JPH11155568A - シイタケ形質転換方法 - Google Patents
シイタケ形質転換方法Info
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- JPH11155568A JPH11155568A JP33161197A JP33161197A JPH11155568A JP H11155568 A JPH11155568 A JP H11155568A JP 33161197 A JP33161197 A JP 33161197A JP 33161197 A JP33161197 A JP 33161197A JP H11155568 A JPH11155568 A JP H11155568A
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- JP
- Japan
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- shiitake
- polyethylene glycol
- protoplasts
- vector
- gene
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ポリエチレングリコール処理により外来
遺伝子を含むベクターをシイタケプロトプラストに導入
してシイタケを形質転換する方法において、ポリエチレ
ングリコール処理を、ベクター中のシイタケ発現ユニッ
ト以外の塩基配列を切断する制限酵素の存在下で行なう
ことを特徴とするシイタケの形質転換方法である。 【効果】 シイタケを効率よく形質転換することができ
る。
遺伝子を含むベクターをシイタケプロトプラストに導入
してシイタケを形質転換する方法において、ポリエチレ
ングリコール処理を、ベクター中のシイタケ発現ユニッ
ト以外の塩基配列を切断する制限酵素の存在下で行なう
ことを特徴とするシイタケの形質転換方法である。 【効果】 シイタケを効率よく形質転換することができ
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、シイタケの形質転
換方法に関する。
換方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】シイタケは食品として広く用いられてい
るだけでなく、最近では医療品、酵素等の生産素材とし
ても利用されるようになってきている。このようなシイ
タケの用途の拡大とともに、シイタケの育種改良が必要
となってきている。シイタケの育種法は、従来、野生株
からの選抜、交配および突然変異法などが主として用い
られてきたが、遺伝子工学的方法が確立できれば、短期
間に親株の形質を損なうことなく優良な形質を獲得した
シイタケの新品種を得ることが可能となる。また、特定
の形質に関与する遺伝子が分離されれば、その遺伝子の
大量発現、改良及び破壊などを行なうことができ、形質
を変えるだけでなく、物質生産等にも有利に用いること
ができる。
るだけでなく、最近では医療品、酵素等の生産素材とし
ても利用されるようになってきている。このようなシイ
タケの用途の拡大とともに、シイタケの育種改良が必要
となってきている。シイタケの育種法は、従来、野生株
からの選抜、交配および突然変異法などが主として用い
られてきたが、遺伝子工学的方法が確立できれば、短期
間に親株の形質を損なうことなく優良な形質を獲得した
シイタケの新品種を得ることが可能となる。また、特定
の形質に関与する遺伝子が分離されれば、その遺伝子の
大量発現、改良及び破壊などを行なうことができ、形質
を変えるだけでなく、物質生産等にも有利に用いること
ができる。
【０００３】食用担子菌の遺伝子工学的な形質転換方法
としては、これまでに、Miranda D.らによりマッシュル
ームのエレクトロポレーション法が報告されており（Mi
randa D. van de Rhee,ら., Mol. Gen. Genet., 250, 2
52−258, 1996）、Ming Pengらによりヒラタケのエレク
トロポレーション法が報告されており（Ming Peng,ら.,
Curr. Genet., 22, 53−59, 1992）、Yanaiらによりヒ
ラタケのポリエチレングリコール法が報告されており
（Koji Yanaiら., Biosci. Biotech. Biochem.,60, 472
−475, 1996）、さらにVictoria Barrettらによりキツ
ネタケのポリエチレングリコール法が報告されている
（Victoria Barrettら., Appl. Microbial.Biotechno
l., 33, 313−316, 1990）。
としては、これまでに、Miranda D.らによりマッシュル
ームのエレクトロポレーション法が報告されており（Mi
randa D. van de Rhee,ら., Mol. Gen. Genet., 250, 2
52−258, 1996）、Ming Pengらによりヒラタケのエレク
トロポレーション法が報告されており（Ming Peng,ら.,
Curr. Genet., 22, 53−59, 1992）、Yanaiらによりヒ
ラタケのポリエチレングリコール法が報告されており
（Koji Yanaiら., Biosci. Biotech. Biochem.,60, 472
−475, 1996）、さらにVictoria Barrettらによりキツ
ネタケのポリエチレングリコール法が報告されている
（Victoria Barrettら., Appl. Microbial.Biotechno
l., 33, 313−316, 1990）。
【０００４】しかし、シイタケの形質転換方法として
は、矢内らによるポリエチレングリコール法が報告され
ているだけである（矢内ら、日本農芸化学会1995年度大
会講演要旨集、p230）。しかも、かれらの方法ではシイ
タケの形質転換効率がまだ低い。そこで、シイタケを効
率よく形質転換することのできる形質転換方法の開発が
望まれている。
は、矢内らによるポリエチレングリコール法が報告され
ているだけである（矢内ら、日本農芸化学会1995年度大
会講演要旨集、p230）。しかも、かれらの方法ではシイ
タケの形質転換効率がまだ低い。そこで、シイタケを効
率よく形質転換することのできる形質転換方法の開発が
望まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、シイタケを
効率よく形質転換することのできる形質転換方法を提供
することを目的とする。
効率よく形質転換することのできる形質転換方法を提供
することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
に鑑み鋭意研究した結果、ポリエチレングリコール処理
により外来遺伝子を含むベクターをシイタケプロトプラ
ストに導入してシイタケを形質転換する方法において、
ポリエチレングリコール処理を、ベクター中のシイタケ
発現ユニット以外の塩基配列を切断する制限酵素の存在
下で行なうことにより、シイタケを効率よく形質転換す
ることができることを見出すとともに、上記ポリエチレ
ングリコール処理を、低温下で行なった後、シイタケプ
ロトプラストが成長増殖できる温度下で行なうことによ
りさらに効率よくシイタケを形質転換することができる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
に鑑み鋭意研究した結果、ポリエチレングリコール処理
により外来遺伝子を含むベクターをシイタケプロトプラ
ストに導入してシイタケを形質転換する方法において、
ポリエチレングリコール処理を、ベクター中のシイタケ
発現ユニット以外の塩基配列を切断する制限酵素の存在
下で行なうことにより、シイタケを効率よく形質転換す
ることができることを見出すとともに、上記ポリエチレ
ングリコール処理を、低温下で行なった後、シイタケプ
ロトプラストが成長増殖できる温度下で行なうことによ
りさらに効率よくシイタケを形質転換することができる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は、ポリエチレングリコ
ール処理により外来遺伝子を含むベクターをシイタケプ
ロトプラストに導入してシイタケを形質転換する方法に
おいて、ポリエチレングリコール処理を、ベクター中の
シイタケ発現ユニット以外の塩基配列を切断する制限酵
素の存在下で行なうことを特徴とするシイタケの形質転
換方法である。また、本発明は、上記ポリエチレングリ
コール処理を、低温下で行なった後、シイタケプロトプ
ラストが成長増殖できる温度下で行なうことを特徴とす
るシイタケの形質転換方法である。
ール処理により外来遺伝子を含むベクターをシイタケプ
ロトプラストに導入してシイタケを形質転換する方法に
おいて、ポリエチレングリコール処理を、ベクター中の
シイタケ発現ユニット以外の塩基配列を切断する制限酵
素の存在下で行なうことを特徴とするシイタケの形質転
換方法である。また、本発明は、上記ポリエチレングリ
コール処理を、低温下で行なった後、シイタケプロトプ
ラストが成長増殖できる温度下で行なうことを特徴とす
るシイタケの形質転換方法である。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のシイタケの形質転換方法は、ポリエチレングリ
コール処理により外来遺伝子を含むベクターをシイタケ
プロトプラストに導入してシイタケを形質転換する方法
において、ポリエチレングリコール処理を、ベクター中
のシイタケ発現ユニット以外の塩基配列を切断する制限
酵素の存在下で行なうことを特徴とする。
本発明のシイタケの形質転換方法は、ポリエチレングリ
コール処理により外来遺伝子を含むベクターをシイタケ
プロトプラストに導入してシイタケを形質転換する方法
において、ポリエチレングリコール処理を、ベクター中
のシイタケ発現ユニット以外の塩基配列を切断する制限
酵素の存在下で行なうことを特徴とする。
【０００９】本発明に用いるシイタケプロトプラストの
調製法は、特に限定されず、公知のいかなる調製法をも
用いることができる。このような調製法としては、例え
ば、Kawasumiらの方法（Kawasumi,Tら., Agric. Biol.
Chem., 51, 1649−1656, 1988）を改良した方法を用い
ることができる。すなわち、栄養寒天培地で培養したシ
イタケ菌糸を集菌し、洗浄後、セルラーゼ及び／又はキ
チナーゼで酵素処理し、ナイロンメッシュで濾過する。
得られる濾液を遠心分離してプロトプラストを沈殿さ
せ、得られる沈殿物を適当な緩衝液で洗浄する。これを
遠心分離してプロトプラストを集め、最終的に約0.5−
１×107プロトプラスト／100μlに調製したものを本発
明のプロトプラストとして用いることができる。この方
法によれば、安定に高収量でシイタケプロトプラストを
得ることができる。
調製法は、特に限定されず、公知のいかなる調製法をも
用いることができる。このような調製法としては、例え
ば、Kawasumiらの方法（Kawasumi,Tら., Agric. Biol.
Chem., 51, 1649−1656, 1988）を改良した方法を用い
ることができる。すなわち、栄養寒天培地で培養したシ
イタケ菌糸を集菌し、洗浄後、セルラーゼ及び／又はキ
チナーゼで酵素処理し、ナイロンメッシュで濾過する。
得られる濾液を遠心分離してプロトプラストを沈殿さ
せ、得られる沈殿物を適当な緩衝液で洗浄する。これを
遠心分離してプロトプラストを集め、最終的に約0.5−
１×107プロトプラスト／100μlに調製したものを本発
明のプロトプラストとして用いることができる。この方
法によれば、安定に高収量でシイタケプロトプラストを
得ることができる。
【００１０】本発明の外来遺伝子を含むベクターとして
は、プロモーター、外来遺伝子及びターミネーターを含
むベクターを用いることができる。プロモーター及びタ
ーミネーターは、シイタケプロトプラスト内で機能する
ことができる限り特に限定されず、いかなる生物由来の
プロモーター及びターミネーターをも用いることができ
る。このようなプロモーター及びターミネーターとして
は、例えば、シイタケ由来のプロモーター及びシイタケ
由来のターミネーターを用いることができる。
は、プロモーター、外来遺伝子及びターミネーターを含
むベクターを用いることができる。プロモーター及びタ
ーミネーターは、シイタケプロトプラスト内で機能する
ことができる限り特に限定されず、いかなる生物由来の
プロモーター及びターミネーターをも用いることができ
る。このようなプロモーター及びターミネーターとして
は、例えば、シイタケ由来のプロモーター及びシイタケ
由来のターミネーターを用いることができる。
【００１１】外来遺伝子はプロモーター及びターミネー
ターの間に配置する。ここで、外来遺伝子とは、シイタ
ケプロトプラストに導入し、形質転換シイタケ菌糸又は
子実体を形成させた時に、特徴ある形質を発現する遺伝
子を意味する。このような外来遺伝子は、特に限定され
ず、いかなる遺伝子であってもよい。例えば、酵素又は
構造タンパク質をコードする遺伝子などを外来遺伝子と
して用いることができる。
ターの間に配置する。ここで、外来遺伝子とは、シイタ
ケプロトプラストに導入し、形質転換シイタケ菌糸又は
子実体を形成させた時に、特徴ある形質を発現する遺伝
子を意味する。このような外来遺伝子は、特に限定され
ず、いかなる遺伝子であってもよい。例えば、酵素又は
構造タンパク質をコードする遺伝子などを外来遺伝子と
して用いることができる。
【００１２】本発明に用いるベクターには、形質転換さ
れたシイタケ形質転換菌糸又は子実体の選択をより効率
的にするために、プロモーター及びターミネーターの間
にマーカー遺伝子を挿入しておくのが好ましい。このよ
うなマーカー遺伝子としては、特に限定されず、公知の
いかなるマーカー遺伝子をも用いることができる。例え
ば、抗生物質ハイグロマイシンＢに対する抵抗性を形質
転換体に付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフ
ェラーゼ(Hygromycin B phospho transferase（hph）)
遺伝子、ビアラホスに対する抵抗性を付与するホスフィ
ノチリシンアセチルトランスフェラーゼ(Phosphinothri
cin acetyl transferase（bar）)遺伝子等から選ばれる
1つ以上の遺伝子をマーカー遺伝子として用いることが
できる。また、マーカー遺伝子は、外来遺伝子を含むベ
クターとは別個のベクターに組み込んでもよい。
れたシイタケ形質転換菌糸又は子実体の選択をより効率
的にするために、プロモーター及びターミネーターの間
にマーカー遺伝子を挿入しておくのが好ましい。このよ
うなマーカー遺伝子としては、特に限定されず、公知の
いかなるマーカー遺伝子をも用いることができる。例え
ば、抗生物質ハイグロマイシンＢに対する抵抗性を形質
転換体に付与するハイグロマイシンＢホスホトランスフ
ェラーゼ(Hygromycin B phospho transferase（hph）)
遺伝子、ビアラホスに対する抵抗性を付与するホスフィ
ノチリシンアセチルトランスフェラーゼ(Phosphinothri
cin acetyl transferase（bar）)遺伝子等から選ばれる
1つ以上の遺伝子をマーカー遺伝子として用いることが
できる。また、マーカー遺伝子は、外来遺伝子を含むベ
クターとは別個のベクターに組み込んでもよい。
【００１３】本発明に用いるベクターの構築は、公知の
方法に従って行なうことができる。本発明のベクターの
構築に用いることができるベクターは、特に限定されず
公知のいかなるベクターであってもよい。例えば、市販
のpUC系ベクター等を本発明のベクターの構築に用いる
ことができる。本発明に用いるベクター中のシイタケ発
現ユニット以外の塩基配列を切断する制限酵素とは、ベ
クター中のシイタケ発現ユニットの塩基配列は切断せ
ず、ベクター中のシイタケ発現ユニット以外の塩基配列
を少なくとも１箇所切断することができるものであれ
ば、特に限定されず、いかなる制限酵素であってもよ
い。ここで、本発明における「ベクター中のシイタケ発
現ユニット」とは、ベクター中のプロモーターからター
ミネーターまでの領域を意味する。
方法に従って行なうことができる。本発明のベクターの
構築に用いることができるベクターは、特に限定されず
公知のいかなるベクターであってもよい。例えば、市販
のpUC系ベクター等を本発明のベクターの構築に用いる
ことができる。本発明に用いるベクター中のシイタケ発
現ユニット以外の塩基配列を切断する制限酵素とは、ベ
クター中のシイタケ発現ユニットの塩基配列は切断せ
ず、ベクター中のシイタケ発現ユニット以外の塩基配列
を少なくとも１箇所切断することができるものであれ
ば、特に限定されず、いかなる制限酵素であってもよ
い。ここで、本発明における「ベクター中のシイタケ発
現ユニット」とは、ベクター中のプロモーターからター
ミネーターまでの領域を意味する。
【００１４】本発明に用いる制限酵素の量は、シイタケ
プロトプラストの量やベクターの量に応じて適宜選択す
ることができる。本発明のポリエチレングリコール処理
は、常法に従って行なうことができる。例えば、シイタ
ケ菌糸から調製したプロトプラストを外来遺伝子を含む
ベクターとともに緩衝液に懸濁し、これに上記制限酵素
及びポリエチレングリコール溶液を加えることによりポ
リエチレングリコール処理を行なうことができる。ポリ
エチレングリコール処理の温度は、通常、低温（例えば
on ice）又は室温とすることができ、ポリエチレングリ
コール処理の時間は、通常、5〜45分間とすることがで
きる。
プロトプラストの量やベクターの量に応じて適宜選択す
ることができる。本発明のポリエチレングリコール処理
は、常法に従って行なうことができる。例えば、シイタ
ケ菌糸から調製したプロトプラストを外来遺伝子を含む
ベクターとともに緩衝液に懸濁し、これに上記制限酵素
及びポリエチレングリコール溶液を加えることによりポ
リエチレングリコール処理を行なうことができる。ポリ
エチレングリコール処理の温度は、通常、低温（例えば
on ice）又は室温とすることができ、ポリエチレングリ
コール処理の時間は、通常、5〜45分間とすることがで
きる。
【００１５】本発明においては、特に、ポリエチレング
リコール処理を、低温下で行なった後、シイタケプロト
プラストが成長増殖できる温度下で行なうことが望まし
い。本発明における低温とは、室温より低い温度をい
う。好ましい低温としては0〜15℃の範囲を例示でき、
特に好ましい低温としては０℃を例示することができ
る。低温下で行なうポリエチレングリコール処理の時間
は、5〜45分間程度とすることができる。
リコール処理を、低温下で行なった後、シイタケプロト
プラストが成長増殖できる温度下で行なうことが望まし
い。本発明における低温とは、室温より低い温度をい
う。好ましい低温としては0〜15℃の範囲を例示でき、
特に好ましい低温としては０℃を例示することができ
る。低温下で行なうポリエチレングリコール処理の時間
は、5〜45分間程度とすることができる。
【００１６】また、本発明におけるシイタケプロトプラ
ストが成長増殖できる温度とは、シイタケプロトプラス
トが成長増殖できる限り特に限定されない。このような
温度は、通常、10〜30℃とすることができるが、特に25
℃とするのが好ましい。シイタケプロトプラストが成長
増殖できる温度下で行なうポリエチレングリコール処理
の時間は、5〜30分間程度とすることができる。
ストが成長増殖できる温度とは、シイタケプロトプラス
トが成長増殖できる限り特に限定されない。このような
温度は、通常、10〜30℃とすることができるが、特に25
℃とするのが好ましい。シイタケプロトプラストが成長
増殖できる温度下で行なうポリエチレングリコール処理
の時間は、5〜30分間程度とすることができる。
【００１７】シイタケプロトプラストが成長増殖できる
温度下で行なうポリエチレングリコール処理は、通常、
低温下で行なうポリエチレングリコール処理に用いるポ
リエチレングリコール溶液に、さらにポリエチレングリ
コール溶液を加えて行なう。本発明のポリエチレングリ
コール処理により、外来遺伝子を含むベクターをシイタ
ケプロトプラストに導入することができる。シイタケ形
質転換菌糸又は子実体は、ポリエチレングリコール処理
したシイタケプロトプラストから、例えば次のようにし
て得ることができる。
温度下で行なうポリエチレングリコール処理は、通常、
低温下で行なうポリエチレングリコール処理に用いるポ
リエチレングリコール溶液に、さらにポリエチレングリ
コール溶液を加えて行なう。本発明のポリエチレングリ
コール処理により、外来遺伝子を含むベクターをシイタ
ケプロトプラストに導入することができる。シイタケ形
質転換菌糸又は子実体は、ポリエチレングリコール処理
したシイタケプロトプラストから、例えば次のようにし
て得ることができる。
【００１８】すなわち、ポリエチレングリコール処理し
たプロトプラストを3〜4日間、栄養培地で培養し、シイ
タケ菌糸を得る。得られるシイタケ菌糸の中から、PCR
法、サザンブロット解析、酵素活性試験等の公知の分子
生物学的及び生化学的試験法を用いて外来遺伝子又はそ
の発現産物を解析することにより、シイタケ形質転換菌
糸の選択を行なうことができる。また、マーカー遺伝子
を含むベクターを用いる場合には、得られるシイタケ菌
糸を選択培地で培養することによりシイタケ形質転換菌
糸を選択することができる。その後、得られるシイタケ
形質転換菌糸が１核菌糸株であるか、２核菌糸株である
かを確認し、１核菌糸株である場合には交配により２核
菌糸株にする。そして、２核菌糸株を用いて通常の菌床
法により15〜25℃で約3ヶ月間培養し、低温処理後、シ
イタケ形質転換子実体を形成させることができる。菌床
培地としては、例えば、シイタケ栽培で通常用いられる
広葉樹を主体としたオガ粉、米糠、ふすま、トウモロコ
シ糠などに水を加えて殺菌したものを用いることができ
る。シイタケ形質転換菌糸又は子実体中の外来遺伝子の
存在の確認は、PCR法、サザンブロット解析、酵素活性
試験等を含む分子生物学的及び生化学的試験法により行
なうことができる。
たプロトプラストを3〜4日間、栄養培地で培養し、シイ
タケ菌糸を得る。得られるシイタケ菌糸の中から、PCR
法、サザンブロット解析、酵素活性試験等の公知の分子
生物学的及び生化学的試験法を用いて外来遺伝子又はそ
の発現産物を解析することにより、シイタケ形質転換菌
糸の選択を行なうことができる。また、マーカー遺伝子
を含むベクターを用いる場合には、得られるシイタケ菌
糸を選択培地で培養することによりシイタケ形質転換菌
糸を選択することができる。その後、得られるシイタケ
形質転換菌糸が１核菌糸株であるか、２核菌糸株である
かを確認し、１核菌糸株である場合には交配により２核
菌糸株にする。そして、２核菌糸株を用いて通常の菌床
法により15〜25℃で約3ヶ月間培養し、低温処理後、シ
イタケ形質転換子実体を形成させることができる。菌床
培地としては、例えば、シイタケ栽培で通常用いられる
広葉樹を主体としたオガ粉、米糠、ふすま、トウモロコ
シ糠などに水を加えて殺菌したものを用いることができ
る。シイタケ形質転換菌糸又は子実体中の外来遺伝子の
存在の確認は、PCR法、サザンブロット解析、酵素活性
試験等を含む分子生物学的及び生化学的試験法により行
なうことができる。
【００１９】
【実施例】以下に実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、これにより本発明の範囲を制限するものでな
い。 〔実施例１〕 形質転換シイタケ菌糸の作出 （１）シイタケ菌糸からのプロトプラストの調製 MYPG（malt extract 0.4%, yeast extract 0.4%, pepto
ne 0.4%, glucose 1%)寒天（1.5〜2%）培地（φ9cmシャ
ーレで４プレート分）で、25℃２週間培養した菌糸をか
きとり、50 ml のMYPG液体培地で１週間培養した。得ら
れた菌糸をガラスフィルターで集菌し、50mlのMYPG液体
培地に懸濁してポリトロンホモジナイザーで裁断した。
これを100μmのナイロンメッシュで濾過し、濾過菌糸を
さらに25℃で５日間培養した。培養菌糸は100μmのナイ
ロンメッシュで集菌後、クエン酸緩衝液（0.6 M mannit
olを含む50mM succinate buffer、pH5.6）で２回洗浄
し、酵素溶液（2.5% Cellulase and 0.1% Chitinaseを
含むクエン酸緩衝液）に１g wet mycelia/10 ml になる
ように懸濁させて、28-30℃でインキュベートした。３
〜４時間後、40μmのナイロンメッシュで濾過し、濾液
を遠心分離してプロトプラストを沈殿させた。上清を捨
て、STC 緩衝液（10mM CaCl2と1.2M Sorbitolを含む10m
M Tris-HCl、pH7.5）を加えて洗浄し、遠心分離してプ
ロトプラストを集めた。得られた沈殿に１mlのSTC 緩衝
液を加えてプロトプラストを懸濁させ、顕微鏡でプロト
プラストの数を計測した。最終的には 0.5-1.0× 107
プロトプラスト／100μl STC 緩衝液に調整して、形質
転換用のプロトプラストとした。
明するが、これにより本発明の範囲を制限するものでな
い。 〔実施例１〕 形質転換シイタケ菌糸の作出 （１）シイタケ菌糸からのプロトプラストの調製 MYPG（malt extract 0.4%, yeast extract 0.4%, pepto
ne 0.4%, glucose 1%)寒天（1.5〜2%）培地（φ9cmシャ
ーレで４プレート分）で、25℃２週間培養した菌糸をか
きとり、50 ml のMYPG液体培地で１週間培養した。得ら
れた菌糸をガラスフィルターで集菌し、50mlのMYPG液体
培地に懸濁してポリトロンホモジナイザーで裁断した。
これを100μmのナイロンメッシュで濾過し、濾過菌糸を
さらに25℃で５日間培養した。培養菌糸は100μmのナイ
ロンメッシュで集菌後、クエン酸緩衝液（0.6 M mannit
olを含む50mM succinate buffer、pH5.6）で２回洗浄
し、酵素溶液（2.5% Cellulase and 0.1% Chitinaseを
含むクエン酸緩衝液）に１g wet mycelia/10 ml になる
ように懸濁させて、28-30℃でインキュベートした。３
〜４時間後、40μmのナイロンメッシュで濾過し、濾液
を遠心分離してプロトプラストを沈殿させた。上清を捨
て、STC 緩衝液（10mM CaCl2と1.2M Sorbitolを含む10m
M Tris-HCl、pH7.5）を加えて洗浄し、遠心分離してプ
ロトプラストを集めた。得られた沈殿に１mlのSTC 緩衝
液を加えてプロトプラストを懸濁させ、顕微鏡でプロト
プラストの数を計測した。最終的には 0.5-1.0× 107
プロトプラスト／100μl STC 緩衝液に調整して、形質
転換用のプロトプラストとした。
【００２０】（２）ベクターの構築 ベクターとしては、先にYanaiら（Koji Yanaiら., Bios
ci. Biotech. Biochem., 60, 472-475, 1996）の開発し
た pLC-barの薬剤耐性遺伝子（bar 遺伝子）をハイグロ
マイシンＢ耐性遺伝子（hph）に交換したものを用い
た。この pLC-hphは、シイタケから得られた ras遺伝子
のプロモーター領域と priA 遺伝子のターミネーター領
域を有している（図１）。
ci. Biotech. Biochem., 60, 472-475, 1996）の開発し
た pLC-barの薬剤耐性遺伝子（bar 遺伝子）をハイグロ
マイシンＢ耐性遺伝子（hph）に交換したものを用い
た。この pLC-hphは、シイタケから得られた ras遺伝子
のプロモーター領域と priA 遺伝子のターミネーター領
域を有している（図１）。
【００２１】（３）遺伝子導入 2.5μgの pLC-hphと50ユニットの SalIとを含む150μl
の STC緩衝液に上記のプロトプラスト懸濁液100μl を
加え、0 ℃で20分間インキュベートした。これに 62.5
μl のポリエチレングリコール(以下「PEG」という）溶
液（10mM CaCl2と60% PEG4000を含む10mM Tris-HCl、pH
7.5）を加え、さらに0 ℃で20分間インキュベートし
た。その後、これに3.125 mlのPEG 溶液を加えて、室温
で20分間インキュベートした。次に 10 mlの STC緩衝液
を加えてプロトプラストを遠心分離し、上清を捨てた。
プロトプラストを４mlのMS（malt extract 2%, 0.6 M s
ucrose）液体培地に懸濁させ、25℃で3-4日間インキュ
ベートした。
の STC緩衝液に上記のプロトプラスト懸濁液100μl を
加え、0 ℃で20分間インキュベートした。これに 62.5
μl のポリエチレングリコール(以下「PEG」という）溶
液（10mM CaCl2と60% PEG4000を含む10mM Tris-HCl、pH
7.5）を加え、さらに0 ℃で20分間インキュベートし
た。その後、これに3.125 mlのPEG 溶液を加えて、室温
で20分間インキュベートした。次に 10 mlの STC緩衝液
を加えてプロトプラストを遠心分離し、上清を捨てた。
プロトプラストを４mlのMS（malt extract 2%, 0.6 M s
ucrose）液体培地に懸濁させ、25℃で3-4日間インキュ
ベートした。
【００２２】（４）Hygromycin B耐性菌糸の選抜 上記によって得られた MS 液体培地に懸濁させたプロト
プラストを遠心分離し、少量のMS液体培地に再懸濁させ
た。このプロトプラストを、 5μg/ml hygromycin Bを
含む最小寒天培地（2g glucose, 0.2g ammonium tartra
te, 0.05g MgSO4-7H2O, 0.1g KH2PO4, 0.112g Na2CO3,
0.132g fumaric acid, 12.5μg thiamine-HCl, 1mg FeS
O4−7H2O, 0.88mg ZnSO4−7H2O, 0.72mg MnCl2−4H2O／
0.1L、pH4.5、1.5％寒天）にまき、 25 ℃でインキュベ
ートした。約５日間培養後、 20μg/ml hygromycin Bを
含む MYPG 寒天（1.5%）培地を重層した。25℃で約５日
間培養後、増殖してきたコロニーを分離し、新しい 20
μg/ml hygromycin B を含むMYPG寒天培地に植え替え
た。さらに１週間程度培養し、増殖してきたコロニーを
新しい20μg/ml hygromycin B を含むMYPG寒天培地に植
え替えて培養した。以上の方法により、約 15 形質転換
体／2.5μg DNA の耐性株を得ることができた。
プラストを遠心分離し、少量のMS液体培地に再懸濁させ
た。このプロトプラストを、 5μg/ml hygromycin Bを
含む最小寒天培地（2g glucose, 0.2g ammonium tartra
te, 0.05g MgSO4-7H2O, 0.1g KH2PO4, 0.112g Na2CO3,
0.132g fumaric acid, 12.5μg thiamine-HCl, 1mg FeS
O4−7H2O, 0.88mg ZnSO4−7H2O, 0.72mg MnCl2−4H2O／
0.1L、pH4.5、1.5％寒天）にまき、 25 ℃でインキュベ
ートした。約５日間培養後、 20μg/ml hygromycin Bを
含む MYPG 寒天（1.5%）培地を重層した。25℃で約５日
間培養後、増殖してきたコロニーを分離し、新しい 20
μg/ml hygromycin B を含むMYPG寒天培地に植え替え
た。さらに１週間程度培養し、増殖してきたコロニーを
新しい20μg/ml hygromycin B を含むMYPG寒天培地に植
え替えて培養した。以上の方法により、約 15 形質転換
体／2.5μg DNA の耐性株を得ることができた。
【００２３】（５）遺伝子導入の確認 上記の方法によって得られたシイタケ菌糸を再度MYPG寒
天培地で増殖させた後、適当量のMYPG液体培地で７日間
以上培養して、菌糸を集め、常法に従って PCR、サザン
ブロット解析を行い、導入遺伝子 hphを確認した（図２
及び３）。
天培地で増殖させた後、適当量のMYPG液体培地で７日間
以上培養して、菌糸を集め、常法に従って PCR、サザン
ブロット解析を行い、導入遺伝子 hphを確認した（図２
及び３）。
【００２４】〔実施例２〕 制限酵素添加効果 （１）プロトプラストの調製 実施例１の（１）と同様の方法を実施し、プロトプラス
トを調製した。 （２）ベクターの構築 実施例１の（２）と同様の方法を実施し、ベクターpLC-
hphを構築した。
トを調製した。 （２）ベクターの構築 実施例１の（２）と同様の方法を実施し、ベクターpLC-
hphを構築した。
【００２５】（３）遺伝子導入 実施例１の（３）において、制限酵素を添加しない場
合、制限酵素 SalI を添加した場合、また pLC-hphのシ
イタケ発現ユニットの内部で２箇所切断する BamHIを添
加した場合について実施例１と全く同一の方法で遺伝子
導入を行った。
合、制限酵素 SalI を添加した場合、また pLC-hphのシ
イタケ発現ユニットの内部で２箇所切断する BamHIを添
加した場合について実施例１と全く同一の方法で遺伝子
導入を行った。
【００２６】（４）Hygromycin B耐性菌糸株の選抜 実施例１の（４）と全く同じ方法で Hygromycin B 耐性
菌糸株の選抜を行った。その結果、制限酵素を添加しな
いで遺伝子導入を行った場合には、形質転換効率が2形
質転換体／2.5μg DNA となった（図４）。制限酵素 Sa
lI を添加して遺伝子導入を行った場合には、50unitsの
添加量が最も形質転換効率が高く、16形質転換体／2.5
μg DNA であった（図４）。この場合、添加量が多くな
るにつれて形質転換効率は低下し、600units添加では形
質転換体が得られなかった（図４）。一方、 pLC-hphの
シイタケ発現ユニットの内部で２箇所切断する BamHIを
添加した場合は、全く形質転換体が得られなかった（図
４）。このことは、シイタケ発現ユニット以外で切断す
る制限酵素が有効であることを示している。このように
発現ベクターのプロモーターの直前を切断する制限酵素
を添加することにより、約８倍形質転換効率を上昇する
ことが認められた。
菌糸株の選抜を行った。その結果、制限酵素を添加しな
いで遺伝子導入を行った場合には、形質転換効率が2形
質転換体／2.5μg DNA となった（図４）。制限酵素 Sa
lI を添加して遺伝子導入を行った場合には、50unitsの
添加量が最も形質転換効率が高く、16形質転換体／2.5
μg DNA であった（図４）。この場合、添加量が多くな
るにつれて形質転換効率は低下し、600units添加では形
質転換体が得られなかった（図４）。一方、 pLC-hphの
シイタケ発現ユニットの内部で２箇所切断する BamHIを
添加した場合は、全く形質転換体が得られなかった（図
４）。このことは、シイタケ発現ユニット以外で切断す
る制限酵素が有効であることを示している。このように
発現ベクターのプロモーターの直前を切断する制限酵素
を添加することにより、約８倍形質転換効率を上昇する
ことが認められた。
【００２７】〔実施例３〕 PEG 処理の実施 （１）プロトプラストの調製 実施例１の（１）と同様の方法を実施し、プロトプラス
トを調製した。 （２）ベクターの構築 実施例１の（２）と同様の方法を実施し、ベクターpLC-
hphを構築した。
トを調製した。 （２）ベクターの構築 実施例１の（２）と同様の方法を実施し、ベクターpLC-
hphを構築した。
【００２８】（３）遺伝子導入 実施例１の遺伝子導入方法のPEG処理において、低温処
理をせずに、シイタケプロトプラストが成長増殖できる
範囲の温度（15-30℃）で１回だけPEG処理して遺伝子導
入を行った。比較例として、実施例１と全く同一の方法
でPEG 処理を２回実施した。
理をせずに、シイタケプロトプラストが成長増殖できる
範囲の温度（15-30℃）で１回だけPEG処理して遺伝子導
入を行った。比較例として、実施例１と全く同一の方法
でPEG 処理を２回実施した。
【００２９】（４）Hygromycin B耐性菌糸株の選抜 PEG処理回数１回及び２回の両者とも、実施例１の方法
と全く同じ方法でHygromycin B耐性菌糸株の選抜を実施
した。その結果、PEG 処理回数１回では、 6形質転換体
／2.5μg DNA の形質転換株が得られたのに対し、PEG
処理回数２回では、14形質転換体／2.5μg DNAの形質転
換株が得られた（図５）。このように PEG処理を低温処
理とシイタケプロトプラストが成長増殖できる温度域と
の２回に分けて実施することにより形質転換効率が２倍
以上上昇することが認められた。
と全く同じ方法でHygromycin B耐性菌糸株の選抜を実施
した。その結果、PEG 処理回数１回では、 6形質転換体
／2.5μg DNA の形質転換株が得られたのに対し、PEG
処理回数２回では、14形質転換体／2.5μg DNAの形質転
換株が得られた（図５）。このように PEG処理を低温処
理とシイタケプロトプラストが成長増殖できる温度域と
の２回に分けて実施することにより形質転換効率が２倍
以上上昇することが認められた。
【００３０】導入に用いるベクターは、ここではシイタ
ケ ras遺伝子のプロモーター領域とシイタケ PriA 遺伝
子ターミネーター領域の間にハイグロマイシンＢ耐性遺
伝子を含むDNA （pLC-hph）を用いているが、シイタケ
で発現しうるものであればなんら限定されるものではな
い。
ケ ras遺伝子のプロモーター領域とシイタケ PriA 遺伝
子ターミネーター領域の間にハイグロマイシンＢ耐性遺
伝子を含むDNA （pLC-hph）を用いているが、シイタケ
で発現しうるものであればなんら限定されるものではな
い。
【００３１】
【発明の効果】本発明によれば、シイタケを効率よく形
質転換することができる。
質転換することができる。
【図１】pLC−hphの模式図である。
【図２】hph遺伝子のPCR増幅断片の電気泳動写真であ
る。
る。
【図３】hph遺伝子のサザンブロッティングの結果を表
す写真である。
す写真である。
【図４】シイタケの形質転換における制限酵素の添加効
果を表す図である。
果を表す図である。
【図５】シイタケの形質転換におけるポリエチレングリ
コール処理の影響を表す図である。
コール処理の影響を表す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年１２月１０日
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 石井 静子 千葉県木更津市矢那4508−19 Ｏ−ＦＬ ＡＴＳ202号 (72)発明者 平野 達也 岩手県北上市諏訪町１−３−27 諏訪町壱 番 街Ａ206 (72)発明者 梶原 将 東京都世田谷区上野毛１−21−14−101 (72)発明者 宍戸 和夫 神奈川県相模原市すすきの町５−６
Claims (2)
- 【請求項１】 ポリエチレングリコール処理により外来
遺伝子を含むベクターをシイタケプロトプラストに導入
してシイタケを形質転換する方法において、ポリエチレ
ングリコール処理を、ベクター中のシイタケ発現ユニッ
ト以外の塩基配列を切断する制限酵素の存在下で行なう
ことを特徴とするシイタケの形質転換方法。 - 【請求項２】 前記ポリエチレングリコール処理を、低
温下で行なった後、シイタケプロトプラストが成長増殖
できる温度下で行なうことを特徴とする、請求項１記載
の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33161197A JPH11155568A (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | シイタケ形質転換方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP33161197A JPH11155568A (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | シイタケ形質転換方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11155568A true JPH11155568A (ja) | 1999-06-15 |
Family
ID=18245599
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33161197A Pending JPH11155568A (ja) | 1997-12-02 | 1997-12-02 | シイタケ形質転換方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11155568A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007312618A (ja) * | 2006-05-23 | 2007-12-06 | Iwate Prefecture | シイタケの保存過程で発現する細胞壁分解酵素関連遺伝子群、及びその利用方法 |
| CN103598087A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-02-26 | 鲁东大学 | 一种猪肚菇低温型菌株选育方法 |
| JP2015155545A (ja) * | 2000-03-02 | 2015-08-27 | シー・ピー・ケルコ・ユー・エス・インコーポレイテツド | ポリヒドロキシ酪酸産生欠失スフィンゴモナス属の細菌変異株およびスフィンガンの清澄化方法 |
-
1997
- 1997-12-02 JP JP33161197A patent/JPH11155568A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2015155545A (ja) * | 2000-03-02 | 2015-08-27 | シー・ピー・ケルコ・ユー・エス・インコーポレイテツド | ポリヒドロキシ酪酸産生欠失スフィンゴモナス属の細菌変異株およびスフィンガンの清澄化方法 |
| JP2007312618A (ja) * | 2006-05-23 | 2007-12-06 | Iwate Prefecture | シイタケの保存過程で発現する細胞壁分解酵素関連遺伝子群、及びその利用方法 |
| CN103598087A (zh) * | 2013-11-05 | 2014-02-26 | 鲁东大学 | 一种猪肚菇低温型菌株选育方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041115 |
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| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20080122 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
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| A02 | Decision of refusal |
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