JPH11151100A - プローブによる核酸の検出方法 - Google Patents
プローブによる核酸の検出方法Info
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- JPH11151100A JPH11151100A JP9333735A JP33373597A JPH11151100A JP H11151100 A JPH11151100 A JP H11151100A JP 9333735 A JP9333735 A JP 9333735A JP 33373597 A JP33373597 A JP 33373597A JP H11151100 A JPH11151100 A JP H11151100A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】
【課題】標的二本鎖DNA に損傷を与えず且つ標的二本鎖
DNA の正確な情報を得ることを可能にした、プローブを
用いた核酸検出方法を提供する。 【解決手段】本発明の核酸検出方法は、RecAタンパク質
を介して第一の一本鎖DNA プローブが結合した標的二本
鎖DNA を一本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼで処理すること
により、第一のプローブと相補的な塩基配列またはその
一部からなる、検出可能な標識をラベルした第二の一本
鎖DNA プローブが標的DNA に特異的に結合することを可
能にし、核酸の検出を行う。
DNA の正確な情報を得ることを可能にした、プローブを
用いた核酸検出方法を提供する。 【解決手段】本発明の核酸検出方法は、RecAタンパク質
を介して第一の一本鎖DNA プローブが結合した標的二本
鎖DNA を一本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼで処理すること
により、第一のプローブと相補的な塩基配列またはその
一部からなる、検出可能な標識をラベルした第二の一本
鎖DNA プローブが標的DNA に特異的に結合することを可
能にし、核酸の検出を行う。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、一本鎖DNA プロー
ブを用いて、所定の塩基配列を有する二本鎖DNAを検出
する方法に関する。
ブを用いて、所定の塩基配列を有する二本鎖DNAを検出
する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】所定の塩基配列を有するDNA の探索は、
分子生物学、臨床検査の分野において用いられる技術で
あり、とりわけ遺伝子クローニング、遺伝的疾患の検出
における基礎的技術となっている。従来のDNA 検出法と
しては、変性処理によって調製した一本鎖DNA サンプル
に、標識したプローブを結合させ、所定の塩基配列を有
する一本鎖DNA を検出するサザンブロッティング法が広
く用いられている。一方、変性処理を施さず、二本鎖DN
A サンプルの中から所定の塩基配列を有する二本鎖DNA
を直接検出することを可能とした方法として以下に記載
する先行技術が知られている。
分子生物学、臨床検査の分野において用いられる技術で
あり、とりわけ遺伝子クローニング、遺伝的疾患の検出
における基礎的技術となっている。従来のDNA 検出法と
しては、変性処理によって調製した一本鎖DNA サンプル
に、標識したプローブを結合させ、所定の塩基配列を有
する一本鎖DNA を検出するサザンブロッティング法が広
く用いられている。一方、変性処理を施さず、二本鎖DN
A サンプルの中から所定の塩基配列を有する二本鎖DNA
を直接検出することを可能とした方法として以下に記載
する先行技術が知られている。
【０００３】第一の方法は、RecAタンパク質を介して、
所定の塩基配列を有する標的二本鎖DNA にオリゴヌクレ
オチドプローブを結合させ、３者の複合体（以下RecA組
換え中間体という）を形成させることを特徴とするもの
である（Cheng et al., J. Biol. Chem. 263, 15110-15
117, 1988 ）。この方法においては、二本鎖DNA サンプ
ルを分離用ゲルにかけるために必要とされるRecAタンパ
ク質分解反応を行った後、標的二本鎖DNA へのオリゴヌ
クレオチドプローブの結合が不安定になるのを防ぐため
に、光架橋反応を行い、標的二本鎖DNA とプローブとの
安定な結合を達成している。しかし、該光架橋反応にお
ける紫外線の照射は、標的DNA へのプローブの非特異的
な結合を生じさせるとともに、標的DNA 自体の損傷を引
き起こすという欠点を有する。
所定の塩基配列を有する標的二本鎖DNA にオリゴヌクレ
オチドプローブを結合させ、３者の複合体（以下RecA組
換え中間体という）を形成させることを特徴とするもの
である（Cheng et al., J. Biol. Chem. 263, 15110-15
117, 1988 ）。この方法においては、二本鎖DNA サンプ
ルを分離用ゲルにかけるために必要とされるRecAタンパ
ク質分解反応を行った後、標的二本鎖DNA へのオリゴヌ
クレオチドプローブの結合が不安定になるのを防ぐため
に、光架橋反応を行い、標的二本鎖DNA とプローブとの
安定な結合を達成している。しかし、該光架橋反応にお
ける紫外線の照射は、標的DNA へのプローブの非特異的
な結合を生じさせるとともに、標的DNA 自体の損傷を引
き起こすという欠点を有する。
【０００４】このような先行技術の問題点を解決するた
めに、特願平8-54278 号において、本願出願人は、核酸
に損傷を与えずに二本鎖核酸中の特定塩基配列を検出す
る方法を記載した。この第二の方法は、前記光架橋反応
によるプローブの標的二本鎖DNA への結合に代えて、酵
素反応を用いた温和な条件下でプローブをループ状にし
て標的DNA に固定するものであり、標的二本鎖DNA への
損傷を与えるという欠点を有しないものである。しかし
ながら、この方法では、最終的にプローブが結合した状
態のDNA を生じるために、分離用ゲルを用いた検出時に
おいて、DNA 分子の大きさおよび形状を含めた、標的二
本鎖DNA の正確な状態を完全には反映し得ないという欠
点を有している。
めに、特願平8-54278 号において、本願出願人は、核酸
に損傷を与えずに二本鎖核酸中の特定塩基配列を検出す
る方法を記載した。この第二の方法は、前記光架橋反応
によるプローブの標的二本鎖DNA への結合に代えて、酵
素反応を用いた温和な条件下でプローブをループ状にし
て標的DNA に固定するものであり、標的二本鎖DNA への
損傷を与えるという欠点を有しないものである。しかし
ながら、この方法では、最終的にプローブが結合した状
態のDNA を生じるために、分離用ゲルを用いた検出時に
おいて、DNA 分子の大きさおよび形状を含めた、標的二
本鎖DNA の正確な状態を完全には反映し得ないという欠
点を有している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、本願出願人
による前記発明の欠点を克服するために、DNA 分子の大
きさ、形状を含めた、標的二本鎖DNA の正確な情報を得
ることを可能にし、且つ二本鎖DNA に損傷を与えること
なく検出する方法を提供するものである。
による前記発明の欠点を克服するために、DNA 分子の大
きさ、形状を含めた、標的二本鎖DNA の正確な情報を得
ることを可能にし、且つ二本鎖DNA に損傷を与えること
なく検出する方法を提供するものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決し、目
的を達成するために、本発明による核酸検出方法は、以
下のごとく構成されている。
的を達成するために、本発明による核酸検出方法は、以
下のごとく構成されている。
【０００７】所定の塩基配列を有する一本鎖DNA プロー
ブを用いて、二本鎖DNA サンプルの中から、該所定の塩
基配列を有する二本鎖DNA を検出する方法であって、
（１）RecAタンパク質、前記所定の塩基配列を有する第
一の一本鎖DNA プローブおよび前記二本鎖DNA サンプル
を混合し、前記第一の一本鎖DNA プローブが、RecA タ
ンパク質を介して前記二本鎖DNA に結合してなる第一の
複合体を形成するステップと、（２）該第一の複合体に
一本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼを作用させて消化するス
テップと、（３）ステップ(2) で得られた消化生成物に
タンパク質分解酵素を作用させてRecAタンパク質を分解
し、消化生成物から前記第一の一本鎖DNA プローブを解
離させるステップと、（４）ステップ(3) で得られた解
離生成物に対して、前記所定の塩基配列またはその一部
と相補的な塩基配列からなり且つ検出可能な標識でラベ
ルされた第２の一本鎖DNA プローブを添加し、この両者
からなる第２の複合体を形成するステップと、（５）該
第２の複合体に含まれる前記標識を検出するステップと
を具備することを特徴とする核酸検出方法である。
ブを用いて、二本鎖DNA サンプルの中から、該所定の塩
基配列を有する二本鎖DNA を検出する方法であって、
（１）RecAタンパク質、前記所定の塩基配列を有する第
一の一本鎖DNA プローブおよび前記二本鎖DNA サンプル
を混合し、前記第一の一本鎖DNA プローブが、RecA タ
ンパク質を介して前記二本鎖DNA に結合してなる第一の
複合体を形成するステップと、（２）該第一の複合体に
一本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼを作用させて消化するス
テップと、（３）ステップ(2) で得られた消化生成物に
タンパク質分解酵素を作用させてRecAタンパク質を分解
し、消化生成物から前記第一の一本鎖DNA プローブを解
離させるステップと、（４）ステップ(3) で得られた解
離生成物に対して、前記所定の塩基配列またはその一部
と相補的な塩基配列からなり且つ検出可能な標識でラベ
ルされた第２の一本鎖DNA プローブを添加し、この両者
からなる第２の複合体を形成するステップと、（５）該
第２の複合体に含まれる前記標識を検出するステップと
を具備することを特徴とする核酸検出方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明において使用するRecAタン
パク質は、元来DNA に突然変異を生じた場合に、変異部
位を正常な塩基配列に組み換えるという、DNA 修復反応
の一種である組換え反応に関与するタンパク質である。
本発明では、RecAタンパク質は、二本鎖標的DNA 中の所
定の塩基配列部位に、前記第一の一本鎖DNA プローブを
特異的に結合させて、RecA組換え中間体を形成させるた
めに用いられる。
パク質は、元来DNA に突然変異を生じた場合に、変異部
位を正常な塩基配列に組み換えるという、DNA 修復反応
の一種である組換え反応に関与するタンパク質である。
本発明では、RecAタンパク質は、二本鎖標的DNA 中の所
定の塩基配列部位に、前記第一の一本鎖DNA プローブを
特異的に結合させて、RecA組換え中間体を形成させるた
めに用いられる。
【０００９】ここで、前記第一の一本鎖DNA プローブ
は、検出すべき二本鎖DNA 中の所定の塩基配列の一部を
含むDNA であり、好ましくは塩基数が10〜150 である。
は、検出すべき二本鎖DNA 中の所定の塩基配列の一部を
含むDNA であり、好ましくは塩基数が10〜150 である。
【００１０】前記二本鎖DNA サンプルには、ゲノムDNA
サンプルを含む任意のDNA サンプルを用いることができ
る。
サンプルを含む任意のDNA サンプルを用いることができ
る。
【００１１】次にRecA組換え中間体に一本鎖DNA 特異的
ヌクレアーゼを作用させ、消化反応を行う。ここで、一
本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼとは、一本鎖のDNA のみを
特異的に消化せしめる酵素である。一本鎖DNA 特異的ヌ
クレアーゼによる消化反応は本発明の第一の特徴をな
す。本発明では任意の一本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼを
用いることができる。好ましい一本鎖DNA 特異的ヌクレ
アーゼには、ヌクレアーゼS1がある。
ヌクレアーゼを作用させ、消化反応を行う。ここで、一
本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼとは、一本鎖のDNA のみを
特異的に消化せしめる酵素である。一本鎖DNA 特異的ヌ
クレアーゼによる消化反応は本発明の第一の特徴をな
す。本発明では任意の一本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼを
用いることができる。好ましい一本鎖DNA 特異的ヌクレ
アーゼには、ヌクレアーゼS1がある。
【００１２】一本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼによる消化
反応後、消化生成物から第一の一本鎖DNA プローブを解
離させるために、タンパク質分解反応を行う。これによ
ってRecAタンパク質は分解され、RecAタンパク質を介し
て消化生成物と結合している第一の一本鎖DNA プローブ
は、消化生成物から解離する。この目的は、プローブの
完全なる非特異的結合をなくすことに貢献している。
反応後、消化生成物から第一の一本鎖DNA プローブを解
離させるために、タンパク質分解反応を行う。これによ
ってRecAタンパク質は分解され、RecAタンパク質を介し
て消化生成物と結合している第一の一本鎖DNA プローブ
は、消化生成物から解離する。この目的は、プローブの
完全なる非特異的結合をなくすことに貢献している。
【００１３】次に、得られた解離生成物に第二の一本鎖
DNA プローブを結合させる操作を行う。ここで、第二の
一本鎖DNA プローブは、第一の一本鎖DNA プローブと相
補的な塩基配列を有するDNA の一部または全部からなる
一本鎖DNA であり、第一のプローブと同一の塩基配列ま
たはその一部からなるDNA を第二の一本鎖プローブとし
て用いても標的二本鎖DNA を検出し得ないことに注意す
る必要がある。好ましくは、第二の一本鎖DNA プローブ
の塩基数は5 〜150 である。
DNA プローブを結合させる操作を行う。ここで、第二の
一本鎖DNA プローブは、第一の一本鎖DNA プローブと相
補的な塩基配列を有するDNA の一部または全部からなる
一本鎖DNA であり、第一のプローブと同一の塩基配列ま
たはその一部からなるDNA を第二の一本鎖プローブとし
て用いても標的二本鎖DNA を検出し得ないことに注意す
る必要がある。好ましくは、第二の一本鎖DNA プローブ
の塩基数は5 〜150 である。
【００１４】第二の一本鎖DNA プローブは検出可能な標
識物質でラベルされ、二本鎖DNA サンプル中から、所定
の塩基配列を含む二本鎖DNA を検出することが可能とな
る。好ましい標識物質には、放射性同位体、蛍光物質、
ビオチン、ジゴキシゲニンが含まれるが、これらに限定
されない。
識物質でラベルされ、二本鎖DNA サンプル中から、所定
の塩基配列を含む二本鎖DNA を検出することが可能とな
る。好ましい標識物質には、放射性同位体、蛍光物質、
ビオチン、ジゴキシゲニンが含まれるが、これらに限定
されない。
【００１５】また、標的DNA への第二の一本鎖DNA プロ
ーブの結合は、温和な条件で起こるため、消化されたDN
A に何ら損傷を与えることがない。
ーブの結合は、温和な条件で起こるため、消化されたDN
A に何ら損傷を与えることがない。
【００１６】本発明の方法によって、所定の塩基配列を
有する二本鎖DNA の検出が可能であることは、後述の実
施例の結果から明らかである。本発明はいかなる理論に
も拘泥するものではないが、本発明の理解を容易にする
ために、その推定される作用機序について説明すれば次
の通りである。
有する二本鎖DNA の検出が可能であることは、後述の実
施例の結果から明らかである。本発明はいかなる理論に
も拘泥するものではないが、本発明の理解を容易にする
ために、その推定される作用機序について説明すれば次
の通りである。
【００１７】以下推定される作用機序を図１に従って説
明する。
明する。
【００１８】反応の第一段階は、二本鎖DNA サンプル、
第一の一本鎖DNA プローブおよびRecAタンパク質を混合
することによって、RecA組換え中間体が形成されるRecA
組換え中間体形成反応である。RecA組換え中間体におい
ては、第一の一本鎖DNA プローブは、図中点線で示され
た未知の結合様式により、RecAタンパク質を介して二本
鎖DNA の特異的塩基配列部位（第一のプローブと同じ配
列を有する部位）と結合している。本反応は公知の反応
である。
第一の一本鎖DNA プローブおよびRecAタンパク質を混合
することによって、RecA組換え中間体が形成されるRecA
組換え中間体形成反応である。RecA組換え中間体におい
ては、第一の一本鎖DNA プローブは、図中点線で示され
た未知の結合様式により、RecAタンパク質を介して二本
鎖DNA の特異的塩基配列部位（第一のプローブと同じ配
列を有する部位）と結合している。本反応は公知の反応
である。
【００１９】反応の第二段階は、RecA組換え中間体にヌ
クレアーゼS1を作用させる、ヌクレアーゼS1消化反応で
ある。本反応によって、続いて行われる標的DNA への第
二のプローブの結合反応が可能となることを鑑みると、
ヌクレアーゼS1によって標的DNA が消化されたことが強
く示唆される。
クレアーゼS1を作用させる、ヌクレアーゼS1消化反応で
ある。本反応によって、続いて行われる標的DNA への第
二のプローブの結合反応が可能となることを鑑みると、
ヌクレアーゼS1によって標的DNA が消化されたことが強
く示唆される。
【００２０】反応の第三段階は、タンパク質分解酵素に
よるRecAタンパク質の分解である。本反応によってRecA
タンパク質は分解され、第一の一本鎖DNA は標的DNA か
ら解離する。本反応は、公知の反応である。
よるRecAタンパク質の分解である。本反応によってRecA
タンパク質は分解され、第一の一本鎖DNA は標的DNA か
ら解離する。本反応は、公知の反応である。
【００２１】反応の第四段階は、消化反応処理をなされ
た標的DNA に、第二の一本鎖DNA プローブを結合せしめ
る反応である。第二の一本鎖DNA プローブが、第一の一
本鎖DNA プローブと同一の塩基配列またはその一部であ
る場合には、ヌクレアーゼS1によって消化されたと推定
される標的DNA に結合せず、第一の一本鎖DNA プローブ
と相補的塩基配列またはその一部である場合にのみ結合
し得るので、消化された部位は、第一の一本鎖DNA が結
合した標的DNA 中の所定の塩基配列部位と相補的な塩基
配列部位であることが推定できる。
た標的DNA に、第二の一本鎖DNA プローブを結合せしめ
る反応である。第二の一本鎖DNA プローブが、第一の一
本鎖DNA プローブと同一の塩基配列またはその一部であ
る場合には、ヌクレアーゼS1によって消化されたと推定
される標的DNA に結合せず、第一の一本鎖DNA プローブ
と相補的塩基配列またはその一部である場合にのみ結合
し得るので、消化された部位は、第一の一本鎖DNA が結
合した標的DNA 中の所定の塩基配列部位と相補的な塩基
配列部位であることが推定できる。
【００２２】＜変形例＞第二の一本鎖DNA プローブとし
て、所定の塩基配列と相補的な塩基配列中の１乃至数個
の塩基を所望の塩基と置換した一本鎖DNA を用いること
により、部位特異的突然変異の導入を行うこともでき
る。
て、所定の塩基配列と相補的な塩基配列中の１乃至数個
の塩基を所望の塩基と置換した一本鎖DNA を用いること
により、部位特異的突然変異の導入を行うこともでき
る。
【００２３】また、本発明は所定の塩基配列を含む任意
の二本鎖DNA を標識物質でラベルすることを可能とする
ので、ゲノムDNA サンプルまたは制限酵素断片から特定
のDNA を単離するための方法としても用いることがで
き、遺伝子治療または遺伝子クローニングにおいて有用
である。
の二本鎖DNA を標識物質でラベルすることを可能とする
ので、ゲノムDNA サンプルまたは制限酵素断片から特定
のDNA を単離するための方法としても用いることがで
き、遺伝子治療または遺伝子クローニングにおいて有用
である。
【００２４】上記の核酸検出方法において、第二の一本
鎖DNA プローブを結合させるステップに代えて、検出可
能な標識でラベルされたヌクレオチドおよびDNA ポリメ
ラーゼを用いて、標識されたヌクレオチドを直接、解離
生成物に取り込ませ、標的DNA を検出することも可能で
ある。この方法によれば、さらに高感度の検出が可能と
なる。
鎖DNA プローブを結合させるステップに代えて、検出可
能な標識でラベルされたヌクレオチドおよびDNA ポリメ
ラーゼを用いて、標識されたヌクレオチドを直接、解離
生成物に取り込ませ、標的DNA を検出することも可能で
ある。この方法によれば、さらに高感度の検出が可能と
なる。
【００２５】
【実施例】実施例１：本発明によるDNA 検出方法におけ
るRecAタンパク質、ヌクレアーゼS1の依存性および第一
の一本鎖DNA プローブの特異性 本発明によるDNA 検出方法においてRecAタンパク質、ヌ
クレアーゼS1が必須成分であること、および第一の一本
鎖DNA プローブの塩基配列を含有する二本鎖DNA が特異
的に検出されることを示すために以下の実験を行った。
るRecAタンパク質、ヌクレアーゼS1の依存性および第一
の一本鎖DNA プローブの特異性 本発明によるDNA 検出方法においてRecAタンパク質、ヌ
クレアーゼS1が必須成分であること、および第一の一本
鎖DNA プローブの塩基配列を含有する二本鎖DNA が特異
的に検出されることを示すために以下の実験を行った。
【００２６】以下に示す実験条件は標準条件であり、本
発明による核酸検出方法に必須と考えられる成分を全て
添加したものである。
発明による核酸検出方法に必須と考えられる成分を全て
添加したものである。
【００２７】＜実験材料及び実験方法＞ １．RecA組換え中間体の形成 RecA組換え中間体を形成するために、以下の反応液Ａお
よび反応液Ｂを調製する。
よび反応液Ｂを調製する。
【００２８】反応液Ａ： オリゴヌクレオチドプローブ 5pmol RecAタンパク質 3.0 μg ATP-γS 0.48mM 反応液Ｂ： 標的直鎖状DNA 200ng ATP-γS 0.48mM 反応液A 中のオリゴヌクレオチドプローブは、塩基数12
0 の１本鎖DNA である（配列番号１）。RecAタンパク質
はエピセンターテクノロジー社のものを用いた。ATP-γ
S （ベーリンガーマンハイム社）の濃度は最終濃度であ
る。緩衝液は、30mM酢酸トリス（pH7.2 ）、2.5mM 酢酸
マグネシウム緩衝液を用いた。
0 の１本鎖DNA である（配列番号１）。RecAタンパク質
はエピセンターテクノロジー社のものを用いた。ATP-γ
S （ベーリンガーマンハイム社）の濃度は最終濃度であ
る。緩衝液は、30mM酢酸トリス（pH7.2 ）、2.5mM 酢酸
マグネシウム緩衝液を用いた。
【００２９】反応液Ｂ中の標的直鎖状DNA は、プラスミ
ドpBR322DNA を制限酵素Nde I で直鎖状にしたものであ
り、配列番号１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配
列をその一部に含む公知のDNA である。緩衝液は、30mM
酢酸トリス（pH7.2 ）、2.15mM酢酸マグネシウム緩衝液
を用いた。
ドpBR322DNA を制限酵素Nde I で直鎖状にしたものであ
り、配列番号１のオリゴヌクレオチドプローブの塩基配
列をその一部に含む公知のDNA である。緩衝液は、30mM
酢酸トリス（pH7.2 ）、2.15mM酢酸マグネシウム緩衝液
を用いた。
【００３０】反応液Ａと反応液Ｂをそれぞれ単独で、37
℃で15分間加温した後、両反応液を混合し、さらに37℃
で30分間加温する。混合後の液量は、20μL である。
℃で15分間加温した後、両反応液を混合し、さらに37℃
で30分間加温する。混合後の液量は、20μL である。
【００３１】２．ヌクレアーゼS1による消化反応 次にその全量を、一本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼを含む
酵素反応液に加え、全量を100 μL とし、45℃で100 分
間加温する。本実験においては、一本鎖DNA 特異的ヌク
レアーゼとして、ヌクレアーゼS1（宝酒造社）を用い
た。
酵素反応液に加え、全量を100 μL とし、45℃で100 分
間加温する。本実験においては、一本鎖DNA 特異的ヌク
レアーゼとして、ヌクレアーゼS1（宝酒造社）を用い
た。
【００３２】酵素反応液は、以下の組成である。
【００３３】 ヌクレアーゼS1 200ユニット 酢酸ナトリウム（pH4.6 ） 30mM NaCl 280mM ZnSO4 1mM 反応を停止するために、150mM Tris-HCl（pH8.8 ）、20
mM EDTA を加えて、45℃で30分間加温し、ヌクレアーゼ
S1を失活させる。
mM EDTA を加えて、45℃で30分間加温し、ヌクレアーゼ
S1を失活させる。
【００３４】３．標的DNA への第二のプローブの結合 反応液全量に対し、1/10倍量の3M酢酸ナトリウム、２倍
量のエタノールを加え、冷却・遠心して、DNA 分子の分
離濃縮を行い、得られたDNA 沈殿を蒸留水10μL に溶か
した後、除タンパク反応液（10mM EDTA 、0.5%(W/V)SD
S、0.7mg/mLプロテイナーゼＫ（最終濃度））を加え
る。さらに、これに対して3'末端をジゴキシゲニンで末
端標識した2.5pmol 、塩基数35の第二のオリゴヌクレオ
チドプローブ（配列番号２）を添加し、全量を25μL と
し、55℃で15分間加温する。
量のエタノールを加え、冷却・遠心して、DNA 分子の分
離濃縮を行い、得られたDNA 沈殿を蒸留水10μL に溶か
した後、除タンパク反応液（10mM EDTA 、0.5%(W/V)SD
S、0.7mg/mLプロテイナーゼＫ（最終濃度））を加え
る。さらに、これに対して3'末端をジゴキシゲニンで末
端標識した2.5pmol 、塩基数35の第二のオリゴヌクレオ
チドプローブ（配列番号２）を添加し、全量を25μL と
し、55℃で15分間加温する。
【００３５】４．電気泳動およびDNA の検出 その全量を0.8%アガロースゲル電気泳動に供する。泳動
後、エチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録し
た後、浸透させながら0.25N HCl 処理を施し、ゲル中の
DNA を脱プリン処理する。毛管現象によってゲル中のDN
A をナイロンメンブレン（日本ポール社製・バイオだイ
ンＡ）に転写した後、ＵＶ固定する。室温で60分間メン
ブレンのブロッキング（ベーリンガー社）を行った後、
該ブロッキング溶液中で、室温で30分間アルカリフォス
ファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体と反応させる。反
応処理後、150mM Tris-HCl (pH7.5) 、100mM NaCl洗浄
液で、15分間２回洗浄し、CDP-Star（アマシャム社）を
適量添加する。室温で５分間反応させた後、メンブレン
をインスタントフィルムに接触させてシグナルを検出す
る。
後、エチジウムブロミド染色を行いゲルの写真を記録し
た後、浸透させながら0.25N HCl 処理を施し、ゲル中の
DNA を脱プリン処理する。毛管現象によってゲル中のDN
A をナイロンメンブレン（日本ポール社製・バイオだイ
ンＡ）に転写した後、ＵＶ固定する。室温で60分間メン
ブレンのブロッキング（ベーリンガー社）を行った後、
該ブロッキング溶液中で、室温で30分間アルカリフォス
ファターゼ結合抗ジゴキシゲニン抗体と反応させる。反
応処理後、150mM Tris-HCl (pH7.5) 、100mM NaCl洗浄
液で、15分間２回洗浄し、CDP-Star（アマシャム社）を
適量添加する。室温で５分間反応させた後、メンブレン
をインスタントフィルムに接触させてシグナルを検出す
る。
【００３６】＜結果＞図２および図３に、上記の実施例
に示した実験の結果を示す。図２のゲルは化学発光法に
よる検出（第二のプローブが結合したDNA の特異的な検
出）、図３のゲルはエチジウムブロミドによる検出（DN
A の非特異的な検出）の結果である。
に示した実験の結果を示す。図２のゲルは化学発光法に
よる検出（第二のプローブが結合したDNA の特異的な検
出）、図３のゲルはエチジウムブロミドによる検出（DN
A の非特異的な検出）の結果である。
【００３７】レーンM はサイズマーカー（λ/Hind III
DNAフラグメント）である。
DNAフラグメント）である。
【００３８】レーン１は本発明に必要なすべての成分を
加えて行った実験の結果である。図２および図３ともに
シグナルが検出されており、本発明の方法により、所定
の塩基配列を有する二本鎖DNA が検出され得ることが明
らかである。
加えて行った実験の結果である。図２および図３ともに
シグナルが検出されており、本発明の方法により、所定
の塩基配列を有する二本鎖DNA が検出され得ることが明
らかである。
【００３９】レーン２は第一のプローブとして、標的DN
A に対して非特異的なプローブ（配列番号３）を用いた
実験の結果である。図３のゲルではバンドが検出されて
いるにもかかわらず、図２のゲルではバンドが検出され
ておらず、本発明により二本鎖DNA を特異的に検出する
ためには、第一のプローブとして標的DNA に特異的なプ
ローブを用いることが不可欠であることが示された。
A に対して非特異的なプローブ（配列番号３）を用いた
実験の結果である。図３のゲルではバンドが検出されて
いるにもかかわらず、図２のゲルではバンドが検出され
ておらず、本発明により二本鎖DNA を特異的に検出する
ためには、第一のプローブとして標的DNA に特異的なプ
ローブを用いることが不可欠であることが示された。
【００４０】レーン３はRecAタンパク質を添加せずに行
った実験結果、レーン4 はヌクレアーゼS1を添加せずに
行った実験結果をそれぞれ示している。両レーンともに
図３のゲルではバンドが検出されているにもかかわら
ず、図２のゲルではバンドが検出されておらず、本発明
による二本鎖DNA の特異的検出のために、RecAタンパク
質およびヌクレアーゼS1が必須要素であることを意味す
る。
った実験結果、レーン4 はヌクレアーゼS1を添加せずに
行った実験結果をそれぞれ示している。両レーンともに
図３のゲルではバンドが検出されているにもかかわら
ず、図２のゲルではバンドが検出されておらず、本発明
による二本鎖DNA の特異的検出のために、RecAタンパク
質およびヌクレアーゼS1が必須要素であることを意味す
る。
【００４１】以上の実験結果から、RecAタンパク質、ヌ
クレアーゼS1および標的DNA に特異的な第一のプローブ
は全て、本発明による標的二本鎖DNA の検出方法に必須
の成分であり、本発明による方法の実施によって、所定
の目的である二本鎖DNA の特異的検出が達成されること
が明らかとなった。
クレアーゼS1および標的DNA に特異的な第一のプローブ
は全て、本発明による標的二本鎖DNA の検出方法に必須
の成分であり、本発明による方法の実施によって、所定
の目的である二本鎖DNA の特異的検出が達成されること
が明らかとなった。
【００４２】
【発明の効果】・本発明による核酸検出法の反応過程中
では、サザンブロット法で必要とされる変性反応を一切
行わずに、直接二本鎖DNA に一本鎖DNA プローブを結合
させ、検出することが可能である。
では、サザンブロット法で必要とされる変性反応を一切
行わずに、直接二本鎖DNA に一本鎖DNA プローブを結合
させ、検出することが可能である。
【００４３】・第二の一本鎖DNA プローブとして、所定
の塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNA を用いるこ
とにより、大きさ、形状が元通りの標的DNA を得ること
ができ、標的DNA の正確な情報が得られる。
の塩基配列と相補的な塩基配列を有するDNA を用いるこ
とにより、大きさ、形状が元通りの標的DNA を得ること
ができ、標的DNA の正確な情報が得られる。
【００４４】・所定の塩基配列を有する標的DNA に対し
て特異的に標識を付けることが可能となり、ゲノム等の
DNA 混合物から特定のDNA を単離すること、遺伝子クロ
ーニングのために制限酵素断片混合物から特定のDNA 断
片を単離することになどに応用することができる。
て特異的に標識を付けることが可能となり、ゲノム等の
DNA 混合物から特定のDNA を単離すること、遺伝子クロ
ーニングのために制限酵素断片混合物から特定のDNA 断
片を単離することになどに応用することができる。
【００４５】・強い紫外線を照射する必要がないので、
標的核酸に障害を与えない。
標的核酸に障害を与えない。
【００４６】
配列番号：１ 配列の長さ：120 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GACCGTCTCC GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG GTTTTCACCG TCATCACCGA AACGCGCGAG 60 GCAGCTGCGG TAAAGCTCAT CAGCGTGGTC GTGAAGCGAT TCACAGATGT CTGCCTGTTC 120 配列番号：2 配列の長さ：35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GATGAGCTTT ACCGCAGCTG CCTCGCGCGT TTCGG 35 3'末端ジゴキシゲニンテーリング標識 配列番号：3 配列の長さ：120 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG 60 ATCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC 120
【図１】本発明のDNA 検出方法において推定される作用
機序の概略を示す図。
機序の概略を示す図。
【図２】本発明のDNA 検出方法における、第一のプロー
ブの特異性およびRecAタンパク質、ヌクレアーゼS1の依
存性を調べた実験において、化学発光法による検出を行
った結果を示す電気泳動写真。
ブの特異性およびRecAタンパク質、ヌクレアーゼS1の依
存性を調べた実験において、化学発光法による検出を行
った結果を示す電気泳動写真。
【図３】本発明のDNA 検出方法における、第一のプロー
ブの特異性およびRecAタンパク質、ヌクレアーゼS1の依
存性を調べた実験において、エチジウムブロミド染色に
よる検出を行った結果を示す電気泳動写真。
ブの特異性およびRecAタンパク質、ヌクレアーゼS1の依
存性を調べた実験において、エチジウムブロミド染色に
よる検出を行った結果を示す電気泳動写真。
Claims (4)
- 【請求項１】 所定の塩基配列を有する一本鎖DNA プロ
ーブを用いて、二本鎖DNA サンプルの中から、該所定の
塩基配列を有する二本鎖DNA を検出する方法であって、 （１）RecAタンパク質、前記所定の塩基配列を有する第
一の一本鎖DNA プローブおよび前記二本鎖DNA サンプル
を混合し、前記第一の一本鎖DNA プローブが、RecA タ
ンパク質を介して前記二本鎖DNA に結合してなる第一の
複合体を形成するステップと、 （２）該第一の複合体に一本鎖DNA 特異的ヌクレアーゼ
を作用させて消化するステップと、 （３）ステップ(2) で得られた消化生成物にタンパク質
分解酵素を作用させてRecAタンパク質を分解し、消化生
成物から前記第一の一本鎖DNA プローブを解離させるス
テップと、 （４）ステップ(3) で得られた解離生成物に対して、前
記所定の塩基配列またはその一部と相補的な塩基配列か
らなり且つ検出可能な標識でラベルされた第２の一本鎖
DNA プローブを添加し、この両者からなる第２の複合体
を形成するステップと、 （５）該第２の複合体に含まれる前記標識を検出するス
テップとを具備することを特徴とする核酸検出方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の二本鎖DNA を検出する
方法であって、 （ａ）前記ステップ(2) での消化によって、第一の一本
鎖DNA プローブが結合した領域において、前記二本鎖DN
A における前記所定の塩基配列に対して相補的な塩基配
列部分が消化されたことと、 （ｂ）前記ステップ(4) における前記第二の一本鎖DNA
プローブは、前記消化された塩基配列部分において、前
記二本鎖DNA サンプル中の前記所定の塩基配列部分とハ
イブリダイゼーションすることとを特徴とする核酸検出
方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載の方法において、第二の
一本鎖DNA プローブを添加して第２の複合体を形成する
ステップに代えて、検出可能な標識を有するヌクレオチ
ドおよびDNA ポリメラーゼを用いて前記解離生成物に前
記標識を有するヌクレオチドを取り込ませるステップを
具備する方法。 - 【請求項４】 請求項１に記載の方法において、第二の
一本鎖DNA プローブとして、所定の塩基配列またはその
一部と相補的な塩基配列中の１乃至数個の塩基を所望の
塩基と置換した一本鎖DNA を用いる方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9333735A JPH11151100A (ja) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | プローブによる核酸の検出方法 |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9333735A JPH11151100A (ja) | 1997-11-19 | 1997-11-19 | プローブによる核酸の検出方法 |
Publications (1)
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|---|---|
| JPH11151100A true JPH11151100A (ja) | 1999-06-08 |
Family
ID=18269377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (2)
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| JP (1) | JPH11151100A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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- 1998-11-19 US US09/196,643 patent/US6132972A/en not_active Expired - Fee Related
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