JPH11142745A - 顕微鏡装置 - Google Patents
顕微鏡装置Info
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- JPH11142745A JPH11142745A JP30893097A JP30893097A JPH11142745A JP H11142745 A JPH11142745 A JP H11142745A JP 30893097 A JP30893097 A JP 30893097A JP 30893097 A JP30893097 A JP 30893097A JP H11142745 A JPH11142745 A JP H11142745A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 光学系の調整が容易でＳ／Ｂ比が優れた顕微
鏡装置を提供する。 【解決手段】 光源１０から出力された励起光Ａは、反
射鏡１２および１３を経て鏡体２０内に導かれ、対物レ
ンズ３０の最先端レンズ３１の平坦面３１Ａに入射し、
最先端レンズ３０の出射面から出射され、カバーガラス
５１と試料６０との境界面で全反射する。この全反射に
伴いエバネセント照明された試料６０の表面近傍に存在
する蛍光物質から蛍光Ｂが発生し、その蛍光Ｂは、対物
レンズ３０および反射鏡２１を経て光検出器７０により
検出される。
鏡装置を提供する。 【解決手段】 光源１０から出力された励起光Ａは、反
射鏡１２および１３を経て鏡体２０内に導かれ、対物レ
ンズ３０の最先端レンズ３１の平坦面３１Ａに入射し、
最先端レンズ３０の出射面から出射され、カバーガラス
５１と試料６０との境界面で全反射する。この全反射に
伴いエバネセント照明された試料６０の表面近傍に存在
する蛍光物質から蛍光Ｂが発生し、その蛍光Ｂは、対物
レンズ３０および反射鏡２１を経て光検出器７０により
検出される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料の表面近傍を
エバネセント照明して当該表面近傍から発生した光束を
検出し、当該表面近傍を観察する顕微鏡装置に関するも
のである。
エバネセント照明して当該表面近傍から発生した光束を
検出し、当該表面近傍を観察する顕微鏡装置に関するも
のである。
【０００２】
【従来の技術】互いに屈折率が異なる２つの媒質が密着
している場合に、屈折率が高い媒質の側から境界面に一
定角度以上の入射角で光を入射させると、その光は境界
面で全反射するとともに、屈折率が低い媒質中の境界面
近傍にエバネセント波が発生する。このエバネセント波
を利用することにより、試料の境界面近傍のみを光学的
に観察することができる。
している場合に、屈折率が高い媒質の側から境界面に一
定角度以上の入射角で光を入射させると、その光は境界
面で全反射するとともに、屈折率が低い媒質中の境界面
近傍にエバネセント波が発生する。このエバネセント波
を利用することにより、試料の境界面近傍のみを光学的
に観察することができる。
【０００３】例えば、蛍光物質が含まれた試料に対し励
起光をエバネセント照明して発生した蛍光を観察する蛍
光顕微鏡装置においては、試料の境界面近傍に存在する
蛍光物質のみを励起し、他の領域に存在する蛍光物質を
励起しないことから、境界面に垂直な方向についての蛍
光測定の空間分解能が向上し、また、不要な背景光が発
生することなくＳ／Ｂ比も向上し、したがって、微弱な
蛍光をも検出することができる。
起光をエバネセント照明して発生した蛍光を観察する蛍
光顕微鏡装置においては、試料の境界面近傍に存在する
蛍光物質のみを励起し、他の領域に存在する蛍光物質を
励起しないことから、境界面に垂直な方向についての蛍
光測定の空間分解能が向上し、また、不要な背景光が発
生することなくＳ／Ｂ比も向上し、したがって、微弱な
蛍光をも検出することができる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】このような試料をエバ
ネセント照明して観察する顕微鏡装置においては、プリ
ズム等を用いてエバネセント照明するとともに、試料に
対してプリズム等が配される側とは反対の側に配された
対物レンズを介して試料から発生した光束を観察してい
た。それ故、試料が厚い場合や不透明である場合には、
試料中のエバネセント照明された位置を対物レンズによ
り観察することができなかった。
ネセント照明して観察する顕微鏡装置においては、プリ
ズム等を用いてエバネセント照明するとともに、試料に
対してプリズム等が配される側とは反対の側に配された
対物レンズを介して試料から発生した光束を観察してい
た。それ故、試料が厚い場合や不透明である場合には、
試料中のエバネセント照明された位置を対物レンズによ
り観察することができなかった。
【０００５】このような問題点を解消すべく、薄いガラ
ス板の両面で全反射を繰り返しながら光を導波させて当
該ガラス面上に置かれた試料をエバネセント照明する顕
微鏡装置が提案されている（例えば、M.Nakache, et a
l., "Topological and modulated distribution of sur
face markers on endothelial cells", Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA, Vol.83, pp.2874-2878, 1986 ）。しかし、
この顕微鏡装置では、対物レンズの視野内で試料がエバ
ネセント照明されるよう光学系を調整することは困難で
あり実用的ではない。
ス板の両面で全反射を繰り返しながら光を導波させて当
該ガラス面上に置かれた試料をエバネセント照明する顕
微鏡装置が提案されている（例えば、M.Nakache, et a
l., "Topological and modulated distribution of sur
face markers on endothelial cells", Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA, Vol.83, pp.2874-2878, 1986 ）。しかし、
この顕微鏡装置では、対物レンズの視野内で試料がエバ
ネセント照明されるよう光学系を調整することは困難で
あり実用的ではない。
【０００６】また、エバネセント照明に用いる光束を対
物レンズ中を通過させて、対物レンズの最先端レンズ
（対物レンズ内の複数のレンズのうち最も試料に近い位
置にあるレンズ）から出射した後に試料表面で全反射す
るよう試料に入射させる顕微鏡装置も提案されている
（例えば、D.Axelrod, "Total Internal Reflection Fl
uorescence Microscopy", Methods in Cell Biology, V
ol.30, pp.245-270, 1989、および、M.Tokunaga, et a
l., "Single Molecule Imaging of Fluorophores and E
nzymatic Reactions Achieved by Objective-Type Tota
l Internal Reflection Fluorescence Microscopy", Bi
ochemical and Biophysical Research Communications,
Vol.235, pp.47-53, 1997）。しかし、このような構成
の蛍光顕微鏡装置では、励起光が対物レンズを通過する
ことから、対物レンズ中で発生する自家蛍光が問題とな
り、微弱光を測定することは困難である。
物レンズ中を通過させて、対物レンズの最先端レンズ
（対物レンズ内の複数のレンズのうち最も試料に近い位
置にあるレンズ）から出射した後に試料表面で全反射す
るよう試料に入射させる顕微鏡装置も提案されている
（例えば、D.Axelrod, "Total Internal Reflection Fl
uorescence Microscopy", Methods in Cell Biology, V
ol.30, pp.245-270, 1989、および、M.Tokunaga, et a
l., "Single Molecule Imaging of Fluorophores and E
nzymatic Reactions Achieved by Objective-Type Tota
l Internal Reflection Fluorescence Microscopy", Bi
ochemical and Biophysical Research Communications,
Vol.235, pp.47-53, 1997）。しかし、このような構成
の蛍光顕微鏡装置では、励起光が対物レンズを通過する
ことから、対物レンズ中で発生する自家蛍光が問題とな
り、微弱光を測定することは困難である。
【０００７】本発明は、上記問題点を解消する為になさ
れたものであり、光学系の調整が容易でＳ／Ｂ比が優れ
た顕微鏡装置を提供することを目的とする。
れたものであり、光学系の調整が容易でＳ／Ｂ比が優れ
た顕微鏡装置を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明に係る顕微鏡装置
は、試料に第１の光束をエバネセント照明し、そのエバ
ネセント照明に伴って試料から発生する第２の光束を観
察する顕微鏡装置であって、第２の光束を入力する対物
レンズと、対物レンズの最先端レンズを介して試料に第
１の光束をエバネセント照明する照明光学系と、を備え
ることを特徴とする。この顕微鏡装置によれば、照明光
学系により、対物レンズの最先端レンズを介して試料に
第１の光束がエバネセント照明され、対物レンズによ
り、そのエバネセント照明に伴って試料から発生する第
２の光束が検出される。
は、試料に第１の光束をエバネセント照明し、そのエバ
ネセント照明に伴って試料から発生する第２の光束を観
察する顕微鏡装置であって、第２の光束を入力する対物
レンズと、対物レンズの最先端レンズを介して試料に第
１の光束をエバネセント照明する照明光学系と、を備え
ることを特徴とする。この顕微鏡装置によれば、照明光
学系により、対物レンズの最先端レンズを介して試料に
第１の光束がエバネセント照明され、対物レンズによ
り、そのエバネセント照明に伴って試料から発生する第
２の光束が検出される。
【０００９】また、本発明に係る顕微鏡装置は、表面に
試料を密着して保持し、最先端レンズを経て入射した第
１の光束を表面で全反射させる透明平板を更に備えるこ
とを特徴とする。この場合には、第１の光束は、対物レ
ンズの最先端レンズから出射されて透明平板に入射し透
明平板と試料との境界面で全反射して、透明平板上の試
料の表面近傍がエバネセント照明される。なお、「密
着」なる語は、物理的に接触している場合だけでなく、
全反射面近傍に生じたエバネセント波が到達する僅かの
間隙（例えば、数十ｎｍ）を隔てている場合をも表すも
のとする。
試料を密着して保持し、最先端レンズを経て入射した第
１の光束を表面で全反射させる透明平板を更に備えるこ
とを特徴とする。この場合には、第１の光束は、対物レ
ンズの最先端レンズから出射されて透明平板に入射し透
明平板と試料との境界面で全反射して、透明平板上の試
料の表面近傍がエバネセント照明される。なお、「密
着」なる語は、物理的に接触している場合だけでなく、
全反射面近傍に生じたエバネセント波が到達する僅かの
間隙（例えば、数十ｎｍ）を隔てている場合をも表すも
のとする。
【００１０】また、本発明に係る顕微鏡装置では、対物
レンズの最先端レンズの外側の表面に試料を密着して保
持し、第１の光束を最先端レンズと試料との境界面で全
反射させることを特徴とする。この場合には、第１の光
束は、対物レンズの最先端レンズの外側の表面で全反射
して、最先端レンズ上の試料の表面近傍がエバネセント
照明される。
レンズの最先端レンズの外側の表面に試料を密着して保
持し、第１の光束を最先端レンズと試料との境界面で全
反射させることを特徴とする。この場合には、第１の光
束は、対物レンズの最先端レンズの外側の表面で全反射
して、最先端レンズ上の試料の表面近傍がエバネセント
照明される。
【００１１】また、本発明に係る顕微鏡装置は、第１の
光束の反射光を対物レンズの外部へ導く反射光導光手段
を更に備えることを特徴とする。この場合には、第１の
光束が対物レンズ内で反射・散乱されることはなく、こ
の顕微鏡装置が蛍光顕微鏡装置として用いられるときに
自家蛍光の発生が抑制される。
光束の反射光を対物レンズの外部へ導く反射光導光手段
を更に備えることを特徴とする。この場合には、第１の
光束が対物レンズ内で反射・散乱されることはなく、こ
の顕微鏡装置が蛍光顕微鏡装置として用いられるときに
自家蛍光の発生が抑制される。
【００１２】また、本発明に係る顕微鏡装置では、対物
レンズの最先端レンズは石英を主成分とすることを特徴
とする。また、本発明に係る顕微鏡装置では、透明平板
は石英を主成分とすることを特徴とする。これら何れの
場合にも、この顕微鏡装置が蛍光顕微鏡装置として用い
られるときに自家蛍光の発生が抑制される。
レンズの最先端レンズは石英を主成分とすることを特徴
とする。また、本発明に係る顕微鏡装置では、透明平板
は石英を主成分とすることを特徴とする。これら何れの
場合にも、この顕微鏡装置が蛍光顕微鏡装置として用い
られるときに自家蛍光の発生が抑制される。
【００１３】また、本発明に係る顕微鏡装置は、対物レ
ンズを経た第２の光束の像を検出する光検出器と、光検
出器により検出された第２の光束の像を画像解析する画
像解析部と、を更に備えることを特徴とする。この場合
には、対物レンズにより結像された第２の光束の像は、
光検出器により検出され、画像解析部により画像解析さ
れる。
ンズを経た第２の光束の像を検出する光検出器と、光検
出器により検出された第２の光束の像を画像解析する画
像解析部と、を更に備えることを特徴とする。この場合
には、対物レンズにより結像された第２の光束の像は、
光検出器により検出され、画像解析部により画像解析さ
れる。
【００１４】
【発明の実施の形態】以下、添付図面を参照して本発明
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。また、試料に励起光（第１の光束）を照射して
蛍光（第２の光束）を観察する蛍光顕微鏡装置について
以下で説明するが、本発明はこれに限られるものではな
い。
の実施の形態を詳細に説明する。尚、図面の説明におい
て同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省
略する。また、試料に励起光（第１の光束）を照射して
蛍光（第２の光束）を観察する蛍光顕微鏡装置について
以下で説明するが、本発明はこれに限られるものではな
い。
【００１５】図１は、本実施形態に係る顕微鏡装置の構
成図であり、図２は、この顕微鏡装置の対物レンズの周
辺部分の拡大構成図である。光源１０は、試料６０中に
存在する蛍光物質を励起する励起光Ａを出力するもので
ある。例えば、波長４８８ｎｍのレーザ光を励起光Ａと
して出力するアルゴンレーザ光源が光源１０として好適
に用いられる。この光源１０の出射口付近には、照射時
間制御部１１が配されている。この照射時間制御部１１
は、制御部７２によりシャッタ開閉動作を行う。照射範
囲調節光学系１４は、励起光Ａが全反射し発生したエバ
ネセント波が試料６０に照射される範囲を調節するため
の光学系である。
成図であり、図２は、この顕微鏡装置の対物レンズの周
辺部分の拡大構成図である。光源１０は、試料６０中に
存在する蛍光物質を励起する励起光Ａを出力するもので
ある。例えば、波長４８８ｎｍのレーザ光を励起光Ａと
して出力するアルゴンレーザ光源が光源１０として好適
に用いられる。この光源１０の出射口付近には、照射時
間制御部１１が配されている。この照射時間制御部１１
は、制御部７２によりシャッタ開閉動作を行う。照射範
囲調節光学系１４は、励起光Ａが全反射し発生したエバ
ネセント波が試料６０に照射される範囲を調節するため
の光学系である。
【００１６】反射鏡１２および１３それぞれは、照射時
間制御部１１から出力された励起光Ａを順次反射させ収
納体３２内に導く。これら反射鏡１２および１３それぞ
れは、位置および方位の調整が可能あり、収納体３２内
の対物レンズ３０の最先端レンズ３１に対する励起光Ａ
の入射位置および入射角の双方または何れか一方を調整
することができる。
間制御部１１から出力された励起光Ａを順次反射させ収
納体３２内に導く。これら反射鏡１２および１３それぞ
れは、位置および方位の調整が可能あり、収納体３２内
の対物レンズ３０の最先端レンズ３１に対する励起光Ａ
の入射位置および入射角の双方または何れか一方を調整
することができる。
【００１７】対物レンズ３０の上方にステージ４０が設
けられ、試料６０を載置するカバーガラス（透明平板）
５１がステージ４０上に置かれる。このカバーガラス５
１は、励起光Ａおよび蛍光Ｂを透過させ且つ自家蛍光を
発生しない石英を主成分とするものが好適である。ま
た、カバーガラス５１と対物レンズ３０の最先端レンズ
３１との間は、試料６０に対し励起光Ａによるエバネセ
ント照明を効果的に行うために、グリセロール５０で満
たされるのが好適である。試料６０は、スペーサ５３を
介してカバーガラス５２により封入されている。試料６
０は、例えば、5-(N-hexadecanoyl)aminofluoresceinに
より染色された神経細胞（ＮＧ−１０８）であり、カバ
ーガラス５１および５２で挟まれた空間内に充填された
塩溶液中で生きたまま封入される。
けられ、試料６０を載置するカバーガラス（透明平板）
５１がステージ４０上に置かれる。このカバーガラス５
１は、励起光Ａおよび蛍光Ｂを透過させ且つ自家蛍光を
発生しない石英を主成分とするものが好適である。ま
た、カバーガラス５１と対物レンズ３０の最先端レンズ
３１との間は、試料６０に対し励起光Ａによるエバネセ
ント照明を効果的に行うために、グリセロール５０で満
たされるのが好適である。試料６０は、スペーサ５３を
介してカバーガラス５２により封入されている。試料６
０は、例えば、5-(N-hexadecanoyl)aminofluoresceinに
より染色された神経細胞（ＮＧ−１０８）であり、カバ
ーガラス５１および５２で挟まれた空間内に充填された
塩溶液中で生きたまま封入される。
【００１８】鏡体２０内に設けられた対物レンズ３０の
最先端レンズ３１の側面の一部は研磨されて平坦面３１
Ａとされ、その平坦面３１Ａは反射防止膜が形成されて
いる。また、この最先端レンズ３１は、励起光Ａおよび
蛍光Ｂを透過させ且つ自家蛍光を発生しない石英を主成
分とするものが好適である。この最先端レンズ３１は、
反射鏡１３により反射され鏡体２０内に導入された励起
光Ａを、平坦面３１Ａに入射し、出射面３１Ｂから出射
させる。
最先端レンズ３１の側面の一部は研磨されて平坦面３１
Ａとされ、その平坦面３１Ａは反射防止膜が形成されて
いる。また、この最先端レンズ３１は、励起光Ａおよび
蛍光Ｂを透過させ且つ自家蛍光を発生しない石英を主成
分とするものが好適である。この最先端レンズ３１は、
反射鏡１３により反射され鏡体２０内に導入された励起
光Ａを、平坦面３１Ａに入射し、出射面３１Ｂから出射
させる。
【００１９】最先端レンズ３１の出射面３１Ｂから出射
された励起光Ａは、グリセロール５０を経てカバーガラ
ス５１に入射し、カバーガラス５１と試料６０との境界
面で全反射するとともに、試料６０の境界面近傍にエバ
ネセント波を発生させる。そして、エバネセント照明さ
れた試料６０の境界面近傍に存在する蛍光物質から蛍光
Ｂが発生する。対物レンズ３０の最先端レンズ３１は、
発生した蛍光Ｂのうちカバーガラス５１およびグリセロ
ール５０を経て到達した蛍光Ｂを入射する。そして、反
射鏡２１は、対物レンズ３０を経た蛍光Ｂを反射させ
て、鏡体２０の外部へ導く。
された励起光Ａは、グリセロール５０を経てカバーガラ
ス５１に入射し、カバーガラス５１と試料６０との境界
面で全反射するとともに、試料６０の境界面近傍にエバ
ネセント波を発生させる。そして、エバネセント照明さ
れた試料６０の境界面近傍に存在する蛍光物質から蛍光
Ｂが発生する。対物レンズ３０の最先端レンズ３１は、
発生した蛍光Ｂのうちカバーガラス５１およびグリセロ
ール５０を経て到達した蛍光Ｂを入射する。そして、反
射鏡２１は、対物レンズ３０を経た蛍光Ｂを反射させ
て、鏡体２０の外部へ導く。
【００２０】光検出器７０は、鏡体２０の外部に導かれ
た蛍光Ｂの結像位置に撮像面を有して蛍光Ｂの像を検出
し、画像解析部７１は、光検出器７０により検出された
蛍光Ｂの像を解析する。制御部７２は、光源１０におけ
る励起光Ａの出力を制御し、照射時間制御部１１におけ
るシャッタ開閉動作を制御し、また、画像解析部７１に
おける画像解析をも制御する。
た蛍光Ｂの結像位置に撮像面を有して蛍光Ｂの像を検出
し、画像解析部７１は、光検出器７０により検出された
蛍光Ｂの像を解析する。制御部７２は、光源１０におけ
る励起光Ａの出力を制御し、照射時間制御部１１におけ
るシャッタ開閉動作を制御し、また、画像解析部７１に
おける画像解析をも制御する。
【００２１】この顕微鏡装置は以下のように作用する。
制御部７２により制御された光源１０および照射時間制
御部１１から出力された励起光Ａは、照射範囲調節光学
系１４、反射鏡１２および１３を経て鏡体２０内へ導か
れ、対物レンズ３０の最先端レンズ３１の平坦面３１Ａ
の所定位置に所定入射角で入射する。最先端レンズ３１
に入射した励起光Ａは、出射面３１Ｂから出射され、グ
リセロール５０を経てカバーガラス５１へ入射する。そ
して、励起光Ａは、カバーガラス５１と試料６０との境
界面で全反射するとともに、試料６０の境界面近傍をエ
バネセント照明する。
制御部７２により制御された光源１０および照射時間制
御部１１から出力された励起光Ａは、照射範囲調節光学
系１４、反射鏡１２および１３を経て鏡体２０内へ導か
れ、対物レンズ３０の最先端レンズ３１の平坦面３１Ａ
の所定位置に所定入射角で入射する。最先端レンズ３１
に入射した励起光Ａは、出射面３１Ｂから出射され、グ
リセロール５０を経てカバーガラス５１へ入射する。そ
して、励起光Ａは、カバーガラス５１と試料６０との境
界面で全反射するとともに、試料６０の境界面近傍をエ
バネセント照明する。
【００２２】試料６０の境界面近傍に存在する蛍光物質
がエバネセント照明により励起されて発生した蛍光Ｂ
は、カバーガラス５１およびグリセロール５０を経て、
対物レンズ３０の最先端レンズ３１に入射する。そし
て、その蛍光Ｂは、対物レンズ３０および反射鏡２１を
経て鏡体２０の外部へ導かれて光検出器７０の検出面上
に結像され、その像が光検出器７０により検出されて画
像解析部７１により画像解析される。
がエバネセント照明により励起されて発生した蛍光Ｂ
は、カバーガラス５１およびグリセロール５０を経て、
対物レンズ３０の最先端レンズ３１に入射する。そし
て、その蛍光Ｂは、対物レンズ３０および反射鏡２１を
経て鏡体２０の外部へ導かれて光検出器７０の検出面上
に結像され、その像が光検出器７０により検出されて画
像解析部７１により画像解析される。
【００２３】このように構成される本実施形態に係る顕
微鏡装置では、試料セル（カバーガラス５１、カバーガ
ラス５２およびスペーサ５３により構成されるセル）を
ステージ４０上で移動させたり取り替えたりする場合で
あっても、カバーガラス５１の光学的厚みが一定であれ
ば、照明光学系（反射鏡１２、反射鏡１３および最先端
レンズ３１を備えて構成される光学系）および検出光学
系（対物レンズ３０、反射鏡２１および光検出器７０を
備えて構成される光学系）を調整する必要がない。ま
た、励起光Ａが試料６０表面に到るまでに最先端レンズ
３１およびカバーガラス５１のみを透過するので自家蛍
光の発生が少なく、最先端レンズ３１およびカバーガラ
ス５１の双方または何れか一方の材質を石英とすること
により自家蛍光の発生を更に少なくすることができる。
微鏡装置では、試料セル（カバーガラス５１、カバーガ
ラス５２およびスペーサ５３により構成されるセル）を
ステージ４０上で移動させたり取り替えたりする場合で
あっても、カバーガラス５１の光学的厚みが一定であれ
ば、照明光学系（反射鏡１２、反射鏡１３および最先端
レンズ３１を備えて構成される光学系）および検出光学
系（対物レンズ３０、反射鏡２１および光検出器７０を
備えて構成される光学系）を調整する必要がない。ま
た、励起光Ａが試料６０表面に到るまでに最先端レンズ
３１およびカバーガラス５１のみを透過するので自家蛍
光の発生が少なく、最先端レンズ３１およびカバーガラ
ス５１の双方または何れか一方の材質を石英とすること
により自家蛍光の発生を更に少なくすることができる。
【００２４】次に、対物レンズの構成について更に詳細
に説明する。図３および図４それぞれは、本実施形態に
係る顕微鏡装置の対物レンズの断面図であり、光軸を含
む面で切断したときの断面図を示している。対物レンズ
３０は、最先端レンズ３１を含めて１１枚のレンズから
構成されている。最先端レンズ３１は、ほぼ半球の形状
であって、その半球の平面と垂直に両端を切断したよう
な形状であり、その両端の切断面の一方が励起光Ａが入
射する平坦面３１Ａとされ、他方が全反射した励起光が
出射する平坦面とされている。
に説明する。図３および図４それぞれは、本実施形態に
係る顕微鏡装置の対物レンズの断面図であり、光軸を含
む面で切断したときの断面図を示している。対物レンズ
３０は、最先端レンズ３１を含めて１１枚のレンズから
構成されている。最先端レンズ３１は、ほぼ半球の形状
であって、その半球の平面と垂直に両端を切断したよう
な形状であり、その両端の切断面の一方が励起光Ａが入
射する平坦面３１Ａとされ、他方が全反射した励起光が
出射する平坦面とされている。
【００２５】図３は、図１および図２に示されたものと
同様に、対物レンズ３０の最先端レンズ３１の上にグリ
セロール５０を介して試料セルが置かれている場合を示
している。一方、図４は、最先端レンズ３１の上に直接
に試料６０が置かれている場合を示している。何れの場
合であっても対物レンズ３０の光軸上で励起光Ａを試料
６０表面で全反射させる必要があることから、図３の場
合と図４の場合とでは、最先端レンズ３１の平坦面３１
Ａへの励起光Ａの入射位置または入射角を反射鏡１２お
よび１３により変更する。
同様に、対物レンズ３０の最先端レンズ３１の上にグリ
セロール５０を介して試料セルが置かれている場合を示
している。一方、図４は、最先端レンズ３１の上に直接
に試料６０が置かれている場合を示している。何れの場
合であっても対物レンズ３０の光軸上で励起光Ａを試料
６０表面で全反射させる必要があることから、図３の場
合と図４の場合とでは、最先端レンズ３１の平坦面３１
Ａへの励起光Ａの入射位置または入射角を反射鏡１２お
よび１３により変更する。
【００２６】最先端レンズ３１への励起光Ａの入射位置
および入射角に依っては、励起光Ａは、レンズ収納体３
２の一部に設けられた入射用孔部（透明な媒質であって
もよい）を経てレンズ収納体３２の内部に入った後に最
先端レンズ３１に入射する必要がある。この場合には、
レンズ収納体３２に入射用孔部の対称位置に出射用孔部
（透明な媒質であってもよい）が設けられ、試料６０表
面で全反射された励起光Ａは、最先端レンズ３１および
出射用孔部（反射光導光手段）を経て対物レンズ３０の
外部へ導かれる。このようにすることにより、励起光Ａ
がレンズ収納体３２内部で反射・散乱されることはない
ので、この点でも自家蛍光の発生を抑制することができ
る。
および入射角に依っては、励起光Ａは、レンズ収納体３
２の一部に設けられた入射用孔部（透明な媒質であって
もよい）を経てレンズ収納体３２の内部に入った後に最
先端レンズ３１に入射する必要がある。この場合には、
レンズ収納体３２に入射用孔部の対称位置に出射用孔部
（透明な媒質であってもよい）が設けられ、試料６０表
面で全反射された励起光Ａは、最先端レンズ３１および
出射用孔部（反射光導光手段）を経て対物レンズ３０の
外部へ導かれる。このようにすることにより、励起光Ａ
がレンズ収納体３２内部で反射・散乱されることはない
ので、この点でも自家蛍光の発生を抑制することができ
る。
【００２７】図５は、対物レンズ３０の最先端レンズ３
１の説明図である。図５（ｂ）は、光軸方向から見た図
であり、図５（ａ）および（ｃ）は、それぞれ光軸に垂
直であって且つ互いに垂直な２方向から見た図である。
平坦面３１Ａには、反射防止膜が形成されている。
１の説明図である。図５（ｂ）は、光軸方向から見た図
であり、図５（ａ）および（ｃ）は、それぞれ光軸に垂
直であって且つ互いに垂直な２方向から見た図である。
平坦面３１Ａには、反射防止膜が形成されている。
【００２８】
【発明の効果】以上、詳細に説明したとおり、本発明に
よれば、照明光学系により、対物レンズの最先端レンズ
を介して試料に第１の光束がエバネセント照明され、対
物レンズにより、そのエバネセント照明に伴って試料か
ら発生する第２の光束が検出される構成としたので、試
料を移動させたり取り替えたりする場合であっても、光
学系の調整を行う必要がなく取扱いが容易である。ま
た、試料をエバネセント照明することから、境界面に垂
直な方向についての測定の空間分解能は高い。
よれば、照明光学系により、対物レンズの最先端レンズ
を介して試料に第１の光束がエバネセント照明され、対
物レンズにより、そのエバネセント照明に伴って試料か
ら発生する第２の光束が検出される構成としたので、試
料を移動させたり取り替えたりする場合であっても、光
学系の調整を行う必要がなく取扱いが容易である。ま
た、試料をエバネセント照明することから、境界面に垂
直な方向についての測定の空間分解能は高い。
【００２９】また、表面に試料を密着して保持する透明
平板を備えて、最先端レンズを経て透明平板に入射した
第１の光束をその表面で全反射させる場合や、対物レン
ズの最先端レンズの外側の表面に試料を密着して保持
し、第１の光束を最先端レンズと試料との境界面で全反
射させる場合は、特に、試料の表面近傍をエバネセント
照明するのに好適である。
平板を備えて、最先端レンズを経て透明平板に入射した
第１の光束をその表面で全反射させる場合や、対物レン
ズの最先端レンズの外側の表面に試料を密着して保持
し、第１の光束を最先端レンズと試料との境界面で全反
射させる場合は、特に、試料の表面近傍をエバネセント
照明するのに好適である。
【００３０】また、第１の光束の反射光を対物レンズの
外部へ導く反射光導光手段を更に備える場合には、第１
の光束が対物レンズ内で反射・散乱されることはなく、
この顕微鏡装置が蛍光顕微鏡装置として用いられるとき
に自家蛍光の発生が抑制される。また、対物レンズの最
先端レンズが石英を主成分とする場合、および、透明平
板が石英を主成分とする場合、これら何れの場合にも、
この顕微鏡装置が蛍光顕微鏡装置として用いられるとき
に自家蛍光の発生が抑制され、Ｓ／Ｎ比の優れた試料観
察が可能である。さらに、波長３４０ｎｍ以下の波長の
第１の光束を試料に照射することができるので、蛍光標
識しない蛋白質を励起して観察することができ、また、
試料中に含まれる光分解性試薬を光分解することもでき
る。
外部へ導く反射光導光手段を更に備える場合には、第１
の光束が対物レンズ内で反射・散乱されることはなく、
この顕微鏡装置が蛍光顕微鏡装置として用いられるとき
に自家蛍光の発生が抑制される。また、対物レンズの最
先端レンズが石英を主成分とする場合、および、透明平
板が石英を主成分とする場合、これら何れの場合にも、
この顕微鏡装置が蛍光顕微鏡装置として用いられるとき
に自家蛍光の発生が抑制され、Ｓ／Ｎ比の優れた試料観
察が可能である。さらに、波長３４０ｎｍ以下の波長の
第１の光束を試料に照射することができるので、蛍光標
識しない蛋白質を励起して観察することができ、また、
試料中に含まれる光分解性試薬を光分解することもでき
る。
【００３１】また、対物レンズを経た第２の光束の像を
検出する光検出器と、光検出器により検出された第２の
光束の像を画像解析する画像解析部と、を更に備える場
合には、対物レンズにより結像された第２の光束の像
は、光検出器により検出され、画像解析部により画像解
析され、これにより、エバネセント照明された試料の表
面近傍の解析が容易となる。
検出する光検出器と、光検出器により検出された第２の
光束の像を画像解析する画像解析部と、を更に備える場
合には、対物レンズにより結像された第２の光束の像
は、光検出器により検出され、画像解析部により画像解
析され、これにより、エバネセント照明された試料の表
面近傍の解析が容易となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本実施形態に係る顕微鏡装置の構成図である。
【図２】本実施形態に係る顕微鏡装置の対物レンズの周
辺部分の拡大構成図である。
辺部分の拡大構成図である。
【図３】本実施形態に係る顕微鏡装置の対物レンズの断
面図である。
面図である。
【図４】本実施形態に係る顕微鏡装置の対物レンズの断
面図である。
面図である。
【図５】本実施形態に係る顕微鏡装置の対物レンズの最
先端レンズの説明図である。
先端レンズの説明図である。
１０…光源、１１…照射時間制御部、１２，１３…反射
鏡、１４…照射範囲調節光学系、２０…鏡体、２１…反
射鏡、３０…対物レンズ、３１…最先端レンズ、３２…
レンズ収納体、４０…ステージ、５０…グリセロール、
５１，５２…カバーガラス、５３…スペーサ、６０…試
料、７０…光検出器、７１…画像解析部、７２…制御
部、Ａ…励起光、Ｂ…蛍光。
鏡、１４…照射範囲調節光学系、２０…鏡体、２１…反
射鏡、３０…対物レンズ、３１…最先端レンズ、３２…
レンズ収納体、４０…ステージ、５０…グリセロール、
５１，５２…カバーガラス、５３…スペーサ、６０…試
料、７０…光検出器、７１…画像解析部、７２…制御
部、Ａ…励起光、Ｂ…蛍光。
Claims (7)
- 【請求項１】 試料に第１の光束をエバネセント照明
し、そのエバネセント照明に伴って前記試料から発生す
る第２の光束を観察する顕微鏡装置であって、 前記第２の光束を入力する対物レンズと、 前記対物レンズの最先端レンズを介して前記試料に前記
第１の光束をエバネセント照明する照明光学系と、 を備えることを特徴とする顕微鏡装置。 - 【請求項２】 表面に前記試料を密着して保持し、前記
最先端レンズを経て入射した前記第１の光束を前記表面
で全反射させる透明平板を更に備えることを特徴とする
請求項１記載の顕微鏡装置。 - 【請求項３】 前記対物レンズの前記最先端レンズの外
側の表面に前記試料を密着して保持し、前記第１の光束
を前記最先端レンズと前記試料との境界面で全反射させ
ることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装置。 - 【請求項４】 前記第１の光束の反射光を前記対物レン
ズの外部へ導く反射光導光手段を更に備えることを特徴
とする請求項１記載の顕微鏡装置。 - 【請求項５】 前記対物レンズの前記最先端レンズは石
英を主成分とすることを特徴とする請求項１記載の顕微
鏡装置。 - 【請求項６】 前記透明平板は石英を主成分とすること
を特徴とする請求項２記載の顕微鏡装置。 - 【請求項７】 前記対物レンズを経た前記第２の光束の
像を検出する光検出器と、 前記光検出器により検出された前記第２の光束の像を画
像解析する画像解析部と、 を更に備えることを特徴とする請求項１記載の顕微鏡装
置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30893097A JPH11142745A (ja) | 1997-11-11 | 1997-11-11 | 顕微鏡装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30893097A JPH11142745A (ja) | 1997-11-11 | 1997-11-11 | 顕微鏡装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11142745A true JPH11142745A (ja) | 1999-05-28 |
| JPH11142745A5 JPH11142745A5 (ja) | 2005-06-30 |
Family
ID=17986994
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30893097A Pending JPH11142745A (ja) | 1997-11-11 | 1997-11-11 | 顕微鏡装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11142745A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6609176B1 (en) | 1999-12-27 | 2003-08-19 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Disk control system and data rearrangement method |
| JP2006011045A (ja) * | 2004-06-25 | 2006-01-12 | Olympus Corp | 全反射顕微鏡 |
| JP2019090892A (ja) * | 2017-11-14 | 2019-06-13 | オリンパス株式会社 | 試料観察方法および試料ホルダ |
-
1997
- 1997-11-11 JP JP30893097A patent/JPH11142745A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6609176B1 (en) | 1999-12-27 | 2003-08-19 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Disk control system and data rearrangement method |
| JP2006011045A (ja) * | 2004-06-25 | 2006-01-12 | Olympus Corp | 全反射顕微鏡 |
| JP2019090892A (ja) * | 2017-11-14 | 2019-06-13 | オリンパス株式会社 | 試料観察方法および試料ホルダ |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041018 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20041020 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20041020 |
|
| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20041020 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20060424 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060509 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060628 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060725 |