JPH11178571A

JPH11178571A - 核酸抽出方法およびそのための試薬

Info

Publication number: JPH11178571A
Application number: JP35110297A
Authority: JP
Inventors: Katsuya Daimon; 克哉大門; Shigeru Komai; 茂駒井; Yutaka Takarada; 裕宝田
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1997-12-19
Filing date: 1997-12-19
Publication date: 1999-07-06

Abstract

(57)【要約】【課題】生物試料、特に多量の夾雑物質を含む全血検体
のような生物試料において、核酸を効率よく簡便に、そ
して自動機械化可能な手段にて抽出する方法を提供す
る。【解決手段】核酸を含有する試料中の核酸を核酸結合性
担体に結合させ、該試料中の核酸以外の物質を除去した
後、核酸を結合した核酸結合性担体から核酸を溶出する
核酸抽出方法において、該核酸結合性担体が予め界面活
性剤を含む溶液中に懸濁された担体である核酸抽出方法
ならびに該方法により抽出された核酸を必要により増幅
した後、目的の核酸を検出する方法およびそのための試
薬。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、核酸を含有する試
料から核酸を抽出する方法、抽出された核酸を必要によ
り増幅し、検出する方法ならびにそれらの試薬に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】近年の遺伝子工学および分子生物学など
の分野の進歩により、感染症や遺伝子疾患などについ
て、ＤＮＡまたはＲＮＡレベルで診断することが可能に
なった。特に、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション
法（ＰＣＲ法、Science, 230:1350-1354,1985)やＮＡＳ
ＢＡ法（Nucleic Acid Sequence Based Amplification
法、Nature, 350,91-92,1991、特許第 2648802号公報お
よび特許第 2650159号公報記載）などの核酸増幅方法に
より、従来であれば、検出が非常に困難であった、生物
試料中の極微量の核酸の検出が可能となり、遺伝子解析
が飛躍的に容易なものとなった。

【０００３】しかしながら、生物試料中の核酸を必要に
より、増幅した後、検出するためには、試料中の核酸を
選択的に取り出す必要がある。これは、通常の生物試料
中には核酸以外の夾雑物質、例えばタンパク質、脂質、
糖類などが大量に含まれており、これらが増幅や検出に
悪影響を及ぼす可能性が少なくないため、予め試料中の
これらの夾雑物質を除き、核酸を抽出し、単離する操作
が必要となる。

【０００４】この核酸の抽出方法は古くから様々な手法
で行われてきた。代表的なものはフェノール法（Biochi
mica et Biophysica Acta, 72:619-629,1963）、アルカ
リ法（Nucleic Acid Research, 7:1513-1523,1979)など
があり、これらの方法は液相で行う方法である。これら
の方法は実験室スケールで汎用されるが、有害かつ廃棄
の容易でないフェノールやクロロホルムのような有機溶
媒などのほか、危険物である水酸化ナトリウムなどを使
用するため、技術的には熟練を要し、再現性よく実施す
ることはかなり困難な方法である。

【０００５】また核酸の抽出に核酸結合用担体を用いる
系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウムを用いる方
法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 76-2:615-619,1979)、ヒ
ドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭 63-263093号
公報）などがある。これらの方法は有害な有機溶媒など
はそれほど使用しないが、そのかわり工程中に遠心分離
操作を多く含むため、多数の試料を一度に処理すること
が困難で、核酸を単離するのに長時間かかるという問題
を含んでいる。

【０００６】このように、従来の核酸単離方法は有機溶
媒やアルカリなどの危険な試薬を使用すること、遠心分
離操作を必要とし、多数検体の処理が難しいことなどの
難点があるが、多数の検体を再現性よく処理し、人的コ
ストを低減させる自動機械化において、さらに大きな問
題点が存在する。

【０００７】核酸抽出の自動機械化を目指したものとし
て、核酸結合性シリカ粒子とカオトロピックイオンを用
いた方法（J.Clinical Microbiology, 28-3:495-503,19
90、特許第 2680462号公報記載）がある。これは、核酸
結合性シリカ粒子と試料中の核酸を遊離する能力をもつ
カオトロピックイオンを試料と混合し、試料中の核酸を
核酸結合性シリカ粒子に結合させ、固相と液相を分離し
て、試料中の夾雑物質を除去した後、核酸結合性シリカ
粒子に結合した核酸を溶離するというものである。該方
法はＤＮＡに加えて、より不安定であるＲＮＡの抽出に
も好適であり、また純度の高い核酸が得られるという点
で非常に優れている。

【０００８】しかしながら、この核酸が結合したシリカ
粒子の洗浄については、遠心分離またはフィルターなど
を使用した濾過などの操作を行う必要があり、機械化の
際に工程が複雑となる。

【０００９】従って、該シリカ粒子を容易に混合あるい
は洗浄するために、該シリカ粒子に磁性をもたせ、磁気
により混合および撹拌する方法（特開平9-19292 号公報
記載）が考えられた。この方法は、試料中の核酸を磁性
シリカ粒子に結合させ、洗浄後、回収するもので、機械
化の際の工程はより簡便になる。しかし、単に磁性をも
たせた粒子を使用するだけでは、検体の種類に影響され
やすく、血液検体、特に全血検体においては回収が困難
となる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決するためになされたものであり、生物試料、特
に多量の夾雑物質を含む全血検体のような生物試料にお
いて、核酸を効率よく簡便に、そして自動機械化可能な
手段にて抽出する方法を提供することを課題とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
課題を解決すべく種々、鋭意検討した結果、生物試料、
特に全血検体から核酸を効率よく回収するために、予め
界面活性剤を含む試薬溶液に核酸結合性担体を懸濁させ
ることが有効であることを見い出し、本発明に到達し
た。

【００１２】すなわち、本発明は核酸を含有する試料中
の核酸を核酸結合性担体に結合させ、該試料中の核酸以
外の物質を除去した後、核酸を結合した核酸結合性担体
から核酸を溶出する核酸抽出方法において、該核酸結合
性担体が予め界面活性剤を含む溶液中に懸濁された担体
であることを特徴とする核酸抽出方法である。

【００１３】また、本発明は下記工程（ａ）〜（ｃ）を
含むことを特徴とする核酸抽出方法である。（ａ）予め界面活性剤を含む溶液中に懸濁された核酸結
合性担体、核酸を含有する試料および核酸を核酸結合性
担体に吸着させるための核酸吸着用溶液を混合して、核
酸を核酸結合性担体に結合させる工程（ｂ）核酸が結合した核酸結合性担体を液体から分離
し、必要により洗浄し、および（ｃ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶出する
工程

【００１４】さらに、本発明は少なくとも、（１）予め
界面活性剤を含む溶液中に懸濁させた核酸結合性担体、
（２）核酸を核酸結合性担体に結合させるための核酸吸
着用溶液および（３）核酸結合性担体に結合した核酸を
溶出するための試薬を含むことを特徴とする核酸抽出用
試薬である。

【００１５】本発明は下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むこ
とを特徴とする核酸検出方法である。（ａ）予め界面活性剤を含む溶液中に懸濁された核酸結
合性担体と、核酸を含有する試料および核酸を核酸結合
性担体に吸着させるための核酸吸着用溶液を混合し、核
酸を核酸結合性担体に結合させる工程、（ｂ）核酸が結
合した核酸結合性担体を液体から分離し、必要により洗
浄し、（ｃ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶
出する工程、（ｄ）必要により、得られた核酸を増幅す
る工程、および（ｅ）目的の核酸を検出する工程

【００１６】また、本発明は少なくとも、（１）予め界
面活性剤を含んむ溶液中に懸濁させた核酸結合性担体、
（２）核酸を核酸結合性担体に吸着させるための核酸吸
着用溶液、（３）核酸結合性担体に結合した核酸を溶出
するための試薬、必要により（４）核酸増幅試薬および
（５）核酸検出用プローブ試薬を含むことを特徴とする
核酸検出用試薬である。

【００１７】

【発明の実施態様】本発明における核酸を含有する試料
とは、全血、血清、血漿、尿、唾液、体液などの動物由
来の生物材料、その他、植物、微生物などの動物以外の
生物材料を包含する。また、これらの生物材料から分離
した細胞および培養細胞を含む。核酸とは、ＤＮＡまた
はＲＮＡを意味し、ＤＮＡとしては、２本鎖ＤＮＡ、１
本鎖ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａなどを含む。また、ＲＮＡとしては、ウイルス、細菌
あるいは真菌等の外来性寄生生物由来のＲＮＡに加え
て、これらの生物材料を産する生物に由来する内在性の
ＲＮＡを含み、ｔ−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡな
どを含む。

【００１８】本発明において使用する核酸結合性担体と
は、試料中の核酸を結合する担体であり、好ましくはカ
オトロピックイオンの存在下に核酸を吸着、すなわち可
逆的な物理的結合により保持することができる親水性表
面を有する固体であれば、特に限定されない。具体的に
は、二酸化珪素、すなわちシリカが好ましく用いられ
る。さらに、二酸化珪素を主成分とする他の物質、例え
ばガラス、珪藻土、あるいはこれらを化学的修飾により
表面処理を施したものや、超常磁性金属酸化物等の他の
物質との複合体も含まれる。化学的修飾により表面処理
を施す場合は、核酸との可逆的な結合を妨げない程度
に、適度な陽性電荷を帯びさせてもよい。自動化を行う
には磁性粒子が特に好ましい。

【００１９】また、これらの核酸結合性担体の形態とし
ては、粒子、フィルター、反応容器等が具体的に挙げら
れるが、特に限定されない。これらのうち、吸着と溶出
の効率を考慮すると、粒子の形態がより好ましい。さら
に、その場合の粒径は、０．０５〜５００μｍ、好まし
くは１〜１００μｍ、特に１〜１０μｍがより好適であ
る。

【００２０】界面活性剤としては、非イオン界面活性
剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、両性界
面活性剤などがあり、好ましくは非イオン界面活性剤を
使用する。非イオン界面活性剤としては、高級アルコー
ル、アルキルフェノール、脂肪酸などのエチレングリコ
ール、多価アルコールの部分エステル、高級脂肪酸グリ
セロールエステル、ソルビトールの脂肪酸エステル、ポ
リプロピレングルコールを疎水性基とし両端にエチレン
グリコールを親水性基として付加重合させたものなどが
ある。具体的は、トリトン系界面活性剤、トウイーン系
界面活性剤、アシルソルビタンなどが例示される。陽イ
オン界面活性剤としては、ドデシルトリメチルアンモニ
ウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリ
ド、セチルトリメチルアンモニウムブロミドなどが例示
される。陰イオン界面活性剤としては、ドデシル硫酸ナ
トリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、コー
ル酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、サルコシン
などが例示される。両性イオン界面活性剤としては、ホ
スファチジルエタノールアミンなどが例示される。これ
らの界面活性剤は単独で、または２種以上併用してもよ
い。

【００２１】これらの界面活性剤の使用濃度は、界面活
性剤の種類により異なり、通常、０．１〜１０容量％で
あり、例えばトリトンＸ−１００を使用した場合、０．
５〜５．０容量％である。本発明では核酸を核酸結合性
担体に結合させる工程の前に、予め界面活性剤を含む溶
液に核酸結合性担体を懸濁させておくことが特徴であ
る。核酸結合性担体の量は、約１．０〜５０重量％であ
り、懸濁条件は、温度約１０〜５０℃、時間約５〜５０
分間である。従来、このような担体は乾燥状態または水
系溶液中に懸濁された形で保存される。本発明では界面
活性剤を含む溶液に懸濁された核酸結合性担体を使用す
ることにより、担体の周囲に界面活性剤の層が形成さ
れ、核酸の結合を阻害するような血液由来の物質の付着
を避けることができる。

【００２２】本発明における核酸を核酸結合性担体に吸
着させるための核酸吸着用溶液とは細胞膜の破壊あるい
は細胞中に含まれるタンパク質を変性させるとともに、
核酸の担体への結合に寄与する物質（吸着剤と呼ぶ）を
溶解した溶液である。このような物質としては、例え
ば、カオトロピック物質を含むｐＨ６〜８の中性溶液、
などが挙げられる。

【００２３】カオトロピック物質としては、一般にカオ
トロピック物質して知られているような、水溶液中でカ
オトロピックイオン（イオン半径の大きな１価の陰イオ
ン）を生成し、疎水性分子の水溶性を増加させる作用を
有しており、核酸の固相担体への吸着に寄与するもので
あれば、特に限定されない。具体的には、グアニジンチ
オシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化ナトリウム、
ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、尿素等が挙げら
れるが、これらのうち、ＲＮＡを分解するリボヌクレア
ーゼに対する阻害効果の大きなグアニジンチオシアン酸
塩あるいはグアニジン塩酸塩の使用が好ましい。これら
のカオトロピック物質の使用濃度は、用いられるカオト
ロピック物質により異なり、通常、１〜８Ｍ、好ましく
は４〜７Ｍであり、例えばグアニジン塩酸塩を使用する
場合は、４〜７．５Ｍである。また、グアニジンチオシ
アン酸塩を使用する場合には、３〜５．５Ｍの範囲であ
り、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、５Ｍ以上で使
用するのが好ましい。

【００２４】本発明の吸着剤を含む核酸吸着用溶液に
は、緩衝剤を含有させることが好ましい。これは予め吸
着用溶液に含まれていても、また、細胞を溶解した後に
緩衝液として添加してもよい。この緩衝剤としては、一
般に使用されるものであれば、特に限定されないが、中
性付近、すなわち、ｐＨ５〜９において緩衝能を有する
ものがより好ましい。例えば、トリス−塩酸塩、四ホウ
酸ナトリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸
ナトリウム緩衝液等が挙げられ、その使用濃度としては
１〜５００ｍＭ、ｐＨは７〜９の範囲が好適である。

【００２５】また、核酸吸着用溶液には、細胞膜の破壊
あるいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的
で界面活性剤を含有させてもよい。この界面活性剤とし
ては、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるもので
あれば、特に限定されないが、具体的には、トリトン系
界面活性剤およびツイーン系界面活性剤等の非イオン界
面活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等の陰
イオン界面活性剤が挙げれる。本発明においては、特に
非イオン性界面活性剤を０．１〜２％の範囲で使用する
のが好ましい。

【００２６】さらに、核酸吸着用溶液には試料中に含ま
れるタンパク質、特にリボヌクレアーゼを変性、失活さ
せる目的で、２−メルカプトエタノールあるいはジチオ
スレイトール等の還元剤を含有させることが好ましい。

【００２７】本発明において必要により使用する洗浄液
とは、核酸結合性担体から核酸の溶離を促進するもので
なく、かつ、タンパク質、糖類、脂質の固相への結合を
妨げるものであれば、特に限定されない。具体的には、
４〜７．５Ｍグアニジン塩酸塩溶液あるいは４０〜８０
％エタノールが好ましく、これらの洗浄液を併用すると
より好適である。つまり、まず、グアニジン塩酸塩溶液
で洗浄した後、さらに４０〜８０％エタノールで洗浄す
ることが好ましい。また、初めに溶解・吸着工程にて使
用した吸着用溶液を洗浄液として使用すると、ゲノムＤ
ＮＡとタンパク質の除去に有効である。このとき、続い
て４０〜８０％エタノールで洗浄することが好ましい。

【００２８】本発明における核酸を結合した核酸結合性
担体から核酸を溶出する核酸抽出液とは、核酸結合性担
体から核酸の溶離を促進するものであれば、特に限定さ
れない。具体的には、水あるいはＴＥバッファー（１０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．
０）が好ましい。

【００２９】本発明の核酸抽出方法は、下記工程（ａ）
〜（ｃ）を含む。（ａ）予め界面活性剤を含む溶液中に懸濁された核酸結
合性担体、核酸を含有する試料および核酸を核酸結合性
担体に結合させるための核酸吸着用溶液を混合して、核
酸を核酸結合性担体に結合する工程（吸着工程）（ｂ）核酸が結合した固相を液体から分離し、必要によ
り洗浄する工程（分離工程）、および（ｃ）固相−核酸複合体から核酸を溶出する工程（溶出
工程）

【００３０】（ａ）吸着工程では、予め界面活性剤を含
む溶液中に懸濁された核酸結合性担体、核酸を含有する
試料および核酸を核酸結合性担体に吸着させるための核
酸吸着用溶液を混合し、核酸を核酸結合性担体に吸着さ
せる。混合方法は、ボルテックスによる攪拌、転倒混
和、磁気攪拌などがあり、混合時間は約５〜６０分間で
ある。これらの物質を混合することにより、試料中の核
酸、タンパク質、糖類などが核酸結合性担体に物理的に
吸着する。

【００３１】従来、核酸−担体複合体を形成する際、血
液検体、特に全血検体のような夾雑物質を多量に含む試
料を処理する場合、血液由来の物質が担体の周囲に付着
し、核酸の結合を妨げる傾向にある。実際、夾雑物質が
多い試料ほど核酸の回収能力が低下する。これを解決す
るため、（ａ）工程では、予め、界面活性剤を含有した
溶液に懸濁させておいた核酸結合性担体を使用する。こ
れにより担体の周囲に界面活性剤の層が形成され、核酸
の結合を阻害するような血液由来の物質の付着を避ける
ことができる。

【００３２】（ｂ）分離工程における液相と核酸結合性
担体との分離手段としては、使用する核酸結合性担体の
形態により異なり、核酸結合性担体が粒子の場合には、
遠心分離、濾過、カラム操作等が好ましい。さらに粒子
内に超常磁性金属酸化物を含ませておいたものを担体と
して使用すれば、磁石等を用いた簡便な磁気分離法が可
能となり、より好適である。

【００３３】（ｂ）分離工程では、必要により洗浄を行
ない、不要なタンパク質、糖類、脂質などを溶離する。
洗浄は１回または２回以上行なう。

【００３４】（ｃ）溶出工程は、上記（ｂ）分離工程に
おける核酸が吸着した核酸結合性担体から該核酸を溶出
する工程である。このとき回収した核酸は、透析やエタ
ノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作を施すことなく、制限
酵素やＤＮＡポリメラーゼ等を使用する酵素反応に直接
使用することができる。また、必要により増幅した後、
核酸プローブ試薬を使用して目的核酸を検出することも
できる。

【００３５】本発明の核酸抽出試薬は、少なくとも、
（１）予め界面活性剤を含む溶液中に懸濁させた核酸結
合性担体、（２）核酸を核酸結合性担体に結合させるた
めの核酸吸着用溶液および（３）核酸結合性担体に結合
した核酸を溶出するための試薬を含む。その組成比は、
使用目的に応じて種々に選択されるが、その一例として
は、（１）約２０〜２００μｌ、（２）約１００〜１
０，０００μｌおよび（３）約２０〜２００μｌがあ
る。

【００３６】本発明の核酸検出方法は下記工程を含む。（ａ）予め界面活性剤を含む溶液中に懸濁された核酸結
合性担体、核酸を含有する試料および核酸を核酸結合性
担体に吸着させるための核酸吸着用溶液を混合して、核
酸を核酸結合性担体に結合する工程（吸着工程）（ｂ）核酸が結合した核酸結合性担体を液体から分離
し、必要により洗浄する工程（分離工程）、および（ｃ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶出する
工程（溶出工程）（ｄ）必要により、得られた核酸を増幅する工程（増幅
工程）、および（ｅ）該核酸を検出する工程（検出工程）

【００３７】（ｄ）増幅工程では、ポリメラーゼ・チェ
イン・リアクション法（ＰＣＲ法、Science, 230:1350-
1354,1985)やＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence Ba
sedAmplification 法、Nature, 350,91-92,1991、特許
第 2648802号公報および特許第 2650159号公報記載）な
どを実施する。ＰＣＲ法では、標的核酸に相補的な塩基
配列を有する２種以上のオリゴヌクレオチド（一方のプ
ライマーの伸長生成物は、１本鎖に解離後、他方のプラ
イマーの鋳型となる）をプライマーとして、ｄＮＴＰの
存在下、ＤＮＡポリメラーゼにより、温度を変化させて
増幅反応を実施する。ＮＡＳＢＡ法では、標的核酸に相
補的な塩基配列を有する２種以上のオリゴヌレオチド
（少なくとも一方のプライマーはＲＮＡポリメラーゼの
プロモーター配列を有する）をプライマーとして、ｄＮ
ＴＰおよびｒＮＴＰの存在下、逆転写酵素、ＤＮＡポリ
メラーゼ、ＲＮａｓｅＨ（一重鎖または二重鎖ＲＮＡま
たはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイ
ブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ）お
よびＲＮＡポリメラーゼにより、一定温度にて増幅反応
を実施する。

【００３８】（ｅ）検出工程では、抽出された核酸また
は必要に増幅された核酸から目的核酸を検出する。該工
程では、標識を有する検出プローブを使用する。標識と
しては、酵素、蛍光物質、放射性物質などの検出可能な
物質を使用する。また、これらの検出可能な物質と結合
可能な物質、例えばビオチン、アビジンなどをプローブ
に結合させてもよい。標識を検出する手段は、それぞれ
の標識に応じて異なり、従来から公知である手段、例え
ば電気泳動、発色測定、蛍光測定、放射性活性測定など
がある。

【００３９】本発明の核酸検出用試薬は、少なくとも、
（１）予め界面活性剤を含む溶液中に懸濁させた核酸結
合性担体、（２）核酸を核酸結合性担体に吸着させるた
めの核酸吸着用溶液、（３）担体に結合した核酸を溶出
するための試薬溶液、必要により（４）核酸増幅試薬お
よび（５）核酸検出プローブ試薬を含む。

【００４０】増幅試薬としては、増幅方法に従い、異な
り、ＰＣＲ法では、少なくとも２種のプライマー、ｄＮ
ＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液などを含む。ＮＡＳ
ＢＡ法では、少なくとも２種のプライマー、ｄＮＴＰお
よびｒＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮ
Ａポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨを含む。

【００４１】核酸検出プローブ試薬としては、標識を結
合した検出プローブ、または標識物質と結合しうる物質
を結合した検出プローブを含む。

【００４２】本発明の核酸検出試薬は、少なくとも、
（１）予め界面活性剤を含む溶液中に懸濁させた核酸結
合性担体、（２）核酸を核酸結合性担体に吸着させるた
めの核酸吸着用溶液、（３）核酸結合性担体に結合した
核酸を溶出するための試薬、必要により（４）核酸増幅
試薬および（５）核酸検出用プローブ試薬を含む。その
組成比は、使用目的に応じて種々に選択されるが、その
一例としては、（１）約２０〜２００μｌ、（２）約１
００〜１０，０００μｌ、（３）約２０〜２００μｌ、
（４）約２０〜１００μｌおよび（５）約１００〜１，
０００μｌがある。

【００４３】

【発明の効果】予め界面活性剤を含む溶液に核酸結合性
担体を懸濁させた後、核酸抽出に使用する本発明の方法
は、夾雑物質を多量に含む検体、例えば全血検体の処理
において、核酸の回収効率に優れている。また、予め界
面活性剤を含む溶液に核酸結合性担体を懸濁させてある
ため、試料を反応させる際の該担体の分散性が良く、試
料溶液中に添加する際にも均質な懸濁溶液として使用で
き、ハンドリングが容易に行えるという利点も有する。

【００４４】

【実施例】以下に、本発明を具体的に実施例により説明
する。実施例１（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌陽性の全血サ
ンプルからの核酸抽出）実施例中、使用した磁性シリカ粒子は、粒径の範囲が１
〜１０μｍ、四三酸化鉄粒子の含有量が重量あたり３０
％、比表面積が５０〜５００ｍ²/ｇ、外部表面積が１０
〜１００ｍ²/ｇである粒子（鈴木油脂工業社製）を使用
した。そして、１．２％のトリトンＸ−１００（ポリエ
チレングリコール・モノ−ｐ−イソオクチルフェニルエ
ーテル）を含んだ食塩水（５モル／ｌ溶液）に懸濁した
０．５ｇ／ｍｌ濃度の磁性シリカ粒子を準備した。比較
のため、０．５ｇ／ｍｌ濃度になるように、滅菌水また
は食塩水中に懸濁した溶液も準備した。

【００４５】生物試料としては、メチシリン耐性黄色ブ
ドウ球菌（以下、ＭＲＳＡと略す）陽性の全血サンプル
を用いた。また、核酸を核酸結合性担体に結合させるた
めの核酸吸着用溶液としては、５．０モル／ｌのグアニ
ジンチオシアン酸塩、１．０％のトリトンＸ−１００お
よび２０ミリモル／ｌのエチレンジアミン四酢酸（以
下、ＥＤＴＡと略す）を含むトリス／塩酸緩衝液を使用
した。洗浄液としては５．０ミリモル／ｌのグアニジン
チオシアン酸塩を含むトリス／塩酸緩衝液を使用した。
また、高濃度の塩を除去するための洗浄液としては、７
０％のエタノール水溶液およびアセトンを使用した。核
酸結合性担体に結合した核酸を回収するための溶出液と
しては滅菌水を使用した。

【００４６】本発明の具体的な操作は次の通りである。（ａ）１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに、核酸
吸着用溶液０．９ｍｌを入れ、次に、全血サンプル０．
１ｍｌを添加し、よく混合した。次に、１．２％のトリ
トンＸ−１００を含む食塩水（５モル／ｌ溶液）に懸濁
した磁性シリカ粒子０．１ｍｌを加えた。また、対照と
して、滅菌水または界面活性剤を含まない食塩水に懸濁
した磁性シリカ粒子を同様に、核酸吸着用液および全血
サンプルを入れた液に加えた。これらをよく混合し、室
温で１０分間放置した。（ｂ）１．５ｍｌ容エッペンドルフチューブ専用の磁極
スタンドに、上記チューブを設置することにより、粒子
を磁極側のチューブ壁面に移動させた。フィルターチッ
プまたはディスポーザブルスポイトを用いて溶液相を吸
引排出した。次いでチューブを磁極スタンドから取り出
し、洗浄液として５モル／ｌのグアニジンチオシアン酸
塩を含むトリス／塩酸緩衝液１．０ｍｌを加えた。十分
混合した後、専用の磁極スタンドに設置し、上記と同様
にして溶液を排出した。洗浄液による洗浄操作をもう一
度繰り返した。１．０ｍｌの７０％エタノール溶液によ
り上記と同様に核酸の吸着した磁性シリカ粒子を洗浄
し、高濃度の塩を除去した。再度、１．０ｍｌの７０％
エタノール溶液で洗浄した後、１．０ｍｌのアセトンで
洗浄した。約５６℃のヒートブロック上に上記チューブ
を設置し、約１０分間放置することにより、チューブ内
および磁性シリカ粒子中のアセトンを完全に蒸発させて
除去した。（ｃ）上記チューブに０．１ｍｌの滅菌水を加え、約５
６℃のヒートブロック上に上記チューブを設置し、１０
分間放置した。磁極スタンドに設置し、溶液相をフィル
ターチップで吸引し、別の新しいチューブに回収した。
回収量は６０〜７０μｌ程度であった。

【００４７】実施例２（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
の検出）実施例１にて、回収した核酸溶液中のＲＮＡをＮＡＳＢ
Ａ法（Nature 350 91-92, 1991 、特許第2648802 号公
報および特許第2650159 公報）により増幅した。すなわ
ち、増幅はｍｅｃＡ遺伝子の配列中から選択した２種の
合成オリゴヌクレオチド（配列番号１および２、配列番
号２にはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
含む）をプライマーとして使用して、Ｔ７ＲＮＡポリメ
ラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素およびＲＮａｓｅＨを用い
た。増幅反応液組成４０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）１２ｍＭＭｇＣｌ₂ ７０ｍＭＫＣｌ５ｍＭＤＴＴ１５％(v/v) ＤＭＳＯ１ｍＭｄＮＴＰ２ｍＭｒＮＴＰ０．２μＭプライマー×２

【００４８】この反応液２５μｌに、実施例１にて回収
した核酸溶液５．０μｌを加え、６５℃で５分間放置
し、４１℃に反応温度を下げ、その後、下記の酵素溶液
２．０μｌを加えた。その後、４１℃で９０分間放置し
た。０．１ＵＲＮａｓｅＨ４０．０ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼ８．０ＵＡＭＶ逆転写酵素０．１ｇ／ｌＢＳＡ

【００４９】核酸の検出は、固相としてナイロン膜を使
用したドットブロットハイブリダイゼーション法により
行った。上記の増幅反応により得られた核酸溶液１．０
μｌを滅菌水で１０倍濃度に希釈して、あらかじめ５×
ＳＳＣ（0.075mol／ｌクエン酸ナトリウム、pH 7.0、0.
75モル／ｌ塩化ナトリウム混合液）で洗浄したナイロン
膜上にブロットした。乾燥後、この膜をハイブリバッグ
（ＢＲＬ社製）に入れ、アルカリホスファターゼ標識し
た検出プローブ（配列番号３）を含むハイブリダイゼー
ション緩衝液１．０ｍｌを加え、振とうさせながら、５
０℃で３０分間ハイブリダイゼーションを行った。その
後、膜をハイブリバッグから取り出し、洗浄液１（５×
ＳＳＣ、１．０％ラウリル硫酸ナトリウム）を入れたバ
ットに移し、５０℃で１０分間洗浄した。次に、洗浄液
２（５×ＳＳＣ、0.5 ％トリトンＸ−１００）のバット
に移し振とうさせながら、室温で１０分間洗浄した。洗
浄が終了した膜を新しいハイブリバッグに入れ、ニトロ
ブルーテトラゾリウムおよび５−ブロモ−４−クロロ−
３−インドリルリン酸を含むアルカリホスファターゼの
基質溶液を加えてシールし、３７℃で６０分間静置する
ことで発色反応させた。発色後膜を蒸留水で洗浄して乾
燥させ、発色を色彩色差計ＣＲ−２２１（ミノルタカメ
ラ社製）により２回測定した。測定には△Ｅモードを使
用し、発色強度を測定した。その結果を表１に示す。

【００５０】

【表１】

【００５１】表１から明らかなように、本発明のトリト
ンＸ−１００を含む磁性シリカ粒子懸濁液を使用した核
酸抽出法により、通常の塩化ナトリウム溶液や滅菌水に
懸濁した磁性粒子を使用した方法よりも、明らかに高い
発色強度を示した。これは核酸の回収量が向上したこと
を示している。

【００５２】実施例３（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
陽性の全血サンプルからの核酸抽出およびメチシリン耐
性黄色ブドウ球菌の検出) 実施例１における１．２％トリトンＸ−１００に代え
て、２．０％のツイーン２０（ポリオキシエチレン・ソ
ルビタン・モノラウレート）を使用し、実施例１および
実施例２と同様にして、メチシリン耐性の黄色ブドウ球
菌陽性の全血サンプルからＲＮＡを抽出し、増幅し、メ
チシリン耐性黄色ブドウ球菌を検出した。その結果を表
２に示す。

【００５３】

【表２】

【００５４】表２から明らかなように、本発明のツイー
ン−２０を含む磁性シリカ粒子懸濁液を使用した核酸抽
出法により、通常の塩化ナトリウム溶液や滅菌水に懸濁
した磁性粒子を使用した方法よりも、明らかに高い発色
強度を示した。これは核酸の回収量が向上したことを示
している。

【００５５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：21 配列の形：核酸トポロジー：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１..21 特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の1332番目
から1352番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有す
る。配列 CGTTACAAGA TATGAAGTGG T 21

【００５６】配列番号：２配列の長さ：47 配列の形：核酸トポロジー：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１..47 特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の1552番目
から1571番目のヌクレオチド配列と相補的な配列を有す
る。またＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を
持つ。配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGCCT TGTCCGTAAC CTGAATC 47

【００５７】配列番号：３配列の長さ：25 配列の形：核酸トポロジー：一本鎖配列の種類：合成ＤＮＡ配列の特徴存在位置：１..25 特徴を決定した方法：Ｓ他の特徴：黄色ブドウ球菌のｍｅｃＡ遺伝子の1410番目
から1434番目のヌクレオチド配列と相同的な配列を有す
る。配列 TAGAGRAGCA CTCGAATTAG GCAGT 25

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸を含有する試料中の核酸を核酸結合
性担体に結合させ、該試料中の核酸以外の物質を除去し
た後、核酸を結合した核酸結合性担体から核酸を溶出す
る核酸抽出方法において、該核酸結合性担体が予め界面
活性剤を含む溶液中に懸濁された担体であることを特徴
とする核酸抽出方法。
【請求項２】下記工程（ａ）〜（ｃ）を含むことを特
徴とする核酸抽出方法。（ａ）予め界面活性剤を含む溶液中に懸濁された核酸結
合性担体、核酸を含有する試料および核酸を核酸結合性
担体に吸着させるための核酸吸着用溶液を混合して、核
酸を核酸結合性担体に結合させる工程（ｂ）核酸が結合した核酸結合性担体を液体から分離
し、必要により洗浄し、および（ｃ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶出する
工程
【請求項３】界面活性剤が、非イオン界面活性剤であ
る請求項１または２記載の核酸抽出方法。
【請求項４】核酸結合性担体が、シリカまたはその誘
導体を含む担体である請求項１または２記載の核酸抽出
方法。
【請求項５】核酸を含有する試料が、生物材料である
請求項１または２記載の核酸抽出方法。
【請求項６】核酸を核酸結合性担体に結合させるため
の核酸吸着用溶液がカオトロピック物質を含有する溶液
である請求項１または２記載の核酸抽出方法。
【請求項７】カオトロピック物質が、グアニジン塩、
ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、（イソ）チオシア
ン酸塩、尿素、またはこれらの組み合わせである請求項
６記載の核酸抽出方法。
【請求項８】少なくとも、（１）予め界面活性剤を含
む溶液中に懸濁させた核酸結合性担体、（２）核酸を核
酸結合性担体に結合させるための核酸吸着用溶液および
（３）核酸結合性担体に結合した核酸を溶出するための
試薬を含むことを特徴とする核酸抽出用試薬。
【請求項９】下記工程（ａ）〜（ｅ）を含むことを特
徴とする核酸検出方法。（ａ）予め界面活性剤を含む溶液中に懸濁された核酸結
合性担体、核酸を含有する試料および核酸を核酸結合性
担体に吸着させるための核酸吸着用溶液を混合し、核酸
を核酸結合性担体に結合させる工程、（ｂ）核酸が結合した核酸結合性担体を液体から分離
し、必要により洗浄し、（ｃ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶出する
工程、（ｄ）必要により、得られた核酸を増幅する工程、およ
び（ｅ）目的の核酸を検出する工程
【請求項１０】少なくとも、（１）予め界面活性剤を
含んむ溶液中に懸濁させた核酸結合性担体、（２）核酸
を核酸結合性担体に吸着させるための核酸吸着用溶液、
（３）核酸結合性担体に結合した核酸を溶出するための
試薬、必要により（４）核酸増幅試薬および（５）核酸
検出用プローブ試薬を含むことを特徴とする核酸検出用
試薬。