JPH11168A - 呼吸沈渣からのマイコバクテリア及びマイコバクテリアｄｎａの効率的回収のためのアルコール−塩緩衝剤洗浄の使用 - Google Patents
呼吸沈渣からのマイコバクテリア及びマイコバクテリアｄｎａの効率的回収のためのアルコール−塩緩衝剤洗浄の使用Info
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- JPH11168A JPH11168A JP10046628A JP4662898A JPH11168A JP H11168 A JPH11168 A JP H11168A JP 10046628 A JP10046628 A JP 10046628A JP 4662898 A JP4662898 A JP 4662898A JP H11168 A JPH11168 A JP H11168A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 粘性生物学的試料から細菌を濃縮する方法を
提供する。 【解決手段】 該方法は、0.7 〜0.9 g/mlの密度を有し
且つ50℃より高い沸点を有する水溶性密度降下剤を前記
試料に添加することを含んで成る。生物学的試料から細
菌と遊離の細菌核酸を濃縮する方法も提供し、該方法は
前記試料を密度粘度降下剤および一価の塩と一緒に混合
することを含んで成る。
提供する。 【解決手段】 該方法は、0.7 〜0.9 g/mlの密度を有し
且つ50℃より高い沸点を有する水溶性密度降下剤を前記
試料に添加することを含んで成る。生物学的試料から細
菌と遊離の細菌核酸を濃縮する方法も提供し、該方法は
前記試料を密度粘度降下剤および一価の塩と一緒に混合
することを含んで成る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物学的試料から
の細菌および遊離細菌核酸の濃縮および回収方法に関す
る。特に、本発明は、その後の核酸分析と適合できる方
法でマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobact
erium tuberculosis；ヒト結核菌）を濃縮する方法に関
する。
の細菌および遊離細菌核酸の濃縮および回収方法に関す
る。特に、本発明は、その後の核酸分析と適合できる方
法でマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobact
erium tuberculosis；ヒト結核菌）を濃縮する方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトの結核の原因物質であるマイコバク
テリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tubercul
osis；ヒト結核菌；Mtb ）は、従来、時間のかかる微生
物培養により同定されている。マイコバクテリア培養に
付される臨床試料は、より迅速に増殖する別の微生物に
よってしばしば汚染される。それらの試料、典型的には
喀痰または他の呼吸試料は、粘性有機物質を液化しそし
て不要な生物を除去するために消化−汚染除去工程にか
けなければならない。この消化−汚染除去工程に使われ
る最も一般的な試薬はＮ−アセチル−Ｌ−システイン−
水酸化ナトリウム（NALC−NaOH）、水酸化ナトリウム−
ドデシル硫酸ナトリウム（NaOH−SDS ）または単独のNa
OHである。典型的な消化−汚染除去プロトコールは、呼
吸試料を上記試薬のうちの１つと共にインキュベート
し、緩衝液または水で希釈することによって該混合物の
ｐＨを下げ、そして該混合物を遠心してマイコバクテリ
アをペレットに濃縮することを含む。上清の一部をデカ
ンテーションし、残った上澄液または緩衝液中にペレッ
トを再懸濁する。こうして得られた懸濁液は「呼吸沈
渣」と呼ばれる。
テリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tubercul
osis；ヒト結核菌；Mtb ）は、従来、時間のかかる微生
物培養により同定されている。マイコバクテリア培養に
付される臨床試料は、より迅速に増殖する別の微生物に
よってしばしば汚染される。それらの試料、典型的には
喀痰または他の呼吸試料は、粘性有機物質を液化しそし
て不要な生物を除去するために消化−汚染除去工程にか
けなければならない。この消化−汚染除去工程に使われ
る最も一般的な試薬はＮ−アセチル−Ｌ−システイン−
水酸化ナトリウム（NALC−NaOH）、水酸化ナトリウム−
ドデシル硫酸ナトリウム（NaOH−SDS ）または単独のNa
OHである。典型的な消化−汚染除去プロトコールは、呼
吸試料を上記試薬のうちの１つと共にインキュベート
し、緩衝液または水で希釈することによって該混合物の
ｐＨを下げ、そして該混合物を遠心してマイコバクテリ
アをペレットに濃縮することを含む。上清の一部をデカ
ンテーションし、残った上澄液または緩衝液中にペレッ
トを再懸濁する。こうして得られた懸濁液は「呼吸沈
渣」と呼ばれる。
【０００３】呼吸沈渣は培養に適する一方、核酸増幅、
制限消化および核酸配列決定といった核酸分析には不適
当である。核酸分析を行う前に、呼吸沈渣から消化−汚
染除去試薬を除去することが必要である。何故なら、そ
れらの試薬は核酸分析を妨害するからである。核酸検出
の確度を高めるために、核酸分析の前に低マイコバクテ
リア力価を有する沈渣試料からマイコバクテリアを更に
濃縮することも有用である。
制限消化および核酸配列決定といった核酸分析には不適
当である。核酸分析を行う前に、呼吸沈渣から消化−汚
染除去試薬を除去することが必要である。何故なら、そ
れらの試薬は核酸分析を妨害するからである。核酸検出
の確度を高めるために、核酸分析の前に低マイコバクテ
リア力価を有する沈渣試料からマイコバクテリアを更に
濃縮することも有用である。
【０００４】本発明より前に、当業者らは試料を水性溶
液中に希釈し、更に遠心してマイコバクテリアをペレッ
トにし、そして消化−汚染除去試薬を含む上澄液を捨て
ることにより、消化−汚染除去試薬の混入および低い細
菌濃度という課題を解決しようと試みている。例えば、
Beavis他〔J. Clin. Microbiol., 33, 2582-2586 (199
5) 〕は、Tris-HClと１％可溶化剤を含む検体洗浄試薬
500μL と呼吸沈渣 100μL とを混合する方法を用いて
いる。12,500×ｇでの10分間の遠心により混合物からマ
イコバクテリアをペレット化している。（Roche Molecu
lar Systems. 1994. Roche Amplicor Mycobacterium tu
berculosis test insert, Roche Molecular Systems, B
ranchburg, NJ も参照のこと。）
液中に希釈し、更に遠心してマイコバクテリアをペレッ
トにし、そして消化−汚染除去試薬を含む上澄液を捨て
ることにより、消化−汚染除去試薬の混入および低い細
菌濃度という課題を解決しようと試みている。例えば、
Beavis他〔J. Clin. Microbiol., 33, 2582-2586 (199
5) 〕は、Tris-HClと１％可溶化剤を含む検体洗浄試薬
500μL と呼吸沈渣 100μL とを混合する方法を用いて
いる。12,500×ｇでの10分間の遠心により混合物からマ
イコバクテリアをペレット化している。（Roche Molecu
lar Systems. 1994. Roche Amplicor Mycobacterium tu
berculosis test insert, Roche Molecular Systems, B
ranchburg, NJ も参照のこと。）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、そのよ
うな方法には制限がある。洗浄緩衝液の添加が容量を５
倍も増やすため、それらの方法は大量の試料容量からの
細菌の濃縮には特に適さない。その上、マイコバクテリ
アは非常に浮遊性であり、水性培地からペレット化する
のが難しいため、そのような方法は制限される。よっ
て、Beavis他が使用したような水または水性緩衝液中で
の遠心は標的生物のかなりの損失を引き起こし得る。加
えて、呼吸沈渣中の遊離のマイコバクテリア核酸は水性
培地中での遠心操作の間にペレット化しない。新鮮試料
の消化と汚染除去により、および貯蔵後の呼吸沈渣の凍
結と解凍によって起こる溶菌の間に核酸が放出され得る
ので、呼吸沈渣には遊離核酸が存在する。
うな方法には制限がある。洗浄緩衝液の添加が容量を５
倍も増やすため、それらの方法は大量の試料容量からの
細菌の濃縮には特に適さない。その上、マイコバクテリ
アは非常に浮遊性であり、水性培地からペレット化する
のが難しいため、そのような方法は制限される。よっ
て、Beavis他が使用したような水または水性緩衝液中で
の遠心は標的生物のかなりの損失を引き起こし得る。加
えて、呼吸沈渣中の遊離のマイコバクテリア核酸は水性
培地中での遠心操作の間にペレット化しない。新鮮試料
の消化と汚染除去により、および貯蔵後の呼吸沈渣の凍
結と解凍によって起こる溶菌の間に核酸が放出され得る
ので、呼吸沈渣には遊離核酸が存在する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、粘性生物学的
試料から、Ｍ．ツベルクローシス（ヒト結核菌）をはじ
めとする細菌を濃縮する方法を提供することにより、こ
れらの課題を解決する。本発明はまた、生物学的試料中
に存在する細菌だけでなく遊離の細菌核酸も濃縮する方
法を提供する。本発明の方法に従って処理された試料
は、その後の核酸分析に使用することができる。
試料から、Ｍ．ツベルクローシス（ヒト結核菌）をはじ
めとする細菌を濃縮する方法を提供することにより、こ
れらの課題を解決する。本発明はまた、生物学的試料中
に存在する細菌だけでなく遊離の細菌核酸も濃縮する方
法を提供する。本発明の方法に従って処理された試料
は、その後の核酸分析に使用することができる。
【０００７】よって、本発明の目的は、試料から消化−
汚染除去試薬を除去する細菌の濃縮および処理方法を提
供することである。本発明の別の目的は、生物学的試料
中に存在する細菌と任意の遊離細菌ＤＮＡを同時に回収
することである。
汚染除去試薬を除去する細菌の濃縮および処理方法を提
供することである。本発明の別の目的は、生物学的試料
中に存在する細菌と任意の遊離細菌ＤＮＡを同時に回収
することである。
【０００８】意外にも、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃
より高い沸点を有する水混和性密度降下剤を使って生物
学的試料から細菌を濃縮できることを発見した。そのよ
うな密度降下剤を一価の塩、例えば酢酸ナトリウムと併
用して、標的細菌の密度より高い密度を有する生物学的
試料から完全細菌および細菌ＤＮＡを回収することがで
きることも発見した。
より高い沸点を有する水混和性密度降下剤を使って生物
学的試料から細菌を濃縮できることを発見した。そのよ
うな密度降下剤を一価の塩、例えば酢酸ナトリウムと併
用して、標的細菌の密度より高い密度を有する生物学的
試料から完全細菌および細菌ＤＮＡを回収することがで
きることも発見した。
【０００９】
【発明の実施の形態】一態様では、本発明は、粘性生物
学的試料からの細菌の濃縮方法に関する。この方法は、
前記試料の密度を細菌の密度より下に下げるのに十分な
量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点を有
する水溶性密度降下剤を前記試料に添加し、そして前記
試料を遠心して、試料中に存在する任意の細菌をペレッ
ト化することを含んで成る。
学的試料からの細菌の濃縮方法に関する。この方法は、
前記試料の密度を細菌の密度より下に下げるのに十分な
量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点を有
する水溶性密度降下剤を前記試料に添加し、そして前記
試料を遠心して、試料中に存在する任意の細菌をペレッ
ト化することを含んで成る。
【００１０】別の態様では、本発明は、生物学的試料か
らの細菌と細菌核酸の濃縮方法に関する。この方法は、
前記試料の密度を前記細菌の密度より下に下げるのに十
分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点
を有する水溶性密度降下剤、および前記遊離細菌核酸を
沈澱させるのに十分な量で一価の塩を前記試料に添加す
ることを含んで成る。次いで、前記試料を遠心して、試
料中に存在する細菌および遊離細菌核酸をペレット化す
る。
らの細菌と細菌核酸の濃縮方法に関する。この方法は、
前記試料の密度を前記細菌の密度より下に下げるのに十
分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い沸点
を有する水溶性密度降下剤、および前記遊離細菌核酸を
沈澱させるのに十分な量で一価の塩を前記試料に添加す
ることを含んで成る。次いで、前記試料を遠心して、試
料中に存在する細菌および遊離細菌核酸をペレット化す
る。
【００１１】更なる態様では、本発明は、粘性生物学的
試料から細菌を濃縮し且つ同時に試料のｐＨを調整する
方法に関する。この方法は、前記試料の密度を前記細菌
の密度より下に下げるのに十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／
mlの密度と50℃より高い沸点を有する水溶性密度降下
剤、およびｐＨ緩衝剤を前記試料に添加することを含ん
で成る。次いで、前記試料を遠心して、前記試料中に存
在する細菌をペレット化する。
試料から細菌を濃縮し且つ同時に試料のｐＨを調整する
方法に関する。この方法は、前記試料の密度を前記細菌
の密度より下に下げるのに十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／
mlの密度と50℃より高い沸点を有する水溶性密度降下
剤、およびｐＨ緩衝剤を前記試料に添加することを含ん
で成る。次いで、前記試料を遠心して、前記試料中に存
在する細菌をペレット化する。
【００１２】本発明の様々な他の目的および利点は、発
明の具体的説明から明白であろう。本明細書中に言及さ
れる全ての刊行物は参考として組み込まれる。
明の具体的説明から明白であろう。本明細書中に言及さ
れる全ての刊行物は参考として組み込まれる。
【００１３】本発明は、核酸分析と適合できる、マイコ
バクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tube
rculosis；ヒト結核菌）のような細菌の検出および同定
のための試料の処理方法を提供する。本発明は様々な核
酸分析方法、例えば核酸増幅（例えばＰＣＲおよびリガ
ーゼ連鎖反応）、制限消化およびヌクレオチド配列決定
と適合できる。その理由は、試料の消化−汚染除去に使
われる阻害物質が効率的に除去されるからである。
バクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tube
rculosis；ヒト結核菌）のような細菌の検出および同定
のための試料の処理方法を提供する。本発明は様々な核
酸分析方法、例えば核酸増幅（例えばＰＣＲおよびリガ
ーゼ連鎖反応）、制限消化およびヌクレオチド配列決定
と適合できる。その理由は、試料の消化−汚染除去に使
われる阻害物質が効率的に除去されるからである。
【００１４】一態様では、本発明は粘性生物学的試料か
らの細菌の濃縮方法に関する。生物学的試料を水混和性
密度降下剤と混合し、次いで前記試料中に存在する細菌
をペレット化することにより、生物学的試料中に含まれ
る細菌を濃縮する。密度降下剤は生じた混合物の密度を
細菌の密度より下にまで下げ、それによって遠心分離に
よる細菌の回収率を高める。
らの細菌の濃縮方法に関する。生物学的試料を水混和性
密度降下剤と混合し、次いで前記試料中に存在する細菌
をペレット化することにより、生物学的試料中に含まれ
る細菌を濃縮する。密度降下剤は生じた混合物の密度を
細菌の密度より下にまで下げ、それによって遠心分離に
よる細菌の回収率を高める。
【００１５】本発明での使用に適する密度降下剤は、水
溶性であり、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度を有し、且つ50℃
より高い沸点を有する。そのような剤としては、非限定
的に、置換または無置換メチルアルコール、置換または
無置換エチルアルコール、置換または無置換プロピルア
ルコール、およびケトンが挙げられる。例えば、エタノ
ール、メタノール、メチルエチルケトン、２−ペンタノ
ール、３−ペンタノン、プロパノール、イソブチルアル
コール、２−プロパノール、tert−ブチルアルコール、
または２−プロパノンを本発明の密度降下剤として使用
することができる。好ましくは、密度降下剤は置換また
は無置換メチルアルコール、置換または無置換エチルア
ルコール、置換または無置換プロピルアルコールであ
る。より好ましくは、本発明の方法における密度降下剤
としてエタノールが使われる。
溶性であり、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度を有し、且つ50℃
より高い沸点を有する。そのような剤としては、非限定
的に、置換または無置換メチルアルコール、置換または
無置換エチルアルコール、置換または無置換プロピルア
ルコール、およびケトンが挙げられる。例えば、エタノ
ール、メタノール、メチルエチルケトン、２−ペンタノ
ール、３−ペンタノン、プロパノール、イソブチルアル
コール、２−プロパノール、tert−ブチルアルコール、
または２−プロパノンを本発明の密度降下剤として使用
することができる。好ましくは、密度降下剤は置換また
は無置換メチルアルコール、置換または無置換エチルア
ルコール、置換または無置換プロピルアルコールであ
る。より好ましくは、本発明の方法における密度降下剤
としてエタノールが使われる。
【００１６】密度降下剤は、標的細菌の密度より低い密
度にまで試料の密度を下げるのに十分な量で試料に添加
される。そのような量は当業者により容易に決定するこ
とができる。好ましくは、試料１容につき２〜６容の密
度降下剤が添加され；より好ましくは、試料１容につき
２〜2.5 容の密度降下剤が添加される。
度にまで試料の密度を下げるのに十分な量で試料に添加
される。そのような量は当業者により容易に決定するこ
とができる。好ましくは、試料１容につき２〜６容の密
度降下剤が添加され；より好ましくは、試料１容につき
２〜2.5 容の密度降下剤が添加される。
【００１７】別の態様では、本発明は、粘性生物学的試
料から細菌を濃縮し、且つ同時に試料のｐＨをその後の
分析に適合するレベルに調整する方法に関する。酢酸
塩、クエン酸塩またはトリス（Tris）のような緩衝剤を
密度降下剤と併用して12〜14のｐＨを有する痰沈渣試料
を洗浄することにより、ポリマー捕捉（pH 6.8）または
ＰＣＲ（pH 8.5）に適合するレベルにまでｐＨを下げる
ことができる。（ポリマー捕捉については、米国特許第
5,582,988 号、同第5,434,270 号および同第5,523,368
号明細書を参照のこと。）試料を水溶性密度降下剤およ
びｐＨ緩衝剤と混合することにより、生物学的試料中に
含まれる細菌を濃縮する。次いで該試料を遠心して、試
料中に存在する任意の細菌をペレット化する。
料から細菌を濃縮し、且つ同時に試料のｐＨをその後の
分析に適合するレベルに調整する方法に関する。酢酸
塩、クエン酸塩またはトリス（Tris）のような緩衝剤を
密度降下剤と併用して12〜14のｐＨを有する痰沈渣試料
を洗浄することにより、ポリマー捕捉（pH 6.8）または
ＰＣＲ（pH 8.5）に適合するレベルにまでｐＨを下げる
ことができる。（ポリマー捕捉については、米国特許第
5,582,988 号、同第5,434,270 号および同第5,523,368
号明細書を参照のこと。）試料を水溶性密度降下剤およ
びｐＨ緩衝剤と混合することにより、生物学的試料中に
含まれる細菌を濃縮する。次いで該試料を遠心して、試
料中に存在する任意の細菌をペレット化する。
【００１８】更なる態様では、本発明は、生物学的試料
からの細菌と遊離細菌核酸の濃縮方法に関する。細菌核
酸は、例えば貯蔵や凍結−解凍処理の間に細菌から遊離
され得る。試料中のこの遊離細菌ＤＮＡを、本発明を使
って濃縮しそして回収することができる。試料を水溶性
密度降下剤および一価の塩で処理することにより、生物
学的試料中に含まれる細菌と遊離細菌核酸の両方が濃縮
される。密度降下剤と一価の塩は、予備混合してからま
たは個別にペレットに添加することができる。次いで混
合物を遠心して、試料中に存在し得る細菌と細菌核酸を
ペレット化する。一価の塩は、ＤＮＡ上の負電荷を中和
するのに必要とされるカチオンを提供するので、水溶液
からの遊離ＤＮＡの沈澱を促進する。ナトリウム、カリ
ウム、アンモニウムまたはリチウムの酢酸塩または塩化
物のような一価の塩と一緒に、エタノールまたはイソプ
ロパノールのような密度降下剤を使用することにより、
試料中に存在する細菌と遊離細菌ＤＮＡの濃縮および回
収が達成される。
からの細菌と遊離細菌核酸の濃縮方法に関する。細菌核
酸は、例えば貯蔵や凍結−解凍処理の間に細菌から遊離
され得る。試料中のこの遊離細菌ＤＮＡを、本発明を使
って濃縮しそして回収することができる。試料を水溶性
密度降下剤および一価の塩で処理することにより、生物
学的試料中に含まれる細菌と遊離細菌核酸の両方が濃縮
される。密度降下剤と一価の塩は、予備混合してからま
たは個別にペレットに添加することができる。次いで混
合物を遠心して、試料中に存在し得る細菌と細菌核酸を
ペレット化する。一価の塩は、ＤＮＡ上の負電荷を中和
するのに必要とされるカチオンを提供するので、水溶液
からの遊離ＤＮＡの沈澱を促進する。ナトリウム、カリ
ウム、アンモニウムまたはリチウムの酢酸塩または塩化
物のような一価の塩と一緒に、エタノールまたはイソプ
ロパノールのような密度降下剤を使用することにより、
試料中に存在する細菌と遊離細菌ＤＮＡの濃縮および回
収が達成される。
【００１９】本発明での使用に適する一価の塩として
は、金属の酢酸塩または塩化物および非金属の酢酸塩ま
たは塩化物が挙げられるが、それに限定されない。好ま
しくは、一価の塩は酢酸リチウム、ナトリウム、カリウ
ムもしくはアンモニウムまたは塩化リチウム、ナトリウ
ム、カリウムもしくはアンモニウムである。より好まし
くは、一価の塩は酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢
酸アンモニウムまたは塩化リチウムである。一価の塩
は、試料中に存在し得る遊離の細菌核酸を沈澱させるの
に十分な量で添加される。そのような量は当業者が容易
に決定できるものである。
は、金属の酢酸塩または塩化物および非金属の酢酸塩ま
たは塩化物が挙げられるが、それに限定されない。好ま
しくは、一価の塩は酢酸リチウム、ナトリウム、カリウ
ムもしくはアンモニウムまたは塩化リチウム、ナトリウ
ム、カリウムもしくはアンモニウムである。より好まし
くは、一価の塩は酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢
酸アンモニウムまたは塩化リチウムである。一価の塩
は、試料中に存在し得る遊離の細菌核酸を沈澱させるの
に十分な量で添加される。そのような量は当業者が容易
に決定できるものである。
【００２０】本発明の方法を使って濃縮することができ
る細菌としては、非限定的に、マイコバクテリア〔例え
ばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacter
iumtuberculosis）およびマイコバクテリウム・アビウ
ム（Mycobacterium avium）〕、プレボテラ（Prevotel
la）種、ポルフィロモナス（Porphyromonas ）種、クラ
ミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）種、
ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）種、
スタフィロコッカス（Staphylococcus）種、ストレプト
コッカス（Streptococcus ）種、エンテロコッカス（En
terococcus）種、クロストリジウム（Clostridium ）
種、およびバクテロイデス（Bacteroides）種が挙げら
れる。他の検出可能な種は当業者に容易に明白であろ
う。
る細菌としては、非限定的に、マイコバクテリア〔例え
ばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacter
iumtuberculosis）およびマイコバクテリウム・アビウ
ム（Mycobacterium avium）〕、プレボテラ（Prevotel
la）種、ポルフィロモナス（Porphyromonas ）種、クラ
ミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）種、
ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae）種、
スタフィロコッカス（Staphylococcus）種、ストレプト
コッカス（Streptococcus ）種、エンテロコッカス（En
terococcus）種、クロストリジウム（Clostridium ）
種、およびバクテロイデス（Bacteroides）種が挙げら
れる。他の検出可能な種は当業者に容易に明白であろ
う。
【００２１】本発明の方法を使って、非限定的例として
呼吸試料（例えば喀痰試料）、呼吸沈渣、口腔液、膣
液、精液、創傷感染液および膿瘍液をはじめとする様々
な生物学的試料から、細菌を濃縮しそして回収すること
ができる。好ましくは、生物学的試料が呼吸試料であ
る。より好ましくは、本発明の方法に使われる呼吸沈渣
を得るために呼吸試料が前処理される。
呼吸試料（例えば喀痰試料）、呼吸沈渣、口腔液、膣
液、精液、創傷感染液および膿瘍液をはじめとする様々
な生物学的試料から、細菌を濃縮しそして回収すること
ができる。好ましくは、生物学的試料が呼吸試料であ
る。より好ましくは、本発明の方法に使われる呼吸沈渣
を得るために呼吸試料が前処理される。
【００２２】一例として、本発明の方法に従って呼吸沈
渣からマイコバクテリウム・ツベルクローシス（ヒト結
核菌）を濃縮することができる。呼吸沈渣を調製するた
めに、喀痰などの呼吸試料を常用の液化および汚染除去
方法により処理する。既知の消化−汚染除去方法のいず
れもこの段階に適し、その例としては、NALC−NaOH処理
の種々の変形〔Kent & Kubica, Public Health Mycobac
teriology A Guide for the Level III Laboratory, U.
S. Department of Health and Human Services, 31-47
(1985)；Noordhock 他, J. Clin. Microbiol., 32, 277
-284 (1994) 〕が挙げられる。それらの方法は一般に、
試料を液化し、そして消化−汚染除去試薬を使って競合
細菌を殺菌し、次いで液化試料を遠心して細菌をペレッ
ト化することを含んで成る。次いで再懸濁したペレッ
ト、即ち呼吸沈渣を、本発明に従って処理してその中に
存在するマイコバクテリアを濃縮することができる。例
えば、調製した呼吸沈渣から密度降下剤エタノールを使
ってＭ．ツベルクローシスを濃縮することができる。
渣からマイコバクテリウム・ツベルクローシス（ヒト結
核菌）を濃縮することができる。呼吸沈渣を調製するた
めに、喀痰などの呼吸試料を常用の液化および汚染除去
方法により処理する。既知の消化−汚染除去方法のいず
れもこの段階に適し、その例としては、NALC−NaOH処理
の種々の変形〔Kent & Kubica, Public Health Mycobac
teriology A Guide for the Level III Laboratory, U.
S. Department of Health and Human Services, 31-47
(1985)；Noordhock 他, J. Clin. Microbiol., 32, 277
-284 (1994) 〕が挙げられる。それらの方法は一般に、
試料を液化し、そして消化−汚染除去試薬を使って競合
細菌を殺菌し、次いで液化試料を遠心して細菌をペレッ
ト化することを含んで成る。次いで再懸濁したペレッ
ト、即ち呼吸沈渣を、本発明に従って処理してその中に
存在するマイコバクテリアを濃縮することができる。例
えば、調製した呼吸沈渣から密度降下剤エタノールを使
ってＭ．ツベルクローシスを濃縮することができる。
【００２３】呼吸沈渣中に存在するＭ．ツベルクローシ
スおよび任意のマイコバクテリア核酸を濃縮し回収する
ためには、本発明の方法に従って試料をエタノールのよ
うな密度降下剤と、酢酸ナトリウムのような一価の塩と
で処理して、低い細菌力価を濃縮し、そして遊離マイコ
バクテリア核酸を回収することができる。
スおよび任意のマイコバクテリア核酸を濃縮し回収する
ためには、本発明の方法に従って試料をエタノールのよ
うな密度降下剤と、酢酸ナトリウムのような一価の塩と
で処理して、低い細菌力価を濃縮し、そして遊離マイコ
バクテリア核酸を回収することができる。
【００２４】密度降下剤を酢酸ナトリウムまたは酢酸ア
ンモニウムと併用して、呼吸沈渣試料からマイコバクテ
リア調製物を濃縮し、洗浄し、そしてｐＨを所望の値に
変更することができ、それらをその後の核酸検出または
分析、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析に適
するものにすることができる。核酸検出および／または
分析用に、ペレット中に存在する回収されたマイコバク
テリアを、当業者に周知である標準溶菌法を使って溶菌
させる。適当な溶菌法としては、加熱、音波処理、ビー
ズ叩解、凍結−解凍、およびプロテアーゼ消化が挙げれ
るが、それらに限定されない。例えば、Noordhock 他,
J. Clin. Microbiol., 32, 277-284 (1994) ; Nolte
他, J. Clin. Microbiol., 31, 1777-1782 (1993) ; Fo
rbes他, J.Clin. Microbiol., 31, 1688-1694 (1993) ;
Hurley他, J. Clin. Microbiol.,25, 2227-2229 (198
7) ; およびFolgueira 他, J. Clin. Microbiol., 31,
1019-1021 (1993) を参照のこと。
ンモニウムと併用して、呼吸沈渣試料からマイコバクテ
リア調製物を濃縮し、洗浄し、そしてｐＨを所望の値に
変更することができ、それらをその後の核酸検出または
分析、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析に適
するものにすることができる。核酸検出および／または
分析用に、ペレット中に存在する回収されたマイコバク
テリアを、当業者に周知である標準溶菌法を使って溶菌
させる。適当な溶菌法としては、加熱、音波処理、ビー
ズ叩解、凍結−解凍、およびプロテアーゼ消化が挙げれ
るが、それらに限定されない。例えば、Noordhock 他,
J. Clin. Microbiol., 32, 277-284 (1994) ; Nolte
他, J. Clin. Microbiol., 31, 1777-1782 (1993) ; Fo
rbes他, J.Clin. Microbiol., 31, 1688-1694 (1993) ;
Hurley他, J. Clin. Microbiol.,25, 2227-2229 (198
7) ; およびFolgueira 他, J. Clin. Microbiol., 31,
1019-1021 (1993) を参照のこと。
【００２５】溶菌させたマイコバクテリアより放出され
た核酸および回収された遊離のマイコバクテリウム核酸
は、消化−汚染除去試薬が除去されているので、核酸分
析に使用することができる。回収された核酸は、例え
ば、核酸ハイブリダイゼーション法や核酸増幅法、例え
ばＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、核酸配列特異的増幅（Ｎ
ＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖転位増幅（Ｓ
ＤＡ）およびＱ−βレプリカーゼ法に用いることができ
る。そのようなプロトコールは当該技術分野で周知であ
り、当業者に容易に利用可能である。例えば、ＰＣＲを
使った核酸の増幅および検出のための一般原理および条
件は、非常に良く知られており、その詳細は米国特許第
4,683,195 号、同第4,683,202 号および4,965,188 号明
細書並びにGuatelli他, Clin. Microbiol. Rev., 2
(2), 217-226 頁(1989)を初めとする多数の参考文献中
に与えられている。指摘の米国特許明細書は本明細書中
に参考として組み込まれる。本明細書中に与えられる技
術の教示と特別な教示のゆえに、当業者は本発明の細菌
の濃縮および回収方法を細胞溶解やポリメラーゼ連鎖反
応方法と組み合わせることによって本発明を実施するこ
とに何ら困難はないだろう。
た核酸および回収された遊離のマイコバクテリウム核酸
は、消化−汚染除去試薬が除去されているので、核酸分
析に使用することができる。回収された核酸は、例え
ば、核酸ハイブリダイゼーション法や核酸増幅法、例え
ばＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、核酸配列特異的増幅（Ｎ
ＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖転位増幅（Ｓ
ＤＡ）およびＱ−βレプリカーゼ法に用いることができ
る。そのようなプロトコールは当該技術分野で周知であ
り、当業者に容易に利用可能である。例えば、ＰＣＲを
使った核酸の増幅および検出のための一般原理および条
件は、非常に良く知られており、その詳細は米国特許第
4,683,195 号、同第4,683,202 号および4,965,188 号明
細書並びにGuatelli他, Clin. Microbiol. Rev., 2
(2), 217-226 頁(1989)を初めとする多数の参考文献中
に与えられている。指摘の米国特許明細書は本明細書中
に参考として組み込まれる。本明細書中に与えられる技
術の教示と特別な教示のゆえに、当業者は本発明の細菌
の濃縮および回収方法を細胞溶解やポリメラーゼ連鎖反
応方法と組み合わせることによって本発明を実施するこ
とに何ら困難はないだろう。
【００２６】下記の実施例は本発明の幾つかの態様を例
証するために与えられるのであって、本発明を限定する
ものであると解釈してはならない。
証するために与えられるのであって、本発明を限定する
ものであると解釈してはならない。
【００２７】
材料および方法：Ｍ．ツベルクローシス（MTb ）を含ま
ないまたは含む凍結痰沈渣試料は、数カ所の臨床微生物
学研究室から入手した。次の試薬を調製し、実験に使用
した。（全ての試薬の調製には脱イオン水を使った。）
ないまたは含む凍結痰沈渣試料は、数カ所の臨床微生物
学研究室から入手した。次の試薬を調製し、実験に使用
した。（全ての試薬の調製には脱イオン水を使った。）
【００２８】１．酢酸ナトリウム溶液（NaAc）：無水酢
酸ナトリウム（12.3 g）を約40 ml のH2O に溶かした。
氷酢酸を使ってこの溶液のpHを5.2 に調整し、水で容量
を50 ml にした。
酸ナトリウム（12.3 g）を約40 ml のH2O に溶かした。
氷酢酸を使ってこの溶液のpHを5.2 に調整し、水で容量
を50 ml にした。
【００２９】２．エタノール／酢酸ナトリウム試薬（Et
OH／NaAc）：上記酢酸ナトリウム溶液１容量部を20〜25
容量部のエタノールと混合した。200 プルーフ（厳密）
のエタノールと変性エタノール（５％イソプロパノール
と５％メタノールを含む）の両方とも同様な成果で用い
られた。
OH／NaAc）：上記酢酸ナトリウム溶液１容量部を20〜25
容量部のエタノールと混合した。200 プルーフ（厳密）
のエタノールと変性エタノール（５％イソプロパノール
と５％メタノールを含む）の両方とも同様な成果で用い
られた。
【００３０】方法１…痰沈渣試料へのNaAcおよびEtOHの
別々の添加 １容量部の上記NaAc溶液を1.5 mlの超遠心管にピペット
で添加した。そこに10容量部の痰沈渣を加え、溶液を手
短に渦動攪拌して混合した。20〜25容量部のエタノール
を加え、再び溶液を手短に渦動攪拌して混合した。試料
の入った超遠心管を超遠心機の中に置き、16,000×ｇで
15分間遠心して細菌をペレットにし且つ核酸を沈澱さ
せ、そして上澄液を捨てた。
別々の添加 １容量部の上記NaAc溶液を1.5 mlの超遠心管にピペット
で添加した。そこに10容量部の痰沈渣を加え、溶液を手
短に渦動攪拌して混合した。20〜25容量部のエタノール
を加え、再び溶液を手短に渦動攪拌して混合した。試料
の入った超遠心管を超遠心機の中に置き、16,000×ｇで
15分間遠心して細菌をペレットにし且つ核酸を沈澱さ
せ、そして上澄液を捨てた。
【００３１】更なる処理のため、細菌／ＤＮＡペレット
を溶菌試薬（10 mM Tris, pH 8.0,１％Tween 20, １％T
riton X-100, 0.1 ％ドデシル硫酸ナトリウム）中に再
懸濁し、100 ℃で30分間加熱して細菌を溶解させ、ＤＮ
Ａを遊離させた。米国特許5,582,988 号明細書に記載さ
れたようなポリマー捕捉技術により、それらの溶解物か
らＤＮＡを回収した。簡単に言えば、可溶性の弱塩基性
カチオンポリマーを使用する。ＤＮＡはそれの負に帯電
したリン酸基によってポリマーに静電結合し、不溶性複
合体を形成する。この複合体を遠心によりペレット化
し、上澄液を捨て、アルカリ溶液中で加熱することによ
り精製ＤＮＡを遊離させる。
を溶菌試薬（10 mM Tris, pH 8.0,１％Tween 20, １％T
riton X-100, 0.1 ％ドデシル硫酸ナトリウム）中に再
懸濁し、100 ℃で30分間加熱して細菌を溶解させ、ＤＮ
Ａを遊離させた。米国特許5,582,988 号明細書に記載さ
れたようなポリマー捕捉技術により、それらの溶解物か
らＤＮＡを回収した。簡単に言えば、可溶性の弱塩基性
カチオンポリマーを使用する。ＤＮＡはそれの負に帯電
したリン酸基によってポリマーに静電結合し、不溶性複
合体を形成する。この複合体を遠心によりペレット化
し、上澄液を捨て、アルカリ溶液中で加熱することによ
り精製ＤＮＡを遊離させる。
【００３２】回収されたマイコバクテリアＤＮＡを、米
国特許第5,089,233 号、同第5,229,297 号および同第5,
380,489 号明細書中に記載されたようなJohnson & John
sonClinical Diagnostics, Inc.のＰＣＲ核酸増幅およ
び検出用パッチ封じ込めシステムを使って増幅および検
出した。簡単に言えば、試料とＰＣＲ試薬を混合し、プ
ラスチックパッチのふくれ部分の中に充填し、次いでパ
ッチをシールする。MTb に独特のＤＮＡ配列を表すビオ
チン標識オリゴヌクレオチドを用いて、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼによるMtb 特異的ＤＮＡの増幅反応を開始さ
せる。試料、ＤＮＡポリメラーゼ、dNTP、緩衝剤および
塩を含有する反応混合物をまず加熱してＤＮＡを変性さ
せ、次いで変性させるための高温（95℃）と、プライマ
ーをアニーリングさせそしてＤＮＡ配列を伸長させるか
またはコピーを合成するための低温（65〜75℃）とを前
後に循環させる。反応生成物を検出チャンバーの中に通
し（そこでそれらがビーズに取り付けられた相補的オリ
ゴ体とハイブリダイズする）た後、増幅させた標的を検
出する。ＨＲＰ−ストレプトアビジンおよびそれに引き
続いてＨＲＰ−色素基質を検出チャンバーの中に通した
後、ハイブリダイズした生成物を検出する。
国特許第5,089,233 号、同第5,229,297 号および同第5,
380,489 号明細書中に記載されたようなJohnson & John
sonClinical Diagnostics, Inc.のＰＣＲ核酸増幅およ
び検出用パッチ封じ込めシステムを使って増幅および検
出した。簡単に言えば、試料とＰＣＲ試薬を混合し、プ
ラスチックパッチのふくれ部分の中に充填し、次いでパ
ッチをシールする。MTb に独特のＤＮＡ配列を表すビオ
チン標識オリゴヌクレオチドを用いて、耐熱性ＤＮＡポ
リメラーゼによるMtb 特異的ＤＮＡの増幅反応を開始さ
せる。試料、ＤＮＡポリメラーゼ、dNTP、緩衝剤および
塩を含有する反応混合物をまず加熱してＤＮＡを変性さ
せ、次いで変性させるための高温（95℃）と、プライマ
ーをアニーリングさせそしてＤＮＡ配列を伸長させるか
またはコピーを合成するための低温（65〜75℃）とを前
後に循環させる。反応生成物を検出チャンバーの中に通
し（そこでそれらがビーズに取り付けられた相補的オリ
ゴ体とハイブリダイズする）た後、増幅させた標的を検
出する。ＨＲＰ−ストレプトアビジンおよびそれに引き
続いてＨＲＰ−色素基質を検出チャンバーの中に通した
後、ハイブリダイズした生成物を検出する。
【００３３】方法２…痰沈渣試料とNaAc／EtOH組合せ試
薬の混合 20〜25容量部の組合せEtOH／NaAc試薬をピペットで超遠
心管に入れた。10容量部の痰沈渣試料を加え、手短に渦
動攪拌して溶液を混合した。試料の入った超遠心管を超
遠心機に入れ、16,000×g で15分間遠心して細菌と沈澱
した核酸をペレット化し、上澄液を捨てた。
薬の混合 20〜25容量部の組合せEtOH／NaAc試薬をピペットで超遠
心管に入れた。10容量部の痰沈渣試料を加え、手短に渦
動攪拌して溶液を混合した。試料の入った超遠心管を超
遠心機に入れ、16,000×g で15分間遠心して細菌と沈澱
した核酸をペレット化し、上澄液を捨てた。
【００３４】更に処理するために、細菌／ＤＮＡペレッ
トを溶菌試薬（10 mM Tris, pH 8.0, １％ Tween 20,
１％ Triton X-100, 0.1％ドデシル硫酸ナトリウム）中
に再懸濁し、100 ℃で30分間加熱して溶菌させてＤＮＡ
を遊離させた。米国特許第5,82,988号明細書に記載され
たようなポリマー捕捉技術により、それらの溶解物から
ＤＮＡを回収した。
トを溶菌試薬（10 mM Tris, pH 8.0, １％ Tween 20,
１％ Triton X-100, 0.1％ドデシル硫酸ナトリウム）中
に再懸濁し、100 ℃で30分間加熱して溶菌させてＤＮＡ
を遊離させた。米国特許第5,82,988号明細書に記載され
たようなポリマー捕捉技術により、それらの溶解物から
ＤＮＡを回収した。
【００３５】米国特許第5,089,233 号、同第5,229,297
号および同第5,380,489 号明細書に記載されたようなJo
hnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.のＰＣＲ
核酸増幅および検出用パッチ封じ込めシステムを使っ
て、回収したマイコバクテリアＤＮＡを増幅し検出し
た。
号および同第5,380,489 号明細書に記載されたようなJo
hnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.のＰＣＲ
核酸増幅および検出用パッチ封じ込めシステムを使っ
て、回収したマイコバクテリアＤＮＡを増幅し検出し
た。
【００３６】実施例１：遊離ＤＮＡの沈澱と回収に対す
るpH、塩、アルコールおよび温度の効果 痰沈渣および他の呼吸沈渣試料に見られるpH域において
溶液からの遊離ＤＮＡの回収の最適条件を同定するため
に、水を水酸化ナトリウムでpH 7, 10または14に調整し
て呼吸沈渣のpH域を模擬し、その水溶液を使って、Sigm
a Chemical Co.から入手した子ウシ胸腺ＤＮＡ（Ct−Ｄ
ＮＡ）を50 ng ＤＮＡ／μL の最終濃度に希釈した。塩
化ナトリウム（NaCl）か酢酸ナトリウム（NaAc）のどち
らか一方を各pH調整済ＤＮＡ試料に加えて0.2 M NaClま
たは0.3 M NaAcの最終濃度にした。1/2 mlアリコートを
超遠心管に移し、1 mlのエタノール（EtOH）か0.5 mlの
イソプロパノール (IPP)のいずれかと混合し、そしてす
ぐに周囲の室温（RT）で遠心するかまたは−20℃で１時
間インキュベートしてから遠心した。遠心は16,000×ｇ
で15分間であった。ペレット材料を0.5 mlの水に再懸濁
し、分光光度計を使ってＤＮＡのλmax （最大吸収波
長）である260 nmでそれの吸光を測定し、未沈澱材料の
吸収と比較した。異なる実験条件下でのＤＮＡの回収率
を下記の表１に与える。
るpH、塩、アルコールおよび温度の効果 痰沈渣および他の呼吸沈渣試料に見られるpH域において
溶液からの遊離ＤＮＡの回収の最適条件を同定するため
に、水を水酸化ナトリウムでpH 7, 10または14に調整し
て呼吸沈渣のpH域を模擬し、その水溶液を使って、Sigm
a Chemical Co.から入手した子ウシ胸腺ＤＮＡ（Ct−Ｄ
ＮＡ）を50 ng ＤＮＡ／μL の最終濃度に希釈した。塩
化ナトリウム（NaCl）か酢酸ナトリウム（NaAc）のどち
らか一方を各pH調整済ＤＮＡ試料に加えて0.2 M NaClま
たは0.3 M NaAcの最終濃度にした。1/2 mlアリコートを
超遠心管に移し、1 mlのエタノール（EtOH）か0.5 mlの
イソプロパノール (IPP)のいずれかと混合し、そしてす
ぐに周囲の室温（RT）で遠心するかまたは−20℃で１時
間インキュベートしてから遠心した。遠心は16,000×ｇ
で15分間であった。ペレット材料を0.5 mlの水に再懸濁
し、分光光度計を使ってＤＮＡのλmax （最大吸収波
長）である260 nmでそれの吸光を測定し、未沈澱材料の
吸収と比較した。異なる実験条件下でのＤＮＡの回収率
を下記の表１に与える。
【００３７】
【表１】
【００３８】その結果は、即座に遠心するかまたは−20
℃でインキュベートした後で遠心するかいずれにせよ、
EtOHかIPP と組み合わせたNaAcが、pH 7または10におい
て試料からＤＮＡを定量的に回収する場合に効果的であ
ることを示す。pH 14 でさえも、NaAcとEtOHの組合せを
使ったＤＮＡの回収率はほぼ定量的であったが、IPPとN
aAcの組合せはこのpHであまり効果的でなかった。NaCl
とアルコールの組合せは、試験したいずれの条件におい
ても、Ct−ＤＮＡの効率的回収を与えなかった。従っ
て、NaAcとEtOHの組合せと、試料を周囲温度で混合した
後すぐの遠心が、痰沈渣や他の呼吸沈渣試料を使う場合
に好ましい。
℃でインキュベートした後で遠心するかいずれにせよ、
EtOHかIPP と組み合わせたNaAcが、pH 7または10におい
て試料からＤＮＡを定量的に回収する場合に効果的であ
ることを示す。pH 14 でさえも、NaAcとEtOHの組合せを
使ったＤＮＡの回収率はほぼ定量的であったが、IPPとN
aAcの組合せはこのpHであまり効果的でなかった。NaCl
とアルコールの組合せは、試験したいずれの条件におい
ても、Ct−ＤＮＡの効率的回収を与えなかった。従っ
て、NaAcとEtOHの組合せと、試料を周囲温度で混合した
後すぐの遠心が、痰沈渣や他の呼吸沈渣試料を使う場合
に好ましい。
【００３９】実施例２：痰沈渣からのＭ．ツベルクロシ
ス (Mtb)の回収 この実験において、試料をまずEtOHのみでまたはNaAcと
EtOHの組合せで希釈すると、痰沈渣試料からのMtb の回
収がより効率的であることが証明された。混合した呼吸
沈渣のプールのアリコートに培養したMtb を添加して、
ＰＣＲアッセイごとにコロニー形成単位（ＣＦＵ）で表
示される数種類の異なる力価を得、上記の方法１に従っ
てNaAc／EtOH処理を実施した。200 μL アリコートを表
２に示す通りに処理した。EtOHのみの場合、NaAcを洗浄
から抜かした。遠心のみの場合、洗浄を完全に省略し、
即ち、上から２つの処理に関する限りはEtOHまたはNaAc
を使わないで呼吸沈渣のみを遠心した。ペレット化した
試料を更に後処理し、上記で概説したようにＰＣＲによ
りMtb についてアッセイした。遠心しない呼吸沈渣に溶
解試薬を直接添加した「遠心なし対照」は、最大回収を
示すために実験に含めた。エタノール洗浄せずに使用し
た多数の呼吸沈渣試料はポリマー捕捉またはＰＣＲを妨
害したけれども、この特定の試料を「遠心なし対照」に
選んだ。その理由はそれがポリマー捕捉またはＰＣＲを
妨害しなかったからである。表２に与えた値は、Mtb に
関してＰＣＲ陽性であった複製物のパーセントである；
ｎ＝４（* ｎ＝３；**ｎ＝１）。
ス (Mtb)の回収 この実験において、試料をまずEtOHのみでまたはNaAcと
EtOHの組合せで希釈すると、痰沈渣試料からのMtb の回
収がより効率的であることが証明された。混合した呼吸
沈渣のプールのアリコートに培養したMtb を添加して、
ＰＣＲアッセイごとにコロニー形成単位（ＣＦＵ）で表
示される数種類の異なる力価を得、上記の方法１に従っ
てNaAc／EtOH処理を実施した。200 μL アリコートを表
２に示す通りに処理した。EtOHのみの場合、NaAcを洗浄
から抜かした。遠心のみの場合、洗浄を完全に省略し、
即ち、上から２つの処理に関する限りはEtOHまたはNaAc
を使わないで呼吸沈渣のみを遠心した。ペレット化した
試料を更に後処理し、上記で概説したようにＰＣＲによ
りMtb についてアッセイした。遠心しない呼吸沈渣に溶
解試薬を直接添加した「遠心なし対照」は、最大回収を
示すために実験に含めた。エタノール洗浄せずに使用し
た多数の呼吸沈渣試料はポリマー捕捉またはＰＣＲを妨
害したけれども、この特定の試料を「遠心なし対照」に
選んだ。その理由はそれがポリマー捕捉またはＰＣＲを
妨害しなかったからである。表２に与えた値は、Mtb に
関してＰＣＲ陽性であった複製物のパーセントである；
ｎ＝４（* ｎ＝３；**ｎ＝１）。
【００４０】表２に示した結果は、EtOHを使わず痰沈渣
の直接遠心を使った時（遠心のみ）よりもEtOHまたはNa
Ac／EtOHを含む培地中の呼吸沈渣から、より一層効率的
に培養菌ペレットが回収されたことを示す。使用した呼
吸沈渣プールは、ＣＦＵ＝０の組における時折のＰＣＲ
陽性結果の説明となる、培養により検出されないごく少
数のMtb 生物で汚染されていた。
の直接遠心を使った時（遠心のみ）よりもEtOHまたはNa
Ac／EtOHを含む培地中の呼吸沈渣から、より一層効率的
に培養菌ペレットが回収されたことを示す。使用した呼
吸沈渣プールは、ＣＦＵ＝０の組における時折のＰＣＲ
陽性結果の説明となる、培養により検出されないごく少
数のMtb 生物で汚染されていた。
【００４１】
【表２】
【００４２】実施例３：患者試料からのMtb の回収 この実験は、Mtb の供給源が培養物ではなくて実際の患
者試料であったこと以外は実施例２と同じであった。培
養によるMtb 試験が陽性であった呼吸沈渣試料のプール
を、培養によるMtb 試験が陰性であった呼吸沈渣試料の
プールで希釈した。200 μL アリコートを実施例２と同
様に試験した。表に与える値はMtb についてＰＣＲ陽性
である複製物の割合（％）である；ｎ＝４。実施例２と
同様に、培養陰性プールは、ＰＣＲにより検出される程
度のMtb を含んでいた。従って、NaAcを使う洗浄と使わ
ない洗浄の間に何も差が観察されなかった。それにもか
かわらず、エタノールも酢酸ナトリウムを使わないでペ
レット化した試料（遠心のみ）では標的(Mtb) の損失が
検出された。
者試料であったこと以外は実施例２と同じであった。培
養によるMtb 試験が陽性であった呼吸沈渣試料のプール
を、培養によるMtb 試験が陰性であった呼吸沈渣試料の
プールで希釈した。200 μL アリコートを実施例２と同
様に試験した。表に与える値はMtb についてＰＣＲ陽性
である複製物の割合（％）である；ｎ＝４。実施例２と
同様に、培養陰性プールは、ＰＣＲにより検出される程
度のMtb を含んでいた。従って、NaAcを使う洗浄と使わ
ない洗浄の間に何も差が観察されなかった。それにもか
かわらず、エタノールも酢酸ナトリウムを使わないでペ
レット化した試料（遠心のみ）では標的(Mtb) の損失が
検出された。
【００４３】
【表３】
【００４４】実施例４：純エタノールと変性エタノール
の比較 費用と規定上の問題から、純エタノールの変わりに変性
エタノールを使用することが有利かもしれない。従っ
て、純エタノール（200 プルーフ）と変性エタノール
（90％エタノール、５％メタノール、５％イソプロパノ
ール）を使って呼吸沈渣プールからの培養マイコバクテ
リアの回収の効力を比較した。試験試料を調製し、実施
例２と同様にNaAcとEtOHで処理した。ただし、１組の試
料では純エタノールの変わりに変性エタノールを使用し
た。下表に与える値はMtb についてＰＣＲ陽性である複
製物の割合（％）である；ｎ＝６。実施例２および３と
同様に、培養陰性プールはわずかにMtb で汚染されるけ
れども、結果は純エタノールと変性エタノールの場合で
同じである。
の比較 費用と規定上の問題から、純エタノールの変わりに変性
エタノールを使用することが有利かもしれない。従っ
て、純エタノール（200 プルーフ）と変性エタノール
（90％エタノール、５％メタノール、５％イソプロパノ
ール）を使って呼吸沈渣プールからの培養マイコバクテ
リアの回収の効力を比較した。試験試料を調製し、実施
例２と同様にNaAcとEtOHで処理した。ただし、１組の試
料では純エタノールの変わりに変性エタノールを使用し
た。下表に与える値はMtb についてＰＣＲ陽性である複
製物の割合（％）である；ｎ＝６。実施例２および３と
同様に、培養陰性プールはわずかにMtb で汚染されるけ
れども、結果は純エタノールと変性エタノールの場合で
同じである。
【００４５】
【表４】
【００４６】実施例５：EtOHのみとEtOH／NaAcとの比較 この実験は、EtOHと組み合わせたNaAcが、痰沈渣試料の
サブセットからのマイコバクテリアの一層効率的な回収
および検出に備えることを証明する。実施例２と同様に
試験試料を調製しそしてNaAc／EtOHまたはEtOHのみで処
理した。ただし、呼吸沈渣の別のＰＣＲ陰性プールを使
用し、呼吸沈渣の容量を300 μL に増やし、そして700
μL の組合せEtOH／NaAc試薬（上記方法２に記載）を使
用した。下表５に与える値はMtb についてＰＣＲ陽性で
あった複製物（ｎ＝４）の割合（％）である。示す通
り、エタノールと酢酸ナトリウムの組合せはエタノール
のみよりもずっと効率的であった。その後の実験は、エ
タノール処理にNaAcを含めた時にポリマー捕捉によりＤ
ＮＡが効率的に回収されたことを証明した。効率的ポリ
マー捕捉は6.8 に非常に近いpHを必要とした。エタノー
ル洗浄からNaAcを除外した場合には、幾つかの呼吸試料
のpHはポリマー捕捉の間7.4 であり、ＤＮＡが効率的に
捕捉されなかった。しかしながら、EtOHと共にNaAcを含
めた場合には、それらの同じ試料の第二のアリコートの
pHは6.8 〜7.1 であり、ＤＮＡが効率的に捕捉された。
NaAcの添加がpHを調整し、それによって、臨床試料のこ
のサブセットからのMtb ＤＮＡの回収を改善したことは
明白である。
サブセットからのマイコバクテリアの一層効率的な回収
および検出に備えることを証明する。実施例２と同様に
試験試料を調製しそしてNaAc／EtOHまたはEtOHのみで処
理した。ただし、呼吸沈渣の別のＰＣＲ陰性プールを使
用し、呼吸沈渣の容量を300 μL に増やし、そして700
μL の組合せEtOH／NaAc試薬（上記方法２に記載）を使
用した。下表５に与える値はMtb についてＰＣＲ陽性で
あった複製物（ｎ＝４）の割合（％）である。示す通
り、エタノールと酢酸ナトリウムの組合せはエタノール
のみよりもずっと効率的であった。その後の実験は、エ
タノール処理にNaAcを含めた時にポリマー捕捉によりＤ
ＮＡが効率的に回収されたことを証明した。効率的ポリ
マー捕捉は6.8 に非常に近いpHを必要とした。エタノー
ル洗浄からNaAcを除外した場合には、幾つかの呼吸試料
のpHはポリマー捕捉の間7.4 であり、ＤＮＡが効率的に
捕捉されなかった。しかしながら、EtOHと共にNaAcを含
めた場合には、それらの同じ試料の第二のアリコートの
pHは6.8 〜7.1 であり、ＤＮＡが効率的に捕捉された。
NaAcの添加がpHを調整し、それによって、臨床試料のこ
のサブセットからのMtb ＤＮＡの回収を改善したことは
明白である。
【００４７】
【表５】
【００４８】実施例６：凍結−解凍後の痰沈渣試料にお
ける遊離Mtb ＤＮＡの検出 この実験は、前に凍結された痰沈渣中の遊離Mtb ＤＮＡ
の存在を証明する。実施例３と同様に調製した培養陽性
痰沈渣試料の３つの200 μL アリコートを、EtOH／NaAc
を添加せずに遠心した。得られた上澄液を0.2 μm フィ
ルターに通して残留細菌を除去した。遊離のMtb ＤＮＡ
を含むであろう濾過した上澄液と、Mtbそれ自体を含む
であろうペレットの両方を、上述したのと同様に更に処
理し、ＰＣＲによりMtb ＤＮＡについてアッセイした。
表６は、Mtb ＤＮＡについてＰＣＲ陽性であった複製物
（ｎ＝４）の割合（％）を示す。このデータは、この痰
沈渣試料に、完全なMtb 生物から回収された量の10倍ほ
どの、かなりの遊離Mtb ＤＮＡが存在することを指摘す
る。この実施例と実施例１に示されるように、本発明の
方法を使って遊離ＤＮＡを回収することができる。
ける遊離Mtb ＤＮＡの検出 この実験は、前に凍結された痰沈渣中の遊離Mtb ＤＮＡ
の存在を証明する。実施例３と同様に調製した培養陽性
痰沈渣試料の３つの200 μL アリコートを、EtOH／NaAc
を添加せずに遠心した。得られた上澄液を0.2 μm フィ
ルターに通して残留細菌を除去した。遊離のMtb ＤＮＡ
を含むであろう濾過した上澄液と、Mtbそれ自体を含む
であろうペレットの両方を、上述したのと同様に更に処
理し、ＰＣＲによりMtb ＤＮＡについてアッセイした。
表６は、Mtb ＤＮＡについてＰＣＲ陽性であった複製物
（ｎ＝４）の割合（％）を示す。このデータは、この痰
沈渣試料に、完全なMtb 生物から回収された量の10倍ほ
どの、かなりの遊離Mtb ＤＮＡが存在することを指摘す
る。この実施例と実施例１に示されるように、本発明の
方法を使って遊離ＤＮＡを回収することができる。
【００４９】
【表６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ Ｇ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 ジョン ダブリュ．バッカス アメリカ合衆国，カリフォルニア 92129, サン ディエゴ，ビア カボロ ロジョ 12865 (72)発明者 ジョアンヌ エイチ．カーシュナー アメリカ合衆国，ミズーリ 63117，セン ト ルイス，クレイトン ロード 9033 (72)発明者 ラシュミ ミタ インド国，ピーアイエヌナンバー 403004，ゴア，ドナ パウラ，マチャド コブ 122
Claims (27)
- 【請求項１】 粘性生物学的試料からの細菌の濃縮方法
であって、 a) 前記試料の密度を前記細菌の密度より下に下げるの
に十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い
沸点を有する水溶性密度降下剤を前記試料に添加し；そ
して b) 前記試料を遠心して、試料中に存在する任意の細菌
をペレット化することを含んで成る方法。 - 【請求項２】 前記試料が核酸分析を妨害する試薬で前
処理される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記試料が呼吸沈渣である、請求項２に
記載の方法。 - 【請求項４】 前記粘性生物学的試料が、呼吸試料、呼
吸沈渣、口腔液、膣液、精液、創傷感染液および膿瘍液
ら成る群より選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記密度降下剤が置換または無置換メチ
ルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、置
換または無置換プロピルアルコール、およびケトン類か
ら成る群より選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】 前記密度降下剤が置換または無置換メチ
ルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、お
よび置換または無置換プロピルアルコールから成る群よ
り選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記密度降下剤がエタノールである、請
求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 試料１容につき２〜６容の密度降下剤が
添加される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 試料１容につき２〜2.5 容の密度降下剤
が添加される、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記細菌がマイコバクテリウム種、プ
レボテラ種、ポルフィロモナス種、クラミジア・トラコ
マチス種、ナイセリア・ゴノレエ種、スタフィロコッカ
ス種、ストレプトコッカス種、エンテロコッカス種、ク
ロストリジウム種およびバクテロイデス種から成る群よ
り選ばれる、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 前記細菌がマイコバクテリウム・ツベ
ルクローシス菌群およびマイコバクテリウム・アビウム
菌群から成る群より選ばれる、請求項１０に記載の方
法。 - 【請求項１２】 前記細菌がマイコバクテリウム・ツベ
ルクローシスであり、前記粘性生物学的試料が呼吸沈渣
であり、そして前記密度降下剤がエタノールである、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項１３】 生物学的試料からの細菌および遊離細
菌核酸の濃縮方法であって、 a) 前記試料の密度を前記細菌の密度より下に下げるの
に十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い
沸点を有する水溶性密度降下剤、および前記遊離細菌核
酸を沈澱させるのに十分な量で一価の塩を前記試料に添
加し；そして b) 前記試料を遠心して、試料中に存在する任意の細菌
および任意の遊離細菌核酸をペレット化することを含ん
で成る方法。 - 【請求項１４】 前記試料が核酸分析を妨害する試薬で
前処理される、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記試料が呼吸沈渣である、請求項１
４に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記粘性生物学的試料が、呼吸試料、
呼吸沈渣、口腔液、膣液、精液、創傷感染液および膿瘍
液ら成る群より選ばれる、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記密度降下剤が置換または無置換メ
チルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、
置換または無置換プロピルアルコール、およびケトン類
から成る群より選ばれる、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記密度降下剤が置換または無置換メ
チルアルコール、置換または無置換エチルアルコール、
および置換または無置換プロピルアルコールから成る群
より選ばれる、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記密度降下剤がエタノールである、
請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 試料１容につき２〜６容の密度降下剤
が添加される、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項２１】 試料１容につき２〜2.5 容の密度降下
剤が添加される、請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】 前記細菌がマイコバクテリウム種、プ
レボテラ種、ポルフィロモナス種、クラミジア・トラコ
マチス種、ナイセリア・ゴノレエ種、スタフィロコッカ
ス種、ストレプトコッカス種、エンテロコッカス種、ク
ロストリジウム種およびバクテロイデス種から成る群よ
り選ばれる、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項２３】 前記細菌がマイコバクテリウム・ツベ
ルクローシス菌群およびマイコバクテリウム・アビウム
菌群から成る群より選ばれる、請求項２２に記載の方
法。 - 【請求項２４】 前記一価の塩が酢酸ナトリウム、塩化
ナトリウム、酢酸アンモニウムおよび塩化リチウムから
成る群より選ばれる、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項２５】 前記細菌がマイコバクテリウム・ツベ
ルクローシスであり、前記粘性生物学的試料が呼吸沈渣
であり、前記密度降下剤がエタノールであり、そして前
記一価の塩が酢酸ナトリウムである、請求項１３に記載
の方法。 - 【請求項２６】 粘性生物学的試料からの細菌の濃縮方
法であって、 a) 前記試料の密度を前記細菌の密度より下に下げるの
に十分な量で、0.7 〜0.9 ｇ／mlの密度と50℃より高い
沸点を有する水溶性密度降下剤、およびｐＨ緩衝剤を前
記試料に添加し；そして b) 前記試料を遠心して、試料中に存在する任意の細菌
をペレット化することを含んで成る方法。 - 【請求項２７】 前記ｐＨ緩衝剤が前記試料のｐＨを６
〜９に緩衝化する、請求項２６に記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3923997P | 1997-02-28 | 1997-02-28 | |
| US09/013987 | 1998-01-27 | ||
| US09/013,987 US6126839A (en) | 1997-02-28 | 1998-01-27 | Use of an alcohol-salt buffer wash for the efficient recovery of mycobacteria and mycobacterial DNA from respiratory sediment |
| US60/039239 | 1998-01-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11168A true JPH11168A (ja) | 1999-01-06 |
| JP4083860B2 JP4083860B2 (ja) | 2008-04-30 |
Family
ID=26685514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04662898A Expired - Fee Related JP4083860B2 (ja) | 1997-02-28 | 1998-02-27 | 呼吸沈渣からのマイコバクテリア及びマイコバクテリアｄｎａの効率的回収のためのアルコール−塩緩衝剤洗浄の使用 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6126839A (ja) |
| EP (1) | EP0861886B1 (ja) |
| JP (1) | JP4083860B2 (ja) |
| AT (1) | ATE311436T1 (ja) |
| DE (1) | DE69832547T2 (ja) |
| DK (1) | DK0861886T3 (ja) |
| ES (1) | ES2252813T3 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9738888B2 (en) * | 2008-03-24 | 2017-08-22 | Universidade Federal de Pernambuco—UFPE | Magnetic nanocomposite retrieval of nucleotide sequence |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1317860C (en) * | 1987-04-01 | 1993-05-18 | Daniel Louis Kacian | Techniques for preparing specimens for bacterial assays |
| CA2121659C (en) * | 1993-05-11 | 2000-11-28 | Michael C. Little | Sample processing method for mycobacteria |
-
1998
- 1998-01-27 US US09/013,987 patent/US6126839A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-27 DE DE69832547T patent/DE69832547T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 DK DK98301456T patent/DK0861886T3/da active
- 1998-02-27 JP JP04662898A patent/JP4083860B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-27 AT AT98301456T patent/ATE311436T1/de active
- 1998-02-27 EP EP98301456A patent/EP0861886B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 ES ES98301456T patent/ES2252813T3/es not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| ES2252813T3 (es) | 2006-05-16 |
| EP0861886B1 (en) | 2005-11-30 |
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| ATE311436T1 (de) | 2005-12-15 |
| EP0861886A1 (en) | 1998-09-02 |
| DK0861886T3 (da) | 2006-01-23 |
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