、上記のＴＮＦαの産生
反応に用いた。ボランティアＡ、Ｂのそれぞれの血液に
ついて、得られた血漿中のＴＮＦα濃度の平均値、標準
偏差及び変動係数（（標準偏差／平均値）×１００）を
表１に示した。

【００３７】

【表１】

【００３８】表１より以下のことが分かる。４℃で２４
時間保存した血液を加温せずに冷えたままの状態で、Ｔ
ＮＦαの産生反応に用いた場合（比較例２）、採血直後
の血液を用いた場合（比較例１）に比較して、ＴＮＦα
の産生量が有意に減少した。

【００３９】しかし、４℃で２４時間保存した血液を、
３７℃で４０分間加温した後、ＴＮＦαの産生反応に用
いる（実施例１）と、ＴＮＦαの産生量は、採血直後の
血液を用いた場合（比較例１）とほぼ同量であった。

【００４０】以上より、採血後、低温で保存した血液の
細胞機能を測定するに際して、刺激剤で刺激する前に、
加温する工程をいれると、採血直後と同様に細胞機能を
精度よく測定することができることが分かった。

【００４１】

【発明の効果】本発明の細胞機能測定方法の構成は、上
記の通りであり、本方法を用いると、血液を用いる細胞
機能測定において、採血した血液を測定を行うまで低温
で保存するので、安定に保存することができ、採血直後
に測定する必要がないために、検体処理効率を上げるこ
とができ、また、低温で保存された血液を測定に先立っ
て体温に近い温度に加温するので、低温で保存されたに
もかかわらず、精度良く細胞機能測定できる細胞機能測
定方法が提供される。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 血液中の細胞機能測定方法であって、採
   血された血液を低温で保存する工程、低温で保存された
   血液を測定に先立って体温に近い温度に加温する工程、
   次いで上記血液中の血液細胞と刺激剤とを反応させて生
   理活性物質を産生させる工程、および産生された生理活
   性物質量を測定する工程とからなることを特徴とする細
   胞機能測定方法。