JPH11146799A - 新規プライマー及びその利用 - Google Patents
新規プライマー及びその利用Info
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- JPH11146799A JPH11146799A JP10214831A JP21483198A JPH11146799A JP H11146799 A JPH11146799 A JP H11146799A JP 10214831 A JP10214831 A JP 10214831A JP 21483198 A JP21483198 A JP 21483198A JP H11146799 A JPH11146799 A JP H11146799A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規プライマー及びその利用の提供。
【解決手段】 ケラチン遺伝子とハイブリダイズする新
規なプライマー、αS1−カゼイン遺伝子とハイブリダイ
ズする新規なプライマー、及びこれらのプライマーを用
いてＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中に含まれるケラチン遺
伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法。さらに
詳しくは、乳を速やかに氷温まで冷却し、緩衝液にて希
釈し遠心分離を行い、得られた沈殿物から抽出したＲＮ
Ａを鋳型とし、本発明プライマーを用いて遺伝子増幅す
ることを特徴とするケラチン遺伝子及び／又はカゼイン
遺伝子を増幅する方法、及びこの方法を用いた乳房炎の
検査方法及び乳腺細胞における乳蛋白質合成レベルの測
定方法。 【効果】 簡便、迅速、且つ高精度な乳房炎の検査方
法、特にウシ乳房炎の検査方法として、あるいは乳腺細
胞における乳蛋白質合成レベルの測定方法として有用。
規なプライマー、αS1−カゼイン遺伝子とハイブリダイ
ズする新規なプライマー、及びこれらのプライマーを用
いてＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中に含まれるケラチン遺
伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法。さらに
詳しくは、乳を速やかに氷温まで冷却し、緩衝液にて希
釈し遠心分離を行い、得られた沈殿物から抽出したＲＮ
Ａを鋳型とし、本発明プライマーを用いて遺伝子増幅す
ることを特徴とするケラチン遺伝子及び／又はカゼイン
遺伝子を増幅する方法、及びこの方法を用いた乳房炎の
検査方法及び乳腺細胞における乳蛋白質合成レベルの測
定方法。 【効果】 簡便、迅速、且つ高精度な乳房炎の検査方
法、特にウシ乳房炎の検査方法として、あるいは乳腺細
胞における乳蛋白質合成レベルの測定方法として有用。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ケラチン遺伝子と
ハイブリダイズする新規なプライマー、αS1−カゼイン
遺伝子とハイブリダイズする新規なプライマー、及びこ
れらのプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中
に含まれるケラチン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を
増幅する方法に関する。さらに詳しくは、乳を速やかに
氷温まで冷却し、緩衝液にて希釈し遠心分離を行い、得
られた沈殿物から抽出したＲＮＡを鋳型とし、本発明プ
ライマーを用いて遺伝子増幅することを特徴とするケラ
チン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法、
この方法を用いた乳房炎の検査方法及び乳腺細胞におけ
る乳タンパク質合成レベルの測定方法に関する。本発明
は、簡便、迅速、且つ高精度な乳房炎の検査方法、特に
ウシ乳房炎の検査方法として、あるいは乳腺細胞におけ
る乳タンパク質合成レベルの測定方法として有用であ
る。
ハイブリダイズする新規なプライマー、αS1−カゼイン
遺伝子とハイブリダイズする新規なプライマー、及びこ
れらのプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中
に含まれるケラチン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を
増幅する方法に関する。さらに詳しくは、乳を速やかに
氷温まで冷却し、緩衝液にて希釈し遠心分離を行い、得
られた沈殿物から抽出したＲＮＡを鋳型とし、本発明プ
ライマーを用いて遺伝子増幅することを特徴とするケラ
チン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法、
この方法を用いた乳房炎の検査方法及び乳腺細胞におけ
る乳タンパク質合成レベルの測定方法に関する。本発明
は、簡便、迅速、且つ高精度な乳房炎の検査方法、特に
ウシ乳房炎の検査方法として、あるいは乳腺細胞におけ
る乳タンパク質合成レベルの測定方法として有用であ
る。
【０００２】
【従来の技術】乳房炎とは、乳房内に侵入してきた病原
性微生物により発症する乳房組織の炎症を指し、乳量の
減少や罹患牛の淘汰など酪農、乳業にとって乳房炎によ
ってもたらされる経済的損失は非常に大きい。乳房炎対
策は早期発見、早期治療が原則であり、乳による診断法
としては体細胞数の計測法、ＰＬテストなどが一般的に
用いられている。これらは乳房炎に罹患すると乳中の体
細胞数が増加する現象や、乳のｐＨがアルカリ側に傾く
現象を利用した測定法であるが、ともに個体間や泌乳期
による変動が大きい因子であり、乳房炎の早期発見法と
しては不十分と考えられる。一般に、乳房炎乳は成分の
変動が見られるが、特にカゼインについては減少が特徴
的である。このことを利用し、過去に乳成分のカゼイン
窒素量／総窒素量の値を利用して乳房炎乳を判定する試
み等も行われたこともあるが、測定値のバラツキが大き
く、正確な判定が困難であった。
性微生物により発症する乳房組織の炎症を指し、乳量の
減少や罹患牛の淘汰など酪農、乳業にとって乳房炎によ
ってもたらされる経済的損失は非常に大きい。乳房炎対
策は早期発見、早期治療が原則であり、乳による診断法
としては体細胞数の計測法、ＰＬテストなどが一般的に
用いられている。これらは乳房炎に罹患すると乳中の体
細胞数が増加する現象や、乳のｐＨがアルカリ側に傾く
現象を利用した測定法であるが、ともに個体間や泌乳期
による変動が大きい因子であり、乳房炎の早期発見法と
しては不十分と考えられる。一般に、乳房炎乳は成分の
変動が見られるが、特にカゼインについては減少が特徴
的である。このことを利用し、過去に乳成分のカゼイン
窒素量／総窒素量の値を利用して乳房炎乳を判定する試
み等も行われたこともあるが、測定値のバラツキが大き
く、正確な判定が困難であった。
【０００３】一方、ウシの能力を評価する方法として、
乳量あるいは乳脂肪率が従来指標として広く用いられて
いたが、最近、健康指向の広がりあるいは乳製品製造上
の観点から、乳タンパク質率が注目されてきている。特
に、乳タンパク質の中でも高カゼインであることが乳質
評価の指標として大いに注目されている。しかし、従来
の方法は乳からカゼインを分離してカゼイン画分の窒素
量を測定するという方法であり、操作が煩雑かつ長時間
必要であり、感度的にも詳細な検討のためには不十分な
ものであった。また近年、赤外分光分析法あるいは近赤
外分光分析法を用いて、簡便に乳中のカゼイン量を測定
する方法も開発されているが、従来法による実測値との
整合性の面で課題が残されている。
乳量あるいは乳脂肪率が従来指標として広く用いられて
いたが、最近、健康指向の広がりあるいは乳製品製造上
の観点から、乳タンパク質率が注目されてきている。特
に、乳タンパク質の中でも高カゼインであることが乳質
評価の指標として大いに注目されている。しかし、従来
の方法は乳からカゼインを分離してカゼイン画分の窒素
量を測定するという方法であり、操作が煩雑かつ長時間
必要であり、感度的にも詳細な検討のためには不十分な
ものであった。また近年、赤外分光分析法あるいは近赤
外分光分析法を用いて、簡便に乳中のカゼイン量を測定
する方法も開発されているが、従来法による実測値との
整合性の面で課題が残されている。
【０００４】乳成分の変動は、様々な要因により発生す
るが、その一つとして乳房炎原因菌が乳管より乳房内に
侵入して乳腺上皮細胞に付着することにより、乳腺上皮
細胞における乳成分の合成が阻害される機構が考えられ
る。つまり、何らかの方法によって乳腺上皮細胞の乳成
分合成能力の変化を測定することにより、乳房炎の早期
発見が可能と考えられる。近年、ポリメレース連鎖反応
（ＰＣＲ法：米国特許第４，６８３，１９５号及び４，
６８３，２０２号）を利用した逆転写−ポリメレース連
鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法が、ｍＲＮＡの転写量を高感
度に検出する方法として用いられるようになり、この方
法により細胞における発現タンパク質を高感度に定性
的、定量的に測定することが可能となった。しかし、乳
房炎の診断のために乳腺組織を切除してＲＮＡを抽出す
ることは産業動物である乳牛においては実質上不可能で
あり、生体を傷つけること無く乳腺上皮細胞のＲＮＡを
抽出する方法は過去に報告が無かった。
るが、その一つとして乳房炎原因菌が乳管より乳房内に
侵入して乳腺上皮細胞に付着することにより、乳腺上皮
細胞における乳成分の合成が阻害される機構が考えられ
る。つまり、何らかの方法によって乳腺上皮細胞の乳成
分合成能力の変化を測定することにより、乳房炎の早期
発見が可能と考えられる。近年、ポリメレース連鎖反応
（ＰＣＲ法：米国特許第４，６８３，１９５号及び４，
６８３，２０２号）を利用した逆転写−ポリメレース連
鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法が、ｍＲＮＡの転写量を高感
度に検出する方法として用いられるようになり、この方
法により細胞における発現タンパク質を高感度に定性
的、定量的に測定することが可能となった。しかし、乳
房炎の診断のために乳腺組織を切除してＲＮＡを抽出す
ることは産業動物である乳牛においては実質上不可能で
あり、生体を傷つけること無く乳腺上皮細胞のＲＮＡを
抽出する方法は過去に報告が無かった。
【０００５】乳からＲＮＡを抽出するためには、ＲＮＡ
分解酵素によるＲＮＡの分解を最小限度に抑える必要が
あり、さらに細胞由来のＲＮＡを抽出する場合は、乳中
の乳腺上皮細胞数は他の細胞と比較して非常に少ないこ
と、また乳成分がＲＮＡ抽出に与える影響を極力除くた
めに、乳を遠心分離して細胞の沈殿を得た上でＲＮＡ抽
出を行う必要がある。又、ケラチン遺伝子は上皮系の細
胞でのみ特異的に発現する細胞骨格遺伝子であるが、様
々な種類があり、種及び部位により発現するケラチン遺
伝子の種類が異なるため、ウシ乳腺上皮細胞量の指標と
して用いるプライマーはウシ乳腺上皮細胞で発現するケ
ラチン遺伝子とハイブリダイズする必要があり、又、ケ
ラチン遺伝子の発現量は上皮細胞数と相関する必要があ
る。又、αS1−カゼインは４つの遺伝的変異体の存在が
知られており、汎用性のある検出法のためには、何れの
αS1−カゼイン変異体遺伝子ともハイブリダイズするプ
ライマーを用いる必要がある。
分解酵素によるＲＮＡの分解を最小限度に抑える必要が
あり、さらに細胞由来のＲＮＡを抽出する場合は、乳中
の乳腺上皮細胞数は他の細胞と比較して非常に少ないこ
と、また乳成分がＲＮＡ抽出に与える影響を極力除くた
めに、乳を遠心分離して細胞の沈殿を得た上でＲＮＡ抽
出を行う必要がある。又、ケラチン遺伝子は上皮系の細
胞でのみ特異的に発現する細胞骨格遺伝子であるが、様
々な種類があり、種及び部位により発現するケラチン遺
伝子の種類が異なるため、ウシ乳腺上皮細胞量の指標と
して用いるプライマーはウシ乳腺上皮細胞で発現するケ
ラチン遺伝子とハイブリダイズする必要があり、又、ケ
ラチン遺伝子の発現量は上皮細胞数と相関する必要があ
る。又、αS1−カゼインは４つの遺伝的変異体の存在が
知られており、汎用性のある検出法のためには、何れの
αS1−カゼイン変異体遺伝子ともハイブリダイズするプ
ライマーを用いる必要がある。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】これらの状況に鑑み、
本発明者らは乳からＲＮＡを調製する方法、及び得られ
たＲＮＡを用いた乳房炎の精度の高い検出法を鋭意研究
した結果、乳を速やかに氷温まで冷却し、緩衝液にて希
釈し遠心分離を行い、必要に応じこれを繰り返し、得ら
れた細胞ペレットからＲＮＡを抽出することにより、乳
中から乳腺上皮細胞由来のＲＮＡを調製する方法を見出
した。さらに、この方法により調製されたＲＮＡを、ウ
シ乳腺上皮細胞において細胞数と相関して発現する塩基
性（タイプ２）コンポーネント３のケラチンにおいて、
ＰＣＲによって増幅する範囲を反応効率を考慮して２７
４ｂｐの大きさに増幅されるようにデザインされたケラ
チン遺伝子の一部を増幅するプライマー、及びαS1−カ
ゼイン遺伝子の遺伝的変異体においても保存されている
配列において、反応効率を考慮して３５１ｂｐの大きさ
に増幅されるようにデザインされたαS1−カゼイン遺伝
子の一部を増幅するプライマーを常法に従って合成し、
これを用いて逆転写−ポリメレース連鎖反応（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ；Wang et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, pp
9717-9721(1989) ）法を行うことにより、乳から簡便、
迅速、且つ高精度に乳房炎の検出を行う方法を見出し
た。即ち本発明は、ケラチン遺伝子とハイブリダイズす
る新規なプライマー、αS1−カゼイン遺伝子とハイブリ
ダイズする新規なプライマー、及びこれらのプライマー
を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中に含まれるケラチ
ン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法を提
供することを課題とする。さらには、乳を速やかに氷温
まで冷却し、緩衝液にて希釈し遠心分離を行い、得られ
た沈殿物から抽出したＲＮＡを鋳型とし、本発明プライ
マーを用いて遺伝子増幅することを特徴とするケラチン
遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法、この
方法を用いた乳房炎の検査方法及び乳腺細胞における乳
タンパク質合成レベルの測定方法を提供することを課題
とする。
本発明者らは乳からＲＮＡを調製する方法、及び得られ
たＲＮＡを用いた乳房炎の精度の高い検出法を鋭意研究
した結果、乳を速やかに氷温まで冷却し、緩衝液にて希
釈し遠心分離を行い、必要に応じこれを繰り返し、得ら
れた細胞ペレットからＲＮＡを抽出することにより、乳
中から乳腺上皮細胞由来のＲＮＡを調製する方法を見出
した。さらに、この方法により調製されたＲＮＡを、ウ
シ乳腺上皮細胞において細胞数と相関して発現する塩基
性（タイプ２）コンポーネント３のケラチンにおいて、
ＰＣＲによって増幅する範囲を反応効率を考慮して２７
４ｂｐの大きさに増幅されるようにデザインされたケラ
チン遺伝子の一部を増幅するプライマー、及びαS1−カ
ゼイン遺伝子の遺伝的変異体においても保存されている
配列において、反応効率を考慮して３５１ｂｐの大きさ
に増幅されるようにデザインされたαS1−カゼイン遺伝
子の一部を増幅するプライマーを常法に従って合成し、
これを用いて逆転写−ポリメレース連鎖反応（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ；Wang et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 86, pp
9717-9721(1989) ）法を行うことにより、乳から簡便、
迅速、且つ高精度に乳房炎の検出を行う方法を見出し
た。即ち本発明は、ケラチン遺伝子とハイブリダイズす
る新規なプライマー、αS1−カゼイン遺伝子とハイブリ
ダイズする新規なプライマー、及びこれらのプライマー
を用いてＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中に含まれるケラチ
ン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法を提
供することを課題とする。さらには、乳を速やかに氷温
まで冷却し、緩衝液にて希釈し遠心分離を行い、得られ
た沈殿物から抽出したＲＮＡを鋳型とし、本発明プライ
マーを用いて遺伝子増幅することを特徴とするケラチン
遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法、この
方法を用いた乳房炎の検査方法及び乳腺細胞における乳
タンパク質合成レベルの測定方法を提供することを課題
とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ケラチン遺伝
子とハイブリダイズする新規なプライマーに関する。
又、αS1−カゼイン遺伝子とハイブリダイズする新規な
プライマーに関する。又、これらのプライマーを用いて
ＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中に含まれるケラチン遺伝子
及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法に関する。
又、さらに詳しくは、乳を速やかに氷温まで冷却し、緩
衝液にて希釈し遠心分離を行い、得られた沈殿物から抽
出したＲＮＡを鋳型とし、本発明プライマーを用いて遺
伝子増幅することを特徴とするケラチン遺伝子及び／又
はカゼイン遺伝子を増幅する方法に関する。又、この方
法を用いた乳房炎の検査方法及び乳腺細胞における乳タ
ンパク質合成レベルの測定方法に関する。本発明は、簡
便、迅速、且つ高精度な乳房炎の検査方法、特にウシ乳
房炎の検査方法として、あるいは乳腺細胞における乳タ
ンパク質合成レベルの測定方法として有用である。
子とハイブリダイズする新規なプライマーに関する。
又、αS1−カゼイン遺伝子とハイブリダイズする新規な
プライマーに関する。又、これらのプライマーを用いて
ＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中に含まれるケラチン遺伝子
及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法に関する。
又、さらに詳しくは、乳を速やかに氷温まで冷却し、緩
衝液にて希釈し遠心分離を行い、得られた沈殿物から抽
出したＲＮＡを鋳型とし、本発明プライマーを用いて遺
伝子増幅することを特徴とするケラチン遺伝子及び／又
はカゼイン遺伝子を増幅する方法に関する。又、この方
法を用いた乳房炎の検査方法及び乳腺細胞における乳タ
ンパク質合成レベルの測定方法に関する。本発明は、簡
便、迅速、且つ高精度な乳房炎の検査方法、特にウシ乳
房炎の検査方法として、あるいは乳腺細胞における乳タ
ンパク質合成レベルの測定方法として有用である。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のケラチン遺伝子とハイブ
リダイズする新規プライマーは、ＣＡＧ−ＴＧＴ−ＣＧ
Ｇ−ＧＧＧ−ＣＴＣ−ＴＧＧ（配列表配列番号１）又は
ＡＴＧ−ＴＧＧ−ＧＴＣ−ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＡＧＧ−Ｃ
Ｔ（配列表配列番号２）で表される配列を有する。又、
αS1−カゼイン遺伝子とハイブリダイズする新規なプラ
イマーは、ＧＴＣ−ＡＡＧ−ＴＧＡ−ＡＴＴ−ＣＴＧ−
ＡＧＧ（配列表配列番号３）又はＴＧＧ−ＣＡＣ−ＴＴ
Ａ−ＣＡＧ−ＧＡＧ−ＡＡＧ（配列表配列番号４）で表
される配列を有する。これらのオリゴヌクレオチドは、
常法に従って合成などにより得ることができる。本発明
は、これらのプライマーを用い乳房炎、特にウシ乳房炎
の診断を行うことができる。本発明での検査対象として
用いる乳は、哺乳動物のものであれば特に限定されない
が、特に好ましくはウシの乳を用いる。本発明の検査対
象となる乳中に含まれる細胞のＲＮＡは、以下のように
調製する。即ち、可能な限り衛生的な環境下で乳を採集
し、速やかに氷温まで冷却する。乳を適当な緩衝液、好
ましくは生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））にて希釈
し、遠心分離を行い、沈殿物を回収する。必要に応じ、
緩衝液、好ましくはＰＢＳ（−）への分散と遠心分離を
繰り返す。このようにして得られた沈殿物から、常法に
て乳中に含まれる細胞由来のＲＮＡを抽出することがで
きる。又、必要に応じｍＲＮＡの抽出も可能である。得
られたＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素により逆転写反
応を行って相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する際に
は、オリゴｄＴプライマーあるいはランダムプライマ
ー、特に好ましくは配列番号２、もしくは配列番号４に
示されるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマー
に用いて行う。次に、得られたｃＤＮＡを鋳型に、配列
番号１に示されるオリゴヌクレオチドをセンスプライマ
ーに、配列番号２で示されるオリゴヌクレオチドをアン
チセンスプライマーに用い、もしくは配列番号３に示さ
れるオリゴヌクレオチドをセンスプライマーに、配列番
号４で示されるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプラ
イマーに用い、ＤＮＡポリメレースによりＰＣＲを行
う。このＰＣＲ反応液を電気泳動にて分離したのち、適
当な染色剤、好ましくはエチジウムブロマイド液により
染色し、染色されたバンドを画像解析装置などにより染
色強度として測定する。配列番号１に示されるオリゴヌ
クレオチドをセンスプライマーに、配列番号２に示され
るオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーに用い
て得られたＰＣＲ反応液におけるバンドの染色強度は塩
基性（タイプ２）コンポーネント３型のケラチン遺伝子
の発現量であり、配列番号３に示されるオリゴヌクレオ
チドをセンスプライマーに、配列番号４に示されるオリ
ゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーに用いて得ら
れたＰＣＲ反応液におけるバンドの染色強度はαS1−カ
ゼイン遺伝子の発現量である。αS1−カゼイン遺伝子発
現量のケラチン遺伝子発現量に対する比を得ることによ
り、対象の乳房における乳腺上皮細胞のαS1−カゼイン
遺伝子発現量を知ることとなる。この値が１．０以上を
示すときが正常、０．５以上、１．０未満を示すときは
軽度の乳房炎、０．５未満のときは重度の乳房炎と診断
することができる。又、前述の方法により得られたケラ
チン遺伝子発現量及びαS1−カゼイン遺伝子発現量を用
い、αS1−カゼイン遺伝子発現量のケラチン遺伝子発現
量に対する比を得ることにより、対象乳房における乳腺
上皮細胞のαS1−カゼイン遺伝子発現量を得ることがで
きる。この値を異なるウシ、あるいは異なる飼料条件な
どで比較することにより、カゼイン合成能力などウシの
乳質評価、あるいは飼料評価の基準とすることができ
る。
リダイズする新規プライマーは、ＣＡＧ−ＴＧＴ−ＣＧ
Ｇ−ＧＧＧ−ＣＴＣ−ＴＧＧ（配列表配列番号１）又は
ＡＴＧ−ＴＧＧ−ＧＴＣ−ＴＧＣ−ＧＡＴ−ＡＧＧ−Ｃ
Ｔ（配列表配列番号２）で表される配列を有する。又、
αS1−カゼイン遺伝子とハイブリダイズする新規なプラ
イマーは、ＧＴＣ−ＡＡＧ−ＴＧＡ−ＡＴＴ−ＣＴＧ−
ＡＧＧ（配列表配列番号３）又はＴＧＧ−ＣＡＣ−ＴＴ
Ａ−ＣＡＧ−ＧＡＧ−ＡＡＧ（配列表配列番号４）で表
される配列を有する。これらのオリゴヌクレオチドは、
常法に従って合成などにより得ることができる。本発明
は、これらのプライマーを用い乳房炎、特にウシ乳房炎
の診断を行うことができる。本発明での検査対象として
用いる乳は、哺乳動物のものであれば特に限定されない
が、特に好ましくはウシの乳を用いる。本発明の検査対
象となる乳中に含まれる細胞のＲＮＡは、以下のように
調製する。即ち、可能な限り衛生的な環境下で乳を採集
し、速やかに氷温まで冷却する。乳を適当な緩衝液、好
ましくは生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ（−））にて希釈
し、遠心分離を行い、沈殿物を回収する。必要に応じ、
緩衝液、好ましくはＰＢＳ（−）への分散と遠心分離を
繰り返す。このようにして得られた沈殿物から、常法に
て乳中に含まれる細胞由来のＲＮＡを抽出することがで
きる。又、必要に応じｍＲＮＡの抽出も可能である。得
られたＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素により逆転写反
応を行って相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する際に
は、オリゴｄＴプライマーあるいはランダムプライマ
ー、特に好ましくは配列番号２、もしくは配列番号４に
示されるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマー
に用いて行う。次に、得られたｃＤＮＡを鋳型に、配列
番号１に示されるオリゴヌクレオチドをセンスプライマ
ーに、配列番号２で示されるオリゴヌクレオチドをアン
チセンスプライマーに用い、もしくは配列番号３に示さ
れるオリゴヌクレオチドをセンスプライマーに、配列番
号４で示されるオリゴヌクレオチドをアンチセンスプラ
イマーに用い、ＤＮＡポリメレースによりＰＣＲを行
う。このＰＣＲ反応液を電気泳動にて分離したのち、適
当な染色剤、好ましくはエチジウムブロマイド液により
染色し、染色されたバンドを画像解析装置などにより染
色強度として測定する。配列番号１に示されるオリゴヌ
クレオチドをセンスプライマーに、配列番号２に示され
るオリゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーに用い
て得られたＰＣＲ反応液におけるバンドの染色強度は塩
基性（タイプ２）コンポーネント３型のケラチン遺伝子
の発現量であり、配列番号３に示されるオリゴヌクレオ
チドをセンスプライマーに、配列番号４に示されるオリ
ゴヌクレオチドをアンチセンスプライマーに用いて得ら
れたＰＣＲ反応液におけるバンドの染色強度はαS1−カ
ゼイン遺伝子の発現量である。αS1−カゼイン遺伝子発
現量のケラチン遺伝子発現量に対する比を得ることによ
り、対象の乳房における乳腺上皮細胞のαS1−カゼイン
遺伝子発現量を知ることとなる。この値が１．０以上を
示すときが正常、０．５以上、１．０未満を示すときは
軽度の乳房炎、０．５未満のときは重度の乳房炎と診断
することができる。又、前述の方法により得られたケラ
チン遺伝子発現量及びαS1−カゼイン遺伝子発現量を用
い、αS1−カゼイン遺伝子発現量のケラチン遺伝子発現
量に対する比を得ることにより、対象乳房における乳腺
上皮細胞のαS1−カゼイン遺伝子発現量を得ることがで
きる。この値を異なるウシ、あるいは異なる飼料条件な
どで比較することにより、カゼイン合成能力などウシの
乳質評価、あるいは飼料評価の基準とすることができ
る。
【０００９】
【実施例】以下の実施例をもって本発明をより詳細に説
明するが、これらは単に例示したのみであり、これらに
よって本発明は何ら限定されるものではない。
明するが、これらは単に例示したのみであり、これらに
よって本発明は何ら限定されるものではない。
【００１０】
【実施例１】乳からＲＮＡを調製する方法 表１に示す１０頭のウシの乳を滅菌した容器に５０ｍｌ
ずつ採取し、氷上にて速やかに冷却したのち、冷却条件
下で実験室へと搬送した。乳をＰＢＳ（−）にて２倍に
希釈し、１，５００Ｇ、４℃で５分間遠心し、沈殿を集
めた。得られた沈殿を５０ｍｌのＰＢＳ（−）へ分散さ
せ、同条件で遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈
殿を試料とし、ＲＮＡｚｏｌ（テル・テスト社）を用
い、ＲＮＡを抽出して試料とした。得られた試料のＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動、並びに波長２６０ｎ
ｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度の比を測定した。電気
泳動図を図１に、吸光度の比を表１にそれぞれ示す。こ
の結果より、試料はＲＴ−ＰＣＲ法に使用可能な純度で
あることが確認された。
ずつ採取し、氷上にて速やかに冷却したのち、冷却条件
下で実験室へと搬送した。乳をＰＢＳ（−）にて２倍に
希釈し、１，５００Ｇ、４℃で５分間遠心し、沈殿を集
めた。得られた沈殿を５０ｍｌのＰＢＳ（−）へ分散さ
せ、同条件で遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈
殿を試料とし、ＲＮＡｚｏｌ（テル・テスト社）を用
い、ＲＮＡを抽出して試料とした。得られた試料のＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動、並びに波長２６０ｎ
ｍ及び２８０ｎｍにおける吸光度の比を測定した。電気
泳動図を図１に、吸光度の比を表１にそれぞれ示す。こ
の結果より、試料はＲＴ−ＰＣＲ法に使用可能な純度で
あることが確認された。
【００１１】
【表１】
【００１２】
【実施例２】プライマーを用いたウシ乳房炎の診断方法
及び結果 実施例１で得られたＲＮＡを各ウシについて、２本ずつ
の微量試験管に総ＲＮＡを各１μｇずつになるように取
り、一方の試験管では配列番号２に示されるプライマー
を用い、もう一方の試験管では配列番号４に示されるプ
ライマーを用いて、逆転写酵素（ギブコ社）を用いて一
次ストランドｃＤＮＡを合成した。反応液を別々の微量
試験管に１μｌずつ取り、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリ
メレース（パーキンエルマージャパン社）を用い、常法
によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応条件は変性９
６℃、１分、アニーリング５６℃、１分、鎖長延長反応
７２℃、１分とした。ＰＣＲ増幅産物を２％アガロース
ゲル電気泳動にて分離後、エチジウムブロマイド染色に
より可視化し、スキャナー（ヒューレットパッカード
社）でコンピューター（アップル社）へ取り込み、画像
解析ソフト（ＮＩＨＩｍａｇｅ）により２７４ｂｐの試
料中ケラチン遺伝子の目的バンド及び３５１ｂｐの試料
中αS1−カゼイン遺伝子の目的バンドの染色強度を数値
化した。バンドの染色状態を図２に、それぞれの染色強
度及びケラチン遺伝子バンド染色強度に対するαS1−カ
ゼイン遺伝子バンド染色強度の比を表３に示す。この結
果、表３にて示される、各ウシにおけるケラチンバンド
染色強度に対するαS1−カゼインバンド染色強度の比の
値から判断した乳房炎の診断結果と、表２に示される目
視、及び体細胞数によって判断した乳房炎の診断結果が
一致した。よって、本法は乳房炎の検査方法として有効
であることが確認された。
及び結果 実施例１で得られたＲＮＡを各ウシについて、２本ずつ
の微量試験管に総ＲＮＡを各１μｇずつになるように取
り、一方の試験管では配列番号２に示されるプライマー
を用い、もう一方の試験管では配列番号４に示されるプ
ライマーを用いて、逆転写酵素（ギブコ社）を用いて一
次ストランドｃＤＮＡを合成した。反応液を別々の微量
試験管に１μｌずつ取り、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリ
メレース（パーキンエルマージャパン社）を用い、常法
によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲの反応条件は変性９
６℃、１分、アニーリング５６℃、１分、鎖長延長反応
７２℃、１分とした。ＰＣＲ増幅産物を２％アガロース
ゲル電気泳動にて分離後、エチジウムブロマイド染色に
より可視化し、スキャナー（ヒューレットパッカード
社）でコンピューター（アップル社）へ取り込み、画像
解析ソフト（ＮＩＨＩｍａｇｅ）により２７４ｂｐの試
料中ケラチン遺伝子の目的バンド及び３５１ｂｐの試料
中αS1−カゼイン遺伝子の目的バンドの染色強度を数値
化した。バンドの染色状態を図２に、それぞれの染色強
度及びケラチン遺伝子バンド染色強度に対するαS1−カ
ゼイン遺伝子バンド染色強度の比を表３に示す。この結
果、表３にて示される、各ウシにおけるケラチンバンド
染色強度に対するαS1−カゼインバンド染色強度の比の
値から判断した乳房炎の診断結果と、表２に示される目
視、及び体細胞数によって判断した乳房炎の診断結果が
一致した。よって、本法は乳房炎の検査方法として有効
であることが確認された。
【００１３】
【表２】
【００１４】
【表３】
【００１５】
【発明の効果】本発明により、ケラチン遺伝子とハイブ
リダイズする新規なプライマー、αS1−カゼイン遺伝子
とハイブリダイズする新規なプライマー、及びこれらの
プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中に含ま
れるケラチン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅す
る方法が提供される。さらに詳しくは、乳を速やかに氷
温まで冷却し、緩衝液にて希釈し遠心分離を行い、得ら
れた沈殿物から抽出したＲＮＡを鋳型とし、本発明プラ
イマーを用いて遺伝子増幅することを特徴とするケラチ
ン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法、こ
の方法を用いた乳房炎の検査方法及び乳腺細胞における
乳タンパク質合成レベルの測定方法が提供される。本発
明は、簡便、迅速、且つ高精度な乳房炎の検査方法、特
にウシ乳房炎の検査方法として、あるいは乳腺細胞にお
ける乳タンパク質合成レベルの測定方法として有用であ
る。
リダイズする新規なプライマー、αS1−カゼイン遺伝子
とハイブリダイズする新規なプライマー、及びこれらの
プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中に含ま
れるケラチン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅す
る方法が提供される。さらに詳しくは、乳を速やかに氷
温まで冷却し、緩衝液にて希釈し遠心分離を行い、得ら
れた沈殿物から抽出したＲＮＡを鋳型とし、本発明プラ
イマーを用いて遺伝子増幅することを特徴とするケラチ
ン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法、こ
の方法を用いた乳房炎の検査方法及び乳腺細胞における
乳タンパク質合成レベルの測定方法が提供される。本発
明は、簡便、迅速、且つ高精度な乳房炎の検査方法、特
にウシ乳房炎の検査方法として、あるいは乳腺細胞にお
ける乳タンパク質合成レベルの測定方法として有用であ
る。
【００１６】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAGTGTCGGG GGCTCTGG 18
【００１７】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATGTGGGTCT GCGATAGGCT 20
【００１８】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTCAAGTGAA TTCTGAGG 18
【００１９】配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGGCACTTAC AGGAGAAG 18
【図１】 乳から抽出したＲＮＡの電気泳動図を表す。
レーン１〜１０：ウシ検体番号 １８ｓ及び２８ｓ：リボソームＲＮＡ
【図２】 試料中αS1−カゼインとケラチンの電気泳動
図を表す。
図を表す。
レーン１〜１０：ウシ検体番号 Ｍ：分子量 ２７４ｂｐ及び３５１ｂｐ：目的バンド
Claims (6)
- 【請求項１】 配列表配列番号１又は２で表される、ケ
ラチン遺伝子とハイブリダイズする新規プライマー。 - 【請求項２】 配列表配列番号３又は４で表される、α
s1−カゼイン遺伝子とハイブリダイズする新規プライマ
ー。 - 【請求項３】 請求項１及び／又は２記載のプライマー
を用いて、ＲＴ−ＰＣＲ法によって乳中に含まれるケラ
チン遺伝子及び／又はカゼイン遺伝子を増幅する方法。 - 【請求項４】 鋳型とする遺伝子が、乳を速やかに氷温
まで冷却し、緩衝液にて希釈し遠心分離を行い、得られ
た沈殿物から抽出したＲＮＡである、請求項３記載の方
法。 - 【請求項５】 請求項３又は４記載の方法を用いた、乳
房炎の検査方法。 - 【請求項６】 請求項３又は４記載の方法を用いた、乳
腺細胞における乳タンパク質合成レベルの測定方法。
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| US09/297,960 US6287771B1 (en) | 1997-09-10 | 1998-09-10 | Method for determining mastitis using keratin and casein which are amplified by primers |
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| JP9-262693 | 1997-09-10 | ||
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