JPH11178594A - ルイスｙ−特異的モノクローナル抗体ｂｒ５５−２に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその使用 - Google Patents

ルイスｙ−特異的モノクローナル抗体ｂｒ５５−２に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体およびその使用

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JPH11178594A
JPH11178594A JP10249573A JP24957398A JPH11178594A JP H11178594 A JPH11178594 A JP H11178594A JP 10249573 A JP10249573 A JP 10249573A JP 24957398 A JP24957398 A JP 24957398A JP H11178594 A JPH11178594 A JP H11178594A
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Herbert Jaksche
ヘルベルト・ヤクシェ
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エベリン・ヤンツェク
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ハンス・ロイブナー
Dieter Scholz
ディーター・ショルツ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 モノクローナル抗体ＢＲ５５−２(Ａｂ１)に
対するマウスモノクローナル内部像抗−イディオタイプ
抗体(Ａｂ２)の発生、産生および特徴付を提供するこ
と。 【解決手段】 モノクローナル抗体ＢＲ５５−２(Ａｂ
１)に対するモノクローナルマウス内部像抗−イディオ
タイプ抗体(Ａｂ２)により解決される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野および従来の技術】１.背景お
よび導入 免疫系を使用する一つの研究は、イディオタイプ的相互
作用を基本にしている。一つの抗体を他のものと区別す
る、Ｉｇ分子の抗原結合部位中および回りの独特な抗原
決定基はイディオトープとして定義されている。与えら
れた抗体の可変領域に存在する全てのイディオトープを
合わせてそのイディオタイプ(ｉｄ)と呼ぶ。イディオタ
イプの分子構造は相補性決定領域および可変領域のフレ
ームワーク領域の両方に局所的であり、常にではないが
一般的に、特異的に関連する重および軽鎖の両方からな
る。
【０００２】イディオタイプは、同系、同種異系または
異種受容体中への抗体(しばしばＡｂ１と呼ぶ)の注射が
抗イディオタイプ抗体(しばしばＡｂ２と呼ぶ)の産生を
誘発するため、血清学的に定義された実在物である。イ
ディオタイプ／抗イディオタイプ相互作用が存在すると
いう仮定を基にして、生理学的に免疫系の受容体基本制
御は、ニールス・ジェルネ(アナリティカル・イムノロ
ジー、１２５Ｃ、３７３、１９７４)により仮定されて
いる。彼のネットワーク理論は、免疫系を、各々抗原決
定基(エピトープ)をその結合部位(パラトープ)を通して
認識でき、各々本系の他の抗体または細胞表面受容体を
それを表示するイディオトープを通して認識できるＩｇ
分子およびＴ−リンパ球上の受容体の収集物として見な
す。多くの研究が、イディオタイプおよび抗イディオタ
イプ受容体がＢ−およびＴ−リンパ球の表面およびその
分泌する抗体に存在することを実際証明している。
【０００３】Ａｂ１およびＡｂ２の間の結合がＡｂ１が
引き寄せられる抗原により阻害される場合、抗原認識を
司る部位を抗体可変領域上に含むため、イディオタイプ
は結合部位関連と見なされる。これらの形態的には疑似
抗原エピトープであるイディオタイプは、これらのエピ
トープの内部像と言われる。Ａｂ２および抗原の両方が
関連Ａｂ１に結合しているため、それらは与えられた抗
原の内部像を意味する同様の三次元構造を分け合ってい
る。原則として内部像抗イディオタイプ抗体は、それか
ら抗原がイディオタイプネットワークを経由して派生す
る抗原の置換基として見ることができる。従って、これ
らの代用抗原は活性免疫化プロトコールにおいて使用し
得る。例えば、それらは、起源の抗原が明白な免疫反応
を誘発するのに充分に免疫化されていなければ、利点を
提供する。このように、非免疫源性炭化水素抗原に疑似
の好適な内部像抗イディオタイプ抗体は、特にあるワク
チン研究に有用であり得る。下記に、これらの論題を更
に具体的に扱う。
【０００４】ハイブリドーマ技術の導入の結果、ほとん
どマウス起源であるモノクローナル抗体(Ｍａｂ)が、多
くの人の癌の型に対して作られている。異種Ｍａｂによ
り検出されるほとんど全てのマーカーは、厳密には癌特
異的ではないが、癌およびある正常および／または胎児
組織に分離する分化抗原である。従って、それらは癌関
連抗原(ＴＡＡ)と最も良く呼ばれる。異種Ｍａｂにより
検出された人癌マーカーが癌患者の抗癌反応を引き起こ
せるかどうか、このような抗原が、癌患者の自己の癌に
対する反応に実際関連するかどうか、各々のＴＡＡの性
質に依存するが、まだ充分には理解されてない。同系宿
主内で天然に免疫源か、免疫源を製造できるいずれかの
ＴＡＡは、治療のためにおよび恐らくは予防的利点で抗
癌免疫を誘発するのに有効である可能性がある。
【０００５】癌関連抗原は、しばしば“自己”の一部で
あり、癌患者における非常に乏しい免疫反応を誘発す
る。比較して、各々のＴＡＡの構造的エピトープに似て
いる三次元形を示す内部像抗イディオタイプ抗体は、癌
をもつ宿主内では外部分子として認識される。従って、
好適な抗−ｉｄＭａｂによる治療的または予防的でさえ
ある免疫化により上昇した免疫反応は、抗癌免疫の原因
となり得る。
【０００６】抗−ｉｄＭａｂによる癌に対する治療的免
疫化は、特に疾病の初期段階で好結果である。初期癌の
手術の時、しばしば隠れた一つの癌細胞が既に患者の種
々の器官内に転移している。これらの微小転移細胞は、
しばしば臨床的に証明された癌組織診断および外科的手
術による除去の数年後の転移癌の成育の原因となること
は知られている。これまで、ほとんど全ての場合におい
て、上皮細胞起源の転移癌が治療不可能である。従っ
て、“最小残余癌”の有効な処置、例えば、巨大転移癌
へ成長するのを予防するための隠れている微小転移細胞
の破壊は、緊急の医学的要求である。病気のこの段階
(アジュバント位置付け)において、既知の化学療法研究
はむしろ悪結果である。しかしながら、最小残余病の段
階における好適な内部像抗−ｉｄＭａｂによる免疫化に
よる特異的抗癌免疫の導入は、免疫系により微小転移細
胞を選択的に除去し得、増加した再発のない生存期間を
もたらす。
【０００７】ＢＲ５５−２に特異性のあるモノクローナ
ル抗体(例えば、ウィスター、欧州特許第２８５０５９
号、エム・ブラスチク−スリンら、ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー、２６２(１９８７)３７
２−３７９またはゼット・ステプルスキーら、ハイブリ
ドーマ、９(１９９０)２０１−２１０参照)は、人の固
体癌の大部分に選択的に発生する炭化水素決定基である
ルイスＹ６抗原を同定する。その特性を基本にして、抗
体ＢＲ５５−２は、基本的に上皮癌の受動免疫治療に使
用できる。
【０００８】胚発生のある段階の間にもまた発生するル
イスＹオリゴサッカライド決定基関連癌はそれ自身ほと
んど免疫源性ではない。しかしながら、ルイスＹ抗原の
構造エピトープに似せることにより内部像特性を伴う、
ＢＲ５５−２(Ａｂ１)に対するモノクローナル抗イディ
オタイプ抗体(Ａｂ２)は、特に疾患の初期段階で、保護
的抗癌免疫性を導入するのに有用である。
【０００９】上皮起源の癌上への発現に加えて、ルイス
Ｙ炭化水素抗原はまた人免疫不全ウィルス(ＨＩＶ)の感
染の病理発生にもまた含まれる。後天性免疫不全症候群
(ＡＩＤＳ)は、その病因がリンパ栄養性レトロウィルス
(ＨＩＶ)の感染に関連するものとして同定されている明
瞭な疾病として認識されている。本疾病は損なわれた細
胞媒介免疫および完全な血中ヘルパーリンパ球減少症、
特に減少したヘルパーＴ−リンパ球(ＣＤ４)に関連する
疾患により特徴付けられる。ＡＩＤＳは、指定された臨
床的特性のコンプレックスおよび血中Ｔ−リンパ球減少
症により通常明示された前症候群が先である。前症候群
は、ＡＩＤＳ関連コンプレックス(ＡＲＣ)と呼ばれる。
【００１０】ＨＩＶは、過去２０年にわたって徹底的に
研究されているウィルスの群に属する。レトロウィルス
が人または動物細胞に侵入した場合、ＲＮＡはＤＮＡに
変わり、宿主細胞内へ挿入し、次いで細胞自身のもので
あるかのようにウィルスの遺伝子を処置してしまう。Ｈ
ＩＶは数年間この細胞内に潜んで残り、体内の免疫系か
らの攻撃から安全で、宿主細胞が分裂する度に盲目的に
複写されることができる。感染された細胞の活性化によ
り急速なウィルス複写の引金が引かれた場合のみ、産生
されたウィルス分子が細胞を殺し、血流中へ流れ出す。
【００１１】ＨＩＶの特異的特性のため、既に人ゲノム
中へ転写されたウィルスおよびプロウィルス両方の遺伝
子情報を、既に感染した患者から除くことによる治療は
成し遂げるのが難しい。従って、ほとんどの治療の試み
は、ウィルス複製の本質的な段階を妨げることにより病
気の進行を遅くする薬剤に集まっている。
【００１２】安全で有効なワクチンの手段によるＨＩＶ
−感染の予防および既に感染した患者の治療的介在が主
要なゴールである。幾つかのワクチン研究が、前臨床ま
たは初期臨床段階で試験されている。それらは主に抗原
としてのウィルス構造、特に、主要エンベロープグリコ
プロテインｇｐ１２０を基本にしている。
【００１３】ウィルスに対して自然に発生する免疫反応
はすべてのウィルスタンパク質に対する抗体および細胞
性免疫の活性化からなる。しかしながら、ＨＩＶ−感染
に対するこの宿主反応は、しばしば数年にわたり持続す
る無症候期間後の病気の進行を最終的に停止させるよう
には思えない。したがって、自然に発生し、最終的には
非保護免疫反応の原因となる同じ抗原を基本にしたワク
チン研究は、疑わしいままである。一つの主要な問題
は、それによりウィルスがタイプ特異的中和抗−ｇｐ１
２０抗体の攻撃から逃れられるＨＩＶの広範な異質性で
ある。
【００１４】ワクチンによる有効なＨＩＶの防御は、２
つ：一つは血流中のウィルスの自由な移動に対して、も
う一つは既に感染された細胞に対しての防御方法が必要
である。インビトロおよびインビボＨＩＶ感染細胞は、
その表面に変化したグリコシル化パターン、すなわちル
イスＹ炭化水素決定基を示すことは知られている。本抗
原が通常ある胎児発育段階の間においてのみ発生し、種
々の悪性度にまた関連するため、ＨＩＶ−感染細胞上の
発現は、レトロウィルス形質転換により誘発されたその
別の分化状態を反映し得る。したがって、この表面表現
型は、人ゲノムのＨＩＶによる形質転換に対する独特な
細胞性宿主反応に似ている。
【００１５】ＨＩＶ外被グリコプロテインは、感染細胞
の機械的グリコシル化により行われる。従って、ＨＩＶ
により製造される感染細胞のグリコシル化パターンの変
化はまた自由に遊離されるウィルス分子上に見られる。
結果として、このような細胞内で産生するＨＩＶの外被
グリコプロテインは、またルイスＹ炭化水素決定基から
なる。従って、ルイスＹオリゴサッカライドは、ＨＩＶ
感染細胞および遊離ＨＩＶ−分子の両方に発現される特
異的宿主反応を示す。
【００１６】上記の考慮を基にして、ルイスＹ構造は、
遊離ウィルスおよびＨＩＶ−感染細胞の両方に対するワ
クチン化法の使用の重要な必要性を満たす。更に、一般
に、宿主がＨＩＶに対して反応するためには、ルイスＹ
抗原はＨＩＶ種から独立して、そのウィルスの遺伝的変
異性により影響を受けない。不幸にも、その炭化水素構
造およびその胎児分化抗原としての“自己”特性を基本
にして、ルイスＹはそれ自身ほとんど免疫源性ではな
い。この抗原に対する自然の免疫反応は人では検出され
ていない。しかしながら、ルイスＹ抗原の構造エピトー
プに似せることにより内部像特性を有するＢＲ５５−２
(Ａｂ１)に対するモノクローナル抗イディオタイプ抗体
(Ａｂ２)は、ウィルス種と無関係な、遊離ＨＩＶおよび
ＨＩＶ感染細胞に対する予防的および治療的免疫の導入
に有用であり得る。
【００１７】独特なワクチンとしてのその予防的および
治療的使用に加えて、モノクローナル内部像抗−ｉｄ抗
体は、それが発生した抗体のイディオタイプに対して非
常に特異的な試薬である。それらはほとんどＡｂ１の結
合領域を排他的に認識する。この認識パターンはＡｂ１
の他の決定基とは無関係である。言い換えると、好適な
抗−ｉｄＭａｂは、その正確な三次元構造において、Ａ
ｂ１の独特なイディオタイプからなる任意の分子を選択
的に同定にする。従って、これらの抗−ｉｄＭａｂは、
Ａｂ１のＦ(ａｂ')2−、Ｆａｂ−およびＦｖ−断片およ
びその変更変異体(変更変異体は異なった定常領域、例
えばマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ１からなる
が、同一のイディオタイプを分けあっている)に、同等
の親和性で結合する。加えて、内部像抗−ｉｄＭａｂの
この高い特異的認識パターンはまた組み換えＤＮＡ技術
により得られた親マウスＭａｂの変異体を含む。
【００１８】人の受動免疫治療におけるマウス抗体の反
復使用により可能性のある問題に打ち勝つために、マウ
ス／人キメラＭａｂが、選択した親マウスＭａｂの可変
領域と人の定常領域を結合させることにより産生でき
る。人血清におけるこのようなマウス／人キメラＭａｂ
の検出のために、これらのキメラＭａｂが人の免疫グロ
ブリンで自然に発生するのと同じ定常領域を有するた
め、非常に特異的な試薬が必要である。親マウスＡｂ１
に対して発生した内部像抗−ｉｄＭａｂは、それ由来の
キメラ抗体をまた認識する。これにより、このような抗
−イディオタイプＭａｂが、例えば大過剰の正常人免疫
グロブリンの存在下、マウス／人キメラＭａｂの血清濃
度の特異的および感受性定量的測定に有用な試薬であ
る。受動免疫治療に使用するための臨床的に興味深い特
性によりＭａｂの特性を更に改善するために、親マウス
抗体の最小必要部分、相補性決定領域(ＣＤＲ)のみが人
可変領域フレームワークおよび人定常領域と結合してい
る“完全に人化した”抗体が、組み換えＤＮＡ技術によ
り構築できる。これらの“完全に人化した”Ｍａｂの設
計および構築のために、配列相同性および分子造形モデ
ルが、更に免疫源性は減少しているが、結合特性は有す
るマウスおよび人配列要素の組み合わせの選択のために
使用される。親マウスＡｂ１のイディオタイプに対して
発生したある内部像抗−ｉｄＭａｂは、もし以下の要
求： ａ)人化変異体の結合領域の三次元構造が、親マウス抗
体のものと非常に似ている ｂ)特異的な抗−ｉｄ抗体が、正確にこの結合領域の三
次元構造を認識する(“真正内部像抗体")が満たされて
いれば、ＣＤＲ−移植人化変異体に結合し得る。
【００１９】従って、上記特性を有する抗−イディオタ
イプＭａｂは、例えば大過剰の正常人免疫グロブリンの
存在下、完全に人化した(ＣＤＲ−移植)Ｍａｂの血清濃
度の特異的および感受性定量的測定に特に有用な試薬で
ある。
【００２０】
【発明の記載】本発明は、モノクローナル抗体ＢＲ５５
−２(Ａｂ１)に対するマウスモノクローナル内部像抗−
イディオタイプ抗体(Ａｂ２)の発生、産生および特徴付
に関する。本発明の更なる部分はこれらの抗−イディオ
タイプＭａｂの、上皮起源の癌および小細胞肺癌および
ＨＩＶ−感染が原因の疾病の有効な治療および予防的免
疫化のための使用である。更に、これらの抗−イディオ
タイプＭａｂの、キメラおよび完全に人化された変異体
(ＷＯ９２／０３１６５に記載のような)を含むＢＲ５５
−２の特性を有する抗体またはその断片および誘導体の
高い選択的および定量的測定およびＢＲ５５−２の特性
を有する分子に一般に適応可能な選択的免疫親和精製法
への使用もまた本発明の一部である。
【００２１】２.抗体ＢＲ５５−２のイディオタイプに
対するマウスモノクローナル抗−イディオタイプ抗体の
発生および特徴付 望ましくない抗−イソタイプ免疫反応を最少にする試み
において、ＢＲ５５−２、マウスＩｇＧ３のＦ(ａｂ')2
−断片を免疫化のために選択した。マウスＭａｂＢＲ５
５−２のイディオタイプに対するマウス抗−ｉｄＭａｂ
の充分な発生のために、同系宿主における好適な免疫反
応を上昇させるために、免疫源性を最大にすることが重
要である。したがって、Ｆｃ−部分が欠けている(開裂
および精製は欧州特許出願第５２８,７６７号に記載)Ｆ
(ａｂ')2−断片を、免疫源担体としてのキーホールリン
ペットヘモシアニン(ＫＬＨ)に、記述された方法(ジェ
ー・カールソンら、バイオケミカル・ジャーナル、１７
３、７２３、１９７８)にしたがって、異種二機能性リ
ンカーＮ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジルジチ
オ)プロピオネート(＝ＳＰＤＰ)を使用して結合した。
【００２２】Ｂａｌｂ／ｃマウスを、マウスＭａｂを発
生させるのに典型的なプロトコールを基本にして、フロ
インド完全アジュバントを使用してＢＲ５５−２／マウ
スＩｇＧ３−Ｆ(ａｂ')2−ＫＬＨ−接合体で免疫化し
た。反復免疫化に続いて、マウス脾臓細胞を、マウスミ
エローマ細胞系ＳＰ２／０と融合した(実験の詳細は実
施例１参照)。
【００２３】培養されたハイブリドーマ細胞の好適な選
択のために、その上清の連続した試験を行った。選択は
以下の基準： ａ)上清中のマウスＩｇＧの濃度を測定することによる
ハイブリドーマの分泌率(実験の詳細は実施例２参照)。
大量のマウスＩｇＧを産生する細胞は、単一細胞培養に
サブクローン化した。 ｂ)ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３のＦ(ａｂ')2−断片
に対する選択した上清の結合(実験の詳細は実施例３参
照)。 ｃ)選択した上清による、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ
２ａのルイスＹ抗原陽性ＳＫＢＲ５人乳癌細胞への結合
の阻害(実験の詳細は実施例４参照)。を基本にした。
【００２４】後者の試験は、Ａｂ２'の内部像特性を示
すために考案される。免疫化に使用したＢＲ５５−２／
マウスＩｇＧ３のＦ(ａｂ')2−断片のＡｂ２'認識残存
定常領域の検出を最少にするために、ＢＲ５５−２のマ
ウスＩｇＧ２ａ変更変異体を結合に使用した。本試験
は、試験ａ)のＩｇＧ濃度測定試験を基本にした定量法
で行った(実施例２)。更に、過剰の非特異的マウス−Ｉ
ｇＧを、ＢＲ５５−２のイディオタイプに特異的でない
Ａｂ２'の検出を避けるために、本阻害実験に加えた。
９５％以上の阻害能力(ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２
ａのＳＫＢＲ５細胞系への結合の阻害)を有するＩｇＧ
を産生するハイブリドーマを選択した。
【００２５】上記の試験法を使用して、６種の異なった
ハイブリドーマが最終的に選択され、発展させた(Ｅ
４、Ｃ１１、Ｂ３、Ｂ９、Ｇ６、Ｇ９)。すべての６種
のハイブリドーマは、マウスＩｇＧ１を、ウサギ−抗−
マウス−ＩｇＧ１／ペルオキシダーゼ(ツィメッドのよ
うな試薬)を使用したサブタイプＥＬＩＳＡで検出され
たように産生する。
【００２６】全ての６種のハイブリドーマを、ローラー
フラスコ(Ｇ培地中３７℃、５％ＣＯ2；３、４日毎に培
地を変える)中で培養し、上清を回収し、続いて精製し
た。
【００２７】各々抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂを含有す
る各々の上清を、免疫親和性クロマトグラフィーを使用
して精製した。一般に、親和性クロマトグラフィーは非
動化配位子と興味の対象の物質の間の相互作用を基本に
している。抗−イディオタイプ抗体ＢＲ５５−２の場
合、親和性カラムのための非常に特異的な配位子は、選
択した抗−イディオタイプＭａｂに結合するＭａｂＢＲ
５５−２／マウスＩｇＧ２ａである(実験の詳細は実施
例５参照)。
【００２８】単離された抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂ
(Ｅ４、Ｃ１１、Ｂ３、Ｂ９、Ｇ６、Ｇ９)の精製度は、
分析的ＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィー、サイズ
排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電
点電気泳動により試験した。全ての６種の抗−ｉｄＢＲ
５５−２Ｍａｂの純度は＞９５％であった(実験の詳細
は実施例６参照；ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電点電気泳
動は図１および２に示す)。
【００２９】精製抗−ｉｄＭａｂを、ＢＲ５５−２／マ
ウスＩｇＧ３のルイスＹ抗原陽性ＳＫＢＲ５細胞系への
結合を阻害する能力を測定することにより、定量的に特
徴付けた。全ての抗−ｉｄＭａｂは、１：１化学量論を
基本にしてＡｂ１のその抗原への結合を阻害する(実験
の詳細は実施例７参照：代表的な結果を図３に示す)。
【００３０】上記の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの内部
像特性およびその代用癌抗原としての使用の決定的な確
証は、異なった種の癌関連抗原に対するＡｂ３反応を発
生する能力に基づく。エヌ・ジェルネのネットワーク理
論に従って、内部像抗−ｉｄＭａｂ(Ａｂ２)による免疫
化により誘発される抗体(Ａｂ３)は、Ａｂ１と同様の結
合特性を有する。従って、抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂ
での免疫化により引き起こされる免疫反応は、ルイスＹ
抗原陽性癌細胞に特異的である。結果として、防御抗癌
免疫は人において抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる免
疫化により誘発し得る。
【００３１】Ａｂ３反応の特性の調査のために、ウサギ
およびアカゲザルを、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃４ならび
に担体およびアジュバントとしての水酸化アルミニウム
で免疫化した。この緩和アジュバントは、人に使用する
異なったワクチンに広く使用されている。陰性対照とし
て、動物をまた同量の非特異的マウス−ＩｇＧ１で免疫
化した。５週間の間の４回の免疫化の後、血清を９週目
で回収した(実験の詳細は実施例８参照)。血清Ｉｇのル
イスＹ抗原陽性ＳＫＲＢ５乳癌細胞系およびルイスＹ抗
原陰性ＷＭ９メラノーマ細胞系への結合を測定した(実
験の詳細は実施例９および１０参照)。
【００３２】抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４は、ウサギお
よびアカゲザルの両方において、高抗体価液性免疫反応
を示す。抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化した動物
の血清Ｉｇは、ルイスＹ抗原陽性ＳＫＲＢ５細胞系に選
択的に結合するが、ルイスＹ抗原陰性ＷＭ９メラノーマ
細胞系には結合しない。比較して、非特異的マウス−Ｉ
ｇＧ１での免疫化では、ほとんど全く癌細胞結合血清Ｉ
ｇは検出されない。これらの結果は表１に要約する。図
４および５において、ウサギおよびアカゲザルの免疫化
前および免疫化血清により、細胞−ＥＬＩＳＡ(ＳＫＲ
Ｂ５細胞)で得られた代表的なＩｇ−結合曲線を示す。
抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化した動物の血清Ｉ
ｇのＳＫＢＲ５細胞への結合は、血清の１：１００００
希釈でもまだ検出できる。
【００３３】最初の免疫化課程の２年後、各々のアカゲ
ザルは、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的マ
ウス−ＩｇＧ１の最初の単一追加抗原注射を受ける。同
様の方法で、２回目の単一追加抗原注射を、最初の免疫
化の３年後(＝最初の追加免疫の１年後)に受ける(実験
の詳細は実施例８参照)。血清をこれらの追加免疫の前
および後に回収する。
【００３４】抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処
理したアカゲザルの全液性免疫反応を、マイクロタイタ
ープレートを覆った抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を基に
したＥＬＩＳＡを使用して測定した(実験の詳細は実施
例１３参照)。全てのアカゲザルの血清において、最初
の免疫化工程および最初および２回目の免疫追加の後
に、非常に高い抗体価免疫反応が見られる。Ｉｇの抗−
ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合は、血清の１：５００
００希釈でもまだ観察できる。幾分低いが、まだ非常に
明白な抗体価が、免疫追加の前にも血清で見られる。こ
れらの結果は図６−８に示す。
【００３５】非特異的マウス−ＩｇＧ１でワクチン処理
したアカゲザルの液性免疫反応もまた上記と同じＥＬＩ
ＳＡを使用して検出した(実験の詳細は実施例１３参
照)。期待されるように、Ｉｇの抗−ｉｄＢＲ５５−２
＃Ｅ４に結合する血清抗体価は、抗−ｉｄＢＲ５５−２
＃Ｅ４でワクチン処理したアカゲザルの血清で見られる
抗体価より低い。非特異的マウス−ＩｇＧ１で免疫化し
たアカゲザルの免疫反応が、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ
４の定常領域と交差反応するが、抗−ｉｄの超可変領域
を指向する免疫反応の部分が欠けている。これらの結果
は図９−１０に示す。
【００３６】免疫反応の癌特異性の証明のために、最初
の免疫工程後および追加免疫の前および後、サル血清Ｉ
ｇの数種のルイスＹ抗原陽性癌細胞系(乳、胃、腸およ
び小細胞肺癌)およびルイスＹ陰性メラノーマ細胞系へ
の結合を測定した(実験の詳細は実施例１０参照)。最初
の免疫化の２年後および最初の追加免疫前に抗−ｉｄＢ
Ｒ５５−２＃Ｅ４で処置したアカゲザルにおいて、ルイ
スＹ抗原陽性癌細胞へ結合する血清Ｉｇはまだ検出でき
る。最初の追加免疫に続いて、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃
Ｅ４で免疫化した動物において、特異的にルイスＹ抗原
陽性癌細胞に結合する血清Ｉｇの途方もなく上昇した抗
体価が観察されるが、抗原陰性細胞系への結合はほとん
ど全く観察されない。非特異的マウスＩｇＧ１で免疫化
したアカゲザルの血清において、どの時点でも特異的結
合は観察されない。同様な結果が２回目の追加免疫の前
および後で見られる。種々の時点での、数種の癌細胞系
を使用した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果は、
図１１−２０に示す。
【００３７】最初の免疫化工程の前および後および最初
の追加免疫の前および後の異なったサル血清でも同様の
Ｉｇの免疫反応のパターンが、ルイスＹ抗原陽性ＳＫＢ
Ｒ５細胞の膜調整物への結合実験で証明できる(実験の
詳細は実施例１１参照)。結果は表２に要約する。
【００３８】抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化する
ことによりアカゲザルで誘発された液性免疫反応の更な
る詳細を更に分析するために、ワクチン処理したサルの
異なった血清をセファロースと組み合わせた抗−ｉｄＢ
Ｒ５５−２＃Ｅ４を導入したカラムで免疫精製した(実
験の詳細は実施例１２参照)。この選択的一工程法によ
り、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４に対する完全な液性免
疫反応が、全ての他の妨害血清タンパク質から分離され
る。最初の実験において、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４
で免疫化したアカゲザルのＩｇを、最初の免疫化工程の
９週間後に得られた血清から免疫精製した。第２の実験
において、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化したア
カゲザルのＩｇを、２回目の免疫追加の４及び９週間後
に得た溜た血清から免疫精製した。その抗−ｉｄＢＲ５
５−２＃Ｅ４カラム上での保持を基本にして、得られた
Ｉｇ−フラクションは、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４抗
体分子の種々のエピトープに、特異的に結合する。これ
らのＩｇ−フラクションは、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ
４の定常領域に対する抗体(抗−アイソタイプ免疫反応)
および、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の結合領域を含む
可変領域に対する抗体(抗−イディオタオプ免疫反応)を
含む。導入部で述べたイディオタイプネットワーク理論
を基にして、後者の部分(ＡＢ３)は、ＢＲ５５−２特異
性を有する抗体(ＡＢ１)と同等な結合特性を示すため、
特に重要である。
【００３９】２回目の免疫追加４および９週間後に得た
溜た血清の免疫精製Ｉｇ−フラクションおよび抗−ｉｄ
ＢＲ５５−２＃Ｅ４のエスケーパーフラクションの結合
を測定した(実験の詳細は、実施例１３参照)。免疫精製
Ｉｇ−フラクションは、強く抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ
４に結合するが、エスケーパーフラクションでは結合は
検出されない。この結果により、本免疫精製法の選択性
および効力が証明される(結果は図２１に示す)。
【００４０】次に、２回目の免疫追加４および９週間後
に得た溜た血清の免疫精製Ｉｇ−フラクションおよびエ
スケーパーフラクションおよび親マウスＭａｂ(ＡＢ１)
の人化変形の結合特性を、ＳＫＢＲ５乳癌細胞で比較し
た。本人化ＡＢ１変形(ＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１)
を、アカゲザルＩｇ(非常に緊密に関連するアカゲザル
Ｉｇにまた結合するヤギ−抗−人−Ｉｇ／ペルオキシダ
ーゼ)の検出にまた使用した同じ試薬で検出できるた
め、比較を容易にするために選択した。ほとんど全ての
癌細胞結合反応性は、免疫精製Ｉｇ−フラクション中で
促進される。この結果により、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃
Ｅ４の免疫化により誘発されたアカゲザルＩｇとルイス
Ｙ抗原陽性癌細胞系の交差反応性が証明される。更に、
重量を基本にして、免疫精製Ｉｇ−フラクションの結合
強度は、ＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１(ＡＢ１)より僅か
５倍少ないだけである。免疫精製Ｉｇ−フラクションの
ある部分のみが抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の結合領域
を指向し、本ネットワーク理論に従うとこの部分のみが
ＡＢ１と同等な結合特性を有することを考慮に入れる
と、この結果は注目すべきである。アカゲザル血清の免
疫親和性精製の収率を基にして、免疫精製Ｉｇ−フラク
ションの抗体価量は約２００μg／ml血清であり、ＢＲ
５５−２／人化ＩｇＧ１と同等な癌細胞結合特性のＩｇ
の約４０μg／mlに対応する(結果は図２２に示し、実験
の詳細は実施例１０および１２参照)。
【００４１】免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)とＢＲ５５−２
／人化ＩｇＧ１のルイスＹ陽性乳癌細胞系ＳＫＢＲ５お
よびルイスＹ陰性メラノーマ細胞系ＷＭ９に対する結合
特性の比較を図２３に示す(実験の詳細は実施例１０参
照)。ＡＢ３フラクションおよびＢＲ５５−２／人化Ｉ
ｇＧ１の両方が上記のルイスＹ陽性細胞系に強く結合す
るが、両方の抗体はルイスＹ陰性細胞系には特異的に結
合しない。これらの結果により、ＡＢ３−フラクション
および人化ＡＢ１変形の結合パターンの類似性が証明さ
れる。
【００４２】ＡＢ３−フラクションの同様な免疫反応性
のパターンは、ルイスＹ陽性ＳＫＢＲ５細胞系およびル
イスＹ陰性細胞系ＷＭ９の膜フラクションを使用したＥ
ＬＩＳＡによりまた観察される。ＡＢ３−フラクション
の実質的な結合は、ルイスＹ陽性細胞膜に対してのみ検
出される(結果は図２４に示し、実験の詳細は実施例１
１参照)。
【００４３】免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)の結合特性は、
更に数種のルイスＹ陽性人癌細胞系(小細胞肺癌、胃
癌、大腸癌、乳癌)で実証された。免疫精製サルＩｇ
は、試験した細胞系に強く結合する(結果は図２５に示
し、実験の詳細は実施例１０参照)。
【００４４】ＡＢ１抗体ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３
は、癌細胞への結合に続いて、人エフェクター機構の活
性化を経由した癌細胞破壊を媒介する。抗−ｉｄＢＲ５
５−２＃Ｅ４で免疫化して誘発したアカゲザルＩｇの癌
細胞破壊の能力を試験するために、免疫精製サルＩｇ
(ＡＢ３)を使用した。この実験のために、ＡＢ３−フラ
クションを最初の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による免
疫化工程の９週間後に得たアカゲザルの血清から免疫精
製した(上記参照)。このＡＢ３−フラクションを、人Ｐ
ＢＭＣをエフェクター細胞として使用したＡＤＣＣ実験
において、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３(ＡＢ１)と比
較した(結果は図２６に示し、実験の詳細は実施例１４
参照)。免疫精製ＡＢ３−フラクションは、高濃度で、
人エフェクター細胞の活性化による癌細胞破壊を、マウ
スＡＢ１と同等に媒介する。この結果により、抗−ｉｄ
ＢＲ５５−２＃Ｅ４でのワクチン処理による選択的癌細
胞細胞毒性の示唆が証明される。免疫精製Ｉｇ−フラク
ションのある部分のみしか、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ
４の結合領域を指向せず、この部分が癌細胞に結合し、
ＡＤＣＣを媒介すると思われるため、高濃度のＡＢ３が
必要である。
【００４５】導入部で述べたように、ルイスＹ炭化水素
抗原はまたＨＩＶに感染した人白血球上に発現すること
が知られている。抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非
特異的マウスＩｇＧ１で免疫化したアカゲザルの血清Ｉ
ｇのＨＩＶ感染細胞に対する結合行動を調べるため、最
初の免疫化工程前および９週間後に得られたサル血清
を、人血清中のＨＩＶ−陽性性を検出するために作られ
た商業的に入手可能な試験キットで試験した。本試験
は、抗−人ＩｇＧ−ＦＩＴＣを使用した間接免疫蛍光に
より検出された人血清ＩｇのＨＩＶ−感染人Ｔ細胞系Ｐ
ＡＬＬへ結合する能力を基本にしている。人およびアカ
ケザルのＩｇの大きな類似性のため、試験キットの本来
の試薬はまたアカケザルＩｇにも適応できる。非感染Ｐ
ＡＬＬ細胞への結合を対照として使用する(実験の詳細
は実施例１５参照)。
【００４６】正常アカケザル血清では、ＨＩＶ感染およ
び非感染ＰＡＬＬ細胞の両方のバックグラウンド免疫蛍
光は、正常人血清で検出されたバックグラウンド免疫蛍
光より僅かに高い。しかしながら、抗−ｉｄＢＲ５５−
２＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルの血清ＩｇのみがＨＩ
Ｖ−感染ＰＡＬＬ細胞と実質的に結合するが、非感染Ｐ
ＡＬＬ細胞への結合はほとんど全く検出されない。非特
異的マウス−ＩｇＧ１で免疫化したアカゲザルの血清Ｉ
ｇのＨＩＶ−感染ＰＡＬＬ細胞に対する反応性は、明ら
かにあまり促進されておらず、正常サル血清で見られる
バックグラウンドの免疫蛍光と非常に近い(結果は表３
に要約する)。
【００４７】抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化した
アカゲザルのＩｇは、２回目の免疫追加の４及び９週間
後に得た貯蔵血清から、抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４カ
ラム(上記参照)を使用して免疫精製した。本免疫精製Ｉ
ｇ(ＡＢ３)の結合特性を、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ
３(ＡＢ１)と、既に述べた人血清中のＨＩＶ−血清陽性
性を検出するために設計された商業的に入手可能な試験
キット中で比較した(実験の詳細は実施例１５参照)。免
疫精製Ｉｇ−フラクション(ＡＢ３)は選択的にＨＩＶ−
感染ＰＡＬＬ細胞に結合するが、非感染ＰＡＬＬ細胞へ
の結合は検出されない。同様な結合パターンがＢＲ５５
−２／マウスＩｇＧ３(ＡＢ１)で見られる。これらの結
果は表４に要約する。
【００４８】種々の癌およびＨＩＶが原因である疾病の
予防および処置のための独特なワクチンとしての使用に
加えて、本発明で記載のＢＲ５５−２の結合領域に対し
て発生した内部像抗−イディオタイプＭａｂは、ＢＲ５
５−２への結合特性を有するモノクローナル抗体、その
誘導体または断片の定量的測定の有力な道具である。例
えば、人血清中の全てのマウスのＢＲ５５−２のサブタ
イプの濃度を選択的に測定するのに使用できる。ＢＲ５
５−２の結合領域の三次元構造の認識のため、これらの
抗−ｉｄＭａｂは免疫反応性ＢＲ５５−２構造のみに結
合する。この特性は、既知の抗−定常領域剤を基本にし
たものより優れた検出系を導く。免疫反応性ＢＲ５５−
２／マウスＩｇＧ３またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ
２ａの定量的測定のためのＥＬＩＳＡ系は、実施例１６
に記載され、人血清中のＭａｂの典型的な標準曲線は図
２７に示す。
【００４９】本発明で記載の抗−ｉｄＭａｂを基にした
同様なＥＬＩＳＡ系が、人血清中のＢＲ５５−２の免疫
反応性マウス／人キメラの高度に選択的な定量的測定に
適用できる。これらのキメラはＢＲ５５−２の可変領域
および人定常領域からなる(例えば人ＩｇＧ１または人
ＩｇＧ３)。人血清中での大量に過剰な正常人Ｉｇのた
め(＞１０mg／ml)、このようなマウス／人キメラは、血
清に存在する任意の人Ｉｇに結合する既知の抗−人−Ｆ
ｃ剤を使用して人血清中では検出できない。選択的ＥＬ
ＩＳＡ系は実施例１７および１８に記載し、人血清中で
の典型的な標準曲線は図２８および２９に示す。
【００５０】完全に人化したＢＲ５５−２の変異体は、
マウス親Ｍａｂの相補性決定領域(ＣＤＲ)を、人のフレ
ームワークおよび定常領域へ融合させることにより構築
する。コンピューター造形の手段により、選択した人フ
レームワークのある点変異が、親マウスＭａｂと比較し
てルイスＹ陽性癌細胞に対する結合親和性を実質的に損
失しない人化変異体を導く。従って、本来のマウスアミ
ノ酸配列の少しの部分のみのこれらの人化変異体は、結
合特性が未変化で残っていることを測定する。著しく、
本発明で記載の全ての抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂはま
たこれらの親マウスＩｇＧ３Ｍａｂの人化ＩｇＧ１変異
体のイディオタイプに強く結合する。抗−ｉｄＭａｂの
ＡＢ１人化変異体への結合行動は、上記のマウス／人キ
メラＭａｂと同等である。これは、ファルマシアのＢＩ
Ａｃｏｒｅ(商標)系を使用した生物特異的相互作用分析
により証明される。殆どの場合、高濃度で、抗−ｉｄＢ
Ｒ５５−２およびＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧまたは
ＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間で殆ど１：１化学量論
が観察される。実験の詳細は実施例１９に示し、抗体価
曲線は図３０−３５に示す。これらの発見は抗−ｉｄＭ
ａｂの、全てのＢＲ５５−２の変異体の超可変領域の無
傷三次元形への結合の結合特性およびその内部像特性を
証明する最重要点である。
【００５１】この独特および選択的認識パターンを基に
して、抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂはまた、人血清中
で、血清中に存在する大過剰の人免疫グロブリンにもか
かわらず、ＢＲ５５−２に特性を有する免疫反応性人化
抗体の高度に選択的定量測定に使用できる。同じＥＬＩ
ＳＡ系がまたサル血清中でのＢＲ５５−２に特性を有す
る人化抗体の定量的測定に有用である。例えば、人化Ｂ
Ｒ５５−２Ｍａｂの受動免疫治療のための、前臨床開発
間に必要なサル毒性および薬物動態の研究に非常に重要
である。ＥＬＩＳＡ系は実施例２０に記載し、人血清に
おける典型的標準曲線は図３６に示す。
【００５２】ＢＲ５５−２全ての変異体の抗−ｉｄＢＲ
５５−２Ｍａｂによる結合領域の認識はまたＢＲ５５−
２／マウスＩｇＧ３の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への
結合をＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１およびＢＲ５５
−２／キメラ人ＩｇＧ３と比較することにより証明され
る。両方のキメラは、一定量の親マウスＭａｂの抗−ｉ
ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合を用量依存的に競合阻害
する。この競合ＥＬＩＳＡは実施例２１に記載し、結果
は図３７に示す。
【００５３】ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の抗原陽性
癌細胞系への結合は、補体媒介破壊に必須である。従っ
て、癌細胞毒性の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂによる阻
害は、Ａｂ１の細胞表面上のその抗原への結合を阻止す
る能力を反映する。ＳＫＢＲ５人乳癌細胞系に対するＢ
Ｒ５５−２／マウスＩｇＧ３により媒介された補体依存
細胞毒性の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による有効な中
和を図３８に示し、実験の詳細は実施例２２参照。
【００５４】ＢＲ５５−２の無傷結合領域の全ての構造
の非常に特異的な認識のため、抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍ
ａｂは、全てのＢＲ５５−２の変異体の単一工程免疫精
製法に使用できる。抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４はＣＨ
−セファロース４Ｂと結合する。この免疫親和性材料
は、例えばインビトロで培養されたＢＲ５５−２／キメ
ラ人ＩｇＧ１の直接の精製に使用できる。キメラＭａｂ
は、純度＞９５％で、収率７５％で得られた。非常に選
択性のため、本免疫精製法はプロテインＡを使用した親
和性精製より優れている。実験の詳細は実施例２３、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥは図３９に示す。不純物は検出されな
い。同じ方法が、同様の好結果で、ＣＤＲの移植により
得たＢＲ５５−２の人化変異体の細胞培養上清の非常に
有効な一工程精製に適応できる。
【００５５】結論として、ウサギおよびアカゲザルのマ
ウスモノクローナルＩｇＧ１抗−イディオタイプ抗体に
よるＢＲ５５−２(抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４)に特性
を有する抗体のイディオタイプに対する免疫化は、ルイ
スＹ陽性人癌細胞に特異的に結合する高い抗体価免疫反
応を導く。アカゲザルの実験で証明されるように、反復
追加免疫化により、抗−癌免疫性が数年維持される。こ
れらの免疫化により人エフェクター細胞存在下で誘発さ
れたＩｇは、癌細胞毒性をＡＤＣＣ中で示す。抗−ｉｄ
免疫化の特異性は、アカゲザルの対照群の非特異的マウ
スＩｇＧ１による免疫化により証明される。非特異的マ
ウスＩｇＧ１に対する実質的免疫反応にもかかわらず、
任意の種類の癌細胞への特異的結合は検出されない。
【００５６】これらの結果により、人における保護的抗
癌免疫性の誘発を目的とする治療および予防的活性免疫
化のための抗−ｉｄＢＲ５５−２ＭａｂのルイスＹ癌関
連抗原の代替物としての使用は、最重要点である。
【００５７】更に、アカゲザルの抗−ｉｄＢＲ５５−２
Ｍａｂによる免疫化は、選択的にＨＩＶ−感染陽性細胞
に特異的にまた結合する高い抗体価免疫反応を導く。こ
れらの細胞は、ルイスＹを発現することが知られてい
る。比較して、アカゲザルの非特異的マウスＩｇＧ１に
よる免疫化は、ＨＩＶ−陽性または陰性細胞への特異的
結合を導かない。
【００５８】これらの結果から、ＨＩＶおよびＨＩＶ感
染が原因である疾病の保護的免疫性の誘発を目的とする
治療および予防的ワクチン処理のための抗−ｉｄＢＲ５
５−２ＭａｂのルイスＹ炭水化物抗原の代替物としての
使用は、最重要点である。
【００５９】抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの予防的およ
び治療的ワクチンとしての使用に加えて、これらの内部
像抗−ｉｄＭａｂは、血清中または他の体液中における
キメラおよび人化変異体を含むＢＲ５５−２に特異性を
有する分子の、非常に選択的および定量的測定に有用な
試薬である。好適なマトリックスと共有結合したこれら
の抗−ｉｄＭａｂは、ＢＲ５５−２に特異性を有するす
べての分子の高収率で非常に選択的な単一工程免疫親和
性精製にまた使用できる。
【００６０】以下の実施例は本発明を説明する。略語は
以下の意味を有する： ＡＤＣＣ： 抗体依存性細胞性細胞毒性 ＢＳＡ： 牛血清アルブミン ＣＤＣ： 補体依存細胞毒性 ＤＭＥＭ： ダルベッコ修飾イーグル培地 ＥＤＣ： Ｎ−エチル−Ｎ'−(３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイ ミドヒドロクロリド ＥＬＩＳＡ: 酵素結合免疫吸着測定 ＦＣＳ： 牛胎児血清 ＨＢＳ： ヘペス緩衝化食塩水 Ｍａｂ： モノクローナル抗体 ＮＨＳ： Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド ＰＢＭＳ： 末梢血単核細胞 ＰＢＳ： リン酸緩衝化食塩水 RAM-IgG1： ウサギ抗マウスＩｇＧ１免疫グロブリン ＲＰＭＩ： ロスウェル・パーク・メモリアル・インスチテュート ＳＤＳ： ドデシル硫酸ナトリウム ＫＬＨ： キーホルリンペットヘモシアニン ＳＰＤＰ： Ｎ−サクシンイミジル−３−(２−ピリジル−ジチオプロピオ ン酸) ＰＡＧＥ： ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＩＥＦ： 等電点電気泳動 ＰＥＧ： ポリエチレングリコール ＦＩＴＣ： フルオリンイソチオシアネート ＩＦＡ： 免疫蛍光測定。
【００６１】実施例中で記載される材料は以下の通りで
ある： マイクロタイタープレート：イムノプレートII(ヌンク) 細胞系： ＳＫＢＲ５: 人乳癌細胞系 ＣＡＴＯ： 人胃癌細胞系 ＳＷ９４８: 人大腸癌細胞系 ＳＷ２： 人小細胞肺癌系 ＷＭ９： 人メラノーマ細胞系 ＰＡＬＬ： 人Ｔ−細胞系 ＳＰ２： マウスミエローマ細胞系 培地Ａ： ＲＰＭＩ１６４０＋２ｇ／ｌＮａＨＣＯ3 １００Ｕ／mlペニシリンＧ １００μg／ml硫酸ストレプトマイシン ４mMグルタミン １０％ＦＣＳ(熱不活性、γ−グロブリン−不存在) 培地Ｂ： ＲＰＭＩ１６４０＋２ｇ／ｌＮａＨＣＯ3 １００Ｕ／mlペニシリンＧ １００μg／ml硫酸ストレプトマイシン ４mMグルタミン １０％ＦＣＳ(熱不活性) 培地Ｃ： ＤＭＥＭ １０％ＮＣＴＣ−１３５(合成培地、ギブコ) １％ＭＥＭ不必須アミノ酸(ギブコ) ０.５％ピルビン酸ナトリウム ０.５％オキサロ酢酸(シグマ) ２０％熱不活性ＦＣＳ ４mMグルタミン １００Ｕ／mlペニシリンＧ １００μg／ml硫酸ストレプトマイシン 培地Ｄ： 培地Ｃ＋１.３６mg／ｌヒポキサンチン ０.３９mg／ｌチミジン 培地Ｅ： 培地Ｄ＋０.４mg／ｌアミノプテリン 培地Ｆ： 培地Ｃ＋マウス胸腺細胞(２５ml培地Ｃに懸濁した一匹のＢａ ｌｂ／ｃマウスの胸腺細胞) 培地Ｇ： ＤＭＥＭ １０％熱不活性ＦＣＳ ４mMグルタミン １００Ｕ／mlペニシリンＧ １００μg／ml硫酸ストレプトマイシン 培地Ｈ： １０mMＮ−(２−ヒドロキシエチル)ピペラジン−Ｎ'−エタン スルホン酸 ３.４mMエチレンジニトロテトラ酢酸 ０.１５Ｍ ＮａＣｌ ０.００５％Ｐ２０(ファルマシア・バイオセンサー・アクチエ ボラーク、ウプサラ、スウェーデン) ＰＥＧ： ポリ−エチレン−グリコール(ＭＷ＝３４００) １ｇが１mlＤＭＥＭに溶解 ＰＢＳ欠乏： １３８.０mM ＮａＣｌ １.５mM ＫＯＨ ２.７mM ＫＣｌ ６.５mM Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ ７.２コーティンク゛ 緩衝液： １５mM Ｎａ2ＣＯ3 ３５mM ＮａＨＣＯ3 ３mM ＮａＮ3 ｐＨ ９.６ 染色緩衝液： ２４.３mMクエン酸 ５１.４mM Ｎａ2ＨＰＯ4 ｐＨ ５.０ 洗浄用緩衝液： ＰＢＳ欠乏中 ２％ ＮａＣｌ ０.２％トリトンＸ−１００ 基質溶液： ４０mg ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド １００ml染色緩衝液 ２０μl Ｈ2Ｏ2 ３０％ 結合緩衝液： ０.１Ｍ トリス／ＨＣｌ ０.２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ ７.５ 溶出緩衝液： ０.１５Ｍ グリシン／ＨＣｌ ０.２Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ ２.８ 連結緩衝液： ０.１Ｍ ＮａＨＣＯ3 ０.５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ ８.０
【００６２】
【実施例】実施例１：抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの発
生 １.１：マウスの免疫化 Ｂａｌｂ／ｃマウスを各々、ＳＰＤＰを経由してＫＬＨ
と組み合わせたＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３のＦ(ａ
ｂ')−断片１００μlで、記載のように(ジェー・カルソ
ンら、バイオケミカル・ジャーナル、１７３、７２３、
１９７８)、以下の計画の腹腔内注射により免疫化す
る： ０日：接合体１００μg(ＰＢＳ欠乏中１mg／ml)＋フロ
インド完全アジュバント１００μl ７および２８日：接合体１００μg(ＰＢＳ欠乏中１mg／
ml)＋フロインド不完全アジュバント１００μl
【００６３】最初の免疫化i.v.の８、９、１０および１
１日後、全４回の追加免疫(各々ＰＢＳ欠乏中１００μl
中接合体１００μg)を与える。１２日に脾臓を無菌的に
取り出し、ＰＢＳ欠乏に懸濁し、３回ＰＢＳ欠乏で洗浄
する。
【００６４】１.２：ハイブリダイゼーション これらの脾臓細胞をＳＰ２／０細胞懸濁液中に１：１の
比で加え、９００ｇで５分遠心する。ＰＥＧ−溶液１ml
(３７℃)を細胞ペレットに１分以内に滴下し、ＰＢＳ欠
乏１ml(３７℃)で翌分以内に希釈する。培地Ｃ１０mlを
穏やかに攪拌しながら加え、懸濁液をＰＢＳ欠乏で５０
mlに希釈する。懸濁液を８００ｇで５分遠心し、ペレッ
トを培地Ｄに再懸濁し、細胞をマイクロタイタープレー
ト(ヌンク９６)のウェルに、２.５×１０5細胞／ウェル
の濃度で移す。一晩、３７℃、５％ＣＯ2でのインキュ
ベーションの後、培地Ｅ１００μl／ウェルを加える。
７２時間後および４日毎に培地を新しい培地Ｄに代え
る。
【００６５】実施例２：ハイブリドーマ上清中のマウス
ＩｇＧの定量的測定 ウサギ−抗−マウス−ＩｇＧ(ノルディック試薬のよう
なもの：コーティング緩衝液中１：１０００)の１００
μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェル
に加え、３７℃で６０分インキュベーションする。プレ
ートを６回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ欠乏／５％Ｆ
ＣＳ２００μlを加え、３０分、３７℃でインキュベー
ションする。プレートを上記のように洗浄する。培養２
週間後に得られたハイブリドーマ上清の１００μlのア
リコートを加え、プレートを３７℃で６０分インキュベ
ーションする。非結合抗体を上記のように洗い出し、ペ
ルオキシダーゼ−結合抗体(ディアノヴァの試薬のよう
なウサギ−抗−マウス−ＩｇＧ／ペルオキシダーゼ；Ｐ
ＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１００μlのアリコ
ートを加える。３０分、３７℃でインキュベーションの
後、プレートを４回洗浄用緩衝液、２回染色緩衝液で洗
浄する。基質溶液の１００μlのアリコートを加え、色
の濃くなるのを５分後に４Ｎ Ｈ2ＳＯ4の５０μlのアリ
コートを加えることにより停止させる。光学的励起を４
９２nmで測定する(参考測定６２０nm)。
【００６６】実施例３：ハイブリドーマ上清−ＩｇＧの
ＢＲ５５−２Ｆ(ａｂ')2−断片に対する特異的結合(Ｅ
ＬＩＳＡ) 充分なマウスＩｇＧ(即ち培地ブランクより１０倍以上
光学密度が高い)を産生するハイブリドーマを、培地Ｆ
中の単一細胞培養にサブクローン化し、培地Ｃ内で更に
２週間培養する。上清を、ＢＲ５５−２のＦ(ａｂ')−
断片(１０μg／ml；コーティング緩衝液中の希釈)の１
００μlのアリコートを使用して実施例２に記載のよう
に試験する。
【００６７】実施例４：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２
ａのＳＫＢＲ５人乳癌細胞への結合のハイブリドーマ上
清−ＩｇＧによる阻害(細胞−ＥＬＩＳＡ) 上記測定で陽性の全てのハイブリドーマ上清を、以下の
ように試験する：マイクロタイタプレートをポリ−Ｌ−
リジンヒドロブロミド(２０−３０kD；ＰＢＳ欠乏中２
０μg／ml；１００μl／ウェル；３０分、室温)で予備
処理し、２回ＰＢＳ欠乏(２００μl／ウェル)で洗浄
し、次いで、培地Ｂ中のＳＫＢＲ５細胞懸濁液(４×１
０6細胞／ml)５０μl／ウェルと共に一晩４℃でインキ
ュベーションする。上清を除去した後、５０μlグルタ
ールジアルデヒド／ウェル(生理食塩水中０.１％)で５
分間、室温で固定し、上清を除去し、細胞をＰＢＳ欠乏
／１％ＢＳＡ／０.１％ＮａＮ3２００μl／ウェル中に
再懸濁し、１時間室温に置く。上清を除去し、プレート
を２回０.０５％トゥイン２０含有ＰＢＳ２００μl／ウ
ェルで洗浄する。
【００６８】１μg／mlマウス−ＩｇＧに調整したハイ
ブリドーマ上清を１０倍過剰の非特異的マウス−ＩｇＧ
と共に３０分、３７℃でインキュベーションする。これ
らのサンプルを０.５μg／mlＢＲ５５−２／マウスＩｇ
Ｇ２ａと共に３０分、３７℃でインキュベーションす
る。本混合物１００μlを細胞に加え、プレートを１時
間、３７℃でインキュベーションする。
【００６９】混合物の後処理：非結合抗体を２回１００
μl／ウェル氷冷０.０５％トゥイン２０含有ＰＢＳで洗
い出す。ペルオキシダーゼ−結合抗体(ツィメッド試薬
のようなウサギ−抗−マウスＩｇＧ２ａ／ペルオキシダ
ーゼ；ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１０
０μlのアリコートを加える。４５分、３７℃でインキ
ュベーションした後、ウェルを３回上記ＰＢＳ／トゥイ
ン２０溶液で洗浄し、次いで基質溶液１００μlを各々
のウェルに加える。５分後、色の濃くなるのを４Ｎ Ｈ
2ＳＯ4を加えることにより停止させる。抗体の細胞への
結合を４９２nmの光学的励起を測定することにより決定
する(参考測定６２０nm)。
【００７０】実施例５：抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの
免疫親和精製 ５.１：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２ａセファロース
の調製 凍結乾燥活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ１０ｇを１mM
ＨＣｌに懸濁し、焼結ガラスフィルターに移し、１mM
ＨＣｌ ２ｌで１５分洗浄する。配位子(ＢＲ５５−２
／マウスＩｇＧ２ａ １２０mg)を連結緩衝液５０mlに
溶解し、栓をした容器内で洗浄したゲルと混合し、１時
間室温でくるくる回転させる。ゲルを連結緩衝液で洗浄
し、１時間１Ｍエタノールアミン５０mlとインキュベー
ションし、残存活性基を遮断する。次いで、親和性収着
媒を交互のｐＨで３サイクル洗浄する。各々のサイクル
は、ｐＨ４(０.１Ｍ酢酸、０.５Ｍ ＮａＣｌ)での洗
浄、続くｐＨ８(０.１Ｍ トリス、０.５Ｍ ＮａＣｌ)
での洗浄から成る。
【００７１】５.２：抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの単
離 クロマトグラフィーを４℃で行う。カラム(ＢＩＯ Ｒ
ＥＸ ＭＰカラム直径１.５cm)をＭａｂＢＲ５５−２／
マウスＩｇＧ２ａセファロース(容量３５ml)で満たす。
ゲルを結合緩衝液および溶出緩衝液で洗浄する。結合緩
衝液による平衡化の後、抗−ｉｄＢＲ５５−２含有条件
媒質をカラムに流速１５ml／分でかける。エスケーパー
フラクションの溶出の後、結合抗−ｉｄＢＲ５５−２が
溶出緩衝液と共に脱着し、脱着後すぐに１Ｍ トリス／
ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５で中和する。
【００７２】５.３：抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの濃
縮 溶出抗体溶液(０.１２mg／ml)の濃縮を、ＰＭ１０ジア
フロ膜を使用した攪拌アミコン超濾過セル中で行う。Ｉ
ｇＧに対する溶質拒否は９８％以上であり、ＩｇＧの最
終濃縮は３.７mg／mlである。
【００７３】 実施例６：精製抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの特徴付け ６.１：Ｍｏｎｏ−Ｑイオン交換クロマトグラフィー カラム： Ｍｏｎｏ−ＱＨＲ５／５(ファルマシア) 緩衝液Ａ： ２０mMトリエタノールアミン、ｐＨ７.７ 緩衝液Ｂ： ２０mMトリエタノールアミン、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.７ 流速： １ml／分 検出： ＵＶ２８０nm 勾配： 直線２％／分 結果： 全ての抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂにおいて＞９５％純度と 分かった
【００７４】 ６.２：高速サイズ排除クロマトグラフィー カラム： ゾルバックスＧＦ２５０、９.４×２５０mm 緩衝液： ０.１Ｍリン酸ナトリウム、０.２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０ 流速： １ml／分 検出： ＵＶ２８０nm 結果： 全ての抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂにおいて＞９５％純度と 分かった
【００７５】６.３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 実験は、１０％アクリルアミドゲルを使用して、レミリ
ーの方法に従って、還元および非還元の両方で行う。不
純物は検出されない(結果は図１に示す)。
【００７６】６.４：等電点電気泳動 分析は、ｐＨ勾配３−９(ファストゲルＩＥＦ３−９)を
使用してファスト−システム(ファルマシア)および銀染
色で行う(結果は図２に示す)。
【００７７】実施例７：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３
のＳＫＢＲ５細胞系への結合(細胞−ＥＬＩＳＡ)−精製
抗−ｉｄＭａｂによる阻害 マイクロタイタプレートの予備処理を実施例４に記載の
ように行う。各々抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂを２％Ｆ
ＣＳ含有ＰＢＳ欠乏で希釈する(１０から０.５μg／m
l)。各々のこれらの希釈に、１μg／mlＢＲ５５−２／
マウスＩｇＧ３を加える。本混合物の１００μlを細胞
に加え、プレートを１時間、３７℃でインキュベーショ
ンする。本混合物を実施例４に記載のように後処理す
る。ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の細胞への結合の程
度を４９２nmの光学的励起を測定することにより決定す
る(参考測定６２０nm)。
【００７８】実施例８:抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４に
よるウサギおよびアカゲザルの免疫化 ８.１：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４によるウサギの免
疫化 ３匹の雌チンチラウサギを、水酸化アルミニウムに吸着
した抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４(抗体１mg＋Ａｌ(Ｏ
Ｈ)3３.３mg／ＰＢＳ欠乏ml)３００μgの皮内投与によ
り、１、８、１５および３６日に免疫化する。３匹のウ
サギを、陰性対照として、同様の条件下、同量の非特異
的マウス−ＩｇＧ１で免疫化する。血清を免疫化前およ
び最初の免疫９週間後に回収する。
【００７９】８.２：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４によ
るアカゲザルの免疫化 ３匹アカゲザルを、水酸化アルミニウムに吸着した抗−
ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４(抗体１mg＋Ａｌ(ＯＨ)3３.３m
g／ＰＢＳ欠乏ml)０.１mg／kgの皮下(s.c.)投与によ
り、１、８、１５および３６日に免疫化する。２匹のア
カゲザルを、陰性対照として、同様の条件下、同量の非
特異的マウス−ＩｇＧ１で免疫化する。血清を免疫化前
および最初の免疫４および９週間後に回収する。
【００８０】最初の免疫化過程の２年後、同じサルは、
各々抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的マウス
−ＩｇＧ(上記と同量および同製剤)の最初の追加免疫注
射を受ける。血清を最初の追加免疫化の前および１およ
び４週間後に集める。最初の免疫化過程の３年後(＝最
初の追加免疫注射の１年後)、同じサルは、各々抗−ｉ
ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４または非特異的マウス−ＩｇＧ
(上記と同量および同製剤)の２回目の追加免疫注射を受
ける。血清を２回目の追加免疫化の前および１、４およ
び９週間後に集める。
【００８１】実施例９：ＳＫＢＲ５またはＷＭ９細胞系
へのウサギ血清Ｉｇの結合(細胞−ＥＬＩＳＡ) マイクロタイタープレートの前処理は実施例４に記載の
ように行う。好適な予備希釈したウサギ血清の１００μ
lのアリコートを細胞に加え、プレートを３７℃で１時
間インキュベーションする。抗体の細胞への結合を、４
９２nmの励起を測定することにより決定する(参考測定
６２０nm)。 実施例１０：ＳＫＢＲ５、ＣＡＴＯ、ＳＷ９４８、ＳＷ
２およびＷＭ９人癌細胞系へのアカゲザル血清Ｉgまた
は免疫精製Ｉg(ＡＢ３)の結合(細胞-ＥＬＩＳＡ)
【００８２】マイクロタイタープレートの前処理は実施
例４に記載のように行う。好適な予備希釈したアカゲザ
ル血清Ｉｇまたは免疫精製アカゲザルＩｇ(実施例１２
をまた参考)および対照としてＢＲ５５−２人化ＩｇＧ
１の１００μlのアリコートを細胞に加え、プレートを
３７℃で１時間インキュベーションする。混合物を実施
例４に記載のように後処理する。抗体の細胞への結合
を、４９２nmの励起を測定することにより決定する(参
考測定６２０nm)。
【００８３】実施例１１：アカゲザル血清Ｉｇまたは免
疫精製Ｉｇ(ＡＢ３)のＳＫＢＲ５−またはＷＭ９−癌細
胞−膜調製物への結合(ＥＬＩＳＡ) ルイスＹ抗原陽性ＳＫＢＲ５人乳癌細胞系およびルイス
Ｙ陰性ＷＭ９メラノーマ細胞系の膜を、ディー・トム
ら、バイオケミカル・ジャーナル、１６８、１８７−１
９４(１９７７)に記載のように調製した。各々の膜調製
物(１０μg／ml；コーティング緩衝液中希釈)の１００
μlのアリコートをマイクロタイタープレートのウェル
に加え、＋４℃で一晩インキュベーションする。プレー
トを４回洗浄用緩衝液で洗浄し、ＰＢＳ欠乏／５％ＦＣ
Ｓ２００μlを加え、３０分、３７℃でインキュベーシ
ョンする。プレートを上記のように洗浄する。ＰＢＳ欠
乏／２％ＦＣＳ中、好適な希釈のアカゲザル血清または
免疫精製アカゲザルＩｇ(２をまた参照)の１００μlの
アリコートを加え、プレートを６０分、３７℃でインキ
ュベーションする。非結合抗体を上記のように洗い出
し、ペルオキシダーゼ−結合抗体(ケミコン＆コーポレ
イテッドの試薬のようなヤギ−抗−人−Ｉｇ／ペルオキ
シダーゼ、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１０
０μlのアリコートを加える。３０分、３７℃でインキ
ュベーションの後、プレートを２回洗浄用緩衝液、２回
染色緩衝液で洗浄する。
【００８４】基質溶液１００μlのアリコートを加え、
５分後、色の濃くなるのを４Ｎ Ｈ2ＳＯ4の５０μlの
アリコートを加えることにより停止させる。光学密度
(ＯＤ)を４９２nmで測定する(参考測定６２０nm)。
【００８５】実施例１２：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４
(ＡＢ３)で免疫化したアカゲザルの血清Ｉｇの抗−ｉｄ
ＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロースを使用した免疫親和
精製 １２.１：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロース
の調製 凍結乾燥活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ９ｇを１mM Ｈ
Ｃｌに懸濁し、焼結ガラスフィルターに移し、１mM Ｈ
Ｃｌ２ｌで１５分洗浄する。配位子(抗−ｉｄＢＲ５５
−２＃Ｅ４ ９５mg)を連結緩衝液５０mlに溶解し、栓
をした容器内で洗浄したゲルと混合し、１時間室温でく
るくる回転させる。ゲルを連結緩衝液で洗浄し、１時間
１Ｍエタノールアミン５０mlとインキュベーションし、
残存活性基を遮断する。次いで、親和性収着媒を交互の
ｐＨで３サイクル洗浄する。各々のサイクルは、ｐＨ４
(０.１Ｍ酢酸、０.５Ｍ ＮａＣｌ)での洗浄、続くｐＨ
８(０.１Ｍ トリス、０.５Ｍ ＮａＣｌ)での洗浄から
成る。
【００８６】１２.２：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で
免疫化したアカゲザル血清Ｉｇ(ＡＢ３)の単離 クロマトグラフィーを４℃で行う。カラム(ファルマシ
アカラムＨＲ５／２、ベッド容積５×２５mm)を抗−ｉ
ｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロース(容量０.５ml)で
満たす。ゲルを結合緩衝液および溶出緩衝液で洗浄す
る。出発材料は抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４で免疫化し
たアカゲザルから、免疫開始９週間後に得た血清２mlで
ある。他の一連の実験のために、抗−ｉｄＢＲ５５−２
＃Ｅ４で免疫化したアカゲザルから、２回目の追加免疫
４および９週間後に得た保存血清２mlを使用した。各々
の血清を結合緩衝液中１：２に希釈し、カラムにかけ
る。エスケーパーフラクションの溶出の後、結合アカゲ
ザル免疫グロブリンが溶出緩衝液と共に脱着し、脱着後
すぐに１Ｍ トリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.５で中和
する。
【００８７】実施例１３：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４
または非特異的マウスＩｇＧ１で免疫化したアカゲザル
血清Ｉｇまたは免疫精製Ｉｇの抗−ｉｄＢＲ５５−２＃
Ｅ４への結合(ＥＬＩＳＡ) 抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４(１０μg／ml；コーティン
グ緩衝液中希釈)の１００μlのアリコートをマイクロタ
イタープレートのウェルに加え、３７℃で６０分インキ
ュベーションする。プレートを６回洗浄用緩衝液で洗浄
し、ＰＢＳ欠乏／５％ＦＣＳ２００μlを加え、３０
分、３７℃でインキュベーションする。プレートを上記
のように洗浄する。サル血清または免疫精製サルＩｇを
ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳ中希釈する。各々のサンプルの
１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートの
ウェルに加え、プレートを６０分、３７℃でインキュベ
ーションする。非結合抗体を上記のように洗い出し、ペ
ルオキシダーゼ−結合抗体(ケミコン＆コーポレイテッ
ドの試薬のようなヤギ−抗−人−Ｉｇ／ペルオキシダー
ゼ、ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１００μlの
アリコートを加える。３０分、３７℃でインキュベーシ
ョンの後、プレートを４回洗浄用緩衝液、２回染色緩衝
液で洗浄する。基質溶液１００μlのアリコートを加
え、５分後、色の濃くなるのを４Ｎ Ｈ2ＳＯ4の５０μ
lのアリコートを加えることにより停止させる。光学密
度(ＯＤ)を４９２nmで測定する(参考測定６２０nm)。
【００８８】実施例１４：人ＰＢＭＣを使用した免疫精
製サルＩｇ(ＡＢ３)またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ
３により媒介されるＳＫＢＲ５細胞に対する抗体依存細
胞毒性(ＡＤＣＣ) 測定の前日、ＳＫＢＲ５細胞を新鮮培地Ａに移し、細胞
培養フラスコ中で３７℃／５％ＣＯ2に保つ。
【００８９】標的細胞の51Ｃｒ標識：細胞を培養フラス
コから回収し、培地Ａ８００μl中５×１０6細胞の濃度
で３７℃／５％ＣＯ2で１時間、１００μCi Ｎａ2 51Ｃ
ｒＯ4とインキュベーションする。細胞を、次いで培地
Ａで洗浄し、過剰の51Ｃｒを除去し、新鮮培地Ａに再懸
濁し、その濃度を２.５×１０5細胞／mlに調製する。
【００９０】ＰＢＭＣの単離：ヘパリン処理した新鮮人
血液５０mlを０.１％グルコース含有ＰＢＳ完全６０ml
で希釈する。本溶液の１５mlのアリコートをフィコール
−パーク溶液１５mlの上に重層し、管を４００ｇで３０
から６０分遠心する。血漿上清を廃棄し、ＰＢＭＣ層を
回収し、ＰＢＳ完全＋０.１％グルコース５０mlで希釈
する。約８０ｇ(１０分)で遠心後、ペレットをＰＢＳ完
全＋０.１％グルコース２５−３０mlに再懸濁し、再遠
心(８０ｇ、１０分)し、ペレットを回収し、培地Ａに懸
濁し、細胞を計数し、懸濁液を約２×１０6から９×１
０6細胞／mlとなるように培地Ａで希釈する。１００μl
のアリコートをマイクロタイタープレートの各々のウェ
ルにピペットで移し、エフェクター細胞を一晩３７℃／
５％ＣＯ2でインキュベーションする。
【００９１】ＡＤＣＣ：51Ｃｒ−標識標的細胞１００μ
lを予備インキュベーションしたエフェクター細胞に、
エフェクター細胞対標的細胞の所望の比で加える。所望
の濃度にＰＢＳ欠乏で希釈した免疫精製サルＩｇ(ＡＢ
３)またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３５０μlを加
え、プレートを一晩(約１８時間)３７℃／５％ＣＯ2で
インキュベーションする。上清をスカトロン−ハーベス
ティング・プレスで回収し、γ−カウンターで計数す
る。これは実験的遊離の値を産生する。全51Ｃｒ遊離
は、ＰＢＭＣを２％ＳＤＳ、５０mM Ｎａ2ＣＯ3および
１０mM ＥＤＴＡ１００μlと置き換え、抗体溶液をＰ
ＢＳ欠乏５０μlと置き換えることにより上記のように
決定する。自然51Ｃｒ遊離はＰＢＭＣを培地Ａ１００μ
lと置き換え、抗体溶液をＰＢＳ欠乏５０μlと置き換え
て得る。
【００９２】計数後、結果を以下のように計算する：
【００９３】実施例１５：ＨＩＶ−感染／非感染ＰＡＬ
Ｌ−細胞へのアカゲザル血清、免疫精製アカゲザルＩｇ
またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の結合(間接的免
疫蛍光測定、ＩＦＡ−抗−ＨＩＶ１−キット、バルドハ
イム) 商業的に入手可能な免疫蛍光測定キット(バルドハイム
＆コーポレイテッド；ＨＩＶ血清陽性性を決定するため
に購入)において、ＨＩＶ−感染および非感染ＰＡＬＬ
細胞(人Ｔ細胞系)をスライドに固定する。実験方法は本
質的に提供者のガイドラインに従う。１％ＢＳＡと共に
３０分、３７℃でインキュベーションした後、スライド
をアカゲザル血清(濃縮およびＰＢＳ欠乏中１：１０希
釈)または正常人血清中で希釈した免疫精製アカゲザル
Ｉｇ(ＡＢ３)またはＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３と共
に１時間、３７℃でインキュベーションする。ＨＩＶ陽
性人血清(試験キットの一部由来)を陽性対照として、正
常人血清を陰性対照として使用する。試験サンプルの非
結合決定基を３回ＰＢＳ欠乏で洗い出し、２％ＦＣＳ含
有ＰＢＳ欠乏中の抗−人−ＩｇＧ−ＦＩＴＣ試薬(試験
キットの一部)または抗−マウス−ＩｇＧ−ＦＩＴＣ(マ
ウスＭａｂの検出のため)の１：２０希釈を加える。３
７℃で３０分インキュベーション、３回ＰＢＳ欠乏で洗
浄およびスライドのはめ込みの後、免疫蛍光が蛍光マイ
クロスコープ内で観察され、得点する(０＝蛍光なし、
５＝最大蛍光)。
【００９４】実施例１６：人血清中の免疫活性ＢＲ５５
−２／マウスＩｇＧ３またはＢＲ５５−２／マウスＩｇ
Ｇ２ａを測定するための抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を
使用したＥＬＩＳＡ 抗−ｉｄ−ＢＲ５５−２＃Ｅ４(１０μg／ml；コーティ
ング緩衝液中希釈)の１００μlのアリコートをマイクロ
タイタープレートのウェルに加え、３７℃で６０分イン
キュベーションする。
【００９５】プレートを６回洗浄用緩衝液で洗浄し、Ｐ
ＢＳ欠乏／５％ＦＣＳ２００μlを加え、３０分、３７
℃でインキュベーションする。プレートを上記のように
洗浄する。ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３またはＢＲ５
５−２／マウスＩｇＧ２ａ含有人血清をＰＢＳ欠乏／２
％ＦＣＳ中好適な希釈で試験する。これらのサンプルの
１００μlのアリコートをマイクロタイタープレートの
ウェルに加え、６０分、３７℃でインキュベーションす
る。標準として、ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３または
ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ２を正常人血清で１０μg
／mlに予備希釈する。ＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳ中の好適
な希釈を上記のように処理する。非結合抗体を上記のよ
うに洗い出し、ペルオキシダーゼ−結合抗体(ツィメッ
ド試薬のようなウサギ−抗−マウスＩｇＧ３／ペルオキ
シダーゼまたはウサギ−抗−マウスＩｇＧ２ａ／ペルオ
キシダーゼ；ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１
００μlのアリコートを加える。３０分、３７℃でイン
キュベーションした後、ウェルを４回洗浄用緩衝液、２
回染色液で洗浄する。
【００９６】基質溶液１００μlのアリコートを加え、
５分後、色の濃くなるのを４Ｎ Ｈ2ＳＯ4の５０μlの
アリコートを加えることにより停止させる。光学的励起
を４９２nmで測定する(参考測定６２０nm)。血清サンプ
ルのＯＤ値は、標準曲線から読み取り、μg／mlで表
す。
【００９７】実施例１７：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４
を使用した人血清中の免疫反応性ＢＲ５５−２／キメラ
人ＩｇＧ１を測定するためのＥＬＩＳＡ ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１含有人血清を上記実施
例１６に記載のように、ペルオキシダーゼ結合抗体(ケ
ミコン＆カンパニーの試薬のようなヤギ−抗−人ＩｇＧ
／ペルオキシダーゼ；ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１００
０)を使用して試験する。
【００９８】実施例１８：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４
を使用した人血清中の免疫反応性ＢＲ５５−２／キメラ
人ＩｇＧ３を測定するためのＥＬＩＳＡ ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ３含有人血清を上記実施
例１７に記載のように試験する。
【００９９】実施例１９：ＢＲ５５−２／キメラ人Ｉｇ
Ｇ１およびＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１と抗−ｉｄＢＲ
５５−２Ｍａｂの間の実時間生特異的相互作用測定 実験はファルマシア・バイオセンサー・アクチエボラー
ク、ウプサラ、スウェーデンのＢＩＡcore(商標)系で行
った。ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１またはＢＲ５５
−２／人化ＩｇＧ１の非動化ＲＡＭ−ＩｇＧ１(ファル
マシア・バイオセンサー・アクチエボラーク、ウプサ
ラ、スウェーデンの試薬のような)に捕獲された種々の
マウスＩｇＧ１抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂへの結合を
実時間生特異的相互作用測定で測定した。
【０１００】系の流速を５μl／分に調製した。センサ
ーチップを蒸留水３５μl中のＮＨＳ０.２０１mgおよび
ＥＤＣ１.３１３mgで活性化した。１０mM 酢酸ナトリ
ウム緩衝液ｐＨ５.０ ３５μlに３０μg／mlの濃度で
溶解されたＲＡＭ−ＩｇＧ１を、次いで活性化センサー
表面と反応させた。残存遊離活性化部位を１Ｍ エタノ
ールアミンヒドロクロリド／ＮａＯＨ、ｐＨ８.５ ３
５μlで遮断した。
【０１０１】測定は３段階で行った： １)各々の抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂ(Ｅ４、Ｃ１１、
Ｂ３、Ｂ９、Ｇ６、Ｇ９)を培地Ｈで希釈し、最終濃度
１０から１７μg／mlにした。各々の測定において、抗
−イディオタイプ抗体をＲＡＭ−ＩｇＧ１に本溶液３５
μlをセンサー表面を通すことにより結合させた。結合
抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの質量の比である“反応単
位”を記録し蓄積した。 ２)マウス／人キメラＩｇＧ１の希釈２０μlおよび培地
Ｈ中の１−１００μg／mlの濃度の人化ＩｇＧ１を次い
で注入し、捕獲抗−ｉｄに結合させる。結合Ｍａｂの質
量の比である“反応単位”を記録し蓄積した。 ３)次いで、センサー表面を１Ｍ ギ酸５μlおよび８Ｍ
尿素５μlの連続注入による次の分析のために再生し
た。
【０１０２】結合率を第２抗体(ＢＲ５５−２／キメラ
人ＩｇＧ１またはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１)で得ら
れた最大反応単位および最初の抗体(各々の抗−イディ
オタイプＭａｂ)で得られた最大反応単位で計算するこ
とにより決定した。 実施例２０：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を使用した人
血清中の免疫反応性ＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の測定
のためのＥＬＩＳＡ ＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１含有人血清を、実施例１７
に記載のように試験する。
【０１０３】実施例２１：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ
３の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合のＢＲ５５−
２／キメラ人ＩｇＧ１またはＢＲ５５−２／キメラ人Ｉ
ｇＧ３による競合 抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４(１０μg／ml；コーティン
グ緩衝液中の希釈)の１００μlのアリコートをマイクロ
タイタープレートのウェルに加え、３７℃で６０分イン
キュベーションする。プレートを６回洗浄用緩衝液で洗
浄し、ＰＢＳ欠乏／５％ＦＣＳ２００μlを加え、３０
分、３７℃でインキュベーションする。プレートを上記
のように洗浄する。キメラ人ＩｇＧ１またはキメラ人Ｉ
ｇＧ３をＰＢＳ欠乏／２％ＦＣＳで希釈する(０.５μg
／mlから３ng／ml)。これらの各々の希釈に、０.０５μ
g／mlＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３を加える。これら
のサンプルの１００μlのアリコートをマイクロタイタ
ープレートのウェルに加え、６０分、３７℃でインキュ
ベーションする。非結合抗体を上記のように洗い出し、
ペルオキシダーゼ−結合抗体(ケミコン・コーポレイテ
ッド試薬のようなヤギ−抗−ヒトＩｇＧ／ペルオキシダ
ーゼ；ＰＢＳ／２％ＦＣＳ中１：１０００)の１００μl
のアリコートを加える。
【０１０４】３０分、３７℃でインキュベーションした
後、ウェルを４回洗浄用緩衝液、２回染色液で洗浄す
る。基質溶液１００μlのアリコートを加え、５分後、
色の濃くなるのを４Ｎ Ｈ2ＳＯ4の５０μlのアリコー
トを加えることにより停止させる。光学密度(ＯＤ)を４
９２nmで測定する(参考測定６２０nm)。
【０１０５】実施例２２：ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ
３により媒介されるＳＫＢＲ５細胞系への補体依存細胞
毒性(ＣＤＣ)−抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による阻害 測定の前日、ＳＫＢＲ５細胞を新鮮培地Ａに移し、細胞
培養フラスコ中で３７℃／５％ＣＯ2に保つ。
【０１０６】標的細胞の51Ｃｒ標識：細胞を培養フラス
コから回収し、培地Ａ８００μl中５×１０6細胞の濃度
で３７℃／５％ＣＯ2で１時間、１００μCi Ｎａ2 51Ｃ
ｒＯ4とインキュベーションする。細胞を、次いで培地
Ａで洗浄し、過剰の51Ｃｒを除去し、新鮮培地Ａに再懸
濁し、その濃度を２.５×１０5細胞／mlに調製する。
【０１０７】ＣＤＣ：本標的細胞の懸濁液の１００μl
のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルにピ
ペットで移す。ＰＢＳ欠乏中所望の濃度に希釈した抗−
ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４の５０μlのアリコートを加え
る。次いで２μg／mlＢＲ５５−２／ＩｇＧ３含有人血
清の１００μlのアリコートをウェル毎に加え、細胞を
一晩、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベーションする。
上清をスカトロン−ハーベスティング・プレスで回収
し、γ−カウンターで計数する。これは実験的遊離の値
を産生する。
【０１０８】全51Ｃｒ遊離は、人血清を２％ＳＤＳ、５
０mM Ｎａ2ＣＯ3および１０mM ＥＤＴＡと置き換え、
抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４溶液をＰＢＳ欠乏５０μl
と置き換えることにより上記のように決定する。自然51
Ｃｒ遊離は人血清を培地Ａと置き換え、抗−ｉｄＢＲ５
５−２＃Ｅ４溶液をＰＢＳ欠乏５０μlと置き換えて得
る。
【０１０９】計数後、結果を以下のように計算する：
【０１１０】実施例２３：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４
セファロースを使用したＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ
１の免疫親和精製 ２３.１：抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４−セファロース
の調製 凍結乾燥活性化ＣＨ−セファロース４Ｂ９ｇを１mM Ｈ
Ｃｌに懸濁し、焼結ガラスフィルターに移し、１mM Ｈ
Ｃｌ２ｌで１５分洗浄する。配位子(抗−ｉｄＢＲ５５
−２＃Ｅ４ ９５mg)を連結緩衝液５０mlに溶解し、栓
をした容器内で洗浄したゲルと混合し、１時間室温でく
るくる回転させる。ゲルを連結緩衝液で洗浄し、１時間
１Ｍエタノールアミン５０mlとインキュベーションし、
残存活性基を遮断する。次いで、親和性収着媒を交互の
ｐＨで３サイクル洗浄する。各々のサイクルは、ｐＨ４
(０.１Ｍ酢酸、０.５Ｍ ＮａＣｌ)での洗浄、続くｐＨ
８(０.１Ｍ トリス、０.５Ｍ ＮａＣｌ)での洗浄から
成る。
【０１１１】２３.２：ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ
１の単離 クロマトグラフィーを４℃で行う。カラム(ＢＩＯ Ｒ
ＥＸ ＭＰカラム直径１.５cm)を抗−ｉｄＢＲ５５−２
＃Ｅ４−セファロース(容量３５ml)で満たす。ゲルを結
合緩衝液および溶出緩衝液で洗浄する。出発物質はＢＲ
５５−２／キメラ人ＩｇＧ１条件培地１００ｌである。
中空ファイバーカートリッジＰ１０を装着したアミコン
ＤＣ２濃縮系を使用した５：１濃縮後、濃縮物をカラム
にかける。エスケーパーフラクションの溶出の後、結合
ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ１が溶出緩衝液と共に脱
着し、脱着後すぐに１Ｍ トリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ
７.５で中和する。
【０１１２】２３.３：ＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ
１の濃縮 溶出抗体溶液の濃縮を、ＰＭ１０ジアフロ膜を使用した
攪拌アミコン超濾過セル中で行う。ＩｇＧに対する溶質
拒否は９８％以上であり、ＩｇＧの最終濃縮は３.３６m
g／mlである。
【０１１３】２３.４：精製ＢＲ５５−２／キメラ人Ｉ
ｇＧ１の特徴付け ２３.４.１：Ｍｏｎｏ−Ｑイオン交換クロマトグラフィー カラム： Ｍｏｎｏ−ＱＨＲ５／５(ファルマシア) 緩衝液Ａ： ２０mM ＴＥＡ、ｐＨ７.７ 緩衝液Ｂ： ２０mM ＴＥＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.７ 流速： １ml／分 検出： ＵＶ２８０nm 勾配： 直線２％／分 結果： ＞９５％純度
【０１１４】 ２３.４.２：高速サイズ排除クロマトグラフィー カラム： ゾルバックスＧＦ２５０、９.４×２５０mm 緩衝液： ０.１Ｍリン酸ナトリウム、０.２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０ 流速： １ml／分 検出： ＵＶ２８０nm 結果： ＞９５％純度
【０１１５】２３.４.３：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 実験は、１０％アクリルアミドゲルを使用して、還元条
件下レミリーの方法に従って行う(結果は図１０に示
す)。 出発物質 マウスモノクローナル抗体ＢＲ５５−２は、例えばそれ
ぞれハイブリドーマＢＲ５５.２(ＢＲ５５−２／ＩｇＧ
３)およびＢＲ５５.２ｓ２ａ(ＢＲ−５５−２／ＩｇＧ
２ａ)から入手可能である。
【０１１６】これらのハイブリドーマは、本来それぞれ
１９８７年２月１７日および１９８７年３月１０日に、
アメリカ合衆国２０８５２マサチューセッツ州、ロック
ビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
に、ブタペスト条約の規則の下、受託番号それぞれＡＴ
ＣＣ ＨＢ９３２４およびＡＴＣＣ ＨＢ９３４７で寄
託された。
【図面の簡単な説明】
【図１】 単離された抗−ｉｄＢＲ５５−２ＭａｂのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを示す
【図２】 単離された抗−ｉｄＢＲ５５−２Ｍａｂの等
電点電気泳動を示す。
【図３】 抗−ｉｄＭａｂがＡｂ１のその抗原への結合
を阻害することを示すグラフである。
【図４】 ウサギにおける細胞−ＥＬＩＳＡ(ＳＫＲＢ
５細胞)で得られた代表的なＩｇ−結合曲線を示す。
【図５】 サルにおける細胞−ＥＬＩＳＡ(ＳＫＲＢ５
細胞)で得られた代表的なＩｇ−結合曲線を示す。
【図６】 抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処理
したアカゲザルの全液性免疫反応を、マイクロタイター
プレートを覆った抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を基にし
たＥＬＩＳＡを使用して測定した結果を示すグラフであ
る。
【図７】 抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処理
したアカゲザルの全液性免疫反応を、マイクロタイター
プレートを覆った抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を基にし
たＥＬＩＳＡを使用して測定した結果を示すグラフであ
る。
【図８】 抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４でワクチン処理
したアカゲザルの全液性免疫反応を、マイクロタイター
プレートを覆った抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４を基にし
たＥＬＩＳＡを使用して測定した結果を示すグラフであ
る。
【図９】 非特異的マウス−ＩｇＧ１でワクチン処理し
たアカゲザルの液性免疫反応をＥＬＩＳＡを使用して検
出した結果を示すグラフである。
【図１０】 非特異的マウス−ＩｇＧ１でワクチン処理
したアカゲザルの液性免疫反応をＥＬＩＳＡを使用して
検出した結果を示すグラフである。
【図１１】 種々の時点での、乳癌細胞系を使用した細
胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフであ
る。
【図１２】 種々の時点での、乳癌細胞系を使用した細
胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフであ
る。
【図１３】 種々の時点での、乳癌細胞系を使用した細
胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフであ
る。
【図１４】 種々の時点での、乳癌細胞系を使用した細
胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフであ
る。
【図１５】 種々の時点での、胃癌細胞系を使用した細
胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフであ
る。
【図１６】 種々の時点での、胃癌細胞系を使用した細
胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフであ
る。
【図１７】 種々の時点での、小細胞肺癌細胞系を使用
した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラ
フである。
【図１８】 種々の時点での、小細胞肺癌細胞系を使用
した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラ
フである。
【図１９】 種々の時点での、大腸癌細胞系を使用した
細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラフで
ある。
【図２０】 種々の時点での、メラノーマ細胞系を使用
した細胞−ＥＬＩＳＡにおけるこれらの結果を示すグラ
フである。
【図２１】 ２回目の免疫追加４および９週間後に得た
溜た血清の免疫精製Ｉｇ−フラクションおよび抗−ｉｄ
ＢＲ５５−２＃Ｅ４のエスケーパーフラクションの結合
を測定した結果を示すグラフである。
【図２２】 ２回目の免疫追加４および９週間後に得た
溜た血清の免疫精製Ｉｇ−フラクションおよびエスケー
パーフラクションおよび親マウスＭａｂ(ＡＢ１)の人化
変形の結合特性を、ＳＫＢＲ５乳癌細胞で比較した結果
を示すグラフである。
【図２３】 免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)とＢＲ５５−２
／人化ＩｇＧ１のルイスＹ陽性乳癌細胞系ＳＫＢＲ５お
よびルイスＹ陰性メラノーマ細胞系ＷＭ９に対する結合
特性の比較を示すグラフである。
【図２４】 ルイスＹ陽性ＳＫＢＲ５細胞系およびルイ
スＹ陰性細胞系ＷＭ９の膜フラクションを使用したＥＬ
ＩＳＡにより観察される、ＡＢ３−フラクションの同様
な免疫反応性のパターンを示すグラフである。
【図２５】 免疫精製サルＩｇ(ＡＢ３)の結合特性を示
すグラフである。
【図２６】 ＡＢ３−フラクションを、人ＰＢＭＣをエ
フェクター細胞として使用したＡＤＣＣ実験において、
ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３(ＡＢ１)と比較した結果
を示すグラフである。
【図２７】 人血清中のＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３
を測定するためのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフであ
る。
【図２８】 人血清中のＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ
１を測定するためのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフで
ある。
【図２９】 人血清中のＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ
３を測定するためのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフで
ある。
【図３０】 抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キ
メラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の
結合を示すグラフである。
【図３１】 抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キ
メラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の
結合を示すグラフである。
【図３２】 抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キ
メラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の
結合を示すグラフである。
【図３３】 抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キ
メラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の
結合を示すグラフである。
【図３４】 抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キ
メラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の
結合を示すグラフである。
【図３５】 抗−ｉｄＢＲ５５−２とＢＲ５５−２／キ
メラ人ＩｇＧまたはＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１の間の
結合を示すグラフである。
【図３６】 人血清のＢＲ５５−２／人化ＩｇＧ１を測
定するためのＥＬＩＳＡ標準曲線を示すグラフである。
【図３７】 ＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３の抗−ｉｄ
ＢＲ５５−２＃Ｅ４への結合をＢＲ５５−２／キメラ人
ＩｇＧ１およびＢＲ５５−２／キメラ人ＩｇＧ３との比
較によりＢＲ５５−２全ての変異体の抗−ｉｄＢＲ５５
−２Ｍａｂによる結合領域の認識を示すグラフである。
【図３８】 ＳＫＢＲ５人乳癌細胞系に対するＢＲ５５
−２／マウスＩｇＧ３により媒介された補体依存細胞毒
性の抗−ｉｄＢＲ５５−２＃Ｅ４による有効な中和を示
すグラフである。
【図３９】 本発明を免疫精製法に使用した結果を示す
ＳＤＳ−ＰＡＧＥである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 エベリン・ヤンツェク オーストリア国アー−1230ウィーン、アウ エル・ベルスバッハ−シュトラーセ20番 (72)発明者 ハンス・ロイブナー オーストリア国アー−1238ウィーン、ハイ ムガッセ23番 (72)発明者 ディーター・ショルツ オーストリア国アー−1040ウィーン、バイ リンガーシュトラーセ31／５番

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 マウスをＢＲ５５−２／マウスＩｇＧ３
    −Ｆ(ａｂ')2−ＫＬＨ−接合体で免疫化し、マウスミエ
    ローマ細胞系ＳＰ２／０と脾臓細胞を融合し、阻害能９
    ５％以上(ＢＲ５５−２マウスＩｇＧ２ａのＳＫＢＲ５
    細胞系への結合を阻害)のＩｇＧ産生する培養ハイブリ
    ドーマ細胞を選択し、抗−イディオタイプ抗体を精製
    し、単離することを含む、モノクローナル抗体ＢＲ５５
    −２(Ａｂ１)に対するモノクローナルマウス内部像抗−
    イディオタイプ抗体(Ａｂ２)の製造法。
  2. 【請求項２】 活性成分としてモノクローナル抗体ＢＲ
    ５５−２(Ａｂ１)に対するモノクローナルマウス内部像
    抗−イディオタイプ抗体(Ａｂ２)を、薬理学的に許容可
    能なアジュバント、担体または希釈剤と共に含有する、
    ＨＩＶ−感染に対する予防的および／または治療的免疫
    化に使用する、医薬組成物。
  3. 【請求項３】 モノクローナル抗体ＢＲ５５−２(Ａｂ
    １)に対するモノクローナルマウス内部像抗−イディオ
    タイプ抗体(Ａｂ２)を、薬理学的に許容可能なアジュバ
    ント、担体または希釈剤と共に含む、上皮起源の癌に対
    するおよび小細胞肺癌に対する免疫化に使用する、医薬
    組成物。
  4. 【請求項４】 モノクローナル抗体ＢＲ５５−２(Ａｂ
    １)に対するモノクローナルマウス内部像抗−イディオ
    タイプ抗体(Ａｂ２)を含む、ＢＲ５５−２の結合特性を
    有するモノクローナル抗体、その誘導体または断片の定
    量的測定用試薬。
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