JPH11196870A - 受容体の機能解析法及びリガンド分子のスクリーニング法 - Google Patents
受容体の機能解析法及びリガンド分子のスクリーニング法Info
- Publication number
- JPH11196870A JPH11196870A JP1484098A JP1484098A JPH11196870A JP H11196870 A JPH11196870 A JP H11196870A JP 1484098 A JP1484098 A JP 1484098A JP 1484098 A JP1484098 A JP 1484098A JP H11196870 A JPH11196870 A JP H11196870A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- adenovirus vector
- odor
- receptor
- gene
- gfp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003446 ligand Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims abstract description 44
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 35
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 abstract 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 abstract 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 21
- 102000012547 Olfactory receptors Human genes 0.000 description 20
- 108050002069 Olfactory receptors Proteins 0.000 description 20
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 15
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 15
- NUJGJRNETVAIRJ-UHFFFAOYSA-N octanal Chemical compound CCCCCCCC=O NUJGJRNETVAIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 210000001706 olfactory mucosa Anatomy 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 9
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 5
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 5
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 5
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 2
- 238000013528 artificial neural network Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000000196 olfactory nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010002724 Pheromone Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 102100038344 Vomeronasal type-1 receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 239000002427 pheromone receptor Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 受容体の機能解析法及びリガンド分子のスク
リーニング法を提供する。 【解決手段】 本発明は受容体の機能を解析する新しい
方法及びリガンド分子のスクリーニング法に関する。に
おい受容体をはじめとして、フェロモン受容体とフェロ
モン分子の関係など、その他のあらゆる受容体の機能解
析とそのリガンド分子のスクリーニングに利用すること
ができる。
リーニング法を提供する。 【解決手段】 本発明は受容体の機能を解析する新しい
方法及びリガンド分子のスクリーニング法に関する。に
おい受容体をはじめとして、フェロモン受容体とフェロ
モン分子の関係など、その他のあらゆる受容体の機能解
析とそのリガンド分子のスクリーニングに利用すること
ができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は受容体の機能解析法
及びリガンド分子のスクリーニング法に関する。より詳
細には、BicistronicあるいはPolycistronicに遺伝子を
発現させる新規アデノウイルスベクター系を用いた受容
体の機能解析法（例えば、におい受容体の機能解析法）
及び用途に関する。
及びリガンド分子のスクリーニング法に関する。より詳
細には、BicistronicあるいはPolycistronicに遺伝子を
発現させる新規アデノウイルスベクター系を用いた受容
体の機能解析法（例えば、におい受容体の機能解析法）
及び用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】成熟した脳は数多くの神経系細胞で構成
されている。神経細胞はそれぞれ異なる機能を持ってい
るが、個々の神経細胞は単独で機能するわけではない。
神経細胞は神経回路網（ニューロンネットワーク）とい
う高次構造を形成し、お互いに情報を伝達することによ
って、記憶や学習など脳としての機能を発現する。脳の
機能を分子レベルで解析するためには、神経回路網を形
成している神経細胞へ効率よく遺伝子を導入する技術が
必要となる。アデノウイルスベクターは神経細胞のよう
な非分裂性細胞への遺伝子導入が可能であり、脳への遺
伝子導入技術として有用性が高いことを示してきた（Hu
man Gene Therapy, 7:149-158, 1997)。
されている。神経細胞はそれぞれ異なる機能を持ってい
るが、個々の神経細胞は単独で機能するわけではない。
神経細胞は神経回路網（ニューロンネットワーク）とい
う高次構造を形成し、お互いに情報を伝達することによ
って、記憶や学習など脳としての機能を発現する。脳の
機能を分子レベルで解析するためには、神経回路網を形
成している神経細胞へ効率よく遺伝子を導入する技術が
必要となる。アデノウイルスベクターは神経細胞のよう
な非分裂性細胞への遺伝子導入が可能であり、脳への遺
伝子導入技術として有用性が高いことを示してきた（Hu
man Gene Therapy, 7:149-158, 1997)。
【０００３】ところで、におい受容体には、GTP結合タ
ンパク質を介するcAMP依存的な情報伝達経路が関与する
ことから、この経路におけるにおい受容体は、７回膜貫
通型のGTP結合タンパク質共役型受容体であると推測さ
れた。GTP結合タンパク質共役型受容体のアミノ酸残基
保存性の高い部分に対応する縮重プライマーを用い、PC
R法で嗅上皮に強く発現しているGTP結合タンパク質共役
型受容体が多数クローニングされた。これらはGTP結合
タンパク質共役型受容体スーパーファミリーの一部を形
成し、すなわちにおい受容体サブファミリーを形成して
いるとされた。このような経緯でにおい受容体はクロー
ニングされたために、におい受容体がどのようなにおい
物質を認識するのかなど、その機能については全く分か
っていないのが現状である。
ンパク質を介するcAMP依存的な情報伝達経路が関与する
ことから、この経路におけるにおい受容体は、７回膜貫
通型のGTP結合タンパク質共役型受容体であると推測さ
れた。GTP結合タンパク質共役型受容体のアミノ酸残基
保存性の高い部分に対応する縮重プライマーを用い、PC
R法で嗅上皮に強く発現しているGTP結合タンパク質共役
型受容体が多数クローニングされた。これらはGTP結合
タンパク質共役型受容体スーパーファミリーの一部を形
成し、すなわちにおい受容体サブファミリーを形成して
いるとされた。このような経緯でにおい受容体はクロー
ニングされたために、におい受容体がどのようなにおい
物質を認識するのかなど、その機能については全く分か
っていないのが現状である。
【０００４】本発明者は、新規に作製したBicistronic
あるいはPolycistronicアデノウイルスベクターを用い
て１つのアデノウイルスベクターで２種類又はそれ以上
のタンパク質を同時に発現させた。green fluorescence
protein (GFP)をマーカー遺伝子として発現するBicist
ronicあるいはPolycistronicアデノウイルスベクターを
用いることによって、アデノウイルスベクターによって
遺伝子が導入された細胞を容易に同定することができ
た。しかも、組織を固定する必要がないので、電気生理
解析、神経発生における神経細胞の移動の観察が容易に
できた。当該アデノウイルスベクターを用いることによ
って、世界に先駆けてにおい受容体の機能を電気生理的
に解析することに成功した。本発明はかかる知見に基づ
いてなされたもので、本発明は受容体の機能を解析する
新しい方法及びリガンド分子のスクリーニング法を提供
することを目的とする。におい受容体をはじめとして、
フェロモン受容体とフェロモン分子の関係など、その他
のあらゆる受容体の機能解析とそのリガンド分子のスク
リーニングを提供する。
あるいはPolycistronicアデノウイルスベクターを用い
て１つのアデノウイルスベクターで２種類又はそれ以上
のタンパク質を同時に発現させた。green fluorescence
protein (GFP)をマーカー遺伝子として発現するBicist
ronicあるいはPolycistronicアデノウイルスベクターを
用いることによって、アデノウイルスベクターによって
遺伝子が導入された細胞を容易に同定することができ
た。しかも、組織を固定する必要がないので、電気生理
解析、神経発生における神経細胞の移動の観察が容易に
できた。当該アデノウイルスベクターを用いることによ
って、世界に先駆けてにおい受容体の機能を電気生理的
に解析することに成功した。本発明はかかる知見に基づ
いてなされたもので、本発明は受容体の機能を解析する
新しい方法及びリガンド分子のスクリーニング法を提供
することを目的とする。におい受容体をはじめとして、
フェロモン受容体とフェロモン分子の関係など、その他
のあらゆる受容体の機能解析とそのリガンド分子のスク
リーニングを提供する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、アデノウイルスベクターを用い
た受容体の機能解析法及びリガンド分子のスクリーニン
グ法である。
めになされた本発明は、アデノウイルスベクターを用い
た受容体の機能解析法及びリガンド分子のスクリーニン
グ法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
体内に存在するある機能分子を発現するアデノウイルス
ベクターを作製し、そのアデノウイルスベクターを用い
てin vivoへの遺伝子導入を行う場合、その機能分子の
発現がアデノウイルスベクター由来なのか、本来生体内
で発現しているものなのかを区別するためには、アデノ
ウイルスのゲノムに対するin situ hybridizationを行
うか、あるいはアデノウイルスベクターで発現させる機
能分子にマーカー遺伝子(green fluorescence protein
等）を融合したタンパク質(fusionprotein)を用いるし
か方法は存在しない。in situ hybridizationを用いた
場合、組織を4%パラフォルムアルデヒドで固定しなけれ
ばならないので電気生理的手法を用いて解析することは
不可能である。fusion proteinを用いる場合、発現させ
る機能分子のC-末端側か、あるいはN-末端側にマーカー
遺伝子を融合させるためマーカー遺伝子が機能分子の作
用を阻害する可能性がある。特に、当該におい受容体の
機能を解析するためには、電気生理的解析が不可欠であ
り、におい受容体の機能が未知であるため、fusion pro
tein 法を採用することはできない。そこで、IRES (int
ernal ribosome entry site)を用いることによって、同
時に複数のタンパク質を発現させることができるアデノ
ウイルスベクター系を開発した。
体内に存在するある機能分子を発現するアデノウイルス
ベクターを作製し、そのアデノウイルスベクターを用い
てin vivoへの遺伝子導入を行う場合、その機能分子の
発現がアデノウイルスベクター由来なのか、本来生体内
で発現しているものなのかを区別するためには、アデノ
ウイルスのゲノムに対するin situ hybridizationを行
うか、あるいはアデノウイルスベクターで発現させる機
能分子にマーカー遺伝子(green fluorescence protein
等）を融合したタンパク質(fusionprotein)を用いるし
か方法は存在しない。in situ hybridizationを用いた
場合、組織を4%パラフォルムアルデヒドで固定しなけれ
ばならないので電気生理的手法を用いて解析することは
不可能である。fusion proteinを用いる場合、発現させ
る機能分子のC-末端側か、あるいはN-末端側にマーカー
遺伝子を融合させるためマーカー遺伝子が機能分子の作
用を阻害する可能性がある。特に、当該におい受容体の
機能を解析するためには、電気生理的解析が不可欠であ
り、におい受容体の機能が未知であるため、fusion pro
tein 法を採用することはできない。そこで、IRES (int
ernal ribosome entry site)を用いることによって、同
時に複数のタンパク質を発現させることができるアデノ
ウイルスベクター系を開発した。
【０００７】におい受容体サブファミリーの１つである
I7 におい受容体とgreen fluorescence protein (GFP)
をそれぞれ過剰に発現させるアデノウイルスベクター
（AdexCAG-I7-IRES-GFP、図1)を作製した。GFPは蛍光を
発するタンパク質であり、その蛍光を観察することによ
ってアデノウイルスベクターによって導入された遺伝子
の発現を確認することができた。また、GFPの蛍光は組
織を固定することなく観察できるので電気生理的手法を
用いた解析が可能となった。
I7 におい受容体とgreen fluorescence protein (GFP)
をそれぞれ過剰に発現させるアデノウイルスベクター
（AdexCAG-I7-IRES-GFP、図1)を作製した。GFPは蛍光を
発するタンパク質であり、その蛍光を観察することによ
ってアデノウイルスベクターによって導入された遺伝子
の発現を確認することができた。また、GFPの蛍光は組
織を固定することなく観察できるので電気生理的手法を
用いた解析が可能となった。
【０００８】AdexCAG-I7-IRES-GFPをラットの嗅上皮に
感染させ、１週間後にGFPで蛍光を発している部分に電
極を置き、74種類のにおい分子を供給し電気生理的反応
を計測した（図２)。アデノウイルスベクター（AdexCAG
-I7-IRES-GFP)を嗅上皮へ感染させたところ、嗅上皮上
の約30%の領域でGFPによる蛍光が観察できた。アデノウ
イルスベクターを感染させた嗅上皮から凍結切片を作製
したところ、主に嗅神経にGFPが発現していることが確
認された。また、アデノウイルスベクター感染後の嗅上
皮からRNAを回収し、I7 におい受容体に対するプローブ
を用いて、ノーザン・ハイブリダイゼーションを行った
ところ、I7 におい受容体のmRNAの発現量が有意に上昇
していることが確認できた。
感染させ、１週間後にGFPで蛍光を発している部分に電
極を置き、74種類のにおい分子を供給し電気生理的反応
を計測した（図２)。アデノウイルスベクター（AdexCAG
-I7-IRES-GFP)を嗅上皮へ感染させたところ、嗅上皮上
の約30%の領域でGFPによる蛍光が観察できた。アデノウ
イルスベクターを感染させた嗅上皮から凍結切片を作製
したところ、主に嗅神経にGFPが発現していることが確
認された。また、アデノウイルスベクター感染後の嗅上
皮からRNAを回収し、I7 におい受容体に対するプローブ
を用いて、ノーザン・ハイブリダイゼーションを行った
ところ、I7 におい受容体のmRNAの発現量が有意に上昇
していることが確認できた。
【０００９】図２に示したような装置を使用し、におい
分子に対する反応を電気生理的手法を用いて計測した。
７４種類のにおい分子に対する電気生理的反応を計測し
たところ、ある特定のにおい分子に対して特異的な電気
生理的反応を示した。図３に７４種類のにおい分子に対
する電気生理的反応の中から、主だったもの９種類を示
した。アデノウイルスベクター（AdexCAG-I7-IRES-GFP)
による遺伝子導入前後で、オクタナール(オクチルアル
デヒド)に対しての電気生理的反応が特異的に増加して
いる。
分子に対する反応を電気生理的手法を用いて計測した。
７４種類のにおい分子に対する電気生理的反応を計測し
たところ、ある特定のにおい分子に対して特異的な電気
生理的反応を示した。図３に７４種類のにおい分子に対
する電気生理的反応の中から、主だったもの９種類を示
した。アデノウイルスベクター（AdexCAG-I7-IRES-GFP)
による遺伝子導入前後で、オクタナール(オクチルアル
デヒド)に対しての電気生理的反応が特異的に増加して
いる。
【００１０】図４では、アデノウイルスベクター（Adex
CAG-I7-IRES-GFP)感染前後の電気生理的反応性の比率を
示した。オクタナール以外はアデノウイルスベクター感
染前後で、1.7倍の差が生じた。白抜きの棒グラフはGFP
を発現するアデノウイルスベクターを嗅上皮に感染させ
た場合の電気生理的反応性を示している。炭素数の異な
るアルデヒドをにおい分子として与え、それぞれの電気
生理的反応を計測した（図５)。アデノウイルスベクタ
ー（AdexCAG-I7-IRES-GFP)を感染させた嗅上皮は、側鎖
の炭素数が８個のアルデヒド（オクタナール)をにおい
分子として用いたときに、最も高い電気生理的反応を示
した。
CAG-I7-IRES-GFP)感染前後の電気生理的反応性の比率を
示した。オクタナール以外はアデノウイルスベクター感
染前後で、1.7倍の差が生じた。白抜きの棒グラフはGFP
を発現するアデノウイルスベクターを嗅上皮に感染させ
た場合の電気生理的反応性を示している。炭素数の異な
るアルデヒドをにおい分子として与え、それぞれの電気
生理的反応を計測した（図５)。アデノウイルスベクタ
ー（AdexCAG-I7-IRES-GFP)を感染させた嗅上皮は、側鎖
の炭素数が８個のアルデヒド（オクタナール)をにおい
分子として用いたときに、最も高い電気生理的反応を示
した。
【００１１】本発明者は、アデノウイルスベクター（Ad
exCAG-I7-IRES-GFP)を用いて嗅神経に遺伝子を導入し、
I7 におい受容体とgreen fluorescence protein (GFP)
をそれぞれ単独に発現させることに成功した。嗅上皮に
GFPを過剰に発現させただけではにおい分子に対して電
気生理的反応は変化は見られなかった（図４）。ゆえ
に、アルデヒドに対する電気生理反応は、I7 におい受
容体の機能による反応であることを明らかにした。ま
た、I7 におい受容体は、におい分子のアルデヒド基の
みを認識しているのではなく、直鎖上の炭素数をも含め
たにおい分子の構造を認識して、電気生理的反応を呈示
することを明らかにした。つまり、これらの結果は、従
来、アフリカツメガエルの卵母細胞あるいは線維芽細胞
では実現できなかった新たな知見である。
exCAG-I7-IRES-GFP)を用いて嗅神経に遺伝子を導入し、
I7 におい受容体とgreen fluorescence protein (GFP)
をそれぞれ単独に発現させることに成功した。嗅上皮に
GFPを過剰に発現させただけではにおい分子に対して電
気生理的反応は変化は見られなかった（図４）。ゆえ
に、アルデヒドに対する電気生理反応は、I7 におい受
容体の機能による反応であることを明らかにした。ま
た、I7 におい受容体は、におい分子のアルデヒド基の
みを認識しているのではなく、直鎖上の炭素数をも含め
たにおい分子の構造を認識して、電気生理的反応を呈示
することを明らかにした。つまり、これらの結果は、従
来、アフリカツメガエルの卵母細胞あるいは線維芽細胞
では実現できなかった新たな知見である。
【００１２】本発明に係る技術は、におい受容体とにお
い分子に限らず、あらゆる受容体とそのリガンド分子の
機能解析及び受容体を利用したリガンド分子のスクリー
ニングに応用される。
い分子に限らず、あらゆる受容体とそのリガンド分子の
機能解析及び受容体を利用したリガンド分子のスクリー
ニングに応用される。
【００１３】
【実施例】以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に
説明するが、本発明は実施例に限定されるものではな
い。 実施例１組換えアデノウイルスベクターの構築 作製した組換えアデノウイルスは、アデノウイルスのE1
AならびにE1Bを除き、非複製型ウイルスベクターとなる
ように設計した。ゆえに、組換えアデノウイルスは細胞
に感染して遺伝子の導入を行うが、細胞内で増殖するこ
とはなかった。CAGプロモターによってmRNAはOR-I7-IRE
S-GFP（図１）とひとつづきになって転写されるが、IRE
Sの立体構造（ヘアピンループ）を認識してribosomeがI
RESに結合し、IRESより下流の遺伝子をタンパク質へと
翻訳した。よって、OR-I7とGFPはそれぞれ単独で翻訳さ
れることが判明した。なお、図中の略号は以下のとおり
である。 CAG: 非常に強力な転写活性を有するプロモーター OR-I7: I7 odorant receptor IRES: internal ribosome entry site GFP: green fluorescence protein GpA: poly A additional signal
説明するが、本発明は実施例に限定されるものではな
い。 実施例１組換えアデノウイルスベクターの構築 作製した組換えアデノウイルスは、アデノウイルスのE1
AならびにE1Bを除き、非複製型ウイルスベクターとなる
ように設計した。ゆえに、組換えアデノウイルスは細胞
に感染して遺伝子の導入を行うが、細胞内で増殖するこ
とはなかった。CAGプロモターによってmRNAはOR-I7-IRE
S-GFP（図１）とひとつづきになって転写されるが、IRE
Sの立体構造（ヘアピンループ）を認識してribosomeがI
RESに結合し、IRESより下流の遺伝子をタンパク質へと
翻訳した。よって、OR-I7とGFPはそれぞれ単独で翻訳さ
れることが判明した。なお、図中の略号は以下のとおり
である。 CAG: 非常に強力な転写活性を有するプロモーター OR-I7: I7 odorant receptor IRES: internal ribosome entry site GFP: green fluorescence protein GpA: poly A additional signal
【００１４】実施例２におい分子に対する反応を電気生理的に計測する方法の
確立及びその結果 精製組換えアデノウイルスAdexCAG-I7-IRES-GFPを含有
する緩衝液30μl（力価は3x109 pfu/ml)を麻酔下でラッ
トの鼻腔に接種した。ラットは３−８日後に屠殺し、鼻
腔を開口した。蛍光照射によってGFPは容易に観察で
き、ウイルス感染とタンパク質の発現のパターンは確認
できた。感覚神経の１−２％が感染していてGFP gene p
roductが発現していた。I7 におい受容体とGFPのbicist
ronic mRNAの発現は感染上皮のノーザンブロットで確認
された。I7 遺伝子の全配列のプローブを使用すること
によって感染上皮には3kbの単一バンドが確認された
が、非感染上皮では認められなかった。このことから感
染上皮ではI7 におい受容体が発現していることが容易
に想像できる。におい分子をそれぞれ10-2から10-3 Mの
濃度で調製して実験に供した。におい分子の供給とEOG
(Electro-olfactogram) 記録法は図２に示した。におい
分子を湿潤空気(humidified air)に注入して感覚上皮に
与えた。当該条件下ではその組織は３時間まで生存し、
30-50個のにおい分子に対する反応を測定することが可
能であった。
確立及びその結果 精製組換えアデノウイルスAdexCAG-I7-IRES-GFPを含有
する緩衝液30μl（力価は3x109 pfu/ml)を麻酔下でラッ
トの鼻腔に接種した。ラットは３−８日後に屠殺し、鼻
腔を開口した。蛍光照射によってGFPは容易に観察で
き、ウイルス感染とタンパク質の発現のパターンは確認
できた。感覚神経の１−２％が感染していてGFP gene p
roductが発現していた。I7 におい受容体とGFPのbicist
ronic mRNAの発現は感染上皮のノーザンブロットで確認
された。I7 遺伝子の全配列のプローブを使用すること
によって感染上皮には3kbの単一バンドが確認された
が、非感染上皮では認められなかった。このことから感
染上皮ではI7 におい受容体が発現していることが容易
に想像できる。におい分子をそれぞれ10-2から10-3 Mの
濃度で調製して実験に供した。におい分子の供給とEOG
(Electro-olfactogram) 記録法は図２に示した。におい
分子を湿潤空気(humidified air)に注入して感覚上皮に
与えた。当該条件下ではその組織は３時間まで生存し、
30-50個のにおい分子に対する反応を測定することが可
能であった。
【００１５】７４種類のにおい分子に対する電気生理的
反応の中から、主だった９種類を示した（図３)。最上
段がアデノウイルスベクター（AdexCAG-I7-IRES-GFP)を
感染させていない状態でのにおい分子に対する電気生理
的反応を示し、中段がアデノウイルスベクター（AdexCA
G-I7-IRES-GFP)を感染させた後のにおい分子に対する電
気生理的反応で、最下段が最上段と中段の差し引きを意
味する。アデノウイルスベクター(AdexCAG-I7-IRES-GF
P)による遺伝子導入前後で、オクタナールに対しての電
気生理的反応が特異的に増加している。
反応の中から、主だった９種類を示した（図３)。最上
段がアデノウイルスベクター（AdexCAG-I7-IRES-GFP)を
感染させていない状態でのにおい分子に対する電気生理
的反応を示し、中段がアデノウイルスベクター（AdexCA
G-I7-IRES-GFP)を感染させた後のにおい分子に対する電
気生理的反応で、最下段が最上段と中段の差し引きを意
味する。アデノウイルスベクター(AdexCAG-I7-IRES-GF
P)による遺伝子導入前後で、オクタナールに対しての電
気生理的反応が特異的に増加している。
【００１６】実施例３におい分子に対する電気生理的反応の解析 アデノウイルスベクター(AdexCAG-I7-IRES-GFP)を感染
させていない状態での電気生理的反応性を1.0とした場
合(非感染)と、感染後の電気生理的反応性(I7感染)の比
を棒グラフで示した（図４）。オクタナール以外は非感
染とI7 感染で有意な差がないのに対して、オクタナー
ルではアデノウイルスベクター感染前後で、1.7倍の差
が生じた。図４のAdexGFP infectedの棒グラフは、GFP
を発現するアデノウイルスベクターを嗅上皮に感染させ
た場合の電気生理的反応を示している。嗅上皮にGFPを
過剰に発現させただけでは、におい分子に対する電気生
理反応性は変化しなかった。
させていない状態での電気生理的反応性を1.0とした場
合(非感染)と、感染後の電気生理的反応性(I7感染)の比
を棒グラフで示した（図４）。オクタナール以外は非感
染とI7 感染で有意な差がないのに対して、オクタナー
ルではアデノウイルスベクター感染前後で、1.7倍の差
が生じた。図４のAdexGFP infectedの棒グラフは、GFP
を発現するアデノウイルスベクターを嗅上皮に感染させ
た場合の電気生理的反応を示している。嗅上皮にGFPを
過剰に発現させただけでは、におい分子に対する電気生
理反応性は変化しなかった。
【００１７】実施例４におい分子の炭素数と電気生理的反応の解析 I7 におい受容体がにおい分子のどの構造を認識して電
気生理的反応を示すのかを解析するために、直鎖状の炭
素数の異なるアルデヒドをにおい分子として与え、それ
ぞれの電気生理的反応を計測した（図５）。I7 におい
受容体はにおい分子のアルデヒド基のみを認識している
だけでなく、直鎖状の炭素数も含めたにおい分子の構造
を認識して反応を示していることが判明した。
気生理的反応を示すのかを解析するために、直鎖状の炭
素数の異なるアルデヒドをにおい分子として与え、それ
ぞれの電気生理的反応を計測した（図５）。I7 におい
受容体はにおい分子のアルデヒド基のみを認識している
だけでなく、直鎖状の炭素数も含めたにおい分子の構造
を認識して反応を示していることが判明した。
【００１８】
【発明の効果】以上のように、本発明においては、組織
に複数の蛋白質を発現することができるアデノウイルス
ベクターが使用されており、組織に簡便且つ確実に受容
体などを導入することができる。従って、本発明によれ
ば、種々の受容体の機能解析及びそのリガンド分子のス
クリーニングを行うことができる。
に複数の蛋白質を発現することができるアデノウイルス
ベクターが使用されており、組織に簡便且つ確実に受容
体などを導入することができる。従って、本発明によれ
ば、種々の受容体の機能解析及びそのリガンド分子のス
クリーニングを行うことができる。
【図１】アデノウイルスベクター (AdexCAG-I7-IRES-GF
P)の構造を示す図である。
P)の構造を示す図である。
【図２】におい分子に対する反応を電気生理的に計測す
る方法を示す図である。
る方法を示す図である。
【図３】におい分子に対する反応を電気生理的に計測し
た結果を示す図である。
た結果を示す図である。
【図４】におい分子に対する電気生理的反応性の比率を
示す図である。
示す図である。
【図５】におい分子の炭素数と電気生理的反応の関係を
示す図である。
示す図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 アデノウイルスベクターを用いた受容体
の機能解析法及びリガンド分子のスクリーニング法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1484098A JPH11196870A (ja) | 1998-01-08 | 1998-01-08 | 受容体の機能解析法及びリガンド分子のスクリーニング法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1484098A JPH11196870A (ja) | 1998-01-08 | 1998-01-08 | 受容体の機能解析法及びリガンド分子のスクリーニング法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11196870A true JPH11196870A (ja) | 1999-07-27 |
Family
ID=11872244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1484098A Pending JPH11196870A (ja) | 1998-01-08 | 1998-01-08 | 受容体の機能解析法及びリガンド分子のスクリーニング法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11196870A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002002009A1 (en) * | 2000-07-05 | 2002-01-10 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Apparatus and method for screening, olfactory mucosa stimulating compound found by the screening method, and therapeutic apparatus and electrode section for measurement |
| EP1416971A4 (en) * | 1999-08-16 | 2004-05-12 | Uab Research Foundation | GENTRANSFER PRESENTATION AND THEIR USE |
| JP2008503201A (ja) * | 2003-11-21 | 2008-02-07 | アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 嗅覚ｇｐｃｒを産生するための方法 |
| WO2015199247A1 (ja) * | 2014-06-27 | 2015-12-30 | 日本たばこ産業株式会社 | 気分障害を診断、治療又は予防する方法 |
| US10487118B2 (en) | 2007-09-27 | 2019-11-26 | Virus Ikagaku Kenkyusho Inc. | Factor involved in latent infection with herpes virus, and use thereof |
| US10539578B2 (en) | 2015-12-28 | 2020-01-21 | Japan Tobacco Inc. | Method for diagnosing, treating, or preventing mood disorders |
-
1998
- 1998-01-08 JP JP1484098A patent/JPH11196870A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1416971A4 (en) * | 1999-08-16 | 2004-05-12 | Uab Research Foundation | GENTRANSFER PRESENTATION AND THEIR USE |
| WO2002002009A1 (en) * | 2000-07-05 | 2002-01-10 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Apparatus and method for screening, olfactory mucosa stimulating compound found by the screening method, and therapeutic apparatus and electrode section for measurement |
| JP3705546B2 (ja) * | 2000-07-05 | 2005-10-12 | 松下電器産業株式会社 | 嗅粘膜刺激性化合物スクリーニング装置及び方法 |
| US6994671B2 (en) | 2000-07-05 | 2006-02-07 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Apparatus and method for screening, olfactory mucosa stimulating compound found by the screening method, and therapeutic apparatus and electrode section for measurement |
| JP2008503201A (ja) * | 2003-11-21 | 2008-02-07 | アリーナ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | 嗅覚ｇｐｃｒを産生するための方法 |
| US10487118B2 (en) | 2007-09-27 | 2019-11-26 | Virus Ikagaku Kenkyusho Inc. | Factor involved in latent infection with herpes virus, and use thereof |
| WO2015199247A1 (ja) * | 2014-06-27 | 2015-12-30 | 日本たばこ産業株式会社 | 気分障害を診断、治療又は予防する方法 |
| US10067142B2 (en) | 2014-06-27 | 2018-09-04 | Japan Tobacco Inc. | Method for diagnosing, treating, or preventing mood disorder |
| JP2020031651A (ja) * | 2014-06-27 | 2020-03-05 | 日本たばこ産業株式会社 | 気分障害を診断、治療又は予防する方法 |
| US10539578B2 (en) | 2015-12-28 | 2020-01-21 | Japan Tobacco Inc. | Method for diagnosing, treating, or preventing mood disorders |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Oulad‐Abdelghani et al. | Meis2, a novel mouse Pbx‐related homeobox gene induced by retinoic acid during differentiation of P19 embryonal carcinoma cells | |
| Anderson et al. | Differential origins of neocortical projection and local circuit neurons: role of Dlx genes in neocortical interneuronogenesis | |
| US12097268B2 (en) | Modulation of neural pathways | |
| Mazzarella et al. | ERp99, an abundant, conserved glycoprotein of the endoplasmic reticulum, is homologous to the 90-kDa heat shock protein (hsp90) and the 94-kDa glucose regulated protein (GRP94). | |
| EP0527806B1 (en) | Epithelins: novel cysteine - rich growth modulating proteins | |
| Isbrandt et al. | Identification and functional characterization of a novel KCNE2 (MiRP1) mutation that alters HERG channel kinetics | |
| Ivic et al. | Adenoviral vector-mediated rescue of the OMP-null phenotype in vivo | |
| US20100124740A1 (en) | Somatic transfer of modified genes to predict drug effects | |
| Ling et al. | Assembly and annotation of human chromosome 2q33 sequence containing the CD28, CTLA4, and ICOS gene cluster: analysis by computational, comparative, and microarray approaches | |
| JP2005512515A5 (ja) | ||
| Pilpel et al. | Rapid, reproducible transduction of select forebrain regions by targeted recombinant virus injection into the neonatal mouse brain | |
| JP7706771B2 (ja) | 選択的スプライシングを使用して遺伝子療法の特異性を制御するための組成物および方法 | |
| Lundstrom | Alphaviruses as tools in neurobiology and gene therapy | |
| JPH11196870A (ja) | 受容体の機能解析法及びリガンド分子のスクリーニング法 | |
| Williamson et al. | Neurofilaments, radial growth of axons, and mechanisms of motor neuron disease | |
| Leingärtner et al. | Cloning and cortical expression of rat Emx2 and adenovirus-mediated overexpression to assess its regulation of area-specific targeting of thalamocortical axons | |
| JP2005528080A5 (ja) | ||
| JP2003533184A (ja) | レチノイン酸レセプターβ２、そのアンタゴニスト、および神経障害治療用の遺伝子治療ベクター | |
| JP2003514549A5 (ja) | ||
| WO2002072768A2 (en) | ISOGENIC ss-CATENIN CELL LINES, AND METHODS OF MAKING AND USING SAME | |
| US6770444B2 (en) | Methods of identifying or screening for agents that binds the Ob-Re | |
| WO1999023880A1 (en) | Somatic transfer of modified genes to predict drug effects | |
| Kuo et al. | Determination of a Necdin cis-Acting Element Required for Neuron-Specific Expression by Using Zebra Fish | |
| AU2003215015A1 (en) | Recombinant expression vectors for functional nav1.9 sodium channels | |
| Cheng et al. | GABAC ρ1 subunits form functional receptors but not functional synapses in hippocampal neurons |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050107 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050407 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071031 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20080321 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |