JPH11187873A - 細胞内物質導入ベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 センダイウイルスとリポソームとの融合体の
ように良好な安定性と優れた細胞内物質導入率を示す
が、当該融合体のように赤血球溶血作用を示さず、安全
に使用出来る、細胞内物質導入ベクターを提供するこ
と。 【解決手段】 膜融合能を有するウイルスまたはその部
分とリポソームとを融合させた、生理的条件下でヒト赤
血球に対して溶血または凝集作用を示すことのない、膜
融合リポソーム（前記ウイルスまたはその部分とリポソ
ームとの融合体）を、細胞内物質導入ベクターを、細胞
内物質導入ベクターとして使用すること。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、安定性と安全性に
優れ、薬物、遺伝子等の適宜な物質を細胞内に効率よく
導入できる、細胞内物質導入ベクターに関する。

【０００２】

【従来の技術および欠点】ドラッグデリバリーシステム
（Ｄrug Ｄelivery Ｓystem：ＤＤＳ)は、薬物の投与方
法や形態を工夫し、体内での薬物動態を制御することに
より薬物を標的部位に選択的に送り込み、結果として最
適の治療効果を得、さらに薬物による副作用を最小限に
とどめることを目的とした薬物投与に関する新しい技術
である。現在までに様々な ＤＤＳ製剤が開発されてい
るが、なかでもリポソーム製剤は欠損酵素の補充、制癌
剤および抗生物質の投与、さらには遺伝子治療の分野に
おいても脚光を浴びている。

【０００３】リポソームは、生体膜を構成しているリン
脂質を基本とする脂質二重層からなる閉鎖型小胞体であ
って、安全性が高く、脂質膜と水層の部分から構成され
ているため、脂溶性または水溶性のいかんを問わず、様
々な薬物を内包することができるので、薬物キャリアー
として優れた機能を有している。また、リポソームの表
面に抗体やペプチド等を結合させることによりターゲッ
ティング能を付与することができ、さらに脂質の種類を
変化させたり、ポリエチレングリコール等で修飾するこ
とにより、温度感受性リポソーム、血中安定性リポソー
ム、プラスミド導入ベクターとしてのカチオニックリポ
ソーム等、種々の性質の異なるキャリアー（ベクター）
を作製できるという特性を有している。

【０００４】通常、リポソームはエンドサイトーシス経
路により細胞内に取り込まれる。すなわち、細胞膜の一
部がリポソームを徐々に取り囲み、次いで陥入し、次第
にくびれて膜から離れ、リポソームを包み込んだ細胞内
小胞となり（エンドサイトーシス）、細胞膜近傍の初期
エンドソーム内に取り込まれる。その後、細胞深部の後
期エンドソームに送られ、そして最終的にはライソゾー
ムへと運ばれる。ところが、ライソゾームは、その内部
に約 40種類の酸性加水分解酵素を保有しており、ライ
ソゾームへ運ばれたリポソームは、この加水分解酵素の
作用により分解され、同時にリポソーム内に封入された
薬物等も代謝されるため、薬物などが未変化体の状態で
細胞質内に到達する割合が極端に低下するという問題が
あった。

【０００５】この致命的な欠点を克服するため、細胞の
バリアーである細胞膜に障害を与えることなく細胞質に
直接薬物等を導入する方法が検討されてきた。例えば、
リポソームが膜融合能を獲得すればライソゾームを経由
することなく、直接薬物等を細胞質ゾルまで送達するこ
とが可能となる。これまでに、リポソームを細胞へ融合
させる方法として、pＨ感受性リポソーム（Ｋ．Ｋono e
t al.:Ｂiochimica etＢiophysica Ａcta、 1193，１(19
94)）およびウイルスのエンベロープ蛋白質をリポソー
ムに組み込んだ再構成リポソーム（Ｓ．Ｂagai et a
l.：Ｔhe Ｊournalof Ｂiological Ｃhemistry、 269，1
966(1994)）が検討されている。しかし、pＨ感受性リポ
ソームは細胞との融合効率が低く、再構成リポソームは
エンベロープ蛋白質がリポソームの内層に配向すること
による封入物質量の制限や操作が煩雑であるために融合
効率が一定しないなどの欠点を有している。

【０００６】一方、センダイウイルス（sendai virus；
hemagglutinating virus of Ｊapan：ＨＶＪ）の膜融合
能をリポソームに付与した膜融合リポソーム（fusogeni
c liposome）、すなわちセンダイウイルスとリポソーム
の融合体（ＨＶＪ−liposome）が報告されている(Ｍ．
Ｎakanishi et al.：Ｅxperimental Ｃell Ｒesearch、1
59，399(1985)）。ＨＶＪは、細胞間融合現象（Ｙ.Ｍae
da et al.：Ｅxperimental Ｃell Ｒesearch、 108，108
(1977)）が認められたことから、動物細胞を用いた遺伝
学の先駆けになったウイルスである。また、ＨＶＪはリ
ポソームとも融合することができ、その融合体（ＨＶＪ
−リポソーム）はさらに細胞膜と融合する。つまり、リ
ポソームとＨＶＪを直接反応させて作製したＨＶＪ−リ
ポソームは、いわゆるハイブリッドベクターであり、内
部にリポソーム由来の空洞を有し、外側はウイルスエン
ベロープと同じスパイク構造を有している。ＨＶＪ−リ
ポソームは、蛋白質、化学物質、遺伝子等、リポソーム
内に封入できるものであればあらゆる物質をセンダイウ
イルスと同等の高い効率で細胞内に導入することができ
る（Ｔ．Ｎakagawa et al.:Ｄrug Ｄelivery Ｓystem、
１１，４１１(1996)）。なおまた、ＨＶＪ-リポソーム
の改良型として、ＤＮＡ結合能を有する核蛋白質である
ＨＭＧ−１(Ｈigh Ｍobility Ｇroup−１）をＤＮＡと
共導入することにより、さらに導入効率が向上するとい
う報告もある（Ｙ. Ｋaneda et al.:Ｊ.Ｍolec.Ｍedici
ne、 ７３，289(1995))。

【０００７】このＨＶＪ−リポソームによるリポソーム
内容物の細胞質内への導入機構は、まずエンベロープ蛋
白質の一つであるＨＮ蛋白質が細胞表面に普遍的に存在
するシアル酸を認識して結合し、次に細胞との融合に直
接関係するＦ蛋白質により細胞と融合することにより行
われる。しかし、ＨＶＪ−リポソームは、シアル酸を介
して細胞膜との融合を行うために、同様にシアル酸を有
する赤血球とも反応し、溶血を引き起こすことが判明し
た。このＨＶＪ−リポソームの有する赤血球溶血作用は
克服されておらず、そのために、ＨＶＪ−リポソームの
投与方法はin vitroおよびex vivo等に限定され、in vi
voおよび全身的な投与には適用できないと言う欠点があ
る。また、インフルエンザウイルスは凝集作用を有して
いるので、これもまた利用できない。

【０００８】特に遺伝子治療の面においては、目的遺伝
子を標的細胞に正確に導入することが必要であり、安全
でかつ効率のよい遺伝子導入法の開発は遺伝子治療研究
の中で最も重要な研究課題である。現在臨床の場では、
主にウイルスの感染機構を利用したレトロウイルスベク
ターやアデノウイルスベクター、合成脂質を用いたカチ
オニックリポソーム等のベクターが試みられている。

【０００９】しかしながら、これらのベクターは、その
遺伝子導入効率、発現効率、安全性（免疫原性)等が実
用的であるとは言い難く、それらを改善するための基礎
的ならびに臨床的研究が精力的に行われているが、それ
らのベクターの改良にも限界が見えはじめてきたのが現
状である。従って、新しい発想に基づいたベクターの開
発が重要な課題となってきている。一方、in vitroやex
vivoによる薬物導入法は導入した細胞の組織への再構
築、生体への負担、培養コスト等に多くの問題を抱えて
いるので、今後は血球系や皮膚の細胞への遺伝子導入を
除き、in vivoあるいは全身的な投与が主流となると考
えられる。そのため、ベクターにも in vivoや全身的な
投与に対応できるものが求められている。故に、赤血球
溶血作用を有さず、安全性に優れ、かつ、導入効率の高
い有用な細胞内物質導入ベクターの開発が望まれてい
た。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記した問
題点の解決、すなわちＨＶＪ−リポソームのように実用
性のある高い安定性と良好な細胞内物質導入率を有する
一方、ＨＶＪ−リポソームに認められる欠点である赤血
球溶血作用や、インフルエンザウイルスに認められる欠
点である赤血球凝集作用を有しない、安全性に優れた、
細胞内物質導入ベクターの提供を目的として行われたも
のである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】水疱性口内炎ウイルス
（Ｖesicular Ｓtomatitis Ｖirus：ＶＳＶ)は、ラブド
ウイルスのベシクロウイルス属に属する(−)単鎖ＲＮＡ
型ウイルスであって、膜表面にエンベロープ蛋白質であ
るＧ蛋白質を有している。その細胞への感染機構は、リ
ポソームと同様、エンドサイトーシス経路により行われ
る。しかし、ＶＳＶはリポソームとは異なり、エンドソ
ーム膜と融合する特性を有しているため、ライソゾーム
内の加水分解酵素による分解を受けることなく、自身の
遺伝子を細胞質内に導入している。つまり、ＶＳＶが細
胞膜のフォスファチジルセリンに接着すると、細胞膜の
構造変化により被覆ピットに内包され、細胞内に被覆小
胞として取り込まれる（Ｒ.Ｓchelgel et al.:Ｐroc.Ｎ
atl.Ａcad.Ｓci.USA 、７９，2291(1982)）。その後、エ
ンドソーム内に運ばれて弱酸性下になるとウイルスＧ蛋
白質のコンフォメーションが変化し（Ｒ. Ｂlumenthal
et al.:Ａnnls ＮewＹork Ａcademy of Ｓciences、285
(1990))、ウイルス膜とエンドソーム膜が融合する。そ
の結果、ウイルスゲノムはライソゾームに移行すること
なく、細胞質ゾルに放出されて感染が成立する。

【００１２】これまでに、ＶＳＶが膜融合能を有するこ
とは知られているが、ヒト赤血球に対する溶血作用はｐ
Ｈ等様々な要因により変化し、溶血作用を示す場合もあ
れば、溶血作用を示さない場合もある（Ｓ．Ｙamada et
al.: Biochemistry、25, 3703(1986);Ｃ.Ａ.Ｂailey e
t al.:Ｖirology、 133(1)，111(1984)；Ｒ．Ｓchlegel
et al.：Ｊ．Ｂiol.Ｃhem.、259(8),4691(1984);Ｒ．Ｓc
hlegel et al.：Ｊ．Ｖirol.、53(1),319(1985) )。ま
た、ＶＳＶは多くの組織細胞に普遍的に存在するフォス
ファチジルセリンを受容体とするため、宿主域が広く
（Ｍ.Ｊ.Ｃlagueet al.:Ｂiochemistry、 ２９，1303(19
90))、さらにウイルス増殖が速いことから大量のウイル
スが採取できるという特徴を有している。一方、ＶＳＶ
とリポソームが融合することは報告されているが（Ｓ.
Ｙamada et al.:Ｂiochemistry、２５，3703(1986))、Ｖ
ＳＶとリポソームとの融合体（ＶＳＶ-リポソーム）自
体が採取されたことはなく、従って、ＶＳＶ−リポソー
ムを細胞内物質導入ベクターとして使用する試みも存在
しなかった。

【００１３】本発明者らは、ＶＳＶ−リポソームの細胞
内物質導入ベクターとしての使用可能性を検討する目的
で研究を重ねた結果、ＶＳＶ−リポソームの単離、精製
に成功し、ＶＳＶ−リポソームがＨＶＪ−リポソームと
同様、実用性のある良好な安定性と細胞内物質導入率を
有する一方、ＨＶＪ−リポソームとは異なって赤血球に
対する溶血作用を有しない事実を確証し、このような確
証事実に基づいて、本発明を完成するに至った。

【００１４】すなわち、本発明は、膜融合能を有するウ
イルス(例えばＶＳＶ）またはその部分とリポソームと
を融合させた、生理的条件下でヒト赤血球に対して溶血
または凝集作用を示すことのない、膜融合リポソームか
ら成る、細胞内物質導入ベクターを提供するものであっ
て、実用性のある安定性と細胞内物質導入率に加え、優
れた安全性を有する点に長所が認められる。

【００１５】本発明で使用するウイルスは、生理的条件
下でヒト赤血球に対して溶血または凝集作用を示すこと
のない、膜融合能を有するものであって、その代表例は
ＶＳＶである。その他のウイルスの具体例としては、ヘ
ルペスウイルス、シンドビスウイルス等を挙げることが
出来る。ここに言う「生理的条件下」とは、ヒトの生体
内条件を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで赤血球の溶血や凝集
を惹き起こすウイルスであっても、ヒト生体内でそのよ
うな現象を起こさないものであれば、使用出来る。な
お、ここに言う「膜融合能」とは、エンドソーム膜又は
細胞膜に対する融合能を言う。以下、ウイルスとして代
表例であるＶＳＶを使用する場合につき本発明を説明す
るが、他のウイルスを使用する場合にもこれに準じて実
施することが出来る。ＶＳＶは上記したとおり既知のウ
イルスであって、本発明においてはこれを不活化して使
用する。不活性化は常套の方法、例えば紫外線照射や界
面活性剤処理により行うことが出来る。ＶＳＶにはその
変異体も包含され、また、ウイルス全体もしくはその部
分あるいは遺伝子組み換えで作成されたウイルスもしく
はその部分であっても、ウイルス膜融合能を有する限
り、本発明で使用することができる。なお、「部分」の
具体例としては、エンベロープ、膜融合蛋白質等が挙げ
られる。

【００１６】リポソームは、その構造から、多重層小胞
（multilamellar vesicles:ＭＬＶ）と単一層小胞に分
類され、単一層小胞は径０.１μｍを境にしてsmall(sma
ll unilamellar vesicles:ＳＵＶ）とlarge（large uni
lamellar vesicles:ＬＵＶ）に分けられる。ＭＬＶは
０.１〜数μｍの直径をもつリポソームでフイルム上の
脂質膜と水溶液を混合し、ボルテクスイング法により調
製する。一般に安定で高分子物質の保持効率も悪くはな
いが、大きさが不均一で多重層であるため、内容物の細
胞への導入効率が劣る。しかし、ＭＬＶは超音波処理と
その後のインキュベーション（アニーリング法）によっ
てＳＵＶからＬＵＶへと変えることができる。ＳＵＶは
大きさが均一（２０〜５０ｎｍ）であるが、高分子物質
を保持しにくく、比較的不安定である。超音波法、プレ
ーベジクル法、エタノール注入法、フレンチプレス法、
コール酸除去法、トリトンＸ−１００バッチ法などの作
製法がある。ＬＵＶは０.１〜１.０μｍ径の小胞で、蛋
白質やＤＮＡなどの保持効率がよい反面、大きさが不均
一である。カルシウム融合法、エーテル注入法、アニー
リング法、凍結融解融合法、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルジョン法
などがある。このようにリポソームの調製には多数の方
法が知られており、封入すべき物質の種類に応じて適宜
のリポソームを選択し、それに応じて適当な調製法を採
用すればよい。最も普通に採用されているリポソームの
製造法の具体例としては、逆相蒸発法（Ｆ．Ｓzoka et
al.：Ｂiochim. Ｂiophys. Ａcta, Ｖol.601，559(198
0)）、エーテル注入法（Ｄ．Ｗ．Ｄeamer：Ａnn. Ｎ.
Ｙ. Ａcad. Ｓci., Ｖol.308，250(1978)）、界面活性
剤法（Ｊ．Ｂrunner et al.：Ｂiochim. Ｂiophys. Ａc
ta,Ｖol.455, 322(1976)）、カルシウム融合法（Ｄ．Ｐ
aＰahadjopoulos et al.：Ｂiophys．Ａcta，Ｖol.45
5，483(1976)）等が挙げられる。

【００１７】リポソームを形成せしめるための脂質とし
ては、一般に、リン脂質、コレステロール類、窒素脂質
等が用いられるが、特にリン脂質が好適に使用される。
より具体的には、ホスファチジルコリン、ホスファチジ
ルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジ
ルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホ
スファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリ
ン、卵黄レシチン、大豆レシチン、リゾレシチン等の天
然リン脂質、あるいはこれらを常法によって水素添加し
たものの他、ジアシルホスフェートが例示され、さらに
前記物質のアシル基の具体例としてはラウリル基、ミリ
ストイル基、パルミトイル基、ステアロイル基、オレオ
イル基などが挙げられる。例えば、ジステアロイルホス
ファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリ
ン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、
ジパルミトイルホスファチジルセリン、エレオステアロ
イルホスファチジルコリン、エレオステアロイルホスフ
ァチジルエタノールアミン、エレオステアロイルホスフ
ァチジルセリン等の合成リン脂質が例示される。

【００１８】これらのリン脂質を含む脂質は単独で用い
ることもできるが、二種以上を併用することも可能であ
る。このとき、エタノールアミンやコリン等の陽性基を
有する原子団を分子内に持つ脂質を用いることにより、
陰性電荷を帯びている核酸物質の結合率を増加させるこ
ともできる。これらリポソーム形成時の主要なリン脂質
の他に、一般にリポソーム形成用添加剤として知られる
コレステロール、ステアリルアミン、α−トコフェロー
ル等の添加剤を用いることもできる。

【００１９】ＶＳＶまたはその膜融合能を有する部分と
リポソームからその間の融合体、すなわちＶＳＶ−リポ
ソームを作成するには、自体常套の方法、例えば適宜の
媒体中、両者を混合すればよい。通常、ＶＳＶのエンベ
ロープが活性化されている条件下に融合させるのが好ま
しく、このために媒体を酸性条件下に保持する。ＶＳＶ
ーリポソームの精製法としては種々の方法が考えられる
が、本発明では、特に蔗糖密度勾配遠心分離法を採用し
て好結果を得ている。

【００２０】なお、細胞内に導入すべき物質の封入は、
通常、融合体の形成に先立ってリポソームに対して行
う。すなわち、リポソームに適宜の物質を封入したう
え、これを前記のとおりＶＳＶと融合させて、物質の封
入されたＶＳＶ−リポソーム融合体を調製する。リポソ
ームに対する物質の封入は、自体常套の方法で実施する
ことが出来、例えばリポソームを形成すべき材料（例え
ばリン脂質）の薄膜を封入すべき物質を含有する溶液に
懸濁、混合するか、必要に応じ更に超音波処理等を施し
て製造することが出来る。なお、リポソームを形成すべ
き材料、封入すべき物質およびＶＳＶを同時に混合し、
必要に応じ超音波処理等を施してもよいが、この場合に
は、当該物質の封入効率やＶＳＶとリポソームの融合効
率が劣化する傾向がある。

【００２１】封入すべき物質としては、特に制限はない
が、薬物、遺伝子等の使用が普通である。その具体例と
しては、抗生物質、化学療法剤、抗アレルギー薬、循環
器官用薬、抗炎症薬、抗リウマチ薬、ホルモン、ビタミ
ン、抗悪性腫瘍薬、リボ造影剤、生理活性を有するタン
パク質、核酸等があり、使用する核酸として更に具体的
には、細胞内に導入されて目的のタンパクを発現させる
ことのできる目的タンパクをコードした核酸、目的のタ
ンパクの発現を抑制することのできる核酸（アンチセン
ス核酸）、自殺遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子等から
選択することができる。

【００２２】リポソームに封入した物質を、更に核への
移行、細胞質への内在化、エンドサイトーシス等を直接
的あるいは間接的に促進し、効果的に細胞への導入を促
進させるために、そのような能力のある物質をエンベロ
ープあるいは融合蛋白を有するリポソームに共存または
修飾させることができる。そのような物質は合成された
ものでもよく、また、天然のもの、例えば生体内の細胞
膜、細胞膜表面もしくは細胞内に存在する成分またはそ
のリガンドであってもよい。更に具体的には、タンパク
質類、ペプチド類、抗体、受容体のリガンド、カルシウ
ム依存性または非依存性の細胞間接着分子（カドヘリン
類、Ｉgファミリータンパク、セクレチン類、インテグ
リン類、プロテオグリカン類等）あるいはそのリガン
ド、糖類、糖タンパク質、グリコサミノグリカン類、ア
ミノ酸、脂質、飽和もしくは不飽和脂肪酸、糖脂質、ス
テロイド骨格を有する物質、ポリエチレングリコール、
アミン類、ポリアミン類等から選択することができる。

【００２３】前記物質は、また、膜融合能を有するウイ
ルスのエンベロープまたは膜融合蛋白あるいは種々のウ
イルスのウイルス成分等から選択されてもよい。ここに
言うウイルス成分とは、ペントン、ペントンベース、フ
ァイバー、ヘキソン、キャプシド、エンベロープ、エン
ベロープ断片、膜融合タンパク、ウイルスタンパク（ス
パイク糖タンパク等）等、機能・構造を有する最小単位
である。ゆえに、本発明の膜融合リポソームに、種々の
ウイルス成分を単離し、付与または置換させたり、膜融
合ウイルスのエンベロープあるいは膜融合タンパクを単
離して、種々のウイルスに付与またはウイルス成分と置
換させたり、または膜融合ウイルスより単離したタンパ
クから成るリポソームを作成し、種々のウイルス成分を
付与することもできる。更には、遺伝子組み換えによ
り、膜融合能を有するエンベロープまたは膜融合蛋白を
発現させたウイルスも用いることが出来る。また、細胞
表面のインテグリンに結合するペントンベース、フィブ
ロネクチンおよびビトロネクチン等の接着分子の共通の
配列であるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ配列を有するペプチ
ドを利用することもできる。これら物質は天然もしくは
合成のいかんを問わず、そのまま或いは誘導体、さらに
は２種またはそれ以上の混合物として利用されてもよ
い。

【００２４】膜融合能を有するウイルスとして、例え
ば、トガウイルス科（Ｔogaviridae）のアルファウイル
ス（Ａlphaviruses）、オルトミキソウイルス科（Ｏrth
omyxoviridae）のインフルエンザウイルス（Ｉnfluenza
riruses）、ヘルペスウイルス科（Ｈerpesviridae）、
バンヤウイルス科（Ｂunyaviridae）、パラミキソウイ
ルス科（Ｐaramyxoviridae）、ラブドウイルス科（Ｒha
bdoviridae）、レトロウイルス科（Ｒetroviridae）、
アレナウイルス科（Ａrenaviridae）、コロナウイルス
科（Ｃoronaviridae）およびイリドウイルス科（Ｉrido
viridae）等がある。

【００２５】本発明のベクターを使用して物質を導入す
べき細胞としては、真核細胞、特に動物細胞系を挙げる
ことが出来、接着細胞系と浮遊細胞系のいずれであって
もよい。また、一般には導入の困難な細胞系である初期
細胞系、幹細胞系、線維芽細胞系、マクロファージ細胞
系等を含め、広範囲な細胞系に適用できる。封入すべき
物質として薬物を選んだ場合、その製剤は、溶液、懸濁
液、シロップ、リポソーム製剤、乳剤、シロップ等の液
体の投与形態であってもよいし、錠剤、顆粒剤、粉末
剤、カプセル剤等の固形の投与形態であってもよい。必
要に応じ、上記製剤には、各種助剤、安定剤、潤滑剤、
その他一般に使用される添加剤、例えば乳糖、クエン
酸、酒石酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウ
ム、白陶土、蔗糖、コーンスターチ、タルク、ゼラチ
ン、寒天、ペクチン、落下生油、オリーブ油、カカオバ
ター、エチレングリコール等が添加され得る。

【００２６】本発明の細胞内物質導入ベクターを使用し
た医薬は、赤血球溶解作用を有しない、安全性の高いも
のであり、ｉｎ ｖｉｖｏ法で投与するか、または全身
的な投与を行うのに適している。すなわち、治療目的の
疾患、標的臓器等に応じた適当な投与経路により投与す
ることが出来、例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内など
に投与するか、又は腎臓、肝臓、肺、脳、神経等の疾患
の対象部位に直接投与することができる。疾患部位に直
接投与すれば、臓器選択的に治療することができる。な
お、ｅｘ ｖｉｖｏ法で投与することも可能であり、こ
の場合には、常法に準じ、ヒトの細胞（例えば、リンパ
球、造血幹細胞等）を採取し、それに本発明の医薬で処
理、感作を行い、その後に当該細胞をヒトの体へ戻せば
よい。

【００２７】臨床においては、家族性高脂血症、閉塞性
動脈硬化症（ＡＳＯ）、高血圧、遺伝子欠損、自己免疫
疾患等さまざまな分野で遺伝子治療が試みられている。
例えば、ＰＴＣＡ（percutaneous transluminal corona
ry angioplasty）後の再狭窄の遺伝子治療においては、
質のよいベクターの開発と、カテーテル（導入手段）の
開発が望まれており、平滑筋細胞増殖抑制に働くアンチ
センスオリゴヌクレオチド等の遺伝物質導入等、本発明
のベクターが好ましく利用できる。

【００２８】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定
されるものではない。 実施例１（紫外線照射によるＶＳＶの不活化） ヒト羊膜由来ＦＬ細胞を５vol.％ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ)(ＧＩＢＣＯ）を含むイーグルＭＥＭ培地（日水製
薬）で培養した。ＶＳＶ Ｎew Jｅrsey株は農林水産省
家畜衛生試験場より分与されたものを用いた。ＶＳＶは
ＦＬ細胞に感染、増殖させ、その培養上清をイーグルＭ
ＥＭ培地で１０倍に希釈したものをウイルス液として使
用した。１５Ｗの紫外線殺菌灯の直下１５cm（１２４μ
Ｗ/cm²）のもとで６０mm dish（Ｎunc）に層厚２mmにな
るようにウイルス液（４.２mＬ）を添加し、紫外線照射
し、経時的に試料液を採取した。９６穴マイクロプレー
トにＦＬ細胞を４×１０⁴個播種し、３７℃、５vol.％
ＣＯ₂下で２４時間培養した。培養液を除去した後、別
に１vol.％ＦＣＳイーグル ＭＥＭ培地で１０倍段階希
釈したウイルス液をそれぞれ５０μＬ／穴添加し、２日
間培養した。細胞変性効果（ＣＰＥ)を顕微鏡下で観察
し、Ｂehrena−Ｋarber法にて５０％培養細胞感染量
（ＴＣＩＤ₅₀）を算出した。表１（ウイルス不活化に対
する紫外線照射の効果）に示すとおり、ＶＳＶの増殖能
は３０秒間の紫外線照射により失活した。以降の実験で
は、この不活化したＶＳＶを使用した。

【表１】

【００２９】実施例２（ＶＳＶ−リポソーム融合体の調
製） ＶＳＶと反応させるリポソームは、できるだけ小さい粒
子にするため、直径100nmのフィルターを通して作製し
た。粒子変化によるリポソームの比重低下を考慮したＶ
ＳＶ、リポソームおよびＶＳＶ−リポソーム反応物を分
離するステップ蔗糖密度勾配遠心を行い、未反応のＶＳ
Ｖ、リポソームおよび ＶＳＶ−リポソーム融合体の分
離・精製を行った。ウイルスの精製 ：ＶＳＶは５vol.％ウシ胎児血清加イー
グル ＭＥＭ培地でＦＬ細胞に感染させ、増殖させた。
この培養上清と２４w/v％のポリエチレングリコール
（ＰＥＧ）6000を含む１.５Ｍ ＮaＣl溶液を１：２の比
率で混合し、最終濃度８w／v％のＰＥＧ6000を含む０.
５Ｍ ＮaＣl溶液とし、３７℃、３時間攪拌した。この
ウイルス液を15000×g、２０分遠心分離の後、沈殿をＮ
ＴＥ溶液（０.１３Ｍ ＮaＣl、１mＭ ＥＤＴＡ、５０m
Ｍ Ｔris ＨＣl、pＨ＝７.８）２mＬに懸濁した。次
に、遠心チューブに６０w/v％、４５w/v％蔗糖／ＮＴＥ
をそれぞれ２mＬ、１０mＬずつ重層し、この最上層へ先
のＶＳＶ懸濁液を添加し、21000rpm（Ｂeckman ＳＷ２
８.１ ロータ)、４℃で４５分間遠心分離した。その
後、６０w/v％と４５w/v％蔗糖溶液の境界に存在するＶ
ＳＶを再度ＮＴＥ溶液に懸濁し、その沈殿（ＶＳＶ）を
実験に使用した。また、ＶＳＶの長期保存はＮＴＥ溶液
で懸濁し、−８０℃以下で冷凍保存した。

【００３０】Ｒhodamine（Ｒh）添加リポソームの調
製：卵フォスファチジルコリン（ＰＣ)(日本油脂)、ウ
シ脊髄由来Ｌ−α−phosphatidyl−Ｌ−serine solutio
n（和光純薬工業)およびコレステロール（Ｃhol)(和光
純薬工業)をモル比４：１：５となるように混合した。
この脂質１５μmolをクロロホルム１.５mＬに溶解し、
さらに０.２mol％のＮ−(lissamine rhodamine Ｂ sulf
onyl)−phosphatidylethanolamine（Ｎ−Ｒh−ＰＥ)(Ａ
vanti Ｐolar Ｌipids）を加えた。これをロータリーエ
バボレーターを用いて５５℃で沸騰を防ぎながら４０〜
５０Ｋpaに減圧してクロロホルムを蒸発させ、ガラス製
遠沈管の壁に薄膜を作成した。さらに３０分間、１００
Ｋpa以上で残存溶媒を完全に除いた。この遠沈管にＢＳ
Ｓ(-)（１０mＭ Ｔris、１５０mＭ ＮaＣl、pＨ＝７.
６）３００μＬ加えた後、５５℃に３０秒浸け、さらに
ボルテックスを３０秒間行った。この操作を計１０回繰
り返すことによりＲhodamine添加リポソームを作製し
た。次にリポソーム懸濁液を液体窒素に浸し、充分凍ら
せた後に５５℃で融解する操作を計３回行った。最後に
０.１μmのポリカーボネート製フィルターに１０回通す
ことにより最大粒子径の均一化を行った。

【００３１】ＶＳＶとリポソームとの融合反応：ＶＳＶ
とリポソームとを融合させる条件は酸性条件下で行っ
た。リポソームの外層は内層と同様に中性であるので、
Ｅcono−Ｐac １０ ＤＧ Ｃhromatography Ｃolumns
（ＢＩO−ＲＡＤ）によりクエン酸緩衝液（１４０mＭ
ＮaＣl、２mＭ ＭgＣl₂、１mＭ ＥＤＴＡ、８０mＭ cit
rate、pＨ＝５.５）に置換した。これを遠心操作により
（23000rpm、１時間）沈殿させた ＶＳＶをよく懸濁
し、氷中３０分、３７℃で１５分間反応させた。ＶＳＶ−リポソーム反応物の分離 ：遠心用チューブに６
０，４５，１０w/v％蔗糖／ＮＴＥをそれぞれ２mL，６.
５mL，６.５mＬずつ重層し、この最上層へ先のＶＳＶ−
リポソーム反応液を添加し、23000rpm，４℃で１時間ス
テップ蔗糖密度勾配遠心分離を行った。遠心分離の後、
密度の高い順に０.８mＬずつ採取し、２０フラクション
に分画した。

【００３２】リポソーム膜成分の定量：リポソームの膜
成分の挙動は、リポソーム膜中のＲhodamineの蛍光を測
定することにより確認した。すなわち、各フラクション
１０μLをＢＳＳ(−)９９０μLに希釈し、これを励起波
長 ５６０nm、蛍光波長 ５９０nmで測定した。 結果を図１に示す。（Ａ）はリポソームの場合、（Ｂ）
はＶＳＶ−リポソーム混合物の場合である。この図に見
られるように、リポソーム単独ではフラクション１９，
２０のみに蛍光が検出されたが、ＶＳＶ−リポソーム反
応液ではリポソーム分画のフラクション１９，２０とそ
れ以外の１０にも顕著な蛍光が検出された。リポソーム
とＶＳＶを反応させることにより、リポソームよりも明
らかに比重の高い分画に蛍光が認められたことから、フ
ラクション１０にＶＳＶ−リポソーム融合体が存在して
いると考えることが出来る。

【００３３】実施例３（ＶＳＶ−リポソーム融合体にお
けるＶＳＶ由来蛋白の検出） フラクション１０に存在するＶＳＶ由来の蛋白質の検出
を行うことにより、このフラクションがＶＳＶとリポソ
ームの反応体であるかどうかを確認した。リポソームの調製 ：実施例２に準じて行った。Ｎ-Ｒh-
ＰＥは加えずに作製した。ＶＳＶ-リポソーム反応物の分離 ： 実施例２に準じて行
った。 ウイルス蛋白質の定量： 各フラクションの蛋白質定量
はプロテインアッセイキット（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用い
て行った。検量線はウシ血清アルブミン（Ａrmour Ｐha
rmaceutical Ｃompany）溶液を用いて作製した。

【００３４】結果を図２に示す。（Ａ）はリポソームの
場合、（Ｂ）はＶＳＶ−リポソーム混合物の場合であ
る。ＶＳＶ単独とステップ蔗糖密度勾配遠心分離したも
のでは大部分の蛋白質が６０w/v％と４５w/v％蔗糖溶液
の境界のフラクション３に存在していた。また、データ
には示していないが、このフラクションにウイルス感染
活性の存在を確認している。一方、ＶＳＶ−リポソーム
反応物では、ＶＳＶ単独のステップ蔗糖密度勾配遠心分
離と同様、フラクション３に蛋白質が確認されたが、こ
の分画以外にリポソームが存在する０％蔗糖溶液のフラ
クション２０、さらに４５w/v％と１０w/v％蔗糖溶液の
境界フラクション１０にも蛋白質が検出された。ＶＳＶ
とリポソームを反応させることにより、フラクション１
０の蛋白質量が増加したこと、および、この同じ分画に
リポソーム膜由来成分が存在することから、この分画に
ＶＳＶとリポソームの融合体（ＶＳＶ−リポソーム）が
存在することが示唆された。

【００３５】実施例４（ＶＳＶとリポソームの融合体の
証明） これまでの結果では、ＶＳＶとリポソームが融合体とし
て存在しているのか、あるいは単に結合しているだけか
必ずしも明瞭ではないため、ＮＢＤ／Ｒh法を用い、Ｖ
ＳＶとリポソームの結合形態を検討した（Ｄouglas Ｋ.
Ｓtruck，ＤickＨoekstra，Ｅ.Ｐagano；Ｂiochemistry
２０，4093(1981))。７−nitro−２,１,３−benzoxadi
azol−４-yl（ＮＢＤ）およびＲhは、それぞれ４６０n
m、５６０nm付近に励起波長を、５３０nm、５９０nm付
近に蛍光波長をもつ蛍光物質である。この蛍光物質は、
両者が隣接して存在する場合、４６０nmでＮＢＤを励起
してもそのエネルギーがＲhに移動してＮＢＤの蛍光が
消失し、逆にＲhの蛍光が表れるという特徴がある。そ
こで、この両蛍光物質を組み込んだリポソームを作製し
た。このリポソームがＶＳＶと融合するとリポソームの
膜脂質成分はＶＳＶの膜脂質成分によって希釈され、両
蛍光物質の距離が長くなり、Ｒhへのエネルギー移動が
行われず、ＮＢＤの５３０nmの蛍光消失が回復すると予
想される。

【００３６】リポソームの調製：リポソームは混合脂質
（ＰＣ：ＰＳ：Ｃhol＝４：１：５）にＮ−Ｒh-ＰＥ、
Ｎ−(７-nitro−２,１,３−benzoxadiazol−４-yl)−ph
osphatidylethanolamine（Ｎ−ＮＢＤ-ＰＥ)(Ａvanti
Ｐolar Lipids）を１mol％ずつ加え、実施例２に準じて
調製した。ＶＳＶ−リポソームの作成および精製 ：ＶＳＶ−リポソ
ームは、上記リポソームから実施例２に準じて調製し
た。得られた ＶＳＶ−リポソームはＮＴＥ溶液に懸濁
し、23000rpm、４℃で１時間遠心分離し、その沈殿（Ｖ
ＳＶ-リポソーム反応体）を実験に使用した。

【００３７】ＨＶＪ−リポソームの作製および調製：Ｈ
ＶＪ−リポソームは、水口らの方法を用いて作製した。
センダイウイルスを遠心分離操作により（24000rpm、４
０分）沈殿させ、これに上記のリポソーム溶液を加えよ
く懸濁して、37℃で２時間反応させた。５０，３０，１
０w/v％ＢＳＳ(−)(１０mＭ Ｔris，１５０mＭ ＮaＣ
l， pＨ＝７.６）をそれぞれ２mL，６.５mL，６.５mLず
つ重層し、この最上層へ先のＨＶＪ−リポソーム懸濁液
を添加し、24000rpm、４℃で２時間遠心分離した。遠心
分離の後、３０w/v％と１０w/v％蔗糖／ＢＳＳ(−)の境
界に来るＨＶＪ−リポソームを回収し、ＢＳＳ(−)に懸
濁し、20000rpm、４℃で４０分間遠心し、洗浄した。遠
心分離の後、沈殿をＢＳＳ(−)に懸濁した。

【００３８】蛍光スペクトル測定：リポソーム、ＨＶＪ
−リポソーム、ＶＳＶ−リポソームを励起波長４６０n
m、蛍光波長５９０nmで蛍光強度を測定した。各々のリ
ポソームの蛍光強度をそろえ、励起波長４６０nm、蛍光
波長４９０〜６５０nmで蛍光スペクトルを測定した。さ
らに、２０vol.％ＴritonX−１００を終濃度が０.２vo
l．％となるように加え、完全にリポソームを破壊さ
せ、その時の蛍光スペクトルを測定した。

【００３９】結果を図３に示す。（Ａ）はリポソームの
場合、（Ｂ）はＨＪＶーリポソームの場合、（Ｃ）はＶ
ＳＶ−リポソームの場合、（Ｄ）はＶＳＶ−リポソーム
に界面活性剤を添加した場合である。リポソームに４６
０nmの励起エネルギーを照射したとき、ＮＢＤの励起エ
ネルギーは、リポソーム膜上の距離的に近いＲhに供給
されるため、ＮＢＤの蛍光波長である５３０nmのピーク
は低く、逆にＲhの蛍光波長である５９０nmの蛍光が強
く表れている。このリポソームを用いて作成したＨＶＪ
−リポソームの場合、ＮＢＤの蛍光はリポソームの２倍
の回復を示した。また、ＶＳＶ−リポソームの場合は、
ＨＶＪ−リポソームと同様ＮＢＤの蛍光強度が増加して
いた。また、それぞれにＴriton Ｘ−１００を加え、粒
子を崩壊させた時には両物質の空間的距離が最大とな
り、リポソーム、ＨＶＪ−リポソーム、ＶＳＶ−リポソ
ームの全てで５３０nmを最大に単一のピークが検出され
た。これらの事実はＶＳＶとリポソームが単に付着、結
合しているのではなく、融合体を形成していることを証
明している。これまでＨＶＪ−リポソームに関しては、
電子顕微鏡による形態および生化学的特性によりＨＶＪ
とリポソームの融合体であることが示されている。図３
(B)に示したＨＶＪ−リポソーム融合体のパターンと図
３(C)に示している ＶＳＶ−リポソームのパターンが一
致していることからも、ＶＳＶとリポソームは融合体と
して存在していると考えられる。

【００４０】実施例５（ＶＳＶ−リポソーム融合体への
物質導入封入効率の検討）リポソームの調製 ：リポソームの調製は実施例２に準じ
て行うが、１００mＭ５(６)−carboxyfluorecein(ＣＦ)
(SIGMA)を封入物質として用いた。未封入のＣＦはEcono
-pac 10DG Chromatography Columnsを用いて除去した。
リポソーム封入物質の定量：ＢＳＳ(−)９９０μLにス
テップ蔗糖密度勾配遠心分離後の各分画を１０μL加
え、励起波長４９０nm、蛍光波長５２０nmで蛍光強度を
測定した。この時の蛍光強度をＦ₀とした。次に、２０v
ol.％ Triton Ｘ−１００を１０μL加えることにより、
リポソームを破壊した。この時の蛍光強度をＦ_xとし
た。リポソームに封入された ＣＦは次式により計算し
た。

【式１】１.０１×Ｆ_x−Ｆ₀

【００４１】ＨＶＪ−リポソームの精製：実施例４に準
じて行った。ＨＶＪ−リポソーム、ＶＳＶ−リポソームの封入効率の
測定 ：リポソーム溶液をＮＴＥ溶液で希釈し、励起波長
５６０nm、蛍光波長５９０nmでＲhの蛍光強度を測定し
た。さらに、Ｔriton Ｘ−１００を加えて完全崩壊した
後、励起波長４９０nm、蛍光波長５２０nmでＣＦの蛍光
強度を測定した。同様に、ＨＶＪ−リポソーム溶液およ
びＶＳＶ−リポソーム溶液の両蛍光強度も測定した。Ｒ
hの蛍光強度あたりのＣＦの蛍光強度を測定し、リポソ
ームに対する ＨＶＪ−リポソームおよび ＶＳＶ−リポ
ソームの封入効率を導いた。

【００４２】結果を図４に示す。この図には、ＶＳＶと
リポソームを反応させ、ステップ蔗糖密度勾配遠心分離
後のリポソーム封入物質の挙動が示されている。（Ａ）
はリポソームの場合、（Ｂ）はＶＳＶ−リポソーム混合
物の場合である。リポソーム単独では蔗糖濃度１０w/v
％以下のフラクション１９，２０のみに蛍光が検出され
た。ＶＳＶとリポソームの反応物ではリポソーム分画の
フラクション１９，２０とフラクション１０に蛍光が検
出された。これは図１のリポソーム膜を検出したときの
フラクションのパターンと同様であることから、ＣＦは
ＶＳＶ−リポソーム内に含まれていることが予想され
る。また、表２（種々のリポソームのカルボキシフルオ
レセインの包含効率）に示したように、この時のリポソ
ームあたりの封入効率はＨＶＪ−リポソーム７３.４
％、ＶＳＶ−リポソーム６６.４％であり、両者に有意
な差は認められなかった。

【表２】

【００４３】実施例６（ＶＳＶ−リポソームと細胞との
結合性）細胞 ：サル腎上皮細胞ＬＬＣＭＫ２細胞は１０vol.％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ）を含むイーグルＭＥＭで培養し
た。リポソームの調製 ：実施例２に準じて行った。ＶＳＶ−リポソームの精製 ：実施例４に準じて行った。膜融合リポソームの精製 ：実施例４に準じて行った。細胞接着率の測定 ：１２穴プレートにＬＬＣＭＫ２細胞
を１.０×１０⁵個播種した。２４時間３７℃、５vol.％
ＣＯ₂で培養した後、細胞を氷上で１０分間プレインキ
ュベートした。その後、氷冷したＰＢＳで細胞を２回洗
浄した後、蛍光量を一定にし、氷冷したＶＳＶ−リポソ
ームを４００μL加え、氷上で１，１０，３０，６０分
間インキュベートした。氷冷したＰＢＳで２回洗浄した
後、０.２５w/v％トリプシン溶液５００μLで細胞を剥
がした。ＰＢＳ５００μLをさらに加え、蛍光光度計で
蛍光強度を測定した。測定後、この溶液の蛋白質量を実
施例１および３に準じて行い、蛋白質濃度に対する蛍光
強度を算出した。

【００４４】結果、すなわちリポソーム（△）、ＶＳＶ
−リポソーム（●）、ＨＶＪ−リポソーム（□）の細胞
への結合率の経時的変化を図５に示す。ＶＳＶ−リポソ
ームは ＨＶＪ−リポソームよりは劣るものの、通常の
リポソームに比べると効率よく細胞に結合した。

【００４５】実施例７（ジフテリア毒素フラグメントＡ
(ＤＴＡ)を封入したＶＳＶ−リポソームの殺細胞効果） ＤＴＡ（分子量約62,000）はジフテリアによって産生さ
れるジフテリア毒素のＡドメインで、数分子細胞内に導
入されれば NAD＋によるポリペプチド鎖延長因子elonga
tion factor２（eＥＦ−２）のＡＤＰ−リボシル化を触
媒し、eＥＦ−２を不活化することによって蛋白合成を
阻害し、細胞を障害させることができる強力な毒素であ
る。しかし、このフラグメントＡは、細胞膜表面上に存
在するジフテリア毒素受容体を識別・認識し、フラグメ
ントＡを細胞に送るフラグメントＢを欠いているため単
独では細胞質に入ることができない。そのため、リポソ
ームに封入されたＤＴＡは膜融合により細胞質に導入さ
れなければ全く毒性を示さないことになる。このように
ＤＴＡはＶＳＶ−リポソームの細胞への物質導入キャリ
アーとして評価するための優れたマーカー蛋白質であ
る。

【００４６】リポソームの調製：リポソームは、封入物
質として２００ng／３０0μL ＤＴＡまたはＢＳＳ(−)
を用いて、実施例２に準じて行った。ＶＳＶ−リポソームの精製 ：実施例４に準じて行った。蛋白質合成能の測定 ：２４穴プレートにＦＬ細胞を２.
５×１０⁴個播種した。 ２４時間３７℃、５vol.％ＣＯ₂で培養した後、細胞を
イーグルＭＥＭで１回洗浄し、種々のＲhの蛍光量で濃
度をそろえたＤＴＡ封入ＶＳＶ−リポソームを２００μ
L加えた。細胞を３７℃で３時間処理し、イーグルＭＥ
Ｍで２回洗浄した後、５vol.％ＦＣＳイーグルＭＥＭで
２４時間培養した。細胞をメチオニンを含まないイーグ
ルＭＥＭで洗浄し、８μＣi／mLの[³⁵Ｓ]−メチオニン
(Amersham)を含むイーグルＭＥＭで３７℃で３時間パル
スした。トリクロロ酢酸不溶性画分に含まれる放射活性
を、液体シンチレーションカウンターで測定した。

【００４７】リポソームリン脂質濃度の測定：ＤＴＡ未
封入リポソームを段階希釈し、リン脂質測定キット（リ
ン脂質Ｂテストワコー）(和光純薬）を用いて測定し
た。 結果を図６に示す。図中、△は空のリポソームの場合、
▲はＤＴＡを含むリポソームの場合、○は空のリポソー
ムの場合、●はＶＳＶ−リポソームの場合である。これ
から明らかなように、ＶＳＶ−リポソームは、細胞への
ＤＴＡ導入による蛋白質合成阻害効果を示した。ＶＳＶ
−リポソームが自身の細胞障害性を伴わずに膜融合によ
りリポソーム内に封入したＤＴＡを細胞内に導入できる
ことを示している。ＶＳＶ−リポソームは通常のリポソ
ームに比べ、その導入効率が１００倍以上優れているこ
とが判明した。

【００４８】実施例８（ＶＳＶ−リポソームの溶血反応
性） ＶＳＶ−リポソームを物質導入キャリアーとしてin viv
oへ直接投与を考えた場合、生体内には物質導入を妨げ
る様々な阻害因子が存在すると考えられる。ＨＶＪ−リ
ポソームは溶血を引き起こすという致命的欠点を有して
いる。ＶＳＶはエンドサイトーシス経路により細胞に取
り込まれ、エンドソーム内のpＨが低下することにより
エンベロープ蛋白質が活性化し、エンドソーム膜（細胞
膜）と融合するが、赤血球の場合にはエンドサイトーシ
スを行わないことにより、溶血を引き起こさないと考え
られ、ＶＳＶ−リポソームの溶血性を検討した。また、
ＶＳＶのエンベロープ蛋白質による融合が活性化される
因子と考えられるpＨにおいても同様に赤血球との反応
性を検討した。

【００４９】リポソームの調製：実施例２に準じて行っ
た。ＶＳＶ−リポソームの精製 ：実施例４に準じて行った。ＨＶＪ−リポソームの精製 ：実施例４に準じて行った。赤血球溶血反応の測定 ：赤血球溶血反応の評価はＨsuら
の方法（Ｍing−ＣhuＨsu,Ａndreas Ｓcheld,Ｐumell
Ｗ.Ｃhoppin；Ｖiology ９５,476(1979)）を一部改変し
て行った。新鮮なヒト赤血球を採取し、heparin処理
（血液１mLに対し５０unit加える）を行った後、ＢＳＳ
(−)で３回洗浄した。１vol.％赤血球／ＢＳＳ(−)の懸
濁液２５０μLを加えて混合し、４℃で１時間静置し
た。その後、直ちに1500×g、４℃、１０分間遠心し、
上清のヘモグロビン量を吸光波長５４０nmにおいて測定
した。１vol.％Triton Ｘ−１００で完全に溶解したと
きの吸光度を１００％溶血として評価した。リポソーム
濃度はＲhの蛍光により一定量にそろえた。

【００５０】結果を表３（ＶＳＶ−リポソームの溶血活
性に対するpＨの効果）に示す。ＨＶＪ−リポソームは
ＨＶＪと同様、HA蛋白質の赤血球凝集活性、Ｆ蛋白質の
融合活性の働きにより、著しい溶血反応が認められた。
ＨＶＪ−リポソームはpＨにほとんど影響されなかっ
た。ＶＳＶ−リポソームはエンドサイトーシスされない
ことにより、pＨ＝７.０で全く溶血反応を示さなかっ
た。さらに、Ｇ蛋白質が活性化されるpＨ＝５.５におい
てもリポソーム同様ほとんど溶血反応を起こさなかっ
た。

【表３】

【００５１】実施例９（ＶＳＶ−リポソームの血漿安定
性） ＶＳＶ−リポソームは、赤血球に対しては溶血反応を示
さないことが明らかとなったが、その他の蛋白質や補体
などの阻害因子が考えられる。ＶＳＶ−リポソームの血
漿安定性をリポソーム封入物質の維持という観点からラ
ット新鮮血漿を用いて評価した。リポソーム封入物質と
しては５(６)−carboxyfluorecein(ＣＦ)を用いるが、
この物質は高濃度では自己消光しているため、リポソー
ムが崩壊しない限り発光しない。従って、リポソームか
ら漏出し発光する蛍光を即座に測定できる。

【００５２】リポソームの調製：実施例５に準じて行っ
た。ＶＳＶ−リポソームの精製 ：実施例４に準じて行った。ＨＶＪ−リポソームの精製 ：実施例４に準じて行った。血漿崩壊率の測定 ：ラットにheparinを静脈内投与し、
血漿を回収した。３７℃に保温した血漿４５０μLにリ
ポソーム由来のリン脂質濃度６.５μg／mLのリポソー
ム、ＶＳＶ−リポソーム、ＨＶＪ−リポソームを５０μ
L加えた。経時的に１０μLずつ採取し、氷冷したＢＳＳ
(−)９９０μLに加えた。蛍光強度を励起波長４９０n
m、蛍光波長５２０nmで測定し、さらに２０vol.％Trito
n Ｘ−１００を１０μL加えてリポソームを完全崩壊さ
せ、蛍光強度を測定した。そこで、血漿に加えないとき
の蛍光強度をＦ０、Triton Ｘ−１００で処理していな
い試料の蛍光強度をＦｔ、処理後の蛍光強度をＦｘと
し、そのときの保持効率を次式で表した：

【式２】保持効率(％)＝(Ｆ_t−Ｆ₀)／(１.０１Ｆ_x−
Ｆ₀)×１００

【００５３】結果を図７に示す。図中、●はＣＦ含有Ｖ
ＳＶ−リポソームの場合、□はＣＦ含有ＨＶＪ−リポソ
ームの場合、△はＣＦ含有リポソームの場合を表す。Ｖ
ＳＶ−リポソームの半減期は約１０分であり、崩壊率は
１１％にとどまり、血漿中における安定性が非常に高い
ことが判明した。一方、ＨＶＪ−リポソームは半減期は
約１分であり、血漿安定性は極めて悪かった。

【００５４】実施例１０（ＶＳＶ−リポソームの遺伝子
導入ベクターとしての有用性）細胞 ：サル腎上皮細胞ＬＬＣＭＫ２細胞は１０vol.％Ｆ
ＣＳを含むイーグルＭＥＭ培地で培養した。プラスミドＤＮＡ ：ニワトリβ−アクチンプロモーター
とサイトメガロウイルスエンハンサー、およびＳＶ４０
early gene poly（Ａ）signalをもつpＣＡＬ２（６.４
Kb）を作成して用いた。リポソームの調製 ：pＣＡＬ２（５mg／mL）を１０mＭ T
ris（pＨ＝７.６)／１５０mＭ ＮaＣl／１０mＭ ＥＤＴ
Ａに懸濁し、実施例２に準じて行った。ＶＳＶ−リポソームの精製 ：実施例４に準じて行った。ＨＶＪ−リポソームの精製 ：実施例４に準じて行った。ＶＳＶ−リポソーム、ＨＶＪ−リポソームを用いたトラ
ンスフェクション ：１２穴プレートにＬＬＣＭＫ２細胞
を５.０×１０⁴個播種した。２４時間、３７℃、５vol.
％ＣＯ₂で培養した後、細胞をＢＳＳ(＋)で洗浄し、１
０vol.％ＦＣＳイーグルＭＥＭで懸濁したpＣＡＬ２を
封入したＨＶＪ−リポソーム（ＯＤ５４０＝０.１）と
そのＲhの蛍光強度に相当するpＣＡＬ２を封入したＶＳ
Ｖ−リポソームを５００μL加え、培養し、経日的にル
シフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の測定 ：ルシフェラーゼ活性はluci
ferase assay system（ピッカジーン）およびルミノメ
ーター（Lumat ＬＢ9501，Ｂerthold）を用いて測定し
た。細胞の蛋白質量は実施例１および３に準じて行っ
た。活性はrelative light units（ＲＬＵ)／μg prote
inとして表した。

【００５５】結果を表４（ＬＬＣＭＫ細胞に種々のリポ
ソームにより導入されたルシフェラーゼ活性に対する培
養時間の影響）に示す。リポソームを作用させたときは
ルシフェラーゼ活性はほとんど検出されなかった。ＨＶ
Ｊ−リポソームを作用させたときのルシフェラーゼ活性
は反応１日目から高く、２日後に最大活性を示した後、
４日後には最大活性の約１／３に減少した。ＶＳＶ−リ
ポソームは３日後に最大活性を示し、４日後には最大活
性を示したときの約６０％に減少した。以上の結果よ
り、ＶＳＶ−リポソームはプラスミドＤＮＡも細胞に導
入することができ、その最大活性はリポソーム単独に比
べて１７０倍以上であった。ＨＶＪ−リポソームに比べ
ると低かったが、この理由として細胞がエンドサイトー
シスを行う粒子径は１５０〜２００nmまでと言われてお
り、今回、モデルであるpＣＡＬ２のサイズ自身のため
にリポソームの粒子径を２００nmにせざるを得なく、そ
のリポソームから作成した ＶＳＶ−リポソームの粒子
径は２００nm以上であると考えられ、細胞に取り込まれ
にくかったためと考えられる。

【表４】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ステップワイズ蔗糖密度勾配遠心分
離後の各画分の蛍光強度を示すものである。

【図２】 図２は、ステップワイズ蔗糖密度勾配遠心分
離後の各分画の蛋白濃度を示すものである。

【図３】 図３は、Ｎ−ＮＢＤ−ＰＥ／Ｎ−Ｒｈ−ＰＥ
リポソームとＶＳＶ間のトランスファーに対する融合の
効果を示すものである。

【図４】 図４は、ステップワイズ蔗糖密度勾配遠心分
離後の各分画の蛍光強度を示すものである。

【図５】 図５は、ＶＳＶリポソームのＬＬＣＭＫ細胞
に対する結合の時間経過を示すものである。

【図６】 図６は、ＤＴＡ含有ＶＳＶ−リポソームのＦ
Ｌ細胞に対する効果を示すものである。

【図７】 図７は、血漿中でのＶＳＶ−リポソームの安
定性を示すものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 // Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 真弓 忠範 大阪府池田市石橋３−11−３−205 (72)発明者 山田 修 大阪府大阪市城東区森之宮２−３−30 扶 桑薬品工業株式会社研究開発センター内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】膜融合能を有するウイルスまたはその部分
   とリポソームとを融合させた、生理的条件下でヒト赤血
   球に対して溶血または凝集作用を示すことのない、膜融
   合リポソームから成る、細胞内物質導入ベクター。
2. 【請求項２】ウイルスまたはその部分が水疱性口内炎ウ
   イルスまたはその膜融合能を有する部分である、請求項
   １記載の細胞内物質導入ベクター。
3. 【請求項３】リポソームに物質が封入されている、請求
   項１または２記載の細胞内物質導入ベクター。
4. 【請求項４】物質が薬物である、請求項３記載の細胞内
   物質導入ベクター。
5. 【請求項５】物質が遺伝子である、請求項３記載の細胞
   内物質導入ベクター。