JPH11142409A

JPH11142409A - 病原性微生物の検出方法

Info

Publication number: JPH11142409A
Application number: JP9327008A
Authority: JP
Inventors: Kozo Ueda; 剛三上田; Kozo Hashimoto; 幸藏橋本; Yoshihisa Kawamura; 川村　　良久; Hideyo Yamaguchi; 英世山口; Muneaki Murayama; ▲宗▼明村山; Kouichi Makimura; 浩一槇村
Original assignee: TOYOBO GENE ANALYSIS KK
Current assignee: TOYOBO GENE ANALYSIS KK
Priority date: 1997-11-11
Filing date: 1997-11-11
Publication date: 1999-05-28

Abstract

(57)【要約】【課題】血液等の臨床試料から、高感度かつ、特異的
に広範囲の病原性微生物、特に病原性真菌を検出する方
法ならびにそのための試薬の提供。【解決手段】（１）病原性微生物に対して特異的親和
性を有する物質を固相担体に結合した不溶性固相担体
に、病原性微生物を含む試料を接触させて、該病原性微
生物を捕捉させ、（２）不溶性固相担体を液相から分離
した後、該不溶性固相担体に捕捉された病原性微生物か
ら遺伝子を単離させ、（３）該遺伝子を増幅させ、次い
で、（４）増幅された遺伝子を検出することを特徴とす
る病原性微生物の検出方法ならびに該方法に使用する試
薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、病原性微生物、特
に病原性真菌の遺伝子を検出することにより、広範囲な
病原性微生物を検出する方法ならびに該方法に使用する
試薬キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】近年の高度医療の普及に伴い、易感染患
者は増加の一途をたどっており、深部（全身性）真菌症
は、易感染患者が高頻度に罹患する重要な感染症とし
て、医療上の問題となってきている。病原性真菌の検出
は、主に該菌を培養することによって行われているが、
培養陽性率が低く長期間を必要とし、同定までには、さ
らに時間を必要とする。また、真菌の抗原あるいは抗体
を用いて、免疫学的に検出する方法、真菌の代謝産物あ
るいは菌体成分を生化学的に検出する方法もあるが、い
ずれの方法も感度が低く、非特異反応により偽陽性を示
す等の問題がある。病原性真菌遺伝子に特異的な核酸プ
ライマーを用いたＰＣＲ法によって、病原性真菌群は極
めて迅速かつ高感度に検出される（特開平6-339399号公
報）。しかしながら、試料より抽出された遺伝子には、
目的とする病原性微生物以外に由来するもの、特に血液
を試料とする場合、比重等の関係があり、真菌と試料中
の白血球等の細胞成分を遠心分離により分離することが
難しく、ヒト由来の遺伝子やその他の物質が多く含まれ
るため、ＰＣＲ法による検出を困難にすることがある。
従って、病原性真菌を特異的により高感度かつ迅速に検
出する方法の開発が望まれていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、血液
等の臨床試料から、高感度かつ特異的に、広範囲の病原
性微生物、特に病原性真菌を検出する方法ならびにその
ための試薬を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記現状
に鑑み、鋭意検討を重ねた結果、病原性微生物、特に病
原性真菌に特異性を有する抗体、抗体断片、または抗血
清を担持させた不溶性固相担体を用いることにより、試
料中より検出すべき該病原性微生物と白血球等の細胞成
分を分離することを可能とした。その後、病原性微生物
遺伝子、特に病原性真菌に特異的な核酸プライマーを用
いたＰＣＲ法を行うことによって試料中の当該遺伝子を
増幅し、極めて高感度に検出することを見いだして、本
発明を完成するに至った。

【０００５】すなわち、本発明は（１）病原性微生物に
対して特異的親和性を有する物質を固相担体に結合した
不溶性固相担体に、病原性微生物を含む試料を接触させ
て、該病原性微生物を捕捉させ、（２）不溶性固相担体
を液相から分離した後、該不溶性固相担体に捕捉された
病原性微生物から遺伝子を単離させ、（３）該遺伝子を
増幅させ、次いで（４）増幅された遺伝子を検出するこ
とを特徴とする病原性微生物の検出方法である。

【０００６】また、本発明は少なくとも、（ａ）病原性
微生物に対して特異的親和性を有する物質を結合した不
溶性固相担体、（ｂ）病原性微生物から遺伝子を単離す
る試薬、および（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー
およびｄＮＴＰを含む遺伝子を増幅する試薬を含有する
ことを特徴とする病原性微生物検出用試薬キットであ
る。

【０００７】

【発明の実施態様】本発明の対象となる病原性微生物と
しては、病原性真菌が挙げられ、具体的にはカンジダ
属、ハンセヌラ属、サッカロマイセス属、トリコスポロ
ン属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、ペニシ
リウム属、ブラストマイセス属、コクシジオイデス属、
ニュウモシスチス属等の菌類が挙げられる。

【０００８】本発明において使用する病原性微生物に対
して特異的親和性を有する物質とは、上記病原性微生物
の表面にある細胞膜あるいは細胞壁に対して特異的親和
性を有する物質であり、例えば、該微生物に対する抗血
清、抗体または抗体断片がある。その特異的親和性とは
抗原・抗体反応により該病原性微生物を特異的に認識
し、結合する能力のことである。

【０００９】当該病原性微生物に対して特異的に親和性
を有する抗体、抗体断片、抗血清等は通常当分野で行わ
れる方法によって製せられる。例えば、抗血清を製造す
る方法としては、該微生物をマウスやウサギといった動
物の背部皮下あるいは腹腔内あるいは静脈等に注射して
免疫し、抗体価が上昇するのを待った後、採血し血清を
得る方法が一般的である。抗体を製造する方法として
は、抗血清を精製するか、または、モノクローナル抗体
を使用する場合には、常法に従いハイブリドーマを作製
して、その分泌液を精製する。抗体断片を製造する方法
としては、クローニングした抗体遺伝子断片を微生物等
に発現させる方法がよく用いられている。当該抗体、抗
体断片、抗血清等の純度は、標的とする病原性微生物に
対する特異的親和性を保持している限り、特に限定され
ない。これらは市販されているものを用いてもよい。例
えば、病原性真菌に対する抗血清としては、カンジダ属
の同定用ではあるが、ヤトロン社の”カンジダチェッ
ク”に、各種の菌種に対する抗血清が含まれている。

【００１０】本発明において使用する固相担体として
は、多孔性微粒子、膜、フィルム、試験管、ビーズ、ウ
ェル等の形状を有する不溶性のものが挙げられる。その
材質としては、ガラス、シリカ、ポリスチレン等の有機
ポリマー等が例示され、該固相は磁性粒子であってもよ
い。好適には、これらの固相表面に化学的または物理的
処理を施して、タンパク質と容易に結合できるものであ
る。

【００１１】本発明の検出方法を用いる対象となる試料
は特に限定されず、血液、血清または髄液等の生体試料
ならびにそれらを希釈したもの等が用いられる。試料と
しては、さらに、無菌的に採取された気管支洗浄液（Ｂ
ＡＬ）、腹水、胸水等の体液等が挙げられる。

【００１２】病原性微生物から遺伝子を単離するには、
まず、病原性微生物の細胞壁または細胞膜を破壊もしく
は溶解する必要がある。その処理方法としては、ガラス
ビーズ等を用いた物理的破砕、超音波による破砕、熱処
理、アルカリ処理、細胞壁溶解酵素処理、界面活性剤処
理等の方法があり、又、いくつかを組み合わせて用いる
こともできる。

【００１３】これらの処理により細胞外に出た遺伝子
は、そのままＰＣＲ法等の遺伝子増幅工程に使用するこ
とが可能であるが、増幅反応に影響がある場合には、更
に遺伝子を精製する必要がある。その精製方法として
は、プロテアーゼ等を使用した蛋白分解処理、フェノー
ル等による蛋白変性処理、クロロホルム等による脂質の
除去等が挙げられる。また、ＰＣＲ法の場合菌体をその
ままサンプルとして増幅することも可能なこともある。

【００１４】病原性微生物から遺伝子を単離する為に、
細胞壁溶解酵素を使用する場合は、菌の種類により酵素
を選択する必要がある。例えば、酵母様真菌の場合は、
Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ（生化学工業）、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ
（Ｎｏｖｏ）等が、グラム陽性菌等ではリゾチーム等が
好適に用いられる。

【００１５】本発明において使用する、遺伝子を増幅す
る方法としては、例えばＰＣＲ法があり、該方法に使用
する試薬は、少なくともＤＮＡポリメラーゼ、プライマ
ーおよびｄＮＴＰを含む。ＤＮＡポリメラーゼとして
は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑＤＮＡポ
リメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤポリメ
ラーゼ等があり、これらのＤＮＡポリメラーゼを改変し
た酵素を使用することも可能である。ｄＮＴＰとは、ｄ
ＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄ
ＵＴＰ等のデオキシヌクレオシド三リン酸を意味する。
プライマーとしては、検出しようとする病原性微生物が
有する遺伝子に対して相補的な塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドが使用される。当該オリゴヌクレオチドは
病原微生物に対する相補性を有している限りその由来は
特に限定されず、合成されたものであっても、当該病原
性微生物の遺伝子から必要な部分を切り出し、通常行わ
れる方法によって精製されたものであってもよい。これ
らのプライマーは、酵素やラジオアイソトープ等で標識
されていてもよい。特に病原性真菌を検出するに当た
り、有用なプライマーとしては、配列表配列番号１およ
び２に記載される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
が例示される。当該オリゴヌクレオチドは、真菌類に共
通な１８ｓＲＮＡをコードするＤＮＡである。

【００１６】遺伝子を増幅する緩衝液としては、それぞ
れの核酸増幅酵素、例えばＤＮＡポリメラーゼに適した
ものを選択すればよい。例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の
緩衝剤に加え、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ₂等の塩類やＴｒｉｔ
ｏｎＸ−１００等の界面活性剤を含む緩衝液等が用いら
れる。

【００１７】これらの試薬には、検出に悪影響を及ぼさ
ないものであれば、界面活性剤、塩類、ポリメラーゼに
対する抗体等が含有されていてもよい。

【００１８】本発明の病原性微生物の検出方法は、
（１）病原性微生物に対して特異的親和性を有する物質
を固相担体に結合した不溶性固相担体に、病原性微生物
を含む試料を接触させて、該病原性微生物を当該担体に
捕捉させ、（２）不溶性固相担体を液相から分離した
後、該不溶性固相担体に捕捉された病原性微生物から遺
伝子を単離させ、（３）該遺伝子を増幅させ、次いで
（４）増幅された遺伝子を検出することによって行われ
る。

【００１９】病原性微生物に対して特異的親和性を有す
る物質を固相担体に結合させるためには、物理的に吸着
させるか、あるいは化学的に担持させる方法が用いられ
る。物理吸着法は、適当な緩衝液中で前記固相担体と病
原性微生物に対して特異的親和性を有する物質とを反応
させることにより行うものである。この反応に使用する
緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、
炭酸緩衝液等が挙げられる。反応は両者を室温にて混合
することにより容易に進行し、目的物を得ることができ
る。また、化学結合法は、いわゆるペプチド結合におけ
るカルボイミジド法やグルタルアルデヒド法等を採用す
ることができる。固相担体への当該物質の結合量は、物
質の種類や結合方法によっても異なり、適宜、選択され
る。

【００２０】上記の、病原性微生物に対して特異的親和
性を有する物質を結合させた不溶性固相担体に、病原性
微生物を含む試料を接触させて、病原性微生物を捕捉す
る工程としては、通常、室温で行うが、例えば当該物質
が抗体や抗体断片、抗血清である場合には、免疫反応を
向上させるため、３０〜４０℃に加温したり、試薬の安
定性を維持するため、４〜２０℃に冷却しておこなって
もよい。例えば、当該不溶性固相担体が磁性粒子の場
合、具体的な接触方法としては、カラム法やバッチ法等
が挙げられるが、より多種類の不溶性固相担体に適用可
能なバッチ法が好ましい。接触時間は、処理温度によっ
ても異なるが通常１〜２０分間程度である。

【００２１】不溶性固相担体を液相から分離する工程と
しては、通常の固体および液体の分離手段を採用すれば
よく、例えば不溶性固相担体が磁性粒子である場合に
は、磁力により分離する。

【００２２】該不溶性固相担体に捕捉された病原性微生
物から遺伝子を単離させる工程としては、遺伝子を単離
させる試薬中で上記不溶性固相担体を処理する工程であ
る。その方法としては、超音波による破砕やガラスビー
ズ等を用いた物理的破砕、熱処理、アルカリ処理、細胞
壁溶解酵素を作用させる方法、ＳＤＳ等を用いた浸透圧
の変化による方法等がある。即ち、本発明における遺伝
子を単離させる試薬としては、実施する処理方法によっ
て異なるが、例えば、上記の細胞壁溶解酵素やＳＤＳ等
を含む試薬が用いられる。

【００２３】単離された遺伝子は、上記増幅試薬を用い
て増幅される。増幅方法としては、ＰＣＲ法の他にＮＡ
ＳＢＡ法、ＴＡＭ法等種々の方法が採用できる。好まし
くは、ＰＣＲ法を実施する。ＰＣＲとは、試料である２
本鎖ＤＮＡを変性して１本鎖にした後、それぞれの鎖に
対して相補的な塩基配列を有するプライマーをハイブリ
ダイズさせ、鎖延長し、得られた２本鎖を再度、変性し
て１本鎖にした後、前記プライマーをハイブリダイズさ
せて、鎖延長する工程を繰り返す方法である。ここで、
一方のプライマーは、他のプライマーの伸長生成物に対
して相補的であることが必要である。

【００２４】増幅された遺伝子を検出する工程として
は、通常当分野で行われている各種の方法が利用される
が、具体的には例えば電気泳動により遺伝子を分離さ
せ、目的の病原性微生物由来の遺伝子を他の遺伝子と区
別して目視検出する方法、標識を有する検出プローブを
ハイブリダイズさせて、目的の病原性微生物由来の遺伝
子を検出する方法、標識プライマーによる増幅後、抗標
識物質を作用させて発色、発光させる方法等がある。

【００２５】本発明においては、上記の病原性微生物の
検出方法に使用する試薬を併せて梱包し、キットとする
ことが、本発明の検出方法を施行するにあたり好適であ
る。当該キットは、少なくとも（ａ）病原性微生物に対
して特異的親和性を有する物質を結合した不溶性固相担
体、（ｂ）病原性微生物から遺伝子を単離するのに必要
な試薬および（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーお
よびｄＮＴＰを含む遺伝子を増幅する試薬を含有してい
る。

【００２６】本発明のキットに含められる、病原性微生
物に対して特異的親和性を有する物質を結合した不溶性
固相担体としては、検出の対象となる病原性微生物に対
して適宜選択されるが、具体的には上述のものが挙げら
れる。何種類もの病原性微生物の検出を目的とする場合
は、各種の病原性微生物に対する特異的親和性を有する
物質を結合した不溶性固相担体を必要量含めることがで
きる。

【００２７】本発明のキットに含められる病原性微生物
から遺伝子を単離する試薬としては、対象となる病原性
微生物や実施する遺伝子を単離する方法によっても異な
る。血液等の生体試料を測定するためのキットを構成す
る場合、最終濃度として、例えば細胞壁溶解酵素０．０
１〜５ｍｇ／ｍｌ程度が含められ、さらに当該遺伝子を
より効率的に抽出するため界面活性剤（ＳＤＳ等）０．
０５〜５％程度、タンパク分解酵素（ｐｒｏｔｅｉｎａ
ｓｅＫ等）０．０１〜１ｍｇ／ｍｌ程度が含められ
る。さらに精製度を高めるためのフェノール／クロロホ
ルム処理に使用する試薬等を必要量併せて梱包しておく
ことも有利である。

【００２８】本発明のキットに含められるＤＮＡポリメ
ラーゼ、プライマーおよびｄＮＴＰを含む遺伝子を増幅
する試薬としては、単離した遺伝子を増幅可能なもので
あればその由来等は特に限定されないが、好ましくは、
上記のとおり、特に病原性真菌を検出するに当たり有用
なプライマーとして、配列表配列番号１および２に記載
される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを使用す
る。当該ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびｄＮＴ
Ｐは、当該増幅工程を十分に行い得る量が含められる
が、血液等の生体試料を測定するためのキットを構成す
る場合であれば、最終濃度として、例えばＤＮＡポリメ
ラーゼは１〜１０００Ｕ／ｍｌ程度、ｄＮＴＰは５０〜
５００ｍＭ程度、プライマーは１〜３００ｎＭ程度が含
められる。

【００２９】さらに所望により本発明のキットには、病
原性微生物から遺伝子を単離する工程に適した緩衝液お
よび当該遺伝子を増幅する工程に適した緩衝液を併せて
含めておいてもよい。さらに、増幅した遺伝子を検出す
るための試薬も、検出方法に併せて各種組み合わせ含め
ておくこともできる。

【００３０】

【実施例】次に、本発明を実施例を用いて具体的に説明
するが本発明はこれに何ら限定されるものではない。実施例１血液中のカンジダ・アルビカンスの検出（１）抗体結合ビーズの作製不溶性固相担体（ダイナビーズ、ダイナル製、粒径２．
８μｍ、Ｔｏｃｙｌａｔｉｖａｔｅｄ）１０⁸beads ／
ｍｌを２μｌに、カンジダ属に対する抗血清（カンジダ
チェック、同定用因子抗体ＮＯ．１、ヤトロン製）１ｍ
ｌをリン酸緩衝液を用いて、３７℃、２０〜２４時間反
応させ物理吸着させた。吸着後、数回リン酸緩衝液４ｍ
ｌを加え、磁気スタンド（ダイナル製）を利用して当該
不溶性固相担体を洗浄し、最終的にリン酸緩衝液で１０
ｍｇ／ｍｌの濃度になるように懸濁した。

【００３１】（２）試料の調整カンジダ・アルビカンスＴＩＭＭ０１６９をサブロー寒
天生培地（ＢＢＬ社製）にて、３０℃、２４時間培養し
た。培養物を滅菌生理食塩水で懸濁して菌液を作製し、
該菌液中の菌数を計算盤を用いて測定した。その数は１
０⁶個／μｌであった。次いで、ヒト健常者より静脈血
を採取し、その血液に調整した前記菌液（１０倍希釈系
列で１個／ｍｌ〜１０³個／ｍｌ）を加えたものを試料
とした。また、該菌液を加えない血液を対照試料とし
た。

【００３２】（３）ビーズを用いたカンジダ・アルビカ
ンスの単離及び遺伝子の抽出１０ｍｇ／ｍｌの上記不溶性固相担体懸濁液１００μｌ
をマイクロチューブに充填し、１〜１０³個／ｍｌの菌
量に調整した試料をそれぞれ２５０μｌを加え、室温で
１〜３分間、緩やかに攪拌しながら、試料と該不溶性固
相担体とを接触させた。接触工程後、数回、リン酸緩衝
液１ｍｌを加え、磁気スタンド（ダイナル製）を利用し
て不溶性固相担体を洗浄し、血液成分等を除去した。つ
いで、再度、磁気スタンド（ダイナル製）を利用して不
溶性固相担体のみを分離した。さらに、不溶性固相担体
に０．５ｍｇ／ｍｌのＮｏｖｏｚｙｍｅ（細胞壁溶解酵
素、ＮＯＶＯ製）を含む酵素液２００μｌを加え、３７
℃、１時間反応させ、細胞壁を溶解した。さらに、１０
％ＳＤＳ、１．５ｍｇ／ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｋ（ベーリンガーマンハイム社製）をそれぞれ２０μｌ
加え、３７℃にて１５分間反応させた後、フェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：
１）を加えて混和し、１３０００ｒｐｍ、１０分間遠心
分離後、ＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは１６μｌ
の滅菌蒸留水に溶解した。

【００３３】（４）Ｂｕｃｈｍａｎらの方法による遺伝
子の抽出比較のために、同じ試料を用いて、ＢｕｃｈｍａｎＴ
（ＳｕｒｇｅｒｙＶｏｌ．１０８，１９９０）らの方
法に従い、ＤＮＡを抽出した。すなわち、ヒト健常者よ
り採取した静脈血１００μｌに、Lysis Buffer 1(50mM
Tris-HCl pH7.5,1%Tween 20、1%Triton-X 100、1%NP-4
0)を１００μｌ加え、１３０００ｒｐｍ、２分間遠心分
離後、上清を除去し、さらに、Lysis Buffer 2 (50mM T
ris-HCl pH7.5, 0.5%Tween 20 、0.5%Triton-X 100、0.
5%NP-40)を１０００μｌ加えて、１３０００ｒｐｍ、２
分間遠心分離し、上清を除去した。次いで、Wash Buffe
r(50mM Tris-HCl pH7.5 、10mM MgCl ₂) にて１〜２回
洗浄後、ＤＮａｓｅＩ（ベーリンガーマンハイム社製、
100 単位/ml ）１００μｌを添加して、反応させた後、
ＤＮａｓｅを失活させ、遠心分離し、ペレットを得た。
その後、０．５ｍｇ／ｍｌのＮｏｖｏｚｙｍｅ（細胞壁
溶解酵素、ＮＯＶＯ製）を含む酵素液２００μｌを加
え、３７℃、１時間反応させて細胞壁を溶解した。さら
に、終濃度が０．１％、１５μｇ／ｍｌとなるように、
ＳＤＳおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ（ベーリンガー
マンハイム社製）をそれぞれ加え、３７℃、１５分間反
応させた。さらに、フェノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコール（２５：２４：１）を加えて混和し、１
３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離後、ＤＮＡを抽出し
た。抽出したＤＮＡは滅菌蒸留水１６μｌに溶解した。

【００３４】（５）遺伝子の増幅得られたＤＮＡ含有溶液５μｌを、配列番号１および２
に記載される塩基配列を有する増幅プライマーを用い、
自動遺伝子増幅装置により増幅反応を実施した。反応液
組成は、２００μＭのｄＮＴＰ、０．３ｐｍｏｌ／μｌ
のプライマー対、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．６単位
／チューブのＴａｑポリメラーゼであり、反応条件は９
４℃、５分間の変性後、９４℃、１分間の変性→５７
℃、１分間のプライマー・アニーリング→７２℃、１分
３０秒の合成反応のサイクルを計３３サイクル行った
後、７２℃、１０分間反応させた。

【００３５】（６）増幅遺伝子の解析増幅反応後、ミネラルオイルの下層の反応液を１０μｌ
取り、２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウム
ブロマイドでＤＮＡを染色し、ＵＶ照射により写真撮影
にて増幅されたＤＮＡを確認した。該菌液を加えない血
液を対照試料として同様に増幅させた後、同様に電気泳
動した。本発明の結果を図１に、Ｂｕｃｈｍａｎらの方
法による結果を図２に示す。両図ともに、レーン１は分
子量マーカーを示し、レーン２、３、４および５はそれ
ぞれ１０³、１０²、１０¹および１個／ｍｌの菌液を
添加した試料についての、レーン６は対照試料について
の結果を示している。

【００３６】図１及び図２から明らかなように、これら
の検出法では１桁以上の感度差が認められた。さらに、
本発明の検出法（図１）では増幅反応に阻害を及ぼすと
思われる宿主由来のＤＮＡの存在は認められなかった
が、図２ではスメアなパターンが観察され、宿主由来の
ＤＮＡの存在が認められた。

【００３７】

【発明の効果】本発明では、病原性微生物に対して特異
的な親和性を有する物質、例えば、抗血清を担持させた
不溶性固相担体を用い、試料から検出すべき病原性微生
物、特に病原性真菌を分離した後、該病原性微生物由来
の遺伝子に特異的な核酸プライマーを用いたＰＣＲを行
うことによって、該遺伝子を増幅して、極めて高感度に
病原性微生物遺伝子を検出することができる。

【００３８】

【配列表】

配列番号: １配列の長さ :１９配列の型 :核酸鎖の数 :１本鎖トポロジー :直鎖状配列の種類 :他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴：配列 ACTTTCGATG GTAGGATAG 19

【００３９】配列番号 :２配列の長さ : 配列の型 :核酸鎖の数 :１本鎖トポロジー :直鎖状配列の種類 :他の核酸合成DNA 配列の特徴：配列 TGATCGTCTT CGATCCCCTA 20

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の方法により、カンジダ・アルビカンス
懸濁液を加えたヒト健常者の静脈血中のカンジダ・アル
ビカンス遺伝子を検出した結果を示す電気泳動の写真で
ある。

【図２】Ｂｕｃｈｍａｎらの方法により、カンジダ・ア
ルビカンス懸濁液を加えたヒト健常者の静脈血中のカン
ジダ・アルビカンス遺伝子を検出した結果を示す電気泳
動の写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者山口英世神奈川県川崎市多摩区栗谷２丁目15番地５ (72)発明者村山 ▲宗▼明東京都江戸川区清新町１丁目４番地10号棟 1015号 (72)発明者槇村浩一東京都日野市南平１丁目３番７号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（１）病原性微生物に対して特異的親和
性を有する物質を固相担体に結合した不溶性固相担体
に、病原性微生物を含む試料を接触させて、該病原性微
生物を捕捉させ、（２）不溶性固相担体を液相から分離
した後、該不溶性固相担体に捕捉された病原性微生物か
ら遺伝子を単離させ、（３）該遺伝子を増幅させ、次い
で、（４）増幅された遺伝子を検出することを特徴とす
る病原性微生物の検出方法。
【請求項２】病原性微生物が病原性真菌である請求項
１記載の方法。
【請求項３】病原性微生物に対して特異的な親和性を
有する物質が、抗体、抗体断片または抗血清である請求
項１または２に記載の方法。
【請求項４】不溶性固相担体が、磁性粒子である請求
項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】病原性微生物を含む試料が、血液、血清
または髄液である請求項１〜４のいずれかに記載の方
法。
【請求項６】該遺伝子を増幅させる工程が、ＤＮＡポ
リメラーゼ、プライマーおよびｄＮＴＰを含む遺伝子を
増幅する試薬を使用して、該遺伝子を増幅する工程であ
り、該遺伝子を増幅するプライマーが、配列表の配列番
号１および２に記載される塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドである請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】少なくとも、（ａ）病原性微生物に対し
て特異的親和性を有する物質を結合した不溶性固相担
体、（ｂ）病原性微生物から遺伝子を単離するのに必要
な試薬、および（ｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー
およびｄＮＴＰを含む遺伝子を増幅する試薬、を含有す
ることを特徴とする病原性微生物検出用試薬キット。
【請求項８】プライマーが、配列表の配列番号１およ
び２に記載される塩基配列を有するオリゴヌクレオチド
である請求項７記載の試薬キット。