JPH11196865A - 凝集性または接着性細胞の固定化およびその利用 - Google Patents
凝集性または接着性細胞の固定化およびその利用Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 物質生産、環境汚染物質の除去等に有用な固
定化細胞を提供すること。 【解決手段】 凝集性または接着性細胞を固定化する。
これにより、増殖可能な凝集性または接着性細胞の集合
体が得られる。この固定化された集合体の活性が低下あ
るいは死滅した細胞は凝集性または接着性を失って該集
合体から脱離するため、生菌のみが維持され、活性が維
持される。従って、物質生産、環境汚染物質の除去等に
有効に利用することができる。この凝集性または接着性
は、遺伝子の導入によっても取得され得る。さらに、分
泌に関する遺伝子と目的の物質の生産に関する遺伝子と
を導入することにより、目的物質が効率よく生産され
る。
定化細胞を提供すること。 【解決手段】 凝集性または接着性細胞を固定化する。
これにより、増殖可能な凝集性または接着性細胞の集合
体が得られる。この固定化された集合体の活性が低下あ
るいは死滅した細胞は凝集性または接着性を失って該集
合体から脱離するため、生菌のみが維持され、活性が維
持される。従って、物質生産、環境汚染物質の除去等に
有効に利用することができる。この凝集性または接着性
は、遺伝子の導入によっても取得され得る。さらに、分
泌に関する遺伝子と目的の物質の生産に関する遺伝子と
を導入することにより、目的物質が効率よく生産され
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、凝集性または接着
性細胞の固定化およびその利用に関する。さらに詳しく
は、固定化された、増殖可能な凝集性または接着性細胞
の集合体であって、活性が低下あるいは死滅した細胞は
凝集性または接着性を失って該集合体から脱離するよう
な細胞の集合体、およびこのような細胞の集合体を用い
て有用物質を生産する方法に関する。
性細胞の固定化およびその利用に関する。さらに詳しく
は、固定化された、増殖可能な凝集性または接着性細胞
の集合体であって、活性が低下あるいは死滅した細胞は
凝集性または接着性を失って該集合体から脱離するよう
な細胞の集合体、およびこのような細胞の集合体を用い
て有用物質を生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から、細胞を固定化して物質生産、
環境汚染物質の分解等に応用する試みがなされている。
しかし、固定化した細胞の活性が低下しあるいは死滅す
るとその活性が低下したあるいは死滅した細胞が固定化
されたまま存在すること等により目的とする物質の生産
性、あるいは環境汚染物質の分解活性が低下するという
問題があった。
環境汚染物質の分解等に応用する試みがなされている。
しかし、固定化した細胞の活性が低下しあるいは死滅す
るとその活性が低下したあるいは死滅した細胞が固定化
されたまま存在すること等により目的とする物質の生産
性、あるいは環境汚染物質の分解活性が低下するという
問題があった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、固定化する
細胞として凝集性または接着性の細胞を用いることによ
り、上記問題点を解決したものである。本発明によれ
ば、活性が低下あるいは死滅した細胞は凝集性または接
着性を失ってこれらの細胞の集合体から脱離し、生存細
胞のみが凝集体を形成しているので、物質生産性がきわ
めて高くなる、あるいは、環境汚染物質の除去が効率的
に行われるという効果をもたらす。
細胞として凝集性または接着性の細胞を用いることによ
り、上記問題点を解決したものである。本発明によれ
ば、活性が低下あるいは死滅した細胞は凝集性または接
着性を失ってこれらの細胞の集合体から脱離し、生存細
胞のみが凝集体を形成しているので、物質生産性がきわ
めて高くなる、あるいは、環境汚染物質の除去が効率的
に行われるという効果をもたらす。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、固定化され
た、増殖可能な凝集性または接着性細胞の集合体であっ
て、活性が低下あるいは死滅した細胞は凝集性または接
着性を失って該集合体から脱離する、固定化された、増
殖可能な凝集性または接着性細胞の集合体に関する。
た、増殖可能な凝集性または接着性細胞の集合体であっ
て、活性が低下あるいは死滅した細胞は凝集性または接
着性を失って該集合体から脱離する、固定化された、増
殖可能な凝集性または接着性細胞の集合体に関する。
【０００５】好適な実施態様においては、前記細胞が遺
伝子の導入により凝集性または接着性を付与された細胞
である。
伝子の導入により凝集性または接着性を付与された細胞
である。
【０００６】好適な実施態様においては、前記細胞が凝
集性の酵母、凝集性のバクテリアまたは動物細胞であ
る。
集性の酵母、凝集性のバクテリアまたは動物細胞であ
る。
【０００７】好適な実施態様においては、前記細胞が、
凝集性または凝集性を付与された酵母であり、前記固定
化が多孔質担体で行われる。さらに、好適な実施態様に
おいては、前記固定化された細胞の集合体は、カラムに
充填されている。
凝集性または凝集性を付与された酵母であり、前記固定
化が多孔質担体で行われる。さらに、好適な実施態様に
おいては、前記固定化された細胞の集合体は、カラムに
充填されている。
【０００８】また、本発明は目的とする物質の生産方法
であって、該方法は、該目的とする物質を生産し得る、
固定化された、増殖可能な凝集性または接着性細胞の集
合体を培養する工程、を含む方法に関する。ここで、該
増殖可能な凝集性または接着性細胞は、活性が低下ある
いは死滅すると該固定化された細胞の集合体から脱離す
る。
であって、該方法は、該目的とする物質を生産し得る、
固定化された、増殖可能な凝集性または接着性細胞の集
合体を培養する工程、を含む方法に関する。ここで、該
増殖可能な凝集性または接着性細胞は、活性が低下ある
いは死滅すると該固定化された細胞の集合体から脱離す
る。
【０００９】好適な実施態様においては、前記細胞が凝
集性または接着性に関する遺伝子の導入により凝集性ま
たは接着性を付与された細胞である。
集性または接着性に関する遺伝子の導入により凝集性ま
たは接着性を付与された細胞である。
【００１０】また、好適な実施態様においては、前記目
的とする物質が分泌される。さらに、好適な実施態様に
おいては、前記目的とする物質の分泌が、分泌に関する
遺伝子と目的とする物質の生産に関する遺伝子とが導入
されて生じる。
的とする物質が分泌される。さらに、好適な実施態様に
おいては、前記目的とする物質の分泌が、分泌に関する
遺伝子と目的とする物質の生産に関する遺伝子とが導入
されて生じる。
【００１１】さらに、好適な実施態様においては、前記
細胞が凝集性の酵母、凝集性のバクテリアまたは動物細
胞であり、更に好適な実施態様においては、前記細胞
が、凝集性または凝集性を付与された酵母である。ま
た、好適な実施態様においては、前記固定化が多孔質担
体で行われる。さらに、好適な実施態様においては、前
記固定化された細胞の集合体がカラムに充填されてい
る。
細胞が凝集性の酵母、凝集性のバクテリアまたは動物細
胞であり、更に好適な実施態様においては、前記細胞
が、凝集性または凝集性を付与された酵母である。ま
た、好適な実施態様においては、前記固定化が多孔質担
体で行われる。さらに、好適な実施態様においては、前
記固定化された細胞の集合体がカラムに充填されてい
る。
【００１２】また、本発明は目的とする物質を生産する
増殖可能な凝集性または接着性の細胞をスクリーニング
する方法であって、該方法は、凝集性または接着性に関
する遺伝子および／または目的とする物質の生産に関す
る遺伝子を細胞に導入する工程；該遺伝子を導入された
細胞を固定化する工程；および該固定化された細胞が生
産する目的物質を検出および／または測定する工程；を
包含する方法に関する。ここで、該増殖可能な凝集性ま
たは接着性細胞は、活性が低下あるいは死滅すると該固
定化された細胞の集合体から脱離する。
増殖可能な凝集性または接着性の細胞をスクリーニング
する方法であって、該方法は、凝集性または接着性に関
する遺伝子および／または目的とする物質の生産に関す
る遺伝子を細胞に導入する工程；該遺伝子を導入された
細胞を固定化する工程；および該固定化された細胞が生
産する目的物質を検出および／または測定する工程；を
包含する方法に関する。ここで、該増殖可能な凝集性ま
たは接着性細胞は、活性が低下あるいは死滅すると該固
定化された細胞の集合体から脱離する。
【００１３】さらに本発明は、固定化された、目的とす
る物質を生産する増殖可能な凝集性または接着性の細胞
の集合体を製造する方法であって、該方法は、凝集性ま
たは接着性に関する遺伝子および／または目的とする物
質の生産に関する遺伝子を細胞に導入する工程；該遺伝
子を導入された細胞を固定化する工程；および該固定化
された細胞が生産する目的物質を検出する工程；を包含
する方法に関する。ここで、該増殖可能な凝集性または
接着性細胞は、活性が低下あるいは死滅すると該固定化
された細胞の集合体から脱離する。
る物質を生産する増殖可能な凝集性または接着性の細胞
の集合体を製造する方法であって、該方法は、凝集性ま
たは接着性に関する遺伝子および／または目的とする物
質の生産に関する遺伝子を細胞に導入する工程；該遺伝
子を導入された細胞を固定化する工程；および該固定化
された細胞が生産する目的物質を検出する工程；を包含
する方法に関する。ここで、該増殖可能な凝集性または
接着性細胞は、活性が低下あるいは死滅すると該固定化
された細胞の集合体から脱離する。
【００１４】また、凝集または接着に関する遺伝子と、
目的とする物質の生産を調節する遺伝子とを有する、固
定化された、目的とする物質を生産する増殖可能な凝集
性または接着性の細胞の集合体を形成するための発現カ
セットに関する：ここで、該増殖可能な凝集性または接
着性細胞は、活性が低下あるいは死滅すると該固定化さ
れた細胞の集合体から脱離する。
目的とする物質の生産を調節する遺伝子とを有する、固
定化された、目的とする物質を生産する増殖可能な凝集
性または接着性の細胞の集合体を形成するための発現カ
セットに関する：ここで、該増殖可能な凝集性または接
着性細胞は、活性が低下あるいは死滅すると該固定化さ
れた細胞の集合体から脱離する。
【００１５】好適な実施態様においては、前記カセット
が、酵母の凝集性に関する遺伝子と酵母での目的の遺伝
子の発現を調節するプロモーターを有する。
が、酵母の凝集性に関する遺伝子と酵母での目的の遺伝
子の発現を調節するプロモーターを有する。
【００１６】
【発明の実施の形態】まず、本発明の、活性が低下ある
いは死滅した細胞が凝集性または接着性を失って脱離す
るような固定化された、増殖可能な凝集性または接着性
細胞の集合体およびその作成方法について説明する。
いは死滅した細胞が凝集性または接着性を失って脱離す
るような固定化された、増殖可能な凝集性または接着性
細胞の集合体およびその作成方法について説明する。
【００１７】本発明において、「固定化」とは、細胞が
遊離の状態ではない状態を意味し、例えば、細胞が担体
に結合あるいは付着した状態、細胞が担体にトラップさ
れた状態等をいう。
遊離の状態ではない状態を意味し、例えば、細胞が担体
に結合あるいは付着した状態、細胞が担体にトラップさ
れた状態等をいう。
【００１８】本発明において、「増殖可能な」とは、細
胞が担体に固定化された状態でありながら、その細胞数
を増加できることを意味し、活性が低下した細胞あるい
は死滅細胞が脱離するにも関わらず、生菌数がほぼ一定
に保たれる場合も含む。
胞が担体に固定化された状態でありながら、その細胞数
を増加できることを意味し、活性が低下した細胞あるい
は死滅細胞が脱離するにも関わらず、生菌数がほぼ一定
に保たれる場合も含む。
【００１９】本発明において、「凝集性」とは、液体中
に浮遊または分散して存在する細胞（例えばバクテリ
ア、酵母等）が、集合して塊（集合体）を作る性質を意
味する。
に浮遊または分散して存在する細胞（例えばバクテリ
ア、酵母等）が、集合して塊（集合体）を作る性質を意
味する。
【００２０】本発明において、「接着性」とは、細胞が
細胞相互間で接着または結合し、集合体を形成する性質
を意味する。
細胞相互間で接着または結合し、集合体を形成する性質
を意味する。
【００２１】本発明において、「集合体」とは、細胞同
士が凝集または接着し、塊となった状態を意味する。ま
た、「活性が低下した」とは、細胞自体は死滅していな
いものの細胞全体の活性が弱まった状態、あるいは、た
とえば凝集に関する活性が低下する、凝集に関する酵素
をコードするＤＮＡのレベルで活性が弱まる等の状態と
なり、凝集できなくなる状態をいう。
士が凝集または接着し、塊となった状態を意味する。ま
た、「活性が低下した」とは、細胞自体は死滅していな
いものの細胞全体の活性が弱まった状態、あるいは、た
とえば凝集に関する活性が低下する、凝集に関する酵素
をコードするＤＮＡのレベルで活性が弱まる等の状態と
なり、凝集できなくなる状態をいう。
【００２２】本発明に用いられる細胞としては、酵母、
バクテリア、真菌（かびを含む）、植物細胞または動物
細胞が挙げられる。取り扱い、安全性等の点から、酵
母、バクテリアおよび動物細胞が好ましい。
バクテリア、真菌（かびを含む）、植物細胞または動物
細胞が挙げられる。取り扱い、安全性等の点から、酵
母、バクテリアおよび動物細胞が好ましい。
【００２３】また、本発明においては、凝集性または接
着性の細胞は、凝集または接着に関する遺伝子の導入に
より凝集性または接着性を付与された細胞であってもよ
い。
着性の細胞は、凝集または接着に関する遺伝子の導入に
より凝集性または接着性を付与された細胞であってもよ
い。
【００２４】本発明において、「凝集または接着に関す
る遺伝子」とは、凝集または接着に関与する物質、例え
ば、酵母におけるキチン、レクチン等、動物細胞におけ
るフィブロネクチン等、をコードする構造遺伝子は、も
ちろん、この構造遺伝子と連関する遺伝子群（例えば、
オペロン）、これらの遺伝子を発現を調節するオペレー
ター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等
のいわゆる調節配列をも含む概念を意味する。凝集性に
関する遺伝子としては、ＦＬＯ１(J.Watari ら、Agric.
Biol.Chem., 55, 1547(1991), G.G.Stewart ら、Can.J.
Microbiol., 23, 441(1977), I.Russell ら、Inst.Bre
w., 86, 120(1980), C.W.Lewisら、J.Inst.Brew., 82 1
58(1976)) 等、ＦＬＯ５(I.Russellら、J.Inst.Brew.,
85, 95(1979)) 、およびＦＬＯ８(I.Yamashitaら、Agri
c.Biol.Chem., 48 131(1984)) 等の遺伝子が挙げられ
る。
る遺伝子」とは、凝集または接着に関与する物質、例え
ば、酵母におけるキチン、レクチン等、動物細胞におけ
るフィブロネクチン等、をコードする構造遺伝子は、も
ちろん、この構造遺伝子と連関する遺伝子群（例えば、
オペロン）、これらの遺伝子を発現を調節するオペレー
ター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー等
のいわゆる調節配列をも含む概念を意味する。凝集性に
関する遺伝子としては、ＦＬＯ１(J.Watari ら、Agric.
Biol.Chem., 55, 1547(1991), G.G.Stewart ら、Can.J.
Microbiol., 23, 441(1977), I.Russell ら、Inst.Bre
w., 86, 120(1980), C.W.Lewisら、J.Inst.Brew., 82 1
58(1976)) 等、ＦＬＯ５(I.Russellら、J.Inst.Brew.,
85, 95(1979)) 、およびＦＬＯ８(I.Yamashitaら、Agri
c.Biol.Chem., 48 131(1984)) 等の遺伝子が挙げられ
る。
【００２５】「遺伝子の導入」とは、細胞の中に遺伝子
を導入し、発現させることを意味し、その方法は問わな
い。バクテリア、酵母、真菌、植物、あるいは動物細胞
に対して、形質転換、形質導入、トランスフェクショ
ン、コトランスフェクション、エレクトロポレーション
等の方法を用い、プラスミドの形態で、あるいは宿主の
遺伝子に挿入して、あるいは宿主の遺伝子と相同組換え
を起こすこと等により、形質を発現させることを意味す
る。
を導入し、発現させることを意味し、その方法は問わな
い。バクテリア、酵母、真菌、植物、あるいは動物細胞
に対して、形質転換、形質導入、トランスフェクショ
ン、コトランスフェクション、エレクトロポレーション
等の方法を用い、プラスミドの形態で、あるいは宿主の
遺伝子に挿入して、あるいは宿主の遺伝子と相同組換え
を起こすこと等により、形質を発現させることを意味す
る。
【００２６】凝集性の細胞の固定化には、例えば、担体
結合法、架橋法および包括法等の公知の方法が適用でき
る。なかでも、凝集性の細胞の固定化には、担体結合法
が最適である。担体結合法には、イオン交換性の樹脂に
吸着させる化学的吸着法あるいは物理的吸着法が含まれ
る。本発明においては、凝集性の細胞を扱う点、活性が
低下あるいは死滅した細胞の脱離の観点から、多孔質の
担体を用いる物理的吸着法が最適である。
結合法、架橋法および包括法等の公知の方法が適用でき
る。なかでも、凝集性の細胞の固定化には、担体結合法
が最適である。担体結合法には、イオン交換性の樹脂に
吸着させる化学的吸着法あるいは物理的吸着法が含まれ
る。本発明においては、凝集性の細胞を扱う点、活性が
低下あるいは死滅した細胞の脱離の観点から、多孔質の
担体を用いる物理的吸着法が最適である。
【００２７】本発明において、「担体」とは、細胞を固
定化することができる物質を意味し、好ましくは、水ま
たはある特定の溶媒に対して不溶性の物質である。本発
明に用いる担体の材質としては、例えば、ポリビニルア
ルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォー
ム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂
多孔質体、シリコンフォーム、セルロース多孔質体等の
発泡体あるいは樹脂が好ましい。細胞の増殖および活性
が低下したあるいは死滅した細胞の脱離等を考慮する
と、多孔質の担体が好ましい。多孔質体の開口部の大き
さは細胞によっても異なるが、細胞が十分に入り込め
て、増殖できる大きさが適当である。バクテリアの場合
は、約１０μｍ〜５００μｍ、酵母、真菌並びに植物細
胞の場合は５０μｍ〜１、０００μｍ、動物細胞の場合
は３０μｍ〜２５０μｍが好適であるが、これに限定さ
れない。
定化することができる物質を意味し、好ましくは、水ま
たはある特定の溶媒に対して不溶性の物質である。本発
明に用いる担体の材質としては、例えば、ポリビニルア
ルコール、ポリウレタンフォーム、ポリスチレンフォー
ム、ポリアクリルアミド、ポリビニルフォルマール樹脂
多孔質体、シリコンフォーム、セルロース多孔質体等の
発泡体あるいは樹脂が好ましい。細胞の増殖および活性
が低下したあるいは死滅した細胞の脱離等を考慮する
と、多孔質の担体が好ましい。多孔質体の開口部の大き
さは細胞によっても異なるが、細胞が十分に入り込め
て、増殖できる大きさが適当である。バクテリアの場合
は、約１０μｍ〜５００μｍ、酵母、真菌並びに植物細
胞の場合は５０μｍ〜１、０００μｍ、動物細胞の場合
は３０μｍ〜２５０μｍが好適であるが、これに限定さ
れない。
【００２８】また、担体の形状は問わない。担体の強
度、培養効率等を考慮すると、球状あるいは立方体状
で、大きさは、球状の場合、直径が２ｍｍ〜５０ｍｍ、
立方体状の場合、２ｍｍ〜５０ｍｍ角が好ましい。
度、培養効率等を考慮すると、球状あるいは立方体状
で、大きさは、球状の場合、直径が２ｍｍ〜５０ｍｍ、
立方体状の場合、２ｍｍ〜５０ｍｍ角が好ましい。
【００２９】本発明に用いる細胞は固定化されているに
も係わらず増殖が可能であり、活性が低下あるいは死滅
すれば容易に脱離するという性質を考慮すると、担体へ
の結合は物理的吸着が最も好ましい。物理的吸着には特
別な手段は必要ない。凝集性あるいは接着性の細胞と前
記多孔質の担体とを単に混合して培養することにより、
細胞が多孔質体の開口部に入りこみ、担体に付着する。
これにより、固定化された、増殖可能な凝集性あるいは
接着性の細胞の集合体が得られる。
も係わらず増殖が可能であり、活性が低下あるいは死滅
すれば容易に脱離するという性質を考慮すると、担体へ
の結合は物理的吸着が最も好ましい。物理的吸着には特
別な手段は必要ない。凝集性あるいは接着性の細胞と前
記多孔質の担体とを単に混合して培養することにより、
細胞が多孔質体の開口部に入りこみ、担体に付着する。
これにより、固定化された、増殖可能な凝集性あるいは
接着性の細胞の集合体が得られる。
【００３０】このようにして得られる固定化された細胞
は、担体に付着した状態で、浮遊状態で培養されるか、
カラム等に充填されて、いわゆるバイオリアクターとし
て用いることができる。連続的にあるいはバッチで繰り
返し培養しても、活性が低下したあるいは死滅した細胞
が脱離していくので、活性が落ちることはなく、有効に
利用することができる。
は、担体に付着した状態で、浮遊状態で培養されるか、
カラム等に充填されて、いわゆるバイオリアクターとし
て用いることができる。連続的にあるいはバッチで繰り
返し培養しても、活性が低下したあるいは死滅した細胞
が脱離していくので、活性が落ちることはなく、有効に
利用することができる。
【００３１】次に、得られた固定化された、増殖可能
な、凝集性あるいは接着性細胞の集合体を用いて、有用
物質を生産する方法について説明する。この方法には特
別な手段は必要なく、そのまま集合体を培養することに
より、目的の有用物質が生産される。本発明の凝集性ま
たは接着性細胞は、活性が低下あるいは死滅すると該固
定化された細胞の集合体から脱離するので、集合体はほ
ぼ生細胞の集団であり、生産性は高く維持される。
な、凝集性あるいは接着性細胞の集合体を用いて、有用
物質を生産する方法について説明する。この方法には特
別な手段は必要なく、そのまま集合体を培養することに
より、目的の有用物質が生産される。本発明の凝集性ま
たは接着性細胞は、活性が低下あるいは死滅すると該固
定化された細胞の集合体から脱離するので、集合体はほ
ぼ生細胞の集団であり、生産性は高く維持される。
【００３２】目的の物質としては、医薬品、食品等に用
いられる蛋白質（酵素、抗体等）、アミノ酸類はもちろ
ん、環境汚染物質をバイオコンバージョンするための酵
素類が挙げられるが、これらに限定されない。
いられる蛋白質（酵素、抗体等）、アミノ酸類はもちろ
ん、環境汚染物質をバイオコンバージョンするための酵
素類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】目的とする物質を生産させるために、その
目的とする物質の生産に関する遺伝子を凝集性または接
着性細胞に導入してもよい。あるいは、凝集性または接
着性を有しない細胞に、凝集または接着に関する遺伝子
と目的の物質の生産に関する遺伝子とを導入した細胞を
用いてもよい。さらに好ましくは、目的とする物質の生
産に関する遺伝子と分泌に関する遺伝子とを組み合わせ
て導入し、目的とする物質が分泌されるようにすること
もできる。
目的とする物質の生産に関する遺伝子を凝集性または接
着性細胞に導入してもよい。あるいは、凝集性または接
着性を有しない細胞に、凝集または接着に関する遺伝子
と目的の物質の生産に関する遺伝子とを導入した細胞を
用いてもよい。さらに好ましくは、目的とする物質の生
産に関する遺伝子と分泌に関する遺伝子とを組み合わせ
て導入し、目的とする物質が分泌されるようにすること
もできる。
【００３４】本発明において、「目的とする物質の生産
に関する遺伝子」とは、目的とする物質をコードする構
造遺伝子、目的の構造遺伝子と連関する遺伝子群（例え
ば、オペロン）、これらの遺伝子を発現を調節するオペ
レーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサ
ー等のいわゆる調節配列をも含む概念を意味する。
に関する遺伝子」とは、目的とする物質をコードする構
造遺伝子、目的の構造遺伝子と連関する遺伝子群（例え
ば、オペロン）、これらの遺伝子を発現を調節するオペ
レーター、プロモーター、ターミネーター、エンハンサ
ー等のいわゆる調節配列をも含む概念を意味する。
【００３５】本発明においては、目的とする物質を生産
する増殖可能な凝集性または接着性の細胞の集合体を形
成するための発現カセットを用いることができる。
する増殖可能な凝集性または接着性の細胞の集合体を形
成するための発現カセットを用いることができる。
【００３６】本発明において、「発現カセット」とは、
凝集または接着に関する遺伝子と、目的とする物質の生
産に関する遺伝子の組み込み部位を有するベクターまた
はプラスミドをいい、宿主細胞内で独立して存在しても
よいし、宿主の染色体に組み込まれてもよい。好ましく
は、この発現カセットは、凝集または接着に関する遺伝
子と目的とする物質の生産を調節する遺伝子とを有し、
目的の物質の構造遺伝子を組み込めば、目的の遺伝子が
発現するようなベクターあるいはプラスミドである。よ
り好ましくは、発現カセットは分泌酵素のリーダー配列
を有することができ、リーダー配列の直後に目的の構造
遺伝子が接続されるような、発現カセットである。適切
な組み込み部位がないときには、目的とする遺伝子をい
ったん組み込み、当業者に周知の部位特異的突然変異誘
発法により不要な配列を除去して、分泌酵素のリーダー
配列の直後に目的の物質の構造遺伝子を結合させること
ができる。これにより、目的の物質が、細胞外（ペリプ
ラズムを含む）に分泌される。
凝集または接着に関する遺伝子と、目的とする物質の生
産に関する遺伝子の組み込み部位を有するベクターまた
はプラスミドをいい、宿主細胞内で独立して存在しても
よいし、宿主の染色体に組み込まれてもよい。好ましく
は、この発現カセットは、凝集または接着に関する遺伝
子と目的とする物質の生産を調節する遺伝子とを有し、
目的の物質の構造遺伝子を組み込めば、目的の遺伝子が
発現するようなベクターあるいはプラスミドである。よ
り好ましくは、発現カセットは分泌酵素のリーダー配列
を有することができ、リーダー配列の直後に目的の構造
遺伝子が接続されるような、発現カセットである。適切
な組み込み部位がないときには、目的とする遺伝子をい
ったん組み込み、当業者に周知の部位特異的突然変異誘
発法により不要な配列を除去して、分泌酵素のリーダー
配列の直後に目的の物質の構造遺伝子を結合させること
ができる。これにより、目的の物質が、細胞外（ペリプ
ラズムを含む）に分泌される。
【００３７】なお、「目的の物質の生産を調節する遺伝
子」とは、遺伝子を発現を調節するオペレーター、プロ
モーター、ターミネーター、エンハンサー等のいわゆる
調節配列を意味する。
子」とは、遺伝子を発現を調節するオペレーター、プロ
モーター、ターミネーター、エンハンサー等のいわゆる
調節配列を意味する。
【００３８】これらの遺伝子あるいは発現カセットの調
製は、公知の遺伝子組換えの手法を用いて行われる。
製は、公知の遺伝子組換えの手法を用いて行われる。
【００３９】得られた形質転換細胞は、以下の方法で、
目的の遺伝子が導入されたか否かをスクリーニングする
ことができる。元来、凝集性あるいは接着性細胞の場合
は、例えば、多孔質体とともに培養して、目的物質を生
産するか否かを検討すればよい。元来、凝集性あるいは
接着性でない細胞の場合は、まず、形質転換細胞を多孔
質体とともに培養して付着する細胞のみを選択し、つい
で、その付着した細胞が目的物質を生産するか否かを決
定すればよい。
目的の遺伝子が導入されたか否かをスクリーニングする
ことができる。元来、凝集性あるいは接着性細胞の場合
は、例えば、多孔質体とともに培養して、目的物質を生
産するか否かを検討すればよい。元来、凝集性あるいは
接着性でない細胞の場合は、まず、形質転換細胞を多孔
質体とともに培養して付着する細胞のみを選択し、つい
で、その付着した細胞が目的物質を生産するか否かを決
定すればよい。
【００４０】このようにして得られた固定化された細胞
は、物質生産にあるいは環境汚染物質の除去に用いられ
る。
は、物質生産にあるいは環境汚染物質の除去に用いられ
る。
【００４１】以下、凝集性の細胞として酵母を、目的物
質としてラット肝ミクロソームのＰ４５０モノオキシゲ
ナーゼを例に挙げて、環境汚染物質除去のモデルケース
として本発明を説明するが、本発明がこれらの実施例に
限定されないことはいうまでもない。
質としてラット肝ミクロソームのＰ４５０モノオキシゲ
ナーゼを例に挙げて、環境汚染物質除去のモデルケース
として本発明を説明するが、本発明がこれらの実施例に
限定されないことはいうまでもない。
【００４２】
【実施例】ラット肝ミクロソームのＰ４５０モノオキシ
ゲナーゼは、分子状酸素の存在下、広範囲の脂溶性物質
に対して一原子酸素を添加する反応を触媒する。この実
施例においては、凝集性酵母にラット肝ミクロソームの
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子を導入し、アセトア
ニリドを基質としてアセトアミノフェンへの変換につい
て検討した例について説明する。
ゲナーゼは、分子状酸素の存在下、広範囲の脂溶性物質
に対して一原子酸素を添加する反応を触媒する。この実
施例においては、凝集性酵母にラット肝ミクロソームの
Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ遺伝子を導入し、アセトア
ニリドを基質としてアセトアミノフェンへの変換につい
て検討した例について説明する。
【００４３】（実験材料）使用した酵母は、凝集性のSa
ccharomyces cerevisiae ATCC60715株である。使用した
プラスミドは、pAMR2 である。プラスミドpAMR2 は、酵
母Saccharomycescerevisiaeのリダクターゼ（Y.Yabusak
iら、J.Biochem., 103, 1004(1988) ）とラット肝ミク
ロソーム(K. Oedaら、DNA,4,203(1985))とを共発現する
プラスミド(H.Murakami ら、J.Biochem., 108, 859(199
0)) である。
ccharomyces cerevisiae ATCC60715株である。使用した
プラスミドは、pAMR2 である。プラスミドpAMR2 は、酵
母Saccharomycescerevisiaeのリダクターゼ（Y.Yabusak
iら、J.Biochem., 103, 1004(1988) ）とラット肝ミク
ロソーム(K. Oedaら、DNA,4,203(1985))とを共発現する
プラスミド(H.Murakami ら、J.Biochem., 108, 859(199
0)) である。
【００４４】なお、P450の発現量は酵母菌体のCO差スペ
クトルにより、HPLCによりアセトアニリドからのアセト
アミノフェンの生成量はHPLCにより、エタノールの生成
量はガスクロマトグラフィーにより、グルコース量はム
タローゼおよびグルコースオキシダーゼにより、および
遊離菌体量と固定された菌体量とは菌体乾重量により、
それぞれ測定した。
クトルにより、HPLCによりアセトアニリドからのアセト
アミノフェンの生成量はHPLCにより、エタノールの生成
量はガスクロマトグラフィーにより、グルコース量はム
タローゼおよびグルコースオキシダーゼにより、および
遊離菌体量と固定された菌体量とは菌体乾重量により、
それぞれ測定した。
【００４５】（実施例１：酵母の形質転換とP450の発
現）酵母の形質転換は、常法に従って、酢酸リチウム法
を用いて行い、プラスミドpAMR2 を有する凝集性酵母AT
CC60715(pAMR2)を取得した。
現）酵母の形質転換は、常法に従って、酢酸リチウム法
を用いて行い、プラスミドpAMR2 を有する凝集性酵母AT
CC60715(pAMR2)を取得した。
【００４６】ＳＤ培地（0.67W/V% nitrogen base w/o
amino acids 、５W/V ％グルコース、160 μg/mlヒスチ
ジン）３L を含む気泡塔型培養槽に、６mm角のポリウレ
タンフォームBSPsを1,000 個/Lとなるように投入し、凝
集性酵母ATCC60715(pAMR2)を植菌し、51時間、30℃で培
養することにより、ポリウレタンフォームに固定した。
ついで、培養液をほぼ抜き取り、新たにP450の基質であ
る15mMのアセトアニリドを含むＳＤ培地を添加し、８時
間反応を行った。これを１サイクル目とし、５回繰り返
し反応を行った結果を図１に示す。また、５サイクル後
の固定化された酵母と遊離している酵母のP450の発現量
を表１に示す。
amino acids 、５W/V ％グルコース、160 μg/mlヒスチ
ジン）３L を含む気泡塔型培養槽に、６mm角のポリウレ
タンフォームBSPsを1,000 個/Lとなるように投入し、凝
集性酵母ATCC60715(pAMR2)を植菌し、51時間、30℃で培
養することにより、ポリウレタンフォームに固定した。
ついで、培養液をほぼ抜き取り、新たにP450の基質であ
る15mMのアセトアニリドを含むＳＤ培地を添加し、８時
間反応を行った。これを１サイクル目とし、５回繰り返
し反応を行った結果を図１に示す。また、５サイクル後
の固定化された酵母と遊離している酵母のP450の発現量
を表１に示す。
【００４７】なお、図１において、■はグルコースの濃
度（g/L ）、△は遊離細胞の濃度(g/L) 、○は固定化細
胞の濃度（mg/BSP）、●はアセトアミノフェンの濃度(
μM)をそれぞれ、表す。
度（g/L ）、△は遊離細胞の濃度(g/L) 、○は固定化細
胞の濃度（mg/BSP）、●はアセトアミノフェンの濃度(
μM)をそれぞれ、表す。
【００４８】
【表１】
【００４９】アセトアニリドのアセトアミノフェン(p-A
AP) への変換活性(P450 の発現) は、サイクルが増えて
も全く減少せず、高発現を維持することができた。他
方、表１からわかるように、固定化された酵母はP450を
著量発現していることが確認できたが、遊離している酵
母の場合にはほとんど発現せず、活性が大きく低下し、
あるいは死滅していることも確認された。
AP) への変換活性(P450 の発現) は、サイクルが増えて
も全く減少せず、高発現を維持することができた。他
方、表１からわかるように、固定化された酵母はP450を
著量発現していることが確認できたが、遊離している酵
母の場合にはほとんど発現せず、活性が大きく低下し、
あるいは死滅していることも確認された。
【００５０】
【発明の効果】本発明の固定化凝集性または接着性細胞
の集合体は、活性が低下あるいは死滅した細胞が凝集性
または接着性を失って該集合体から脱離するため、生菌
のみが維持され、活性が維持される。従って、物質生
産、環境汚染物質の除去等に有効に利用することができ
る。
の集合体は、活性が低下あるいは死滅した細胞が凝集性
または接着性を失って該集合体から脱離するため、生菌
のみが維持され、活性が維持される。従って、物質生
産、環境汚染物質の除去等に有効に利用することができ
る。
【図１】 固定化凝集性酵母の各反応サイクルにおける
活性を示す図である。
活性を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:865）
Claims (18)
- 【請求項１】 固定化された、増殖可能な凝集性または
接着性細胞の集合体であって、活性が低下あるいは死滅
した細胞は凝集性または接着性を失って該集合体から脱
離する、固定化された、増殖可能な凝集性または接着性
細胞の集合体。 - 【請求項２】 前記細胞が遺伝子の導入により凝集性ま
たは接着性を付与された細胞である、請求項１に記載の
細胞の集合体。 - 【請求項３】 前記細胞が凝集性の酵母、凝集性のバク
テリアまたは動物細胞である、請求項１または２に記載
の細胞の集合体。 - 【請求項４】 前記細胞が、凝集性または凝集性を付与
された酵母である、請求項１ないし３いずれかの項に記
載の細胞の集合体。 - 【請求項５】 前記固定化が多孔質担体で行われる、請
求項１ないし４いずれかの項に記載の細胞の集合体。 - 【請求項６】 カラムに充填されている、請求項１ない
し５いずれかの項に記載の細胞の集合体。 - 【請求項７】 目的とする物質の生産方法であって、該
方法は、該目的とする物質を生産し得る、固定化され
た、増殖可能な凝集性または接着性細胞の集合体を培養
する工程、を含む方法：ここで、該増殖可能な凝集性ま
たは接着性細胞は、活性が低下あるいは死滅すると該固
定化された細胞の集合体から脱離する。 - 【請求項８】 前記細胞が凝集性または接着性に関する
遺伝子の導入により凝集性または接着性を付与された細
胞である、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記目的とする物質が分泌される、請求
項７または８に記載の方法。 - 【請求項１０】 前記目的とする物質の分泌が、分泌に
関する遺伝子と目的とする物質の生産に関する遺伝子と
が導入されて生じる、請求項７ないし９いずれかの項に
記載の方法。 - 【請求項１１】 前記細胞が凝集性の酵母、凝集性のバ
クテリアまたは動物細胞である、請求項７ないし１０い
ずれかの項に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記細胞が、凝集性または凝集性を付
与された酵母である、請求項７ないし１１いずれかの項
に記載の細胞の集合体。 - 【請求項１３】 前記固定化が多孔質担体で行われる、
請求項７ないし１２いずれかの項に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記固定化された細胞の集合体がカラ
ムに充填されている、請求項７ないし１３いずれかの項
に記載の方法。 - 【請求項１５】 目的とする物質を生産する増殖可能な
凝集性または接着性の細胞をスクリーニングする方法で
あって、該方法は、 凝集性または接着性に関する遺伝子および／または目的
とする物質の生産に関する遺伝子を細胞に導入する工
程；該遺伝子を導入された細胞を固定化する工程；およ
び該固定化された細胞が生産する目的物質を検出および
／または測定する工程；を包含する方法：ここで、該増
殖可能な凝集性または接着性細胞は、活性が低下あるい
は死滅すると該固定化された細胞の集合体から脱離す
る。 - 【請求項１６】 固定化された、目的とする物質を生産
する増殖可能な凝集性または接着性の細胞の集合体を製
造する方法であって、該方法は、 凝集性または接着性に関する遺伝子および／または目的
とする物質の生産に関する遺伝子を細胞に導入する工
程；該遺伝子を導入された細胞を固定化する工程；およ
び該固定化された細胞が生産する目的物質を検出する工
程；を包含する方法：ここで、該増殖可能な凝集性また
は接着性細胞は、活性が低下あるいは死滅すると該固定
化された細胞の集合体から脱離する。 - 【請求項１７】 凝集または接着に関する遺伝子と、目
的とする物質の生産を調節する遺伝子とを有する、固定
化された、目的とする物質を生産する増殖可能な凝集性
または接着性の細胞の集合体を形成するための発現カセ
ット：ここで、該増殖可能な凝集性または接着性細胞
は、活性が低下あるいは死滅すると該固定化された細胞
の集合体から脱離する。 - 【請求項１８】 前記カセットが、酵母の凝集性に関す
る遺伝子と酵母での目的の遺伝子の発現を調節するプロ
モーターを有する、請求項１７に記載の発現カセット。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10022858A JPH11196865A (ja) | 1998-01-19 | 1998-01-19 | 凝集性または接着性細胞の固定化およびその利用 |
| EP99100822A EP0930363A3 (en) | 1998-01-19 | 1999-01-18 | Immobilization of cohesive or adhesive cells and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10022858A JPH11196865A (ja) | 1998-01-19 | 1998-01-19 | 凝集性または接着性細胞の固定化およびその利用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11196865A true JPH11196865A (ja) | 1999-07-27 |
Family
ID=12094425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10022858A Pending JPH11196865A (ja) | 1998-01-19 | 1998-01-19 | 凝集性または接着性細胞の固定化およびその利用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0930363A3 (ja) |
| JP (1) | JPH11196865A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100406557C (zh) * | 2004-07-22 | 2008-07-30 | 浙江大学 | 固定化细胞色素p450 bm－3的制备方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10048822A1 (de) * | 2000-09-29 | 2002-04-18 | Nimbus Biotechnologie Gmbh | Verfahren zur Immobilisierung von Lipidschichten |
-
1998
- 1998-01-19 JP JP10022858A patent/JPH11196865A/ja active Pending
-
1999
- 1999-01-18 EP EP99100822A patent/EP0930363A3/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100406557C (zh) * | 2004-07-22 | 2008-07-30 | 浙江大学 | 固定化细胞色素p450 bm－3的制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0930363A2 (en) | 1999-07-21 |
| EP0930363A3 (en) | 2002-07-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040323 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040720 |