JPH11172A

JPH11172A - ペプチド輸送タンパク質遺伝子を含むｄｎａ、ベクター及び微生物

Info

Publication number: JPH11172A
Application number: JP9169563A
Authority: JP
Inventors: Hajime Nakajima; 肇中島; Shunichi Dosako; 俊一堂迫; N Cornings W; エヌコーニングスダブリュー; Pallmann B; パールマンビー
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1997-06-11
Filing date: 1997-06-11
Publication date: 1999-01-06

Abstract

(57)【要約】【解決手段】ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactoba
cillus helveticus) 由来のペプチド輸送タンパク質遺
伝子を含むＤＮＡ。前記ＤＮＡを組み込んだペプチド輸
送タンパク質産生能を有するベクター。前記ベクターで
形質転換したペプチド輸送タンパク質産生能を有する微
生物及びそれを培養してペプチド輸送タンパク質を産生
させた菌体から調製したペプチド輸送タンパク質を含有
する膜小胞。【効果】本発明のベクターで形質転換した微生物によ
り産生されるペプチド輸送タンパク質は、ジペプチド及
びトリペプチドを特異的に取り込む性質を有し、しか
も、熱安定性が高く、高温域においても使用することが
できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、乳酸菌のラクトバ
チルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)に
由来するペプチド輸送タンパク質遺伝子を含むＤＮＡに
関する。また、本発明は、このＤＮＡを組み込んだペプ
チド輸送タンパク質産生能を有するベクターに関する。
さらに、本発明は、このベクターで形質転換したペプチ
ド輸送タンパク質産生能を有する微生物、この微生物を
培養してペプチド輸送タンパク質を産生させた菌体から
調製したペプチド輸送タンパク質を含有する膜小胞に関
する。

【０００２】

【従来の技術】生物は、生体外から栄養源を取り込む必
要性から、様々な輸送タンパク質を産生することが知ら
れている。そして、これまでに種々のペプチド輸送タン
パク質が見出されている(Mol. Microbiol., vol.16, p.
825, 1995)。このペプチド輸送タンパク質は、輸送に際
して消費されるエネルギー源の獲得形式に応じ、大きく
二つのタイプに分類することができる。第一のタイプ
は、生体内のＡＴＰ(アデノシン三リン酸)を利用するも
のである。このタイプのペプチド輸送タンパク質は、Ａ
ＢＣ輸送タンパクと呼ばれており、 Higginsの著名な総
説が知られている(Annu. Rev. Cell Biol., vol.8, p.6
7, 1992)。第二のタイプは、ＰＴＲファミリーに属する
ものであり、Steiner により命名されたものである(Mo
l. Microbiol., vol.16, p.825, 1995)。このペプチド
輸送タンパク質は、細胞内外のプロトンの濃度差（プロ
トン駆動力）を利用してペプチド輸送を行うものであ
る。第二のタイプであるプロトン駆動力を利用するペプ
チド輸送タンパク質は、多くの生物で見出されている
が、それらは真核生物に由来するものであり、原核生物
に由来するものとしては、ラクトコッカス・ラクチス(L
actococcus lactis)由来のペプチド輸送タンパク質が知
られるのみであった(J. Biol. Chem., vol.264, p.1139
1, 1994)。しかし、ラクトコッカス・ラクチス(Lactoco
ccus lactis) は、中温性の乳酸菌であるので、ラクト
コッカス・ラクチス(Lactococcus lactis) 由来のペプ
チド輸送タンパク質は、30℃前後の中温域のみでしか使
用することができないという欠点があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、原核生
物に由来するペプチド輸送タンパク質について、鋭意研
究を進めていたところ、ラクトバチルス・ヘルベティカ
ス(Lactobacillus helveticus) に、ペプチド輸送タン
パク質を産生する可能性があることを見出した。そこ
で、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus h
elveticus)の遺伝子をクローニングして、ペプチド輸送
タンパク質を産生する可能性のあるＤＮＡを取得し、こ
のＤＮＡを組み込んだベクターで形質転換した大腸菌
が、ジペプチド及びトリペプチドを特異的に取り込む性
質を有するペプチド輸送タンパク質を産生することを確
認した。さらに、ペプチド輸送タンパク質を産生した大
腸菌から調製されたペプチド輸送タンパク質を含有する
膜小胞を利用することにより、ジペプチド及びトリペプ
チドを特異的に取り込むことができることを見出し、本
発明を完成するに至った。したがって、本発明は、ラク
トバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticu
s) 由来のペプチド輸送タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ
を提供することを課題とする。また、本発明は、ラクト
バチルス・ヘルベティカス(Lactobacillushelveticus)
由来のペプチド輸送タンパク質遺伝子を含むＤＮＡを組
み込んだペプチド輸送タンパク質産生能を有するベクタ
ーを提供することを課題とする。さらに、本発明は、ペ
プチド輸送タンパク質産生能を有するベクターで形質転
換した微生物を提供し、この微生物を培養してペプチド
輸送タンパク質を産生させた菌体から調製したペプチド
輸送タンパク質を含有する膜小胞を提供することを課題
とする。

【０００４】

【課題を解決するための手段】したがって、本発明は、
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helve
ticus)由来のペプチド輸送タンパク質遺伝子を含むＤＮ
Ａである。本発明はまた、ラクトバチルス・ヘルベティ
カス(Lactobacillus helveticus)の染色体遺伝子を、制
限酵素ＨｐａＩで切断することにより得られるペプチド
輸送タンパク質遺伝子を含むＤＮＡである。本発明はま
た、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus h
elveticus)の染色体遺伝子を制限酵素ＨｐａＩで切断す
ることにより得られるＤＮＡを、逆ＰＣＲ（inversePC
R）法で増幅することにより得られるＥｃｏＲＶサイト
及びＢａｍＨＩサイトを有するペプチド輸送タンパク質
遺伝子を含むＤＮＡである。本発明はまた、ラクトバチ
ルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)が、
ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helve
ticus) SBT 2171(FERM P-14381)である前記ＤＮＡであ
る。本発明はまた、前記ＤＮＡを組み込んだペプチド輸
送タンパク質産生能を有するベクターである。本発明は
また、前記ベクターで形質転換したペプチド輸送タンパ
ク質産生能を有する微生物である。本発明はまた、前記
微生物を培養してペプチド輸送タンパク質を産生させた
菌体から調製したペプチド輸送タンパク質を含有する膜
小胞である。

【０００５】以下、本発明について、詳しく説明する。
本発明のラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacill
us helveticus)由来のペプチド輸送タンパク質遺伝子を
含むＤＮＡは、Delleyらの方法(Appl. Environ. Microb
iol., vol.56, p.1967, 1990)等で取得したラクトバチ
ルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus) の
染色体遺伝子を制限酵素ＨｐａＩで切断することにより
得ることができる。なお、本発明において、ラクトバチ
ルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)は、
具体的には、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactoba
cillus helveticus) SBT 2171 (FERM P-14381)である。
さらに、このようにして得られたＤＮＡを、逆ＰＣＲ法
により増幅することにより、ＥｃｏＲＶサイト及びＢａ
ｍＨＩサイトを有するペプチド輸送タンパク質遺伝子を
含むＤＮＡを得ることができる。これらのＤＮＡをベク
ターに組み込んで、ペプチド輸送タンパク質産生能を有
するベクターを得、さらに、得られたベクターで、大腸
菌、枯草菌等の微生物を形質転換して、ペプチド輸送タ
ンパク質の産生能が付与された微生物を得ることができ
る。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明のラクトバチルス・ヘルベ
ティカス（Lactobacillus helveticus）由来のペプチド
輸送タンパク質は、ジペプチド及びトリペプチドを特異
的に取り組む性質を有する。従って、本発明のＤＮＡを
ベクターに組み込んだペプチド輸送タンパク質産生能を
有するプラスミドで形質転換した微生物や、これらの微
生物を培養してペプチド輸送タンパク質を産生させた菌
体から調製したペプチド輸送タンパク質を含有する膜小
胞は、ペプチド輸送タンパク質として使用することがで
きる。例えば、これらの微生物の菌体自体や、菌体から
膜成分を取り出して調製した膜小胞は、ペプチド、ジペ
プチド及びトリペプチドを特異的に濃縮するための担体
や、ジペプチド及びトリペプチドを特異的に検出するセ
ンサー等に利用することができる。ラクトバチルス・ヘ
ルベティカス(Lactobacillus helveticus) は、高温性
の乳酸菌であるので、これに由来する本発明のペプチド
輸送タンパク質は、50℃前後の高温域でも使用が可能で
あるという特徴を有する。なお、ペプチド輸送タンパク
質として膜小胞を使用する場合は、イオン勾配を用いた
方法(Poolman et al., Handbook of Biomembrane,1992)
や牛心筋由来のチトクロムＣオキシダーゼと融合させ
る方法(Driessen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., vo
l.82, p.7555, 1985) 等、プロトン駆動力生成方法を適
宜組み合わせて使用するとよい。

【０００７】

【実施例】次に、実施例及び試験例を示し、本発明をさ
らに詳しく説明する。実施例１（ａ）ラクトバチルス・ヘルベティカスの染色体遺伝子
の調製 Delleyらの方法(Appl. Environ. Microbiol. vol.56, p
p.1967-1970, 1970)に従い、ラクトバチルス・ヘルベテ
ィカス(Lactobacillus helveticus)の染色体遺伝子を調
製した。すなわち、ラクトバチルス・ヘルベティカス(L
actobacillus helveticus) SBT2171 (FERM P-14381) を
ＭＲＳ培地で37℃、16時間培養した後、５％ＭＲＳ培地
に接種し、37℃、５時間培養した。得られた培養物を、
100mMリン酸緩衝液(pH7.0)で２回洗浄した後、遠心分離
を行って菌体を回収し、1mMＥＤＴＡ(エチレンジアミン
四酢酸) を含む10mMトリス緩衝液(pH 7.8)に懸濁した。
次に、菌体を破壊するための操作を行った。すなわち、
菌体懸濁液に、濃度が250μg/mlとなるようにプロテア
ーゼＫ（ベーリンガーマンハイム社製）を、濃度が 500
μg/mlとなるようにプロテアーゼＥ（生化学工業製）を
それぞれ添加して、37℃、30分の処理を行った後、1mM
ＥＤＴＡを含む10mMトリス緩衝液(pH 7.8)で洗浄し、同
緩衝液に処理菌体を懸濁した。この処理菌体懸濁液に、
ムタノリシン（生化学工業製）160Uを添加し、37℃、30
分の処理を行った後、濃度が 0.1％となるようにＳＤＳ
(ラウリル硫酸ナトリウム）を、濃度が75mMとなるよう
にＥＤＴＡを、濃度が 200μg/mlとなるようにプロテア
ーゼＫをそれぞれ添加し、65℃、２時間の処理を行っ
た。そして、上記の処理を行った菌体懸濁液を有機溶媒
（フェノール：クロロホルム＝１：１）で３回洗浄し、
同有機溶媒で分液して水層を回収した後、この水層に最
終濃度が70％となるように冷エタノールを加え、生成し
た沈澱物から滅菌楊枝で染色体遺伝子を巻き取って回収
した。（ｂ）ペプチド輸送蛋白質遺伝子を含むＤＮＡの調製このラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus h
elveticus)SBT 2171(FERM P-14381) の染色体遺伝子に
ついて、制限酵素ＨｐａＩで、37℃、６時間の分解を行
い、ペプチド輸送タンパク質遺伝子を含むＤＮＡを得
た。

【０００８】実施例２（ＤＮＡの増幅）ペプチド輸送タンパク質遺伝子を含む
ＤＮＡを、逆ＰＣＲ法により増幅した。すなわち、実施
例１で得られたＤＮＡをＴ４−ＤＮＡライゲース（ベー
リンガーマンハイム社製）により結合させて環状ＤＮＡ
とし、増幅用鋳型とした。なお、ＤＮＡの増幅は、表１
に示す組成により行った。

【０００９】

【表１】 −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− ＤＮＡ断片50μg/ml溶液 2μl 10倍ＰＣＲ緩衝液（ベーリンガーマンハイム社製） 10μl 5mM ｄＮＴＰミックス（ベーリンガーマンハイム社製） 4μl 100mM 塩化マグネシウム 2μl プライマー１ 2μl プライマー２ 2μl 滅菌水 77μl −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− プライマー１：５’−ＴＣＣＴＧＴＡＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＧ（ＥｃｏＲＶサイトが導入されている）プライマー２：５’−ＡＴＧＡＣＡＣＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＣＴＧ（ＢａｍＨＩサイトが導入されている）

【００１０】次に、ＰＷＯポリメラーゼ（ベーリンガー
マンハイム社製）１μl を加え、下記(1)〜(5)の反応工
程：(1)95℃、10分、(2) 95℃、90秒、(3) 50℃、２
分、(4)72℃、３分、(5)(2)から(4)の30サイクルの繰り
返しにより、ＤＮＡの増幅を行い、ペプチド輸送タンパ
ク質遺伝子を含むＤＮＡを得た。このＤＮＡの塩基配列
及びその塩基配列から推定されるアミノ酸配列を、図１
〜図３及び配列表の配列番号１に示す。なお、反応を開
始する直前に滅菌ミネラルオイルを重層し、水分の蒸散
を防止した。

【００１１】実施例３（ベクターの調製）増幅されたペプチド輸送タンパク質
遺伝子を含むＤＮＡをベクターに結合した。すなわち、
予め制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＶで切断しておい
た大腸菌用ベクターｐＴＡＱＩ（Gencor社製）と、実施
例２で得られたＤＮＡを混合し、ＤＮＡライゲース（ベ
ーリンガーマンハイム社製）で結合させて、ペプチド輸
送タンパク質遺伝子を含むＤＮＡを組み込んだペプチド
輸送タンパク質産生能を有するベクターを得た。

【００１２】実施例４（微生物の形質転換）ペプチド輸送タンパク質産生能を
有するベクターを用い、微生物の形質転換を行った。す
なわち、予め塩化カルシウムで処理した大腸菌 E1772株
(J. Bacteriol., vol.173, pp.234-244, 1991)と、実施
例３で得られたペプチド輸送タンパク質産生能を有する
ベクターを混合し、42℃、90秒のヒートショックにより
ベクターを大腸菌に導入して、ペプチド輸送タンパク質
産生能を有する大腸菌を得た。なお、大腸菌に導入した
ベクターは、アンピシリン 100μg/mlを添加した培地
（ペプトン10g/l、酵母エキス5g/l、食塩5g/l) で選択
した。

【００１３】試験例１（大腸菌のジペプチド取り込み量の測定）実施例４で得
られたペプチド輸送タンパク質産生能を有する大腸菌
に、10mMＤ−乳酸を添加し、酸素を吹き込んだ。１分
後、¹⁴Ｃでラベルしたプロリルアラニン（Ｐｒｏ−Ａｌ
ａ）を添加し、経時的にサンプルを採取して、メンブラ
ンフィルター (0.45μm)で大腸菌をトラップした。そし
て、このフィルターを氷冷した0.1M塩化リチウムで２回
洗浄した後、フィルターを液体シンチレーションカクテ
ルに溶解し、放射活性を測定して、大腸菌のジペプチド
取り込み量を求めた。また、対照として、形質転換して
いない大腸菌と、実施例４と同様の方法により調製した
ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）のＤ
ＮＡ断片を組み込んだペプチド輸送タンパク質産生能を
有するベクターで形質転換した大腸菌についても同様の
試験を行った。結果を図４に示す。図４に示される結果
より、形質転換していない大腸菌は、ジペプチド取り込
み量が極めて低く経時的な増加もほとんどなかった。ま
た、本発明のラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactoba
cillus helveticus)のＤＮＡを導入された大腸菌は、ラ
クトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）のＤＮ
Ａを導入された大腸菌よりも、ジペプチド取り込み量が
非常に高いことが明らかとなった。

【００１４】実施例５（膜小胞の調製）実施例４で得られたペプチド輸送タン
パク質産生能を有する大腸菌を培養し、ペプチド輸送タ
ンパク質を産生させた菌体から膜小胞を調製した。すな
わち、酵母エキス10g/l及びコハク酸ナトリウム10g/lを
添加したＭ９培地（リン酸水素二ナトリウム64g/l、リ
ン酸二水素カリウム15g/l、塩化ナトリウム2.5g/l、塩
化アンモニウム5.0g/lからなるＭ９塩ミックス溶液 200
ml/l、20％グルコース溶液20ml/l）で、37℃、３時間培
養した後、培養物をリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)で洗
浄して、集菌した。そして、Kabackの方法(Methods of
Enzymology, vol.22, pp.99-120, 1971)に従い、この大
腸菌からペプチド輸送タンパク質を含有する膜小胞を調
製した。なお、調製した膜小胞は、各試験に使用する直
前まで液体窒素中で保存しておいた。

【００１５】試験例２（膜小胞のジペプチド取り込み量の測定）実施例５で得
られたペプチド輸送タンパク質を含有する膜小胞の懸濁
液に、最終濃度が50μM となるようにフェナジンメトサ
ルフェートを添加し、空気を吹き込んで、30℃に保持し
た。そして、１分後、最終濃度が10mMとなるようにアス
コルビン酸カリウムを添加し、さらに、１分後、¹⁴Ｃで
ラベルしたＰｒｏ−Ａｌａを添加し、経時的にサンプル
を採取して、メンブランフィルター (0.45μm)で大腸菌
をトラップした。このフィルターを氷冷した0.1M塩化リ
チウムで２回洗浄した後、フィルターを液体シンチレー
ションカクテルに溶解し、放射活性を測定して、膜小胞
のジペプチド取り込み量を求めた。また、対照として、
形質転換していない大腸菌から調製した膜小胞について
も同様の試験を行った。結果を図５に示す。図５に示さ
れる結果より、形質転換していない大腸菌から調製した
膜小胞はジペプチドの取り込み量が低く、経時的変化も
ほとんどないが、本発明の膜小胞は、ジペプチドの取り
込み量が極めて高いことが明らかとなった。さらに、本
発明の膜小胞のジペプチド取り込み量を、37℃と45℃に
おいて比較した。結果を図６に示す。図６から、本発明
の膜小胞は、45℃の高温域において、37℃におけるより
もさらに活性が高いことが判明した。

【００１６】

【発明の効果】本発明のペプチド輸送タンパク質遺伝子
を含むＤＮＡを組み込んだベクターで形質転換した微生
物により産生されるペプチド輸送タンパク質は、ジペプ
チド及びトリペプチドを特異的に取り込むという性質を
有するので、腸管での吸収性が良好で利用効率が高いと
いわれているジペプチド及びトリペプチドを濃縮する際
に使用することができる。また、これらは、ジペプチド
及びトリペプチドを検知する際に使用するセンサーとす
ることもできる。特に、本発明により産生されるペプチ
ド輸送タンパク質は、熱安定性が高く、50℃程度の高温
域においても活性を有するので、高温での酵素反応が必
要であるといわれているタンパク質分解システムにオン
ラインで接続した濃縮装置やセンサー部として有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例２で得られたペプチド輸送タンパク質産
生遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列及びその塩基配列から
推定されるアミノ酸配列を示す。

【図２】実施例２で得られたペプチド輸送タンパク質産
生遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列及びその塩基配列から
推定されるアミノ酸配列の、図１の続きを示す。

【図３】実施例２で得られたペプチド輸送タンパク質産
生遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列及びその塩基配列から
推定されるアミノ酸配列の、図２の続きを示す。

【図４】試験例１における大腸菌のジペプチド取り込み
量を示すグラフである。

【図５】試験例２における膜小胞のジペプチド取り込み
量を示すグラフである。

【図６】試験例２における膜小胞の37℃及び45℃におけ
るジペプチド取り込み量を示すグラフである。

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：1884 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：Lactobacillus helveticus 株名：SBT 2171 配列 AAGATGGACG TTAAGGTCAT CGAAAGCAAG GTTAACTTGA TCGAAGCTGA AAAAGATGCT -121 GTTAATGATG CAGTTGCTAA AGCAATTGAT TAAGTAATAT AAAGTAATAA AAATAAGGAT -61 CTATCTGTAA ATAGGATAGG TCCTTATTTT TCGTGGTGTA ATTGTTTTTA TTGCTTACCT -1 TAGATAAGAA AGGAGTTTTT CTTTGGGTAA ACGAGTTCAA ATACAGCATT CTTTGGACAG 60 CCAAAGGGCT TGTCCACTTT ATTCTTCACT GAAATGTGGG AGCGTTTCAG TTACTACGGC 120 ATG CGG GCT ATC TTA TTA TTC TAC 144 Met Arg Ala Ile Leu Leu Phe Tyr 1 5 ATG TAT TAC GCA GTT ACC AAA GGT GGT TTG GGG ATG TCT CAA ACT ACT 192 Met Tyr Tyr Ala Val Thr Lys Gly Gly Leu Gly Met Ser Gln Thr Thr 10 15 20 GCT GCT TCA ATC ATG TCG ATC TAT GGT TCG CTT GTT TAT TTA TCA ACA 240 Ala Ala Ser Ile Met Ser Ile Tyr Gly Ser Leu Val Tyr Leu Ser Thr 25 30 35 40 CTA GTT GGA GGC TGG CTT TCT GAC AGA GTA TGG GGC TCT AGA AAA ACA 288 Leu Val Gly Gly Trp Leu Ser Asp Arg Val Trp Gly Ser Arg Lys Thr 45 50 55 GTC TTC TAC GGC GGT GTG CTT ATT ATG TTG GGA CAC ATC GTT TTG GCT 336 Val Phe Tyr Gly Gly Val Leu Ile Met Leu Gly His Ile Val Leu Ala 60 65 70 TTG CCA GCT GGT GTA ACG GTG CTA TAC AGG TCG ATT GCT TTA ATC GTT 384 Leu Pro Ala Gly Val Thr Val Leu Tyr Arg Ser Ile Ala Leu Ile Val 75 80 85 GTA GGT ACT GGA TTA TTA AAG CCG AAC GTA TCC GAT ATG GTT GGG GGT 432 Val Gly Thr Gly Leu Leu Lys Pro Asn Val Ser Asp Met Val Gly Gly 90 95 100 CTT TAT TCG GTT GAA GAT CCC CGT CGT GAC GCT GGT TTC AGT ATT TTT 480 Leu Tyr Ser Val Glu Asp Pro Arg Arg Asp Ala Gly Phe Ser Ile Phe 105 110 115 120 GTT TTC GGG ATT AAC TTA GGC TCA ATT ATT GCT CCA TGG CTT GTA CCA 528 Val Phe Gly Ile Asn Leu Gly Ser Ile Ile Ala Pro Trp Leu Val Pro 125 130 135 TGG GCA GCT CAG GGC TTC GGT GTC CAT ATT TTT GGT AGC CAA TTG AAC 576 Trp Ala Ala Gln Gly Phe Gly Val His Ile Phe Gly Ser Gln Leu Asn 140 145 150 TTC CAT GCA GGA TTC TCA TTA GCT GCA GTT GGT ATG TTC TTT GGT TTA 624 Phe His Ala Gly Phe Ser Leu Ala Ala Val Gly Met Phe Phe Gly Leu 155 160 165 GTA CAA TAT GTA CTT GGT GGT AAA AAA TAC TTA TCA ACT GAA AGT CTG 672 Val Gln Tyr Val Leu Gly Gly Lys Lys Tyr Leu Ser Thr Glu Ser Leu 170 175 180 ACA CCT AAT GAT CCT ATT GAT AAA GGC GAT TTG CTT AAT GTG ATC AAG 720 Thr Pro Asn Asp Pro Ile Asp Lys Gly Asp Leu Leu Asn Val Ile Lys 185 190 195 200 TGG GTT GTC ATT ATT ATC ATC GCA ATT GTT GCA ATT TTA GCC GCT ATG 768 Trp Val Val Ile Ile Ile Ile Ala Ile Val Ala Ile Leu Ala Ala Met 205 210 215 GCA GGA GTA GGG CAA TTA AGC GTT GAT AAT GTA ATT ACC TTA TTA ACT 816 Ala Gly Val Gly Gln Leu Ser Val Asp Asn Val Ile Thr Leu Leu Thr 220 225 230 ATT TTG GCG ATT GCA TTG CCA ATC TAC TAC TTC GTG ATG ATG TTT CGC 864 Ile Leu Ala Ile Ala Leu Pro Ile Tyr Tyr Phe Val Met Met Phe Arg 235 240 245 AGC TCA AAG GTT ACT AAG ATT GAG TTA GGA ATT CAT TTA CTA CCT GTA 912 Ser Ser Lys Val Thr Lys Ile Glu Leu Gly Ile His Leu Lue Pro Val 250 255 260 AGC TTG AAG AAT CGG CTG TTT TTC AAA AAA GGA TAT AAG CGG CTT AAG 960 Ser Leu Lys Asn Arg Leu Phe Phe Lys Lys Gly Tyr Lys Arg Leu Lys 265 270 275 280 CAG ATA ATT CAG CTT GAA CTT GCC ATA AAA AGG CAA AGC TTT ATT ATT 1008 Gln Ile Ile Gln Leu Glu Leu Ala Ile Lys Arg Gln Ser Phe Ile Ile 285 290 295 CTG ATA GCG CTC ATC ATC ATG GCC AGC ATT TTG ATT CCA AAC AAA GTG 1056 Leu Ile Ala Leu Ile Ile Met Ala Ser Ile Leu Ile Pro Asn Lys Val 300 305 310 ATC ATT GCC AAA CAT CTG CTC AAG CTG GTT TTG TTG GTG TTC TAT TGG 1104 Ile Ile Ala Lys His Leu Leu Lys Leu Val Leu Leu Val Phe Tyr Trp 315 320 325 ATA GGT CTT AAT TTG ATC CCT TTT AGC ACA TTT GTT CTC TCC TTT CTT 1152 Ile Gly Leu Asn Leu Ile Pro Phe Ser Thr Phe Val Leu Ser Phe Leu 330 335 340 TTT TTA GAT TAT ATC AAA CAT ATG TTT AAG AAA GAG GGG GAA CAA GCA 1200 Phe Leu Asn Tyr Ile Lys His Met Phe Lys Lys Glu Gly Glu Gln Ala 345 350 355 360 AAA AAA ACA AAA GAA AAA AGC CGG ATT CAT CAC GGG ATT GAA ATC CCG 1248 Lys Lys Thr Lys Glu Lys Ser Arg Ile His His Gly Ile Glu Ile Pro 365 370 375 TTG TTT CTC CGG CAA TTA ATC ATA AAT ATA TTC ACC CTA ATA ATT TTG 1296 Leu Phe Leu Arg Gln Leu Ile Ile Asn Ile Phe Thr Leu Ile Ile Leu 380 385 390 GAA GGC GAA ACG CTT TTT GAT GAA AAT GGG GTA GAG GTC AAT ATT GCT 1344 Glu Gly Glu Thr Leu Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Asn Ile Ala 395 400 405 GAA CAT CCA GTG CAA GGA TAT ACG GAA TTG AAT ATC AAC CTT TTG AAT 1392 Glu His Pro Val Gln Gly Tyr Thr Glu Leu Asn Ile Asn Leu Leu Asn 410 415 420 AAA GAT AGC ATT GAT TTG TGG GCT GAT TGG ATT CAA AGC GTT GCA AAA 1440 Lys Asp Ser Ile Asp Leu Trp Ala Asp Trp Ile Gln Ser Val Ala Lys 425 430 435 440 TAT TTG CTT AAT ATC ATG TAT ACG GCA GAT GTG ATC GTA ATA ATT ATT 1488 Tyr Leu Lue Asn Ile Met Tyr Thr Ala Asp Val Ile Val Ile Ile Ile 445 450 455 TTC TAC CTC GTG AAG ATG GCG GCA TTG TGG TGG GCA TGG TCG TAT ATA 1536 Phe Tyr Leu Val Lys Met Ala Ala Leu Trp Trp Ala Trp Ser Tyr Ile 460 465 470 CCG TTG AGT ACA GTA TTT GTA GGC TAT AAA TAC TCA GGT AAA GAT GAG 1584 Pro Leu Ser Thr Val Phe Val Gly Tyr Lys Tyr Ser Gly Lys Asp Glu 475 480 485 TCC TTG CAA GCT GCT TTA GAA GTT TTA TGATAATGGA TCAAAGATTG 1631 Ser Leu Gln Ala Ala Leu Glu Val Leu 490 495 AATTAAAAAA CCTTCTCGCA ATGAGAAGGT TTTTCGTTAG AATTCAGTAT GAATAATGTC 1691 ATCTTCTGGA CGATGTGCTT GG 1703

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lacto
bacillus helveticus) 由来のペプチド輸送タンパク質
遺伝子を含むＤＮＡ。
【請求項２】ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lacto
bacillus helveticus) の染色体遺伝子を制限酵素Ｈｐ
ａＩで切断することにより得られるペプチド輸送タンパ
ク質遺伝子を含むＤＮＡ。
【請求項３】ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lacto
bacillus helveticus) の染色体遺伝子を制限酵素Ｈｐ
ａＩで切断することにより得られるＤＮＡ断片を、逆Ｐ
ＣＲ（inverse PCR）法で増幅することにより得られる
ＥｃｏＲＶサイト及びＢａｍＨＩサイトを有するペプチ
ド輸送タンパク質遺伝子を含むＤＮＡ。
【請求項４】ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lacto
bacillus helveticus) が、ラクトバチルス・ヘルベテ
ィカス(Lactobacillus helveticus) SBT 2171(FERM P-1
4381)である請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ。
【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡ
を組み込んだペプチド輸送タンパク質産生能を有するベ
クター。
【請求項６】請求項５に記載のベクターで形質転換し
たペプチド輸送タンパク質産生能を有する微生物。
【請求項７】請求項６に記載の微生物を培養してペプ
チド輸送タンパク質を産生させた菌体から調製したペプ
チド輸送タンパク質を含有する膜小胞。