JPH11196880A - 変異型ｌｏｘＰ配列とその応用 - Google Patents

変異型ｌｏｘＰ配列とその応用

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JPH11196880A JP10273150A JP27315098A JPH11196880A JP H11196880 A JPH11196880 A JP H11196880A JP 10273150 A JP10273150 A JP 10273150A JP 27315098 A JP27315098 A JP 27315098A JP H11196880 A JPH11196880 A JP H11196880A
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】以下の性質をもつ変異型loxP配列。 （ａ）大腸菌P1ファージ由来の下記の野生型loxP配列に
おいて、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目
（Ｔ）、３番目（Ｇ）、４番目（Ｔ）又は５番目（Ａ）
の塩基のうち少なくとも一つの塩基及び６番目（Ｔ）又
は７番目（Ｇ）の塩基のうち少なくとも一方の塩基が異
なる塩基に置換され、スペーサー領域以外の領域は任意
の塩基に置換されていてもよい配列からなり、 【化１】 （ｂ）リコンビナーゼCreの存在下でも野生型loxP配列
との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらず、（ｃ）リ
コンビナーゼCreの存在下、同一の配列を有するもう一
つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が
起こる。 【効果】本発明の変異型loxP配列を用いることによっ
て、動物細胞をはじめとする高等真核細胞で、効率の高
い遺伝子挿入もしくは遺伝子置換を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は変異型loxP配列とそ
の応用に関する。さらに詳しくは、野生型loxP配列とは
特異的組換え反応は起こさないが変異型どうしでは特異
的組換え反応を起こす変異型loxP配列と、該変異型loxP
配列を用いた遺伝子の置換方法に関する。
【0002】
【従来の技術】動物ウイルスや高等真核細胞である動物
細胞の染色体の特定の部位に、任意の遺伝子を挿入する
こと、あるいは特定の遺伝子を欠如させることは容易で
はない。例えば、動物細胞の染色体の特定の部位に遺伝
子を挿入する方法として一般に行われているのは、目的
遺伝子を挿入したい染色体の部位と同じ配列のDNAを目
的遺伝子の両側に結合したプラスミドDNA等で細胞を形
質転換し、相同組換えにより目的遺伝子が挿入された細
胞を得る方法である。しかし、相同組換えの頻度は著し
く低く、そのために目的遺伝子とともに薬剤耐性遺伝子
等を同時に組み込み、薬剤による選択を行う必要があ
り、目的の細胞を得るまでに数ヶ月を要する。また、目
的遺伝子を挿入した組換え動物ウイルスの作製は、前述
の細胞染色体の場合より多少簡便であるが、それでも例
えば組換えアデノウイルスを作製する場合、目的の遺伝
子を挿入したプラスミド等を用いて相同組換えを行い、
その後組換えウイルスのクローン化ならびに選抜及び増
殖をさせる必要がある（Bett et al., Proc.Natl.Acad.
Sci., Vol. 91, 8802-8806(1994)、Miyake et al., Pro
c.Natl.Acad.Sci., Vol. 93, 1320-1324(1996)）。
【0003】このように動物細胞の染色体の特定の部位の遺
伝子操作や組換えウイルス作製が困難な原因の一つは、
頻度の低い相同組換えを用いているからである。これに
対し、プラスミドやバクテリオファージの作製に用いる
制限酵素のように、DNA配列を特異的に認識する酵素を
用いることができれば、効率の向上が期待できる。その
ような酵素の例として大腸菌のバクテリオファージP1由
来のリコンビナーゼCreが挙げられる。
【0004】Creは、特定の塩基配列（loxP配列）を認識
し、この配列間でDNA鎖の切断、鎖の交換と結合の全行
程を行う特異的なDNA組換え酵素である（Sternberg et
al.,J. Mol. Biol., Vol. 150, 467-486(1981)、Abrems
ki et al., J. Biol. Chem., Vol. 259, 1509-1514(198
4)、Hoess et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.81,1026
-1029(1984)）。すなわち、同一DNA分子上に同方向の２
つのloxP配列が存在する場合は、その間に挟まれたDNA
配列が切り出されて環状分子となり（切り出し反応）、
またその逆に、異なるDNA分子上に２つのloxP配列が存
在し、その一方が環状DNAである場合は、loxP配列を介
して環状DNAが他方のDNA分子上に挿入される（挿入反
応）。Cre及びloxP配列はバクテリオファージで発見さ
れたが、特異的なDNA組換え反応は、前核細胞だけでな
く真核細胞である動物細胞や動物ウイルスでも機能する
ことが知られており、切り出し反応の例としては、動物
培養細胞（Sauer et al., Nucleic Acids Res., Vol.1
7, 147-161(1989)、Kanegaeet al., Gene, Vol.181, 20
7-212(1996)）、動物ウイルス（Sauer et al., Proc.Na
tl.Acad.Sci., Vol.85, 5166-5170(1988)、Anton et a
l., J. Virol., Vol.69, 4600-4606(1995)、Kanegae et
al., Nucleic Acids Res., Vol.23, 3816-3821(199
5)）、トランスジェニックマウス（Lakso et al., Pro
c.Natl.Acad.Sci.,Vol.89, 6232-6236(1992)、Orban et
al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol.89, 6861-6865(199
2)、Gu et al., Cell, Vol. 73, 1155-1164(1993)、Gu
et al., Science, Vol. 265, 103-106(1994)）等が挙げ
られる。
【0005】一方、挿入反応を利用すれば、loxP配列が既に
存在する動物細胞の染色体やウイルスゲノムに、任意の
遺伝子を挿入することが可能であるが、その頻度は極め
て低く（Fukushige et al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vo
l.89, 7905-7909(1992)、Sauer et al., Proc.Natl.Aca
d.Sci., Vol.84, 9108-9112(1987)）、実用的でない。
なぜならば、挿入反応と切り出し反応は可逆的であり、
挿入反応により同一DNA分子上に２つのloxP配列が存在
すると、ただちに切り出し反応も起こり、しかも反応の
平衡は圧倒的に切り出し反応側に偏るからである。
【0006】この挿入反応の頻度を上げるため、本来のloxP
配列（野生型）の塩基配列とは異なる配列のloxP配列
（変異型）を用いた試みが行われた。loxP配列は34塩基
のDNA配列から成り、２つの13塩基の逆方向反復配列（i
nverted repeat）に挟まれた8塩基の配列はスペーサー
領域と呼ばれ、DNA鎖の組換えはスペーサー領域で行わ
れることが知られている（Hoess et al., J. Mol. Bio
l., Vol. 181, 351-362(1985)）。
【化３】 このスペーサー領域の塩基の７番目の塩基をＧ（グアニ
ン）からＡ（アデニン）に置換したloxP配列（変異型lo
xP配列）は、野生型loxP配列との間では特異的DNA組換
え反応が起きないが、２つの変異型loxP配列間では特異
的DNA組換え反応が起きることが示された（Hoess et a
l., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(198
6)）。
【0007】また、あるDNA分子の変異型loxP配列と野生型l
oxP配列との間に存在する遺伝子を、他のDNA分子上に存
在する変異型loxP配列と野生型loxP配列との間に挿入あ
るいは置換する試みが行われた。その例として、プラス
ミドベクター上の遺伝子のバクテリオファージ上の遺伝
子との置換（Waterhouse et al., Nucleic Acids Res.,
Vol.21, 2265-2266(1993)）、ファージミドベクター上
の遺伝子のプラスミドベクターへの挿入（Tsurushita e
t al., Gene, Vol.172, 59-63(1996)）、プラスミドベ
クター上の遺伝子の動物細胞染色体上の遺伝子との置換
（Bethkeet al., Nucleic Acids Res., Vol.25, 2828-2
834(1997)）などが挙げられる。
【0008】しかしながら、これらの試みはただ１種類の変
異型loxP配列、すなわちスペーサー領域の塩基の７番目
の塩基をＧ（グアニン）からＡ（アデニン）に置換した
loxP配列（変異型loxP配列）のみを用いて行われてお
り、該配列の変異型loxP配列が野生型loxP配列との間で
組換え反応を起こさないために好適であるかどうか明ら
かではない。さらに、上記３件の試みは、全て薬剤耐性
遺伝子そのものか、あるいは目的遺伝子とともに薬剤耐
性遺伝子を挿入し、目的の組換えが生じたDNA分子を有
する組換え体のみが薬剤耐性を獲得し増幅されるという
実験系が用いられているので、loxP配列の変異が不十分
で野生型loxP配列と反応が起き、実際の遺伝子挿入（遺
伝子置換）の効率が低下していても、薬剤選択というバ
イアスがかかっているため、見かけ上の反応効率は高く
表示されている可能性がある。
【0009】実際、本発明者らが考案した直接的かつ定量的
な測定方法では、７番目の塩基をＧからＡに置換した変
異型loxP配列は、約5%の頻度で野生型loxP配列との間で
組換え反応が起こり、loxP配列の変異が不十分であるこ
とが確認された。
【0010】このように、従来の技術では変異型loxP配列と
野生型loxP配列とを用い、動物細胞の染色体に存在する
遺伝子置換を行う技術が考案されてはいるが、その効率
は十分ではなかった。
【0011】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、リコ
ンビナーゼＣｒｅの存在下、野生型loxP配列とは組換え
反応が起きず、かつ同一配列の２つの変異型loxP配列間
での組換え反応は２つの野生型loxP配列間と同程度の効
率で起こる変異型loxP配列を提供することである。さら
に本発明の目的は、野生型loxP配列と変異型loxP配列、
もしくは異なる配列の変異型loxP配列の組み合わせによ
り、動物細胞をはじめとする高等真核細胞で、効率の高
い遺伝子挿入もしくは遺伝子置換を行う方法を提供し、
その方法を動植物細胞への遺伝子導入、組換えウイルス
作製、動植物個体での遺伝子操作などに応用することに
ある。
【0012】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、loxP配列
のスペーサー領域の8塩基全てについて可能な１塩基置
換の変異型loxP配列を作製し、非常に鋭敏な測定方法で
反応性を試験することにより、２つのloxP配列間でのリ
コンビナーゼＣｒｅ依存組換え反応の機構を研究し、反
応に必須の塩基配列を見出した。かかる知見に基づき、
同一配列の２つの変異型loxP配列間では、２つの野生型
loxP配列間と同程度の効率で組換え反応が起きるが、野
生型loxP配列もしくは異なる配列の変異型loxP配列とは
組換え反応が起こらない変異型loxP配列を見出した。さ
らに、これらのloxP配列を組み合わせることにより、動
物細胞の染色体に非常に高い効率で遺伝子を挿入するこ
とに成功した。本発明は、かかる知見に基づいて、さら
に研究を進めて完成するに至ったものである。
【0013】すなわち、本発明の要旨は、次のとおりであ
る； （１）以下の性質をもつ変異型loxP配列。 （ａ）大腸菌P1ファージ由来の下記の野生型loxP配列に
おいて、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目
（Ｔ）、３番目（Ｇ）、４番目（Ｔ）又は５番目（Ａ）
の塩基のうち少なくとも一つの塩基及び６番目（Ｔ）又
は７番目（Ｇ）の塩基のうち少なくとも一方の塩基が異
なる塩基に置換され、スペーサー領域以外の領域は任意
の塩基に置換されていてもよい配列からなり、
【化４】 （ｂ）リコンビナーゼＣｒｅの存在下でも野生型loxP配
列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらず、（ｃ）
リコンビナーゼＣｒｅの存在下、同一の配列を有するも
う一つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反
応が起こる； （２）以下の性質をもつ変異型loxP配列。 （ａ）大腸菌P1ファージ由来の下記の野生型loxP配列に
おいて、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目
（Ｔ）、３番目（Ｇ）及び４番目（Ｔ）の塩基から選ば
れる一つの塩基が異なる塩基に置換され、スペーサー領
域以外の領域は任意の塩基に置換されていてもよい配列
からなり、
【化５】 （ｂ）リコンビナーゼＣｒｅの存在下でも野生型loxP配
列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらず、（ｃ）
リコンビナーゼＣｒｅの存在下、同一の配列を有するも
う一つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反
応が起こる； （３）リコンビナーゼＣｒｅの存在下でも異なる配列を
有するもう一つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ
組換え反応が起こらない、上記（１）又は（２）記載の
変異型loxP配列； （４）配列番号：２６、配列番号：２９、配列番号：３
０、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番号：４２
又は配列番号：４９で表される配列である上記（１）記
載の変異型loxP配列； （５）上記（１）ないし（４）いずれかに記載の変異型
loxP配列を有するＤＮＡ； （６）少なくとも一つの野生型loxP配列及び上記（１）
又は（２）記載の変異型loxP配列を少なくとも一つ有す
るＤＮＡ； （７）野生型loxP配列と変異型loxP配列の間に所望の遺
伝子が挿入された上記（６）記載のＤＮＡ； （８）互いに異なる配列をもつ少なくとも２つの上記
（３）記載の変異型loxP配列を有するＤＮＡ； （９）互いに異なる配列をもつ２つの変異型loxP配列の
間に所望の遺伝子が挿入された上記（８）記載のＤＮ
Ａ； （１０）上記（６）ないし（９）いずれかに記載のＤＮ
Ａによって形質転換された細胞； （１１）下記のＤＮＡ（ａ）及びＤＮＡ（ｂ）をリコン
ビナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、下記のＤＮＡ
（ｃ）を得ることからなる遺伝子置換方法。 （ａ）野生型loxP配列、遺伝子Ａ及び上記（１）又は
（２）記載の変異型loxP配列をこの順に有するＤＮＡ。 （ｂ）野生型loxP配列、遺伝子Ｂ及びＤＮＡ（ａ）と同
じ変異型loxP配列をこの順に有する環状ＤＮＡ。 （ｃ）ＤＮＡ（ａ）において遺伝子Ａが遺伝子Ｂに置換
されたＤＮＡ。 ここで、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺
伝子である； （１２）下記のＤＮＡ（ａ）及びＤＮＡ（ｂ）をリコン
ビナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、下記のＤＮＡ
（ｃ）を得ることからなる遺伝子置換方法。 （ａ）互いに異なる配列をもつ２つの上記（３）記載の
変異型loxP配列（変異型loxP配列１及び変異型loxP配列
２）及び遺伝子Ａを変異型loxP配列１／遺伝子Ａ／変異
型loxP配列２の順に有するＤＮＡ。 （ｂ）変異型loxP配列１、遺伝子Ｂ及び変異型loxP配列
２をこの順に有する環状ＤＮＡ。 （ｃ）ＤＮＡ（ａ）において遺伝子Ａが遺伝子Ｂに置換
されたＤＮＡ。 ここで、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺
伝子である； （１３）遺伝子Ｂが機能的な遺伝子ではないことを特徴
とする上記（１１）又は （１２）記載の方法； （１４）遺伝子Ａが機能的な遺伝子ではないことを特徴
とする上記（１１）又は（１２）記載の方法； （１５）ＤＮＡ（ａ）が細胞の染色体ＤＮＡであり、Ｄ
ＮＡ（ｂ）がプラスミドＤＮＡ又は二本鎖環状ＤＮＡウ
イルスであることを特徴とする上記（１１）ないし（１
４）いずれかに記載の方法； （１６）ＤＮＡ（ａ）が細胞の染色体ＤＮＡであり、Ｄ
ＮＡ（ｂ）が細胞内で変換されることにより二本鎖環状
ＤＮＡとなる性質を有することを特徴とする上記（１
１）ないし（１４）いずれかに記載の方法； （１７）ＤＮＡ（ａ）が二本鎖ＤＮＡウイルスの染色体
ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）がプラスミドＤＮＡ又は二
本鎖環状ＤＮＡウイルスであることを特徴とする上記
（１１）ないし（１４）いずれかに記載の方法； （１８）ＤＮＡ（ａ）が二本鎖ＤＮＡウイルスの染色体
ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）が細胞内で変換されること
により二本鎖環状ＤＮＡとなる性質を有することを特徴
とする上記（１１）ないし（１４）いずれかに記載の方
法； （１９）ＤＮＡ（ａ）の二本鎖ＤＮＡウイルスがアデノ
ウイルスであることを特徴とする上記（１７）又は（１
８）記載の方法； （２０）上記（６）ないし（９）いずれかに記載のＤＮ
Ａを染色体上に有するトランスジェニック動物； （２１）上記（６）ないし（９）いずれかに記載のＤＮ
Ａからなる医薬。
【0014】
【発明の実施の形態】以下に本発明について詳細に説明
する。本発明における変異型loxP配列とは、野生型loxP
配列のスペーサー領域の特定の塩基を本来とは異なる塩
基に置換し、その置換によりリコンビナーゼCreによる
特異的DNA組換え反応における基質特異性が変化する配
列を指し、基質特異性に影響しない他の塩基の置換を含
んでいてもよい。ここにいう基質特異性とは、例えば、
野生型loxP配列、変異型loxP配列１、変異型loxP配列２
の３種類のloxP配列が存在する場合、野生型loxP配列と
変異型loxP配列１、野生型loxP配列と変異型loxP配列
２、変異型loxP配列１と変異型loxP配列２のそれぞれの
組合せでは、Creによる特異的DNA組換え反応が実質的に
起こらないことをいう。本基質特異性の程度は、後述す
る遺伝子置換方法を実施する上で十分であればよい。
【0015】この変異型loxP配列と野生型loxP配列とをあら
かじめ細胞の染色体に組み込んでおき、同じ組み合わせ
の２つのloxP配列の間に任意の遺伝子が存在する環状DN
Aを、リコンビナーゼCreとともに細胞に導入することに
より、まず変異型loxP配列どうし、もしくは野生型loxP
配列どうしによる挿入反応により、loxP配列が４ヶ存在
する中間体が生成し、次いで、挿入反応とは異なる組み
合わせのloxP配列間（挿入反応が野生型loxP配列間であ
れば変異型loxP配列間）で切り出し反応が起こることに
より、環状DNAの変異型loxP配列と野生型loxP配列との
間の任意の遺伝子が、細胞の染色体の変異型loxP配列と
野生型loxP配列との間に挿入される。また、細胞の染色
体の変異型loxP配列と野生型loxP配列との間に別の遺伝
子が存在する場合は、上記反応によりこの遺伝子は染色
体から除かれ、環状DNAに挿入されている遺伝子に置換
される。従って、細胞の染色体に変異型loxP配列と野生
型loxP配列が存在すれば、その部位に任意の遺伝子を効
率よく導入することが可能となる。また、変異型loxP配
列と野生型loxP配列との組み合わせの代わりに、特異的
DNA組換え反応が起こらない２つの変異型loxP配列を用
いることもできる。
【0016】本発明の変異型loxP配列は以下のようにして見
出された。loxP配列の基質特異性が変化した変異型loxP
配列としては、スペーサー領域の塩基の７番目の塩基を
GからAに置換した配列が知られている（Hoess et al.,
Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(1986)）。そ
のアッセイ法では、アンピシリン耐性遺伝子及びカナマ
イシン耐性遺伝子を有するプラスミドのカナマイシン耐
性遺伝子の両側に野生型loxP配列と変異型loxP配列とを
挿入し、得られたプラスミドでCre発現大腸菌を形質転
換した。そして、アンピシリン耐性を獲得した大腸菌を
選別後、カナマイシン耐性の有無（２つのloxP配列間で
組換えが起きるとカナマイシン耐性を失う）で、野生型
loxP配列と変異型loxP配列との間の組換え反応の程度を
判断している。すなわち、１分子のプラスミドでのCre
による組換え反応の結果を何億倍にも増幅し、しかも薬
剤による選択を行っているため、実際の組換え反応をど
の程度反映しているかは明らかではない。
【0017】そこで本発明者らは、より直接的で定量的なア
ッセイ方法を確立し、Creによる組換え反応に必須のlox
P配列内の塩基を同定した。まずそのアッセイ法を簡単
に説明する。8塩基のスペーサー領域の全ての塩基を1塩
基ずつ、可能な全ての塩基に置換した変異型loxP配列
（計24種類）及び野生型loxP配列を含むDNAを通常の方
法により合成し、適当な長さのDNA断片、例えばプラス
ミドpBR322を制限酵素消化し直鎖状にしたDNA断片の両
端に、野生型loxP配列及び変異型loxP配列とを結合させ
たDNA断片を基質として用いた。この基質DNAをin vitro
の無細胞系でCre蛋白と反応させ組換え反応を行い、適
当な制限酵素で消化後電気泳動することにより、変異型
loxP配列の野生型loxP配列との組換え反応の効率を定量
的に測定した。その結果、以下に示す結果が得られた； (1)スペーサー領域の１番目又は８番目の塩基を置換し
ても、野生型loxP配列と反応する； (2)２番目、３番目、４番目又は５番目の塩基を置換す
ると、反応は大部分中間体で止まり、最終段階まではほ
とんど進まない。その程度は置換箇所により若干差があ
り、５番目の置換ではごく一部最終段階まで進む； (3)６番目の塩基を置換すると、中間体はほとんどでき
ないが、反応は一部最終段階まで進む。反応が最終段階
まで進む割合は、５番目または７番目の塩基を置換した
場合よりも多い。また置換する塩基の種類により反応の
進行度は異なり、本来の塩基であるTをAに置換すると、
CまたはGに置換した場合より、反応が最終段階まで進む
割合が高い； (4)７番目の塩基を置換すると、中間体はほとんどでき
ないが、反応はごく一部最終段階まで進む。従来報告さ
れているのは、この７番目の塩基のGからAへの置換であ
るが、この置換を行っても、反応は約5%の頻度で最終段
階まで進行した。この頻度は、本発明の目的である遺伝
子置換を行うのには高すぎる値である。なぜならば、野
生型loxP配列と変異型loxP配列との間で5%もの頻度で組
換え反応が起きると、Creによる切り出し反応により、
２つのloxP配列（野生型及び変異型）の間に存在する遺
伝子が欠失してしまう可能性があるからである。
【0018】なお、ここでいう中間体とは、二本鎖DNAのう
ち片側の鎖は組換わっているが他方は組換わっていな
い、いわゆるホリデー構造（Holliday-structure、Hoes
set al., Proc.Natl.Acad.Sci., Vol. 84, 6840-6844(1
987)）の状態を意味する。２つのloxP配列間での組換え
反応は、まずスペーサー領域の下側の鎖の７番目と８番
目の塩基の間が切断され再結合した後、上側の鎖の１番
目と２番目の塩基の間が切断され再結合することにより
反応は完了することが知られている（Guoet al., Natur
e, Vol. 389, 40-46(1997)）。従って、２番目から５番
目までの塩基の置換と、６番目７番目の塩基の置換とは
質的に異なり、前者は下側の鎖の組換えは起きるが上側
の鎖の組換えが起きずに中間体で反応が止まったもの、
後者は下側の鎖の組換えの頻度は低いものが、その一部
で組換え反応が起き、反応が最終段階まで進行したもの
であることが明らかになった。
【0019】次に、同様のアッセイ方法で、同じ配列の２つ
の変異型loxP配列間での組換え反応を検討した。置換箇
所及び置換した塩基の種類により反応性に差はあるもの
の、２番目から７番目の塩基のうち１塩基を置換した２
つの変異型loxP配列間で、Creによる特異的な組換え反
応が認められた。その反応の程度の差は、置換箇所より
も、置換した塩基の種類に依存していた。例えば、３番
目の塩基(G)のCへの置換、及び７番目の塩基(G)のTへの
置換は、他の２種類の塩基に置換した場合よりも明らか
に反応性は悪かった。
【0020】従って、野生型loxP配列において、中央部の８
塩基（スペーサー領域）の２番目（Ｔ）、３番目（Ｇ）
及び４番目（Ｔ）の塩基から選ばれる一つの塩基が異な
る塩基に置換された配列の変異型loxP配列及び該変異型
loxP配列を有するDNAは本発明に含まれる。
【0021】また、以上の知見より、質的に異なる塩基の置
換箇所、すなわち２番目から５番目の任意の箇所と６番
目または７番目を、２つ以上組み合わせることにより、
１塩基のみの置換とは異なり、極めて高い特異性を有
し、同じ変異型loxP配列どうしでは１塩基置換に匹敵す
る組換え効率をもつ変異型loxP配列が得られることが予
想された。
【0022】そこで、次に２番目から５番目の任意の一塩基
の置換と７番目の塩基の置換とを組み合わせた変異型lo
xP配列について、野生型loxP配列との組換え反応効率、
及び同じ配列の２つの変異型loxP配列間での組換え反応
の効率を検討した。２塩基置換した変異型loxP配列のほ
とんどは、野生型loxP配列との組合せでは組換え反応は
最終段階まで全く進まず、１塩基のみの置換よりも基質
特異性が明らかに上昇した。しかしながら、同じ配列の
２つの変異型loxP配列間での組換え反応の効率は、配列
により大きく異なり、全く反応しない配列もあったが、
次に示す変異型loxP配列は実用上十分な組換え効率を示
した。T2C/G7A(#2171、配列番号：26)、T2A/G7A(#227
1、配列番号：29)、T2A/G7C(#2272、配列番号：30)、G3
A/G7A(#3171、配列番号：35)、G3T/G7A(#3371、配列番
号：39)、T4C/G7A(#4171、配列番号：42)、A5G/G7A(#51
71、配列番号：49)。なかでも、T2A/G7C(#2272)及びA5G
/G7A(#5171)の反応効率は非常に高かった。なお、数字
は置換する塩基の場所、数字の前の塩基は置換前の塩
基、数字の後の塩基は置換後の塩基を示す。例えば、T2
C/G7Aは、２番目の塩基をTからCへ、７番目の塩基をGか
らAへ置換した配列を示す。また、かっこ内の番号及び
配列番号との関係は後記の表２に示されている。
【0023】このように、野生型loxP配列のスペーサー領域
の２つの塩基を同時に置換した変異型loxP配列は、野生
型loxP配列とは組換え反応を起こさず、２つの変異型lo
xP配列どうしでは高い効率で組換え反応が起きたことよ
り、１塩基のみ置換したloxP配列よりもさらに基質特異
性が増加したことが明らかとなった。
【0024】従って、野生型loxP配列において、中央部の８
塩基（スペーサー領域）の２番目（Ｔ）、３番目
（Ｇ）、４番目（Ｔ）又は５番目（Ａ）の塩基のうち少
なくとも一つの塩基及び６番目（Ｔ）又は７番目（Ｇ）
の塩基のうち少なくとも一方の塩基が異なる塩基に置換
された変異型loxP配列及び該変異型loxP配列を有するDN
Aは、本発明に含まれる。
【0025】さらに本発明者らは、異なる配列の変異型loxP
配列の間で組換え反応が起こるかどうかを検討した。そ
の例としてT2C/G7A(#2171)とT2A/G7C(#2272)を挙げる
が、これら２種の変異型loxP配列間では組換え反応は全
く起こらなかった。このことは、野生型loxP配列、変異
型loxP配列1、変異型loxP配列2の、少なくとも３種類の
基質特異性が異なるloxP配列を見出したことを意味し、
後述する遺伝子置換を行う上で有用である。
【0026】次に、本発明の変異型loxP配列を用いた遺伝子
置換の方法及びその応用について説明する。
【0027】本発明の遺伝子置換方法は、野生型loxP配列、
遺伝子Ａ及び変異型loxP配列をこの順に有するＤＮＡ
（ａ）と、野生型loxP配列、変異型loxP配列をこの順に
有する環状ＤＮＡ（ｂ）とをリコンビナーゼＣｒｅの存
在下に反応させ、ＤＮＡ（ａ）中の遺伝子Ａを遺伝子Ｂ
に置換することからなる。ここで、野生型loxP配列と変
異型loxP配列とはＣｒｅ依存組換え反応は起こらず、遺
伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺伝子であ
る。
【0028】また本発明の遺伝子置換方法は、互いに異なる
配列をもつ２つの変異型loxP配列（変異型loxP配列１及
び変異型loxP配列２）及び遺伝子Ａを変異型loxP配列１
／遺伝子Ａ／変異型loxP配列２の順に有するＤＮＡ
（ａ）と、変異型loxP配列１、遺伝子Ｂ及び変異型loxP
配列２をこの順に有する環状ＤＮＡ（ｂ）とをリコンビ
ナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、ＤＮＡ（ａ）中の遺
伝子Ａを遺伝子Ｂに置換することからなる。ここで、変
異型loxP配列１と変異型loxP配列２とはＣｒｅ依存組換
え反応は起こらず、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異な
る任意の遺伝子である。
【0029】遺伝子置換の方法は、基本的に次のようにして
行う。その例として、野生型loxP配列と変異型loxP配列
を用いた方法につき説明するが、変異型loxP配列１と変
異型loxP配列２を用いる場合も同様である。また、動物
細胞の染色体の遺伝子を置換する場合を例として説明す
るが、本方法は動物細胞の染色体に限らず、動物ウイル
スのゲノムや、植物細胞、酵母または細菌等の微生物の
染色体や、バクテリオファージなどにも適用できる。
【0030】まず、動物細胞の染色体にあらかじめ野生型lo
xP配列と変異型loxP配列とを挿入しておく。野生型loxP
配列と変異型loxP配列との間には任意の遺伝子Ａが存在
してよく、この場合は遺伝子置換となり、遺伝子Ａが存
在しない場合には、遺伝子挿入となる。
【0031】一方、野生型loxP配列と変異型loxP配列とを挿
入した環状DNA分子の２つのloxP配列の間に、導入しよ
うとする遺伝子Ｂを挿入しておく。この環状DNA分子
は、例えばプラスミドDNAや二本鎖環状DNAウイルスのよ
うにあらかじめ環状分子となったものを用いてもよい
し、また何らかの操作により細胞内に導入後、環状分子
となるものを用いてもよい。この遺伝子Ｂと野生型及び
変異型loxP配列が存在する環状DNA分子を公知の方法に
より前述した細胞内に導入し、同時に公知の方法により
Cre蛋白を細胞内で発現させることにより、環状DNA分子
上の遺伝子Ｂが細胞の染色体上の野生型loxP配列と変異
型loxP配列との間に挿入される。その際、細胞の染色体
上の２つのloxP配列の間に遺伝子Ａが存在する場合は、
この遺伝子Ａが除かれ遺伝子Ｂが挿入される遺伝子置換
となる。染色体上の２つのloxP配列の間に遺伝子が存在
しない場合には遺伝子挿入となる。さらに、環状DNAの
２つのloxP配列の間に遺伝子が存在しない場合は、染色
体上の遺伝子Ａを除くことができる。しかも、遺伝子Ａ
を除いても染色体上には２つのloxP配列は存在するの
で、２つのloxP配列の間に任意の遺伝子Ｃを有する別の
環状DNA分子を用いることにより、再びこの染色体上の
２つのloxP配列間に遺伝子を導入することができる。
【0032】動物細胞に環状DNA分子を導入する方法は、一
般的に用いられている方法を使用することができる。そ
の例として、エレクトロポレーション法、リン酸カルシ
ウム共沈殿法、DEAE-dextran法、リポフェクション法、
遺伝子銃などの物理化学的方法や、環状DNAウイルス等
が挙げられる。環状DNAウイルスの例としては、パピロ
ーマウイルスやSV40などが挙げられる。また、細胞内に
導入後、環状分子とする方法の例としては、リコンビナ
ーゼを用いる方法が挙げられ、そのリコンビナーゼとし
ては、酵母の2mlプラスミド由来のFLPやチゴサッカロマ
イセス・ルーイイのpSR1プラスミド由来のR、そしてCre
などが挙げられる。
【0033】動物細胞の染色体にあらかじめ２つのloxP配列
を挿入するには、例えば、２つのloxP配列が存在するプ
ラスミドDNA等を用いて細胞を形質転換すればよい。形
質転換時の遺伝子導入方法は、前述した物理化学的方法
で行うことができる。さらに、レトロウイルスやアデノ
随伴ウイルス、HIV等の、ウイルスゲノムを細胞の染色
体に挿入する性質を有するウイルスを用いてもよい。
【0034】動物細胞内でCreを発現させる方法は、Creの遺
伝子をコードするDNAやRNAを細胞に導入後、細胞内でCr
e蛋白を発現させる方法や、Cre蛋白そのものを細胞内に
導入する方法を用いることができる。前者の例として
は、Creの遺伝子をコードするDNAやRNAを前述した物理
化学的方法で細胞に導入する方法や、ウイルスベクター
を用いる方法が挙げられる。ウイルスベクターとして
は、アデノウイルス、ワクチニアウイルス、ヘルペスウ
イルス、EBウイルスなどが挙げれられるが、その遺伝子
導入効率の高さからアデノウイルスが好適な例として挙
げられる。
【0035】本発明の変異型loxP配列を用いた動物細胞染色
体上での遺伝子置換法の利点は、その効率の高さと染色
体の特定の部位に遺伝子を挿入できることである。特に
後者は形質転換細胞を取得する上では極めて重要であ
る。なぜならば、DNAを用いた通常の形質転換法（相同
組換え以外）や、レトロウイルスやアデノ随伴ウイルス
などのウイルスベクターを用いた方法では、染色体上で
の目的遺伝子の挿入部位はランダムであるため、挿入部
位により目的遺伝子の発現量及びその染色体での安定性
に大きな差があるからである。そのため、例えば目的遺
伝子を安定に（長期間）、しかも高発現する形質転換細
胞株を得るには、非常に多くの細胞株をスクリーニング
しなければならない。しかも、一遺伝子ごとに、すなわ
ち１回の形質転換ごとに、このスクリーニングを繰り返
さなければならない。それに較べて、本発明による方法
では、２つのloxP配列にはさまれたある遺伝子の発現を
指標にして、その発現量が高く安定な細胞株を一旦取得
すれば、任意のどの遺伝子を導入しても、遺伝子の発現
が高く安定な細胞株を容易に取得することができる。し
かも、その効率は極めて高いため、通常必要な薬剤選択
の操作が必要なく、細胞のクローン化の操作だけで目的
の細胞株を短期間に取得することができる。対象とする
細胞株に特に制限はないが、トランスジェニック動物の
作製に用いるES細胞などの形質転換には、特に有効であ
る。
【0036】本発明による動物細胞染色体の遺伝子置換方法
は、培養細胞だけでなく動物個体に対しても適用でき
る。特定の外来遺伝子を動物個体で発現させる方法とし
て、トランスジェニック動物の技術が存在するが、目的
の遺伝子を発現するトランスジェニック動物の作製には
非常に時間がかかる。なぜならば、通常の方法でトラン
スジェニック動物を作製するには、まず目的遺伝子を発
現するES細胞等を作製し、次いでこのES細胞等を仮親の
腹で発生させ、生まれた子どもを目的遺伝子の発現を指
標にスクリーニングし、さらに目的遺伝子を発現してい
る動物個体をかけ合わせて初めて多数のトランスジェニ
ック動物が得られるという、複雑な操作が必要であるか
らである。通常これらの操作には半年から１年を要す
る。本発明の方法を用いれば、一旦遺伝子導入用のトラ
ンスジェニック動物を作製すれば、個々の遺伝子に応じ
たトランスジェニック動物の作製は不要となる。遺伝子
導入用のトランスジェニック動物とは、染色体に変異型
loxP配列と野生型loxP配列とを挿入した動物で、その作
製は従来のトランスジェニック動物作製と同様の方法で
行い、薬剤による選択のため２つのloxP配列の間にネオ
マイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子を挿入してもお
いてもよい。この遺伝子導入用動物に、(a)野生型loxP
配列と変異型loxP配列との間に目的遺伝子を挿入した環
状DNA分子、及び(b)Cre蛋白を導入することにより、(a)
(b)両者が導入された組織や細胞で目的遺伝子が染色体
に挿入され、その遺伝子を発現させることができる。動
物個体への(a)(b)の導入は、リポソーム法やウイルスべ
クター、遺伝子銃など既存の方法で十分に行うことがで
きる。本発明の方法を用いれば、異なる遺伝子を導入す
る場合でも、遺伝子に応じた環状DNA分子(a)を用いるだ
けでよく、非常に時間のかかるトランスジェニック動物
の作製を行う必要がない。さらに、(a)(b)両者を局所的
に導入するだけで、目的の臓器や組織にのみ目的遺伝子
を挿入することもできる。
【0037】本発明は、組換えウイルスの作製にも用いるこ
とができる。ウイルスとしてDNAウイルスが挙げられ、D
NAウイルスとして、アデノウイルス、単純ヘルペスウイ
ルス、ＥＢウイルス、サイトメガロウイルス等のヘルペ
スウイルス、ワクシニアウイルス、カナリアポックスウ
イルス等のポックスウイルス、昆虫のバキュロウイルス
等が挙げられる。また、ウイルスとしてRNAウイルスが
挙げられ、特にレトロウイルスが好ましい。なぜなら、
レトロウイルスベクターを作製する場合、力価の高いウ
イルス産生細胞を各遺伝子を産生するレトロウイルスベ
クターごとに選択しているが、本法を用いることによ
り、一度マーカー遺伝子を発現するウイルス高産生細胞
株を樹立しておけば、この細胞株染色体上のマーカー遺
伝子を目的遺伝子と置換することにより、高産生株を容
易に得ることができると考えられるからである。
【0038】本発明方法による組換えウイルス作製の具体的
な方法を、組換えアデノウイルスの作製を例として説明
する。従来の技術での組換えアデノウイルスの作製方法
は、アデノウイルスゲノム及び目的遺伝子を挿入したプ
ラスミドベクターやコスミドベクター等で、293細胞な
どの細胞を形質転換し、相同組換えにより生じた組換え
ウイルスをクローン化後、目的のウイルスを選別し増殖
させる方法であり、これには長期間の作業が必要であ
る。本発明による方法では、効率の低い相同組換えを介
さないため、短期間に目的の組換えウイルスを作製する
ことができる。すなわち、変異型loxP配列と野生型loxP
配列とを挿入した遺伝子導入用のアデノウイルスをまず
作製しておき、次いでこのウイルスを293細胞など組換
えアデノウイルス作製に適した細胞に感染させ、同時に
野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に目的遺伝子を
挿入したプラスミドDNAを該細胞に導入するとともにCre
蛋白を発現させることにより、変異型loxP配列と野生型
loxP配列との間に目的遺伝子が挿入された組換えウイル
スが高頻度に得られる。この場合、遺伝子導入用のアデ
ノウイルスは、Creによる組換えによりloxP配列にはさ
まれたパッケージング配列が除去されるように作製し、
プラスミドDNAから目的遺伝子と同時にパッケージング
配列を加えて置換することにより、目的ウイルスが選択
的に得られるようにしてもよい。Cre蛋白は、プラスミ
ドDNAの形で導入してもよいし、またあらかじめ細胞を
形質転換し、Cre蛋白を常時あるいは何らかの誘導によ
り発現するようにしておいてもよい。以下に上記方法を
より詳しく説明する。外来遺伝子Ａが外来遺伝子Ｂに置
換された組換えアデノウイルスを作製する場合について
説明する。遺伝子導入用の組換えアデノウイルスの構造
の例として、アデノウイルス左端逆方向反復配列（inve
rted terminal repeat：ITR）／野生型loxP配列／パッ
ケージング配列／野生型loxP配列／遺伝子A／変異型lox
P配列、の順にloxP配列を挿入したアデノウイルスが挙
げられる。ここで、野生型loxP配列／遺伝子Aの断片は
Ｅ１欠失部位に挿入される。外来遺伝子Ｂ挿入用プラス
ミドDNAの例としては、野生型loxP配列／パッケージン
グ配列／遺伝子Ｂ／変異型loxP配列の構造を有するプラ
スミドが挙げられる。これらの遺伝子導入用のアデノウ
イルスと外来遺伝子Ｂ挿入用プラスミドDNAとを同時に
或いは順次、Cre蛋白を発現させるようにした293細胞な
どの細胞に導入すると、遺伝子導入用のアデノウイルス
では２つの野生型loxP配列に挟まれたパッケージング配
列が除かれるとともに、野生型loxP配列／遺伝子A／変
異型loxP配列の部分がプラスミド由来の野生型loxP配列
／パッケージング配列／遺伝子Ｂ／変異型loxP配列に置
換された組換えアデノウイルスが生成する。遺伝子置換
されなかった遺伝子導入用のアデノウイルスは、反応効
率が高い二つの野生型loxP配列間の通常の「切り出し反
応」によりパッケージング配列が除去されているため、
ウイルスDNAは複製するもののウイルス粒子（virion）
内にDNAがパッケージングされずウイルスとしては複製
しない。一方、遺伝子置換されたアデノウイルスはパッ
ケージング配列を有するため、ウイルスとして複製でき
るため、「遺伝子Ｂ」に置換された組換えアデノウイル
スが高頻度に得られる。遺伝子導入用のアデノウイルス
の変異型loxP配列の挿入位置は、外来遺伝子Ａのすぐ隣
であってもよいし、遺伝子Ａから離れたアデノウイルス
ゲノム内であってもよい。後者の挿入位置の例として
は、L3遺伝子とE2A遺伝子との間の非翻訳領域、E3遺伝
子の欠失部位、E4遺伝子の上流域と右側のITRとの間な
どが挙げられる。これらの位置に変異型loxP配列を挿入
して遺伝子置換を行う場合、生成するアデノウイルスDN
Aがウイルス粒子（virion）に効率よくパッケージング
されるように、目的遺伝子挿入用プラスミドの野生型lo
xP配列／変異型loxP配列間のDNAのサイズを調節する必
要があるが、遺伝子置換された組換えアデノウイルスは
ウイルスの複製に必須の遺伝子を欠失しているため、遺
伝子治療用ベクターとして用いる場合、現在のアデノウ
イルスベクターで問題となっている副作用が軽減できる
と考えられる。
【0039】本発明の変異型loxP配列をもつDNAは、医薬と
して遺伝子治療にも用いることができる。その方法を以
下に説明する。まず、ヒト細胞の染色体に変異型loxP配
列と野生型loxP配列とをあらかじめ挿入する。そのため
に、変異型loxP配列と野生型loxP配列を有するDNAが医
薬品として用いられる。該DNAは、例えば、レトロウイ
ルスやアデノ随伴ウイルス（AAV）などのウイルスベク
ター中に含まれる形で投与される。なかでも、AAVを使
用することが好ましい。なぜならば、レトロウイルスに
よる遺伝子導入は、染色体にランダムに挿入されるが、
AAVでは染色体の特定の部位（第19番染色体のAAV-S1領
域）に挿入される確率が高いからである。この染色体の
特定部位への遺伝子導入にはAAVがコードするウイルス
遺伝子（Rep）が必須であるが、現在用いられているAAV
ベクターではAAV遺伝子の大部分が除かれているため、
染色体への特異的組み込み機構は失われている。しか
し、変異型loxP配列と野生型loxP配列とを合わせてもわ
ずか100塩基足らずであるため、AAVの全ウイルス遺伝子
を保持したまま、２つのloxP配列を挿入したウイルスを
作製できる。その挿入位置は、AAV遺伝子の両端に存在
する逆方向反復配列（inverted terminal repeat：IT
R）の各々すぐ内側が望ましい。この２つのloxP配列を
挿入したAAVをヒトに投与することにより、染色体に２
つのloxP配列を挿入することができる。
【0040】次いで、野生型loxP配列と変異型loxP配列との
間に目的遺伝子を挿入した環状DNA分子からなる医薬
と、Cre蛋白もしくはCre遺伝子をコードするDNA分子を
投与することにより、染色体上に存在する２つのloxP配
列の間に挟まれたAAV遺伝子が除かれ、目的遺伝子に置
換される。医薬としての環状DNA分子とCre蛋白もしくは
Cre遺伝子をコードするDNA分子をヒト細胞に導入する方
法としては、ウイルスベクターやリポソームベクターな
ど既存の遺伝子治療に用いられているベクターを用いる
方法が挙げられる。
【0041】このようにして染色体に遺伝子が挿入されたヒ
ト細胞では、目的遺伝子の両端に変異型loxP配列と野生
型loxP配列が存在し、さらにその外側にAAVのITRが存在
するのみで、AAVの構造遺伝子は全く存在しないため、A
AV由来の蛋白が発現し抗原となることもなく、目的遺伝
子の発現が長期間安定に持続することが期待できる。ま
た、挿入した遺伝子が不要になった場合、野生型loxP配
列と変異型loxP配列の間に遺伝子が存在しない環状DNA
分子を投与することにより、挿入した遺伝子を染色体か
ら除くことができる。さらに、その後再び染色体への遺
伝子の挿入が必要になった場合、２つのloxP配列が染色
体上に残っているため、前述した方法で任意の遺伝子を
挿入することができる。このように、本発明の変異型lo
xP配列をもつDNAは、染色体への遺伝子を挿入及び除去
が自由にできる遺伝子治療のための医薬として用いるこ
とができる。
【0042】本発明の変異型loxP配列をもつDNAを医薬とし
て用いる場合、該DNAの細胞内への導入方法としては、
ウイルスベクターによるもの、及びその他のものに大別
される（日経サイエンス、1994年４月号、20-45 頁、月
刊薬事、36(1),23-48 (1994)、及びこれらの引用文献
等) 。本発明の医薬においてはいずれの方法も適用する
ことができる。ウイルスベクターによる導入方法として
は、例えばレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関
連ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、
ポリオウイルス、シンビス他のＲＮＡウイルス等に本発
明の変異型loxP配列をもつDNAあるいは対応するRNAを組
み込んで導入する方法が挙げられる。この中で、レトロ
ウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等を用
いた方法が特に好ましい。その他の導入方法としては、
リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェク
ション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーショ
ン法、遺伝子銃法等が挙げられ、リポソーム法が特に好
ましい。
【0043】また、本発明の変異型loxP配列をもつDNAを実
際に医薬として作用させるには、該DNAを直接体内に導
入するIn Vivo 法、及びヒトからある種の細胞を採取し
体外で該DNAを該細胞に導入しその細胞を体内に戻すEx
Vivo 法がある（日経サイエンス，1994年４月号，20-45
頁、月刊薬事，36(1), 23-48 (1994) 、及びこれらの
引用文献等) 。本発明の医薬においては治療目的の疾
患、標的臓器等に応じて、適宜いずれかの方法を選択し
て適用することができる。
【0044】本発明の医薬において、In Vivo 法により投与
する場合は治療目的の疾患、標的臓器等に応じた適当な
投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮
下、筋肉内などに投与するか、又は腎臓、肝臓、肺、
脳、神経等の疾患の対象部位に直接投与することができ
る。
【0045】また、Ex Vivo 法による場合には、常法に準
じ、ヒトの細胞（例えば、リンパ球、造血幹細胞等）を
採取し、それに本発明の医薬を感作させて遺伝子導入を
行った後、その細胞をヒトへ戻すことが行われる。
【0046】In Vivo 法により投与する場合は、種々の製剤
形態（例えば、液剤等）をとりうるが、一般的には有効
成分である変異型loxP配列をもつDNAを含有する注射剤
等とされる。また、必要に応じて、慣用の担体を加えて
もよい。当該注射剤等は常法により調製することがで
き、例えば、変異型loxP配列をもつDNAを適切な溶剤
（例えば、滅菌された水、緩衝液、生理食塩水等）に溶
解した後、フィルター等で濾過して滅菌し、次いで無菌
的な容器に充填することにより調製することができ、ま
た変異型loxP配列をもつDNAに代え、変異型loxP配列を
もつDNAを組み込んだウイルスベクターを製剤化しても
よい。さらに、変異型loxP配列をもつDNAを包埋したリ
ポソーム（又はＨＪＶ−リポソーム）においては、懸濁
剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤などのリポソーム製剤
の形態とすることができる。
【0047】製剤中の変異型loxP配列をもつDNAの含量は、
治療目的の疾患、標的臓器、患者の年齢、体重などによ
り適宜調製することができるが、通常変異型loxP配列を
もつDNAとして0.0001mg〜 100mg、好ましくは 0.001mg
〜１０mgであり、これを数日ないし数月に１回投与する
のが適当である。
【0048】以上は、野生型loxP配列と変異型loxP配列の組
合せ、もしくは変異型loxP配列1と変異型loxP配列2の組
合せの２つのloxP配列を用いた場合の遺伝子置換の方法
の説明であるが、基質特異性の異なる３つ以上のloxP配
列を用いることにより、遺伝子置換方法の応用範囲をさ
らに広げることが可能である。基質特異性の異なる３つ
のloxP配列の組み合わせとして、例えば、野生型loxP配
列と２つの変異型loxP配列、３つの変異型loxP配列等が
挙げられる。本方法を、野生型loxP配列、変異型loxP配
列1、変異型loxP配列2の３つの異なるloxP配列が同一DN
A上に存在する場合を例として説明する。野生型loxP配
列／遺伝子Ａ／変異型loxP配列1／遺伝子Ｂ／変異型lox
P配列2をこの順に有するDNA(a)に、野生型loxP配列／遺
伝子Ｃ／変異型loxP配列1を有する環状DNA(b)とをリコ
ンビナーゼCreの存在下に反応させると、DNA(a)中の遺
伝子Ａを遺伝子Ｃに置換することができる。一方、環状
DNA(b)の代わりに、変異型loxP配列1／遺伝子Ｄ／変異
型loxP配列2を有する環状DNA(c)とをリコンビナーゼCre
の存在下に反応させると、DNA(a)中の遺伝子Ｂを遺伝子
Ｄに置換することができる。すなわち、異なる環状DNA
を用いるだけで、DNA(a)に存在する複数の遺伝子のうち
目的の遺伝子のみを任意の遺伝子に置換することができ
る。
【0049】次に本発明の変異型loxP配列を用いた遺伝子置
換の具体例について説明する。以下の例で、変異型loxP
配列は、全てスペーサー領域の２番目の塩基をTからCへ
７番目の塩基をGからAへの置換した配列（配列番号：２
６）を用いた。
【0050】（１）アデノウイルスゲノムに存在する遺伝子
の置換 置換する遺伝子の例として大腸菌lacZ遺伝子を用い、環
状DNA分子上のlacZ遺伝子を、アデノウイルスゲノムの
野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入する系で
本発明の変異型loxP配列の有効性を確認した。
【0051】まず、遺伝子置換される側のアデノウイルス、
すなわちターゲット用アデノウイルスとして、E1遺伝子
及びE3遺伝子を欠失させたアデノウイルス５型のE1遺伝
子欠失部位に、CAGプロモーター／野生型loxP配列／変
異型loxP配列／ポリＡ配列を、その転写方向が左向き
（アデノウイルスE1遺伝子の転写方向と逆向き）になる
ように挿入した組換えアデノウイルス（AxCALwM）を作
製した。なお、ここに言うCAGプロモーターとは、高発
現ベクターとして特開平3-168087号公報に開示されてい
るものである。
【0052】lacZ遺伝子を野生型loxP配列と変異型loxP配列
との間に挿入した環状DNA分子は、野生型loxP配列／lac
Z遺伝子／変異型loxP配列の構造を有するプラスミドDNA
としてtransfectionにより直接細胞に導入してもよい。
しかし、transfectionによる細胞への遺伝子導入効率は
数10%にとどまり、全ての細胞には目的DNAを導入できな
いため、アデノウイルスベクターを用いてCre依存的に
細胞内で環状DNA分子とする方法により、ほぼすべての
細胞に環状DNA分子を導入した。そのために、E1遺伝子
及びE3遺伝子を欠失させたアデノウイルス５型のE1遺伝
子欠失部位に、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナー
ゼ（TK）遺伝子のポリＡ配列／野生型loxP配列／lacZ遺
伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列／野
生型loxP配列を、その転写方向が左向きになるように挿
入した組換えアデノウイルス（AxALZMOL）を作製した。
この組換えウイルスAxALZMOLをドナー用アデノウイルス
と呼ぶ。AxALZMOLにCre蛋白を作用させると、２つの野
生型loxP配列間で組換え反応が起こり、野生型loxP配列
／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ
配列の構造の、環状DNA分子が生成する。なお、TK遺伝
子のポリＡ配列は、未同定のアデノウイルス由来のプロ
モーターからlacZ遺伝子の転写が起こらないようにする
ために挿入した。また、Cre蛋白は、Cre発現組換えアデ
ノウイルスAxCANCre（鐘ケ江ら、Nucleic Acids Res.,
Vol.23, 3816-3821(1995)）により供給した。
【0053】次に、これら３種類の組換えアデノウイルスを
用い、アデノウイルスゲノムに存在する遺伝子の置換
（挿入）実験を行った。ドナー用アデノウイルスAxALZM
OL、ターゲット用アデノウイルスAxCALwM、及びCre発現
アデノウイルスAxCANCreを、動物培養細胞（CV-1細胞も
しくはCOS-1細胞）に同時に感染させた。ドナー用アデ
ノウイルスAxALZMOL及び生成した環状DNA分子はlacZ遺
伝子を有するもののプロモーターが存在しないためlacZ
遺伝子は発現しない。環状DNA分子上のlacZ遺伝子が、
ターゲット用アデノウイルスAxCALwMのCAGプロモーター
の下流、すなわち野生型loxP配列と変異型loxP配列との
間に挿入されて初めてlacZ遺伝子が発現する。従って、
lacZ遺伝子の発現は、実際に遺伝子置換（この場合は挿
入）が起きたことの明確な証拠となる。
【0054】上記３種類のウイルス単独、もしくはそのうち
の２つのウイルスの組合せではlacZ遺伝子が発現した細
胞は全く存在しなかったが、３種類のウイルスを同時に
感染することによりlacZ遺伝子の発現が明らかに認めら
れ、しかもlacZ遺伝子を発現した細胞の割合はドナー用
アデノウイルスの量に依存して増加し、最大約90%の細
胞でlacZ遺伝子の発現を認めた。以上の結果より、ドナ
ー用アデノウイルス上のlacZ遺伝子が、環状DNA分子の
形を介して、ターゲット用アデノウイルスの野生型loxP
配列と変異型loxP配列との間に非常に効率よく挿入され
た、すなわち遺伝子置換が起きたことがを明らかとなっ
た。
【0055】（２）動物細胞の染色体に存在する遺伝子の置
換 次に、アデノウイルスゲノム上だけでなく、動物細胞の
染色体に存在する遺伝子も効率よく置換できることを示
すため、以下の実験を行った。実験系の原理は（１）と
同じであるが、遺伝子置換される細胞株（ターゲット細
胞）を得るため、CAGプロモーター／野生型loxP配列／
ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子／変異型loxP配列／ポリ
Ａ配列の構造のDNAを含むプラスミドで、CV-1細胞を形
質転換し、ハイグロマイシンＢ耐性を有しかつ上記の構
造のDNAが細胞当たり１コピーのみ挿入された細胞株を
複数作製した。
【0056】これら細胞株にドナー用アデノウイルスAxALZM
OL及びCre発現アデノウイルスAxCANCreを同時に感染さ
せた。その結果、ドナー用アデノウイルスまたはCre発
現アデノウイルス単独ではlacZ遺伝子を発現した細胞は
全く存在しなかったが、両ウイルスを同時感染すること
により、lacZ遺伝子が発現した細胞が非常に高頻度で認
められた。その割合は用いた細胞株により異なるが、最
大約30%の細胞でlacZ遺伝子が発現していた。この実験
系においては細胞のクローン化は一切行っていないた
め、lacZ遺伝子が発現した細胞の割合は、染色体上での
遺伝子置換が起きた割合を直接示している。従って、以
上の結果は、本発明の変異型loxP配列を用いることによ
り、動物細胞の染色体での遺伝子置換を非常に効率よく
行えることを示すものである。
【0057】
【実施例】以下、本発明の一部として実施例により本発
明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例
によりなんら限定されるものではなく、本発明の技術分
野における通常の変更ができることは言うまでもない。
なお、実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、各種
酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う諸操作は、特に
断らない限り、「Molecular Cloning, A Laboratory Ma
nual. T. Maniatisら編、第２版(1989)、Cold Spring H
arbor Laboratory」に記載の方法に準じて行なった。
【0058】実施例１ ＜２つの変異型loxP配列間でのリコンビナーゼCre依存
組換え反応＞ （１）リコンビナーゼCreを含む細胞抽出液の調製 リコンビナーゼCre依存組換え反応に用いるCreを含む細
胞抽出液を得る目的で以下の操作を行った。Cre発現組
換えアデノウイルスベクターAxCANCre（鐘ケ江ら、Nucl
eic acid Res., Vol.23, 3816-3821(1995)）約1 x 109
PFUを、225cm2フラスコ１本の293細胞（ヒト胎児腎臓由
来細胞株）に感染（37℃、１時間）させ、培地（5% FCS
含有DMEM培地）を添加後さらに24時間培養した。培養終
了後、低速遠心機で1000回転5分遠心し、培養上清を捨
て細胞を集めた。細胞に保存用緩衝液（50%グリセロー
ル／20mMトリス塩酸(pH7.5)／300mM塩化ナトリウム／1m
MEDTA(pH7.5)）5mlを加え細胞を懸濁し、密閉型ソニケ
ーターを用い200W、２分（30秒x４回）で細胞を破砕
し、細胞内に存在するCre蛋白を放出させた。得られた
細胞破砕液をマイクロ遠心機で15000回転10分遠心し、
その上澄を冷凍保存（−80℃）した。
【0059】（２）変異型loxP配列を含む合成DNAの作製 野生型loxP配列中の８塩基のスペーサー部分を１塩基も
しくは２塩基同時に、他の塩基に置換した52塩基の合成
DNAを作製した。合成したDNAの種類は、１塩基の変異が
24種類、２塩基同時の変異が29種類で、それぞれセンス
鎖及びアンチセンス鎖を合成した。野生型loxP配列の合
成DNAの構造を図１（センス鎖は配列番号：５５、アン
チセンス鎖の配列番号：５６）に示す。また、変異型lo
xP配列（センス鎖及びアンチセンス鎖）を図２〜図５に
示す。野生型センス鎖とアンチセンス鎖は全くの相補配
列ではなく、各々の鎖をアニーリングし２本鎖DNAとし
た際、5'末端がそれぞれ４塩基突出し、両末端が制限酵
素XbaI及びXhoIの消化断片になるように設計した。その
ため、これらの２本鎖DNAは、XbaI断片側は制限酵素Xba
I及びNheI消化断片と、XhoI断片側は制限酵素XhoI及びS
alI消化断片とそれぞれ結合できる。全ての１本鎖合成D
NAは、5'末端をT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化
し、それぞれの変異に対応するセンス鎖及びアンチセン
ス鎖をアニーリングした。以後、この２本鎖合成DNAを
変異型loxP合成DNAと呼ぶ。
【0060】（３）２つの変異型loxP配列を含む基質DNAの
調製 直鎖状DNAの両端に同じ配列の変異型loxP配列を有する
基質DNAを得る目的で、以下の操作を行った。プラスミ
ドpBR322を制限酵素NheI及びSalIで同時に消化し、変異
型loxP合成DNA（１塩基のみの置換）24種類をそれぞれT
4 DNAリガーゼでligation反応（プラスミド：合成DNAの
モル比１：６）を行った後、制限酵素XbaI及びXhoIで同
時に消化した。この制限酵素処理によりpBR322 DNAの両
端に複数個結合した変異型loxP合成DNAが除かれ、pBR32
2 DNAの両端に同じ配列の変異型loxP合成DNAが一ヶ所ず
つ結合した約4.1kbの直鎖状DNAが生じる。次いで、未反
応及び制限酵素消化された変異型loxP合成DNAをGEANCLE
AN II（フナコシ社製）により除き、両端に変異型loxP
配列が結合した直鎖状DNA（約4.1kb）を次に示す反応の
基質DNAとして用いた。
【0061】（４）２つの変異型loxP配列間でのCre依存組
換え反応 以下に示すアッセイ方法で、２つの変異型loxP配列間で
Cre依存組換え反応が起きるかどうかを検討した。終濃
度、50mMトリス塩酸(pH7.5)／10mM MgCl2／1mg/mlウシ
血清アルブミン／1mMフェニルメチルスルフォニルフロ
ライド(PMSF)／5μg/mlアプロチニンを含む緩衝液に、
（３）で調製した基質DNA（1μg）と（１）で調製したC
reを含む細胞抽出液10μlを加え（反応液量50μl）、37
℃で30分反応した。反応終了後、反応液に45μlのＴＥ
バッファー（pH8.0）及び5μlのEDTA溶液（pH8.0）を加
え、フェノール／クロロホルム抽出ならびにクロロホル
ム抽出を行い、さらにエタノール沈殿し、得られたDNA
をRNaseA(20μg/ml)を含むＴＥバッファー（pH8.0） 30
μlに溶解した。次いで、その半量を制限酵素BsaHI消化
し、アガロースゲル電気泳動後、臭化エチジウム（EtB
r）染色により検出されたDNAのバンドを解析した。
【0062】Creによる組換え反応を行う前の直鎖状の基質D
NA（約4.1kb）を制限酵素BsaHI消化すると、2.7kb、610
bp、380bp、360bpの４本のバンドが生じる。一方、基質
DNAがCreにより組換え反応を起こすと、変異型loxPを１
個有する約4.0kbの環状DNAと変異型loxPのみからなる約
50bpの直鎖状DNAが生じるので、これらを制限酵素BsaHI
消化すると、2.7kb、920bp、380bp、50bpの４本のバン
ドが生じる（図６参照）。従って、920bpのバンドはCre
による組換え反応が起きたことを示し、610bp及び360bp
のバンドはCreによる組換え反応が起きていないことを
示すので、これらのバンドの量比により組み換え反応の
効率が分かる。結果を表１に示す。
【表１】 （表中、反応の中間体及び最終反応体の量を０〜９まで
の10段階で表示した。数字が大きいほど生成量が多い。
２つの野生型loxp配列間で反応を行った場合の最終反応
体の量（DNAバンドの濃さ）を最大の「９」とし、DNAの
バンドがほとんど検出できない場合（「９」の５％未
満）を「０」とした。反応の中間体の詳細については、
実施例２−（２）で説明する。）
【0063】#11、#73の変異型loxP配列は反応効率が悪かっ
たが、その他の変異型loxP配列は配列により多少反応効
率に差はあるものの同じ配列の変異型loxP配列どうしで
はCre依存組換え反応が生じることが確認された。
【0064】実施例２ ＜野生型loxP配列と変異型loxP配列との間でのCre依存
組換え反応（その１）＞ （１）野生型loxP配列と変異型loxP配列を含む基質DNA
の調製 〔1〕野生型loxP配列を一つ有するプラスミド（pBRwt）
の構築 プラスミドpBR322に一つの野生型loxP配列を挿入したプ
ラスミド（pBRwt）を構築するため、以下の(a)及び(b)
の操作を行った。 (a)pBR322を制限酵素EcoNIで消化し、さらにKlenow酵素
により両端を平滑化し、フェノール／クロロホルム抽出
を行ってEcoNIならびにKlenow酵素を失活させた後、ゲ
ル濾過により反応液をＴＥバッファーに置換した。次い
で、XhoIリンカー（5'-pCCTCGAGG-3'）をligationし、
制限酵素XhoI及びPstIで同時消化後、アガロース電気泳
動を行い約2.9kbのバンドを切り出した。このバンドをG
EANCLEAN II（フナコシ社製）を用いて精製し、片側の
端がXhoI消化断片、他方がPstI消化断片である約2.9kb
のDNA断片を得た。 (b)pBR322を制限酵素NheIで消化し、野生型loxP配列を
含む合成DNA(52bp)をligation後、制限酵素XhoI及びPst
Iで同時消化し、反応液をアガロース電気泳動した。野
生型loxP配列を一つ含む約1.4kbのバンドを切り出し、G
EANCLEAN II（フナコシ社製）を用いて精製した。この
約1.4kbのDNA断片も片側の端がXhoI消化断片、他方がPs
tI消化断片である。 (a)(b)で調製した両DNAをligation後大腸菌を形質転換
し、pBR322のNheIサイトとEcoNIサイトとの間に一つの
野生型loxP配列が挿入されたプラスミドpBRwt(4.4kb、
図７)を得た。
【0065】〔2〕野生型loxP配列と変異型loxP配列を含む
基質DNAの調製 直鎖状DNAの片側の端に野生型loxP配列を、他方に変異
型loxP配列を有する基質DNAを調製するため以下の操作
を行った。プラスミドpBRwtの野生型loxP配列から約30b
p離れた位置にSalIサイトが存在するので、このプラス
ミドを制限酵素SalIで消化し直鎖状にした後、実施例１
−（３）と同じ変異型loxP合成DNA（52bp、24種類）をl
igationした（プラスミド：合成DNAのモル比１：６）。
この操作によりpBRwtのSalI消化部位に変異型loxP合成D
NAのXhoI消化断片側が結合する。次いで、反応液を制限
酵素XbaI及びXhoIで同時に消化し、pBRwtの両端に複数
個結合した変異型loxP合成DNAを除いた後、未反応及び
制限酵素消化された変異型loxP合成DNAをGEANCLEAN II
（フナコシ社製）により反応液から除き、片方の端に野
生型loxP配列が、他方の端に変異型loxP配列が各一ヶ結
合した直鎖状DNA（約4.4kb、図８）を得た。このDNAを
基質DNAとして次に示す反応に用いた。
【0066】（２）野生型loxP配列と変異型loxP配列との間
でのCre依存組換え反応 反応及び解析方法は実施例１−（４）と同様であるが、
基質DNAは実施例１−（３）で示したDNAの代わりに実施
例２−（１）で示したDNAを用いた。下記に示した野生
型loxP配列の塩基配列で、２つのloxP配列間での組換え
は、８塩基のスペーサー領域の下側のDNA鎖の７番目と
８番目の塩基の間の切断・再結合がまず起こり、次いで
上側のDNA鎖の１番目と２番目の塩基の間の切断・再結
合が起こることで反応が完了することが知られている
（Guo et al., Nature,Vol. 389, 40-46(1997)）。
【化６】 従って、下側のDNA鎖の組換えは起こるが上側のDNA鎖の
組換えが起こらない場合は、反応の中間体として検出さ
れる。本発明者らが用いたアッセイ系では、この中間体
は約970bp付近のバンドとして検出された。
【0067】実施例１−（４）で示したが、920bpのバンド
は上側及び下側のDNAの両方が組換わり反応が完了した
ことに由来するバンドで、970bpのバンドは中間体で反
応が止まっていることに由来するバンドである。この２
本のバンドの有無に特に着目して解析した結果を表１に
示す。また、表１の結果の概要を以下に示す（#の後の
数字は変異loxP配列番号）。 #11,12,13(配列番号:2,3,4)：反応は最終段階まで進
む； #21,22,23(配列番号:5,6,7)：反応は中間体で止まり、
最終段階まで進まない； #31,32,33(配列番号:8,9,10)：反応は中間体で止まり、
最終段階まで進まない； #41,42,43(配列番号:11,12,13)：反応は中間体で止ま
り、最終段階まで進まない； #51,52,53(配列番号:14,15,16)：反応は大部分中間体で
止まるが、ごく一部最終段階まで進む（約５％）； #61,63(配列番号:17,19)：中間体はほとんどできない
が、反応はごく一部最終段階まで進む（５〜１０％）； #62 (配列番号:18)：中間体はほとんどできないが、反
応は一部最終段階まで進む（最終反応体は#61,63より多
い）； #71,72,73(配列番号:20,21,22)：中間体はほとんどでき
ないが、反応はごく一部最終段階まで進む（約５％、最
終反応体は#61,63より少ない）； #81,82,83(配列番号:23,24,25)：反応は最終段階まで進
む； 以上の結果、１番目から８番目の塩基の置換効果を置換
箇所毎にまとめると、(1)１番目又は８番目の塩基を置
換しても野生型loxP配列と反応する、(2)２番目、３番
目又は４番目の塩基を置換すると野生型loxP配列とはほ
とんどど反応しない、(3)５番目、６番目又は７番目の
塩基を置換すると野生型loxP配列と反応しにくくなるが
一部反応する、ことが明らかになった。また、これらの
結果から、２番目から５番目の塩基の置換と、６番目及
び７番目の塩基の置換とは質的に異なり、前者は反応が
中間体で止まり、後者は反応の最初のステップが著しく
阻害されているためであることが明らかになった。
【0068】さらに本発明者らの測定法では、野生型loxP配
列との間では特異的DNA組換え反応が起きないと報告（H
oess et al., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300
(1986)）されている変異型loxP配列（#71に相当）は、
野生型loxP配列との反応性が完全には失われてはおら
ず、約５％の頻度で組換え反応が起こることが明らかと
なった。
【0069】実施例３ ＜野生型loxP配列と変異型loxP配列との間でのCre依存
組換え反応（その２）＞ （１）野生型loxP配列と変異型loxP配列とを含む基質DN
Aの調製 野生型loxP配列と変異型loxP配列とのCre依存組換え反
応を、実施例１及び２で用いたアッセイ系より感度の高
いアッセイ系で検出するための基質DNAを得るために、
以下の操作を行った。
【0070】〔1〕野生型loxP配列と変異型loxP配列を有す
るプラスミド（pBLAmutant）の構築 pBR322の両端に野生型loxP配列と変異型loxP配列とが各
一ヶ結合した約4.4kbの直鎖状DNAに、アデノウイルス５
型由来のDNA断片を結合したプラスミドを構築するた
め、以下の操作を行った。アデノウイルス５型のE1及び
E3遺伝子以外のほぼ全長が挿入されたコスミドベクター
pAxcw（特開平8-308585号公報15頁）を制限酵素XbaI及
びXhoIで同時に消化し、反応液をアガロース電気泳動後
約3.8kbのバンドを切り出し、GEANCLEAN II（フナコシ
社製）を用いて精製した。この3.8kbのDNA断片と、実施
例２−（１）−〔2〕で調製した、片方の端に野生型lox
P配列が他方の端に変異型loxP配列が各一ヶ結合した直
鎖状DNA（約4.4kb）をligation後、大腸菌を形質転換し
プラスミドpBLAmutant(8.2kb、図９)を得た。なおこの
プラスミドpBLAmutantは、この操作を行ったプラスミド
の総称で、実際には表１の#11,#21,#22,#23,#31,#41,#5
1,#61,#71,#72,#73,#81に対応する変異型loxP配列と野
生型loxP配列とを各一ヶを有する個々のプラスミドを作
製した。
【0071】〔2〕野生型loxP配列と変異型loxP配列を含む
基質DNAの調製 プラスミドpBLAmutantから、Cre依存組換え反応に基質
に用いる野生型loxP配列と変異型loxP配列とを有する直
鎖状DNAを調製するため以下の操作を行った。プラスミ
ドpBLAmutantには、挿入したアデノウイルスゲノム部分
に制限酵素NcoIサイトが一ヶ所存在するので、このプラ
スミドを制限酵素NcoIで消化し直鎖状DNAとし、反応液
をアガロース電気泳動後約8.2kbのバンドを切り出し、G
EANCLEAN II（フナコシ社製）を用いて精製した。この
8.2kbの直鎖状DNAを次に示す反応の基質として用いた。
【0072】（２）野生型loxP配列と変異型loxP配列との間
でのCre依存組換え反応 前述した基質DNAを実施例１−（４）で示した反応液に
加え、37℃で30分Cre依存組換え反応を行った。反応終
了後、反応液に45μlのＴＥバッファー（pH8.0）及び5
μlのEDTA溶液（pH8.0）を加え、フェノール／クロロホ
ルム抽出ならびにクロロホルム抽出を行い、さらにエタ
ノール沈殿し、得られたDNAをRNaseA(20μg/ml)を含む
ＴＥバッファー（pH8.0） 30μlに溶解した。次いで、
その半量を制限酵素DraI消化し、アガロースゲル電気泳
動後、臭化エチジウム（EtBr）染色により検出されたDN
Aのバンドを解析した。
【0073】基質として用いた直鎖状DNAには、野生型loxP
配列と変異型loxP配列との間にDraIサイトが２ヶ所存在
するので、Creによる組換えが起きない場合は、DraI消
化により5.9kb、1.3kb、0.7kbの３本のバンドが生じる
（図１０）。一方、基質DNAがCreにより組換え反応を起
こすと、２ヶ所のDraIサイト及びloxP配列一つを含む約
4kbの環状DNAと、一つのloxP配列を含みDraIサイトが存
在しない約3.8kpの直鎖状DNAが生じるので、DraI消化に
より3.8kb、3.3kb、0.7kbの３本のバンドが生じる。従
って、3.8kb及び3.3kbのバンドの存在はCreによる組換
え反応が起きたことを示し、5.9kb及び1.3kbのバンド存
在ははCreによる組換え反応が起きていないことを示す
ので、これらのバンドの量比により組み換え反応の効率
が分かる。さらに、実施例２−（２）で説明した反応の
中間体は、このアッセイでは10数kbの位置に検出され
た。結果を以下にまとめた。 #11,81 ：反応は最終段階まで進む； #21,22,23,31,41：反応は中間体で止まり、最終段階ま
で進まない； #51 ：反応は大部分中間体で止まるが、ごく一部
最終段階まで進む； #61 ：中間体はほとんどできないが、一部最終段
階まで進む； #71 ：中間体はほとんどできないが、一部最終段
階まで進む（最終産物は#72,73より多い）； #72,73 ：中間体はほとんどできないが、ごく一部最
終段階まで進む； 以上の結果より、実施例２よりも感度の高い方法でアッ
セイを行っても傾向は同じで、野生型loxP配列との間で
は特異的DNA組換え反応が起きないと報告（Hoess et a
l., Nucleic Acids Res., Vol.14, 2287-2300(1986)）
されている変異型loxP配列（#71に相当）でも、野生型l
oxP配列との反応性は一部残っており、その程度（最終
反応物の量）は同じ箇所の置換である#72や#73よりも高
く、#71の置換は野生型loxP配列との反応性を欠失させ
るためには不十分であることが再度確認された。
【0074】実施例４ ＜２つの塩基を置換した変異型loxP配列と野生型loxP配
列との間でのCre依存組換え反応＞
【0075】（１）野生型loxP配列と変異型loxP配列との間
でのCre依存組換え反応 〔1〕野生型loxP配列と変異型loxP配列とを含む基質DNA
の調製 直鎖状DNAの片側の端に野生型loxP配列を、他方に変異
型loxP配列を有する基質DNAを実施例２−（１）−〔2〕
に示した方法に従い調製した。すなわち、プラスミドpB
R322に野生型loxP配列が１個挿入されたプラスミドpBRw
t（実施例２−（１）−〔1〕に記載）の制限酵素SalIサ
イトに、各々の２塩基置換した変異型loxP合成DNA（図
４及び図５参照）をligationした直鎖状DNAを基質DNAと
して調製した。 〔2〕Cre依存組換え反応（その１） 〔1〕で調製した基質DNAを用い、実施例１−（４）に示
した方法でCre依存組換え反応を行い解析した。その結
果を表２（右欄）に示す。
【表２】 （表中、反応の中間体及び最終反応体の量を０〜９まで
の10段階で表示した。数字が大きいほど生成量が多い。
２つの野生型loxp配列間で反応を行った場合の最終反応
体の量（DNAバンドの濃さ）を最大の「９」とし、DNAの
バンドがほとんど検出できない場合（「９」の５％未
満）を「０」とした。反応の中間体の詳細については、
実施例２−（２）での説明を参照されたい。） #6171の変異型loxP配列を用いた場合は最終反応体（920
bp）が一部認められ、野生型loxP配列との間で組み換え
反応が生じた。しかし、それ以外の解析された変異型lo
xP配列は野生型loxP配列とは全く反応せず、その程度は
１塩基置換の変異型loxP配列の場合よりもさらに少なか
った。 〔3〕野生型loxP配列と変異型loxP配列とを有するプラ
スミドの構築 #2171、#2272、#2373の変異型loxP合成DNAを用い、実施例
２−（１）−〔2〕及び３−（１）−〔1〕に示した方法
で、野生型loxP配列と変異型loxP配列とを有するプラス
ミドpBLAmutant(8.2kb、図９参照)を３種類構築した。 〔4〕Cre依存組換え反応（その２） 〔3〕で構築したプラスミドを制限酵素NheIで消化し、
実施例３−（１）−〔2〕に示した方法で野生型loxP配
列と変異型loxP配列とを有する直鎖上の基質DNA(8.2kb)
を調製した。この基質DNAを用い、実施例３−（２）で
示した方法でCre依存組換え反応を行い解析した。その
結果、３種類の変異型loxP配列いずれの場合とも、反応
の中間体及び最終反応体はほとんど生じなかった。すな
わち、２塩基を置換した変異型loxP配列は、野生型loxP
配列との組換え反応をほとんど起こさず、反応の特異性
は１塩基置換の変異型loxP配列の場合よりもさらに高ま
ったことが示された。
【0076】（２）２つの同じ配列の変異型loxP配列間での
Cre依存組換え反応 〔1〕２つの変異型loxP配列を含む基質DNAの調製 29種類の変異型loxP配列（図４及び図５参照）につい
て、実施例１−（３）に示した方法で直鎖状DNAの両端
に同じ配列の変異型loxP配列を有する基質DNAを調製し
た。すなわち、上記変異型loxP合成DNAを、制限酵素Nhe
I及びSalIで同時に消化したプラスミドpBR322にそれぞ
れligationし、pBR322 DNAの両端に同じ配列の変異型lo
xP合成DNAが結合した約4.1kbの直鎖状DNAを調製した。 〔2〕Cre依存組換え反応（その１） 〔1〕で調製した基質DNAを用い、実施例１−（４）に示
した方法でCre依存組換え反応を行い解析した。その結
果を表２（左欄）に示す。#2173や#2372のように全く組
換え反応が起こらない変異型loxP配列もあったが、#227
1、#2272、#3171、#3371、#4171、#6171、#6171は１塩基置換
の変異型loxP配列とほぼ同程度、#2171、#2273、#3271、#4
172は１塩基置換の変異型loxP配列の半分程度の効率で
組換え反応が起きていることを確認した。 〔3〕変異型loxP配列を一つ有するプラスミドの構築 #2171、#2272、#2373の変異型loxP合成DNAを用い、実施例
２−（１）−〔1〕に示した方法で、プラスミドpBR322
のNheIサイトとEcoNIサイトとの間にそれぞれの変異型l
oxP配列を一つ挿入した３種類のプラスミド（pBR2171、p
BR2272、pBR2373、各4.4kb、図７参照)を構築した。 〔4〕２つの同じ配列の変異型loxP配列を有するプラス
ミドの構築 〔3〕で構築した３種類のプラスミド（pBR2171、pBR227
2、pBR2373）をそれぞれ制限酵素SalIで消化し、プラス
ミドに挿入されているのと同じ配列の変異型loxP合成DN
A（#2171、#2272、#2373）をそれぞれligtion後、実施例
２−（１）−〔2〕及び実施例３−（１）−〔1〕に示し
た方法で、２つの同じ配列の変異型loxP配列を有する３
種類のプラスミド（pBLA2171x2、 pBLA2272x2、 pBLA2373
x2、各8.2kb、図９参照）を構築した。 〔5〕Cre依存組換え反応（その２） 〔4〕で構築した３種類のプラスミドを制限酵素NheIで
それぞれ消化し、実施例３−（１）−〔2〕に示した方
法で２つの同じ配列の変異型loxP配列を有する直鎖上の
基質DNA(8.2kb)を調製した。この基質DNAを用い、実施
例３−（２）で示した方法でCre依存組換え反応を行い
解析した。その結果、変異型loxP配列#2272間での組換
え反応は、野生型loxP配列間での組換え反応とほぼ同程
度の非常に高い効率であった。変異型loxP配列#2171
は、一部中間体で反応が止まるものの最終段階まで反応
は進行した。一方、変異型loxP配列#2373は反応はほと
んど中間体でとまり、最終段階まで進まなかった。
【0077】（３）異なる配列の変異型loxP配列間でのCre
依存組換え反応の検討 〔1〕異なる配列の変異型loxP配列を有するプラスミド
の構築 （２）−〔3〕で構築したプラスミドpBR2171及びpBR227
2をそれぞれ制限酵素SalIで消化し、プラスミドに挿入
されている変異型loxP配列とは異なる配列の変異型loxP
合成DNA（pBR2171は#2272もしくは#2373と、pBR2272は#
2373と）とligtion後、実施例２−（１）−〔2〕及び実
施例３−（１）−〔1〕に示した方法で、２つの異なる
配列の変異型loxP配列を有する３種類のプラスミド（pB
LA2171-2272、pBLA2171-2373、pBLA2272-2373、各8.2kb、
図４参照）を構築した。 〔2〕Cre依存組換え反応 〔1〕で構築したプラスミドを制限酵素NheIで消化し、
実施例３−（１）−〔2〕に示した方法で２つの異なる
配列の変異型loxP配列を有する直鎖上の基質DNA(8.2kb)
を調製した。この基質DNAを用い、実施例３−（２）で
示した方法でCre依存組換え反応を行い解析した。その
結果、３種の異なる配列（#2171、#2272、#2373）の変異
型loxP配列間では、いずれの組み合わせともCre依存組
換え反応は全く起きなかった。すなわち、それぞれの変
異型loxP配列は他のloxP配列と交叉反応しないことが示
された。
【0078】以上、（１）から（３）の結果より、２つの塩
基を同時に置換した変異型loxP配列は、一塩基のみ置換
した変異型loxP配列より認識特異性が高まった。すなわ
ち、２つの塩基を同時に置換した変異型loxP配列は、野
生型loxP配列及び異なる変異型loxP配列とは反応せず、
かつ同じ配列の変異型loxP配列どうしでは野生型loxP配
列どうしと同程度反応することが明らかに示された。さ
らに、変異の部位としては、loxP配列のスペーサー領域
の２番目、３番目、４番目、５番目の内うちの一つの塩
基と、７番目の塩基との組み合わせが好ましく、かつ同
じ塩基部位であっても置換する塩基の種類により、反応
性及び反応特異性が異なることが示された。以上の結果
より、本発明の目的とする変異型loxP配列として、具体
的には#2171(配列番号:26)、 #2271(配列番号:29)、 #227
2(配列番号:30)、 #3171(配列番号:35)、 #3371(配列番
号:39)、 #4171(配列番号:42)、 #5171(配列番号:49)など
が挙げられる。
【0079】実施例５ ＜野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入された
遺伝子の置換に必要なプラスミド及びコスミドベクター
の構築＞
【0080】（１）遺伝子置換のターゲット側のプラスミド
及びコスミドベクターの構築 〔1〕２つの野生型loxP配列間にクローン化部位（SwaI
サイト）を持つプラスミド（puLwL）の構築 プラスミドpUC119の制限酵素Ecl136IIサイトに、野生型
loxP配列が同方向に２つ挿入されたプラスミドpuLL（鐘
ケ江ら、Nucleic acids Res.,Vol.23, 3816-3821(199
5)）の、２つのloxP配列間に存在するクローン化部位を
制限酵素NruIサイトからSwaIサイトに変えるため以下の
操作を行った。puLLを制限酵素NruIで消化し、SwaIリン
カー（5'-pGATTTAAATC-3'、配列願号：６１）をligatio
n後、再度NruIで消化した。NruIによる再度の消化は、S
waIリンカーが結合せずにNruIサイトが再生したプラス
ミドを除くために行った。反応液で大腸菌を形質転換
し、２つの野生型loxP配列間にクローン化部位としてSw
aIサイトを持つプラスミドpuLwL(3.3kb、図１１中のＡ)
を得た。
【0081】〔2〕野生型loxP配列と変異型loxP配列との間
にクローン化部位（SwaIサイト）を持つプラスミド（pu
LwM及びpuMwL）の構築 プラスミドpuLwLの２つの野生型loxP配列のうちの一つ
を変異型loxP配列に置換した２種類のプラスミドを構築
するため、以下の（Ａ）、（Ｂ）の各操作を行った。プ
ラスミドpuLwM（図１１中のＢ）は、同図に示したpuLwL
の左側の野生型loxP配列を、プラスミドpuMwL（図１１
中のＣ）は右側の野生型loxP配列をそれぞれ変異型loxP
配列に置換したものである。なお、ここで変異型loxP配
列として、野生型loxP配列のスペーサー部分の２番目と
７番目の塩基を同時に変異させた#2171(配列番号:26)の
配列を用いた。以下の実施例での変異型loxP配列とは、
全てこの配列のものである。 （Ａ）puLwMの構築 puLwLを制限酵素XhoIで消化し、変異型loxP配列を含む6
0bpの合成DNA（図１２、上側の鎖の配列番号：５７、下
側の鎖の配列番号：５８）をligation後大腸菌を形質転
換し、野生型loxP配列と変異型loxP配列間にSwaIサイト
を持つプラスミドpuLwM(3.3kb)を得た。さらに、このプ
ラスミドpuLwMの合成DNA部分の塩基配列を解読し、野生
型loxP配列及び変異型loxP配列が目的通り挿入されてい
ることを確認した。なお、用いた合成DNAは一方の端はX
hoI消化断片であるが他方はSalI消化断片になるように
設計したので、プラスミドpuLwMの野生型loxP配列内のX
hoIサイトは消滅している。 （Ｂ）puMwLの構築 puLwLを制限酵素MluIで消化し、変異型loxP配列を含む6
0bpの合成DNA（図１３、上側の鎖の配列番号：５９、下
側の鎖の配列番号：６０）をligation後大腸菌を形質転
換し、変異型loxP配列と野生型loxP配列間にSwaIサイト
を持つプラスミドpuMwL(3.3kb)を得た。さらに、プラス
ミドpuLwMの場合と同様、puMwLの合成DNA部分の塩基配
列を解読し確認した。なお、用いた合成DNAは一方の端
はMluI消化断片であるが他方はBssHII消化断片になるよ
うに設計したので、プラスミドpuMwLの野生型loxP配列
内のMluIサイトは消滅している。
【0082】〔3〕CAGプロモーターのクローン化部位に２つ
の野生型loxP配列を挿入したプラスミド（pCALL）の構
築 CAGプロモーターのプロモーター部とポリＡ配列との間
に２つの野生型loxP配列を挿入したプラスミドを得るた
め以下の両DNAを調製した。なお、ここに言うCAGプロモ
ーターとは、高発現ベクターとして特開平3-168087号公
報に開示されているものである。 (a)CAGプロモーターを含むプラスミドpCAGGS（Niwa et.
al., Gene, Vol.108, 193-200(1991)）のクローン化部
位であるEcoRIサイトをSwaIサイトに変えたプラスミドp
CAGw（特開平8-84589号公報10頁）を制限酵素SwaIで消
化したDNA。 (b)プラスミドpuLL（〔1〕に記載）を制限酵素BamHI及
びEcoRIで同時に消化し、さらにKlenow酵素により両端
を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により回収し
た２つの野生型loxP配列を含む約100bpのDNA断片。 (a)(b)両DNAを断片をligationし、制限酵素SwaI消化後
大腸菌を形質転換し、プラスミドpCALL(4.9kb)を得た。
【0083】〔4〕プラスミドpCALLのクローン化部位をSwaI
サイトに変えたプラスミド（pCALwL）の構築 プラスミドpCALLの２つのloxP配列間に存在するクロー
ン化部位を制限酵素NruIサイトからSwaIサイトに変える
ため以下の操作を行った。pCALLを制限酵素NruIで消化
し、SwaIリンカー（5'-pGATTTAAATC-3'、配列番号：６
１）をligation後、再度制限酵素NruIで消化した。NruI
による再度の消化の理由は〔1〕と同じである。反応液
で大腸菌を形質転換し、CAGプロモーター内に２つの野
生型loxP配列が存在し、かつその間にクローン化部位と
してSwaIサイトを持つプラスミドpCALwL(4.9kb、図１４
中のＤ)を得た。
【0084】〔5〕CAGプロモーター内に野生型loxP配列と変
異型loxP配列を挿入したプラスミド（pCALwM）の構築 プラスミドpCALwLの野生型loxP配列の一つを変異型loxP
配列に置換したプラスミドを得るため以下の両操作を行
った。 (a)プラスミドpCALwLを制限酵素MluI及びXhoIで同時に
消化後、アガロースゲル電気泳動により野生型loxP配列
を含まない約4.8kbの断片を回収した。 (b)プラスミドpuLwMを制限酵素MluI及びXhoIで同時消化
後アガロースゲル電気泳動し、野生型及び変異型loxP配
列を含む100bpのDNA断片を回収した。 (a)(b)で調製した両DNAをligation後大腸菌を形質転換
し、プラスミドpCALwM(4.9kb、図１４中のＥ)を得た。p
CALwMは、プロモーター／野生型loxP配列／SwaIサイト
（クローン化部位）／変異型loxP配列／ポリＡ配列の構
造を有するプラスミドである。
【0085】〔6〕組換えアデノウイルス作製用コスミドベ
クター（pAxCALwM）の作製 〔5〕で作製したプラスミドpCALwMの、プロモーターか
らポリＡ配列までの部分を挿入したコスミドベクターを
作製するため以下の両操作を行った。なお、コスミドベ
クターの作製は既存の方法（Miyake et al., Proc.Nat
l.Acad.Sci., Vol.93, 1320-1324(1996)、及び特開平7-
298877号公報）に従った。 (a)アデノウイルス５型のE1及びE3遺伝子以外のほぼ全
長が挿入されたカセットコスミドpAxcw（特開平8-30858
5号公報15頁）を制限酵素SwaIで消化した。 (b)プラスミドpCALwMを制限酵素ApaLI及びHindIII及びH
incIIで同時消化し、さらにKlenow酵素により両端を平
滑化後、反応液をアガロースゲル電気泳動し約2.4kbの
断片を回収した。 (a)(b)で調製した両DNAをligation後、反応液の一部を
ラムダ・イン・ビトロ・パッケージングキット（ギガパ
ックXL、Stratagene社製）を用いてパッケージング反応
を行い、反応液を大腸菌に感染させカセットコスミドpA
xCALwM(44.9kb)を得た。
【0086】（２）遺伝子置換のターゲット側のプラスミド
の構築 〔1〕野生型loxP配列と変異型loxP配列との間にlacZ遺
伝子を挿入したプラスミド（puLZM）の構築 プラスミドpuLwM（（１）−〔2〕に記載）の野生型loxP
配列と変異型loxP配列との間に大腸菌lacZ遺伝子を挿入
したプラスミドを得るため以下の両操作を行った。 (a)プラスミドpuLwMを制限酵素SwaIで消化後、アガロー
スゲル電気泳動により直鎖状のDNA断片を回収した。 (b)プラスミドpSRlacZ（Miyake et al., Proc.Natl.Aca
d.Sci., Vol.93, 1320-1324(1996)）を制限酵素SalI及
びPstIで同時に消化し、さらにKlenow酵素により両端を
平滑化した後、アガロースゲル電気泳動によりlacZ遺伝
子を含む約3.1kbのDNA断片を回収した。 (a)(b)で調製した両DNAをligationし、制限酵素SwaI消
化後大腸菌を形質転換し、プラスミドpuLZM(6.4kb、図
１５中のＦ)を得た。
【0087】〔2〕野生型loxP配列と変異型loxP配列との間
にSV40の複製オリジン（ori）及びポリＡ配列を挿入し
たプラスミド（puMOL）の構築 プラスミドpuMwLの野生型loxP配列と変異型loxP配列と
の間にをSV40のori及びポリＡ配列挿入したプラスミド
を得るため以下の両操作を行った。 (a)プラスミドpuMwL（（１）−〔2〕に記載）を制限酵
素SwaIで消化後、アガロースゲル電気泳動により直鎖状
のDNA断片を回収した。 (b)プラスミドpCAGGS（（１）−〔3〕に記載）を制限酵
素BamHI消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化
した後、アガロースゲル電気泳動によりSV40のori及び
ポリＡ配列を含む約340bpのDNA断片を回収した。 (a)(b)で調製した両DNAをligationし、制限酵素SwaI消
化後大腸菌を形質転換し、プラスミドpuMOL(3.6kb、図
１５中のＧ)を得た。
【0088】〔3〕野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型lox
P配列／SV40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列を挿
入したプラスミド（puLZMOL）の構築 プラスミドpuLZMから変異型loxP配列を除き、プラスミ
ドpuMOLの、変異型loxP配列／SV40のori及びポリＡ配列
／野生型loxP配列を含む断片を挿入するため以下の操作
を行った。 (a)プラスミドpuLZMを制限酵素NheI及びXhoIで同時に消
化後、アガロースゲル電気泳動により野生型loxP配列と
lacZ遺伝子を含む約6.4kbのDNA断片を回収した。 (b)プラスミドpuMOLを制限酵素NheI及びXhoIで同時に消
化後、アガロースゲル電気泳動により、変異型loxP配列
／SV40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列を含む約4
40bpのDNA断片を回収した。 (a)(b)で調製した両DNAをligationし、制限酵素SwaI消
化後大腸菌を形質転換し、プラスミドpuLZMOL(6.8kb、
図１６中のＨ)を得た。
【0089】〔4〕プラスミドpuLZMOLのlacZ遺伝子の5'上流
にチミジンキナーゼ遺伝子のポリＡ配列を挿入したプラ
スミド（puALZMOL）の構築 単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1）のチミジンキナー
ゼ（TK）遺伝子のポリＡ配列を、プラスミドpuLZMOLに
挿入したプラスミドを構築するため次の両操作を行っ
た。 (a)プラスミドpuLZMOLを、lacZ遺伝子の5'上流側の野生
型loxP配列の5'上流で一ヶ所切断したDNA断片を得るた
め以下の操作を行った。puLZMOLを制限酵素SmaIで消化
し次いで制限酵素KpnIで消化後、アガロースゲル電気泳
動により約6.8kbの直鎖状DNA断片を回収した。 (b)プラスミドpTKは、HSV-1のTK遺伝子を含む約3.6kbの
BamHI消化断片が、pBR322のBamHIサイトに挿入されたプ
ラスミドである（M.Wigler et. al. Cell, Vol.14. 725
-731(1978)）。pTKを制限酵素SmaI及びNcoI消化する
と、約320bpのTK遺伝子のポリＡ配列が切り出せる。か
つ切り出したDNA断片の両端をSmaI及びKpnIサイトにす
るため以下の操作を行った。プラスミドpTKを制限酵素N
coIで消化し、Klenow酵素により両端を平滑化した。次
いで、KpnIリンカー（5'-pGGGTACCC-3'）をligationし
た後、制限酵素KpnIで消化した。さらに、制限酵素SmaI
消化後アガロースゲル電気泳動を行い、TK遺伝子のポリ
Ａ配列を含む約320bpのDNA断片を回収した。 (a)(b)で調製した両DNAをligation後、大腸菌を形質転
換しプラスミドpuALZMOL(7.1kb、図１６中のＩ)を得
た。puALZMOLは、TK遺伝子のポリＡ配列／野生型loxP配
列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及びポリ
Ａ配列／野生型loxP配列、の構造を有するプラスミドで
ある。なお、この過程でTK遺伝子のポリＡ配列を挿入し
たのは、これら一連の遺伝子を有する組換えアデノウイ
ルスを作製した場合、挿入部位の上流にある未同定のア
デノウイルス由来のプロモーターからlacZ遺伝子の転写
が起こらないようにするためである。
【0090】〔5〕組換えアデノウイルス作製用コスミドベ
クター（pAxALZMOL）の作製 プラスミドpuALZMOLの挿入遺伝子（TK遺伝子のポリＡ配
列／野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV
40のori及びポリＡ配列／野生型loxP配列）を挿入した
コスミドベクターを作製するため以下の操作を行った。
プラスミドpuALZMOLを制限酵素XbaI及びXhoI及びDraIで
同時消化し、さらにKlenow酵素により両端を平滑化後、
反応液をアガロースゲル電気泳動し約4.5kbのDNA断片を
回収した。このDNA断片と制限酵素SwaIで消化したカセ
ットコスミドpAxcw（（１）−〔6〕で調製）とをligati
onし、制限酵素SwaIで消化後、反応液の一部をラムダ・
イン・ビトロ・パッケージングキット（ギガパックXL、
Stratagene社製）を用いてパッケージング反応を行い、
反応液を大腸菌に感染させカセットコスミドpAxALZMOL
(46.7kb)を得た。
【0091】実施例６ ＜遺伝子置換に必要な組換えアデノウイルスの作製＞ （１）遺伝子置換のターゲット用組換えアデノウイルス
（AxCALwM）の作製 非増殖型アデノウイルスベクター（E1及びE3遺伝子を欠
失）のE1遺伝子欠失部位に、プロモーター／野生型loxP
配列／SwaIサイト（クローン化部位）／変異型loxP配列
／ポリＡ配列、を挿入した組換えアデノウイルスを作製
するため以下の操作を行った。なお、組換えアデノウイ
ルスの作製は既存の方法（Miyake et al., Proc.Natl.A
cad.Sci., Vol.93, 1320-1324(1996)、及び特開平7-298
877号公報）に従った。E3遺伝子を欠失したヒトアデノ
ウイルス５型由来株であるAd5-dlX（I.Saito et al.,
J.Virol., Vol.54, 711-719(1985)）のウイルスDNA−末
端蛋白質複合体を制限酵素EcoT22I消化した。このウイ
ルスDNA−末端蛋白質複合体と、実施例５−（１）−
〔6〕で作製したコスミドベクターpAxCALwMとを用いリ
ン酸カルシウム共沈法で293細胞を形質転換した。生じ
た組換えアデノウイルスのクローニングならびにウイル
スの選別を行い、目的の組換えウイルスAxCALwM（図１
７）を得た。この組換えウイルスを継代し、高力価の４
次ウイルス液もしくは５次ウイルス液をCsCl超遠心法に
て精製（Y.Kanegae et al., Jpn.J.Med.Sci.Biol., Vo
l.47, 157-166(1994)）したウイルス液を以後の実験に
用いた。
【0092】（２）遺伝子置換のドナー用組換えアデノウイ
ルス（AxALZMOL）の作製 非増殖型アデノウイルスベクター（E1及びE3遺伝子を欠
失）のE1遺伝子欠失部位に、TK遺伝子のポリＡ配列／野
生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のor
i及びポリＡ配列／野生型loxP配列、を挿入した組換え
アデノウイルスを作製するため以下の操作を行った。制
限酵素EcoT22I消化したAd5-dlXのウイルスDNA−末端蛋
白質複合体と、実施例５−（２）−〔5〕で作製したコ
スミドベクターpAxALZMOLとをリン酸カルシウム共沈法
で293細胞を形質転換し、（１）と同様の方法で目的の
組換えウイルスAxALZMOL（図１７）を得た。この組換え
ウイルスも４次ウイルス液もしくは５次ウイルス液をCs
Cl超遠心法にて精製したウイルス液を以後の実験に用い
た。
【0093】実施例７ ＜細胞の染色体上に存在する遺伝子の置換に用いる細胞
株の作製＞ （１）ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を発現する遺伝子
置換用細胞株の作製 〔1〕野生型loxP配列と変異型loxP配列との間にクロー
ン化部位を有するレポーター遺伝子挿入用プラスミド
（pCALwMds）の構築 実施例５−（１）−〔5〕で作製したプラスミドpCALwM
（図１４中のＥ）は、プラスミドpCAGGS（実施例５−
（１）−〔3〕に記載）のCAGプロモーター内のクローン
化部位であるEcoRIサイトに、野生型loxP配列／クロー
ン化部位（SwaIサイト）／変異型loxP配列を挿入したプ
ラスミドである。このpCALwMから、SV40のori及びポリ
Ａ配列を除く目的で以下の操作を行った。pCALwMをBamH
I消化しSV40のori及びポリＡ配列を除き、次いで自己li
gtion後大腸菌を形質転換しプラスミドpCALwMds(4.6k
b、図１８中のＡ)を得た。
【0094】〔2〕ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を挿入し
たプラスミド（pCALhmBMds）の構築 プラスミドpCALwMdsのSwaIサイトにハイグロマイシンＢ
耐性遺伝子を挿入したプラスミドを構築するため、以下
の両DNAを調製した。 (a)プラスミドpCALwMdsを制限酵素SwaIで消化したDNA断
片。 (b)プラスミドpCHD2L（Ikeda et al., Gene, Vol.71, 1
9-27(1988)）を制限酵素SmaI及びDraIで同時に消化後、
アガロース電気泳動により回収したハイグロマイシンＢ
耐性遺伝子を含む約1.1kbのDNA断片。 (a)(b)両DNAをligation後大腸菌を形質転換し、プラス
ミドpCALhmBMds(5.7kb、図１８中のＢ)を得た。pCALhmB
Mdsは、ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子がCAGプロモータ
ー内の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入さ
れたプラスミドである。
【0095】〔3〕ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子を発現す
る形質転換細胞株の作製。 細胞の染色体上に、プロモーター／野生型loxP配列／ハ
イグロマイシンＢ耐性遺伝子／変異型loxP配列／ポリＡ
配列、の外来DNAを１コピー有する形質転換細胞株を得
るため、以下の操作を行った。なお、細胞の形質転換
は、Chen-Okayama法によるリン酸カルシウム-DNA共沈殿
法にて行った。 (i)〔2〕で調製したプラスミドpCALhmBMds 20μgを終濃
度250mMの塩化カルシウム溶液に溶解（液量100μl）
し、100μlの2 x BBS溶液（50mM N,N-bis[2-hydroxyeth
yl]-2-aminoethane sulfonic acid／280mM NaCl2／1.5m
M Na2HPO4 (pH6.95)）を加えた後、5% FCS添加DMEM培地
で培養した6cmシャーレのCV-1細胞に添加し、3% CO2存
在下35℃で約24時間培養した。 (ii)培養液を除き、PBS(-)で細胞を洗浄後、10% FCS添
加DMEM培地を添加し、5%CO2存在下37℃で一晩培養し
た。 (iii)6cmシャーレから細胞をはがし96穴プレートにまき
かえ、さらに一晩培養後、培養液に終濃度0.4mg/mlのハ
イグロマイシンＢを含む培地を添加し、さらに培養を続
け、３から４日おきにハイグロマイシンＢを含む培地を
交換した。 (iv)約３週間後に生存している細胞（ハイグロマイシン
Ｂ耐性細胞株）をクローン化し、拡大培養後細胞のゲノ
ムDNAを抽出した。形質転換に用いたプラスミドpCALhmB
Mdsには認識部位が存在しない制限酵素PvuIIで、このゲ
ノムDNAを消化後電気泳動し、プラスミドpCALhmBMdの全
長をプローブに用いてサザンブロットを行い、細胞の染
色体上に目的の遺伝子が１コピーのみ挿入された形質転
換細胞を18株得た。なお、目的の遺伝子が１コピーのみ
挿入されていることは、プラスミドpCALhmBMdに認識部
位が一ヶ所のみ存在する制限酵素EcoRIで、細胞のゲノ
ムDNAを消化後に行ったサザンブロットでも確認した。
【0096】（２）ブレオマイシン耐性遺伝子を発現する遺
伝子置換用細胞株の作製 〔1〕ブレオマイシン耐性遺伝子を挿入したプラスミド
（pCALGFBMds）の構築 プラスミドpCALwMdsのSwaIサイトにブレオマイシン耐性
遺伝子を挿入したプラスミドを構築するため、以下の操
作を行った。プラスミドpTracer-CMV（Invitogen社製）
を制限酵素PmaCI消化後アガロース電気泳動を行い、緑
色蛍光蛋白質（green fluorescent protein：GFP）とブ
レオマイシン耐性遺伝子との融合蛋白質の遺伝子を含む
約1.1kbのDNA断片を回収した。このDNA断片と、制限酵
素SwaI消化したプラスミドpCALwMds（（１）−〔2〕で
調製）とをligationし、制限酵素SwaI消化後大腸菌を形
質転換しプラスミドpCALGFBMds(5.7kb、図１８中のＣ)
を得た。pCALGFBMdsは、GFPとブレオマイシン耐性遺伝
子との融合蛋白質の遺伝子がCAGプロモーター内の野生
型loxP配列と変異型loxP配列との間に挿入されたプラス
ミドである。
【0097】〔2〕ブレオマイシン耐性遺伝子を発現する形
質転換細胞株の作製。 細胞の染色体上に、プロモーター／野生型loxP配列／GF
Pとブレオマイシン耐性遺伝子との融合蛋白質の遺伝子
／変異型loxP配列／ポリＡ配列、の外来DNAを１コピー
有する形質転換細胞株を得るため、以下の操作を行っ
た。基本的には、（１）−〔3〕で示したハイグロマイ
シンＢ耐性細胞株の作製方法と同じであるので、以下に
相違点のみ示す。CV-1細胞の形質転換は、〔2〕で作製
したプラスミドpCALGFBMdsを用いた。形質転換細胞株の
選択薬剤は、ブレオマイシン（終濃度0.4mg/ml）を用い
た。目的の遺伝子が１コピーのみ挿入された形質転換細
胞を選択するためのサザンブロットは、pCALGFBMdsの全
長をプローブに用いて行った。得られたブレオマイシン
耐性細胞株（全て目的の遺伝子が１コピーのみ挿入）
を、挿入遺伝子の発現の強弱により分類するため、GFP
の発現量を測定した。GFPの発現量は、478nmの励起光に
より発光した507nmの蛍光を観測することにより行い、G
FPの発現の強い細胞株（C18, C35）、中程度の細胞株
（C29, C38）、弱い細胞株（C19, C30）に分類された
（数字は細胞株の番号）。
【0098】実施例８ ＜アデノウイルスゲノム上に存在する遺伝子の置換＞野
生型loxP配列と変異型loxP配列との組み合わせにより、
プラスミドDNA（環状DNA）上に存在するlacZ遺伝子をア
デノウイルスゲノム上に置換できることを実証するため
に以下の実験を行った。本実験の原理は次の通りである
（図１７）。実施例６で作製したドナー用組換えアデノ
ウイルスAxALZMOLは、TK遺伝子のポリＡ配列／野生型lo
xP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列／SV40のori及び
ポリＡ配列／野生型loxP配列、が挿入されている。この
ウイルスと実施例１で示したCre発現組換えアデノウイ
ルスAxCANCreとを培養細胞に同時感染すると、２つの野
生型loxP配列間で特異的組換え反応が起こり、TK遺伝子
のポリＡ配列／野生型loxP配列を有するアデノウイルス
(a)と、野生型loxP配列／lacZ遺伝子／変異型loxP配列
／SV40のori及びポリＡ配列、の構造を有する環状DNA
(b)が生じる。２つの野生型loxP配列を挿入した組換え
アデノウイルスとCre発現組換えアデノウイルスとを用
いたこの反応の効率は非常に高く（鐘ケ江ら、Nucleic
acids Res.,Vol.23, 3816-3821(1995)）、ほぼ100%の培
養細胞でアデノウイルス(a)と環状DNA(b)が生成するこ
とが予測される。環状DNA(b)は、SV40 oriのプロモータ
ーを有するが、その転写は直後のSV40ポリＡ配列により
ブロックされるため、lacZ遺伝子は発現しない。この環
状DNA(b)が生成した細胞に、さらに実施例６で作製した
ターゲット用組換えアデノウイルスAxCALwMを感染させ
ると、環状環状DNA(b)とAxCALwMとの間で組み換え反応
が起こり、野生型loxP配列及び変異型loxP配列を各２ヶ
有する中間体を経て、プロモーター／野生型loxP配列／
lacZ遺伝子／変異型loxP配列／ポリＡ配列の構造を有す
るアデノウイルス(c)が生成する。アデノウイルス(c)で
はlacZ遺伝子が発現し、lacZ遺伝子にコードされるβ-
ガラクトシダーゼが産生され、以下に示す染色操作によ
り細胞は青く染色される。
【0099】実際の実験では、ドナー用組換えアデノウイル
スAxALZMOL、Cre発現組換えアデノウイルスAxCANCre、
ターゲット用組換えアデノウイルスAxCALwMの３種類の
ウイルスを同時に培養細胞（CV-1細胞もしくはCOS-1細
胞）に感染させた。それぞれのウイルスのmoi（重複感
染度）は次の通りである。ターゲット用組換えアデノウ
イルス：moi=9、Cre発現組換えアデノウイルス：moi=5
または15、ドナー用組換えアデノウイルス：moi=10、3
0、60、100、200。１時間のウイルス感染後、培地を加
え培養した。３日後、培養液を除きPBS(-)で細胞面を洗
浄後、0.25%グルタルアルデヒド液を加え4℃で10分間細
胞を固定後、再度PBS(-)洗浄し、X-Gal染色液（5mMフェ
リシアン化カリウム／5mMフェロシアン化カリウム／2mM
塩化マグネシウム／1mg/ml X-Gal(5-Bromo-4-Chloro-3-
Indolyl-b-D-Galactoside)／PBS(-)）を加え一晩染色し
た。その結果を図１９に示す。
【0100】図１９は、Cre発現組換えアデノウイルスをmoi
=15でCV-1細胞に感染させた場合の結果である。ドナー
用組換えアデノウイルスのmoi=60では約60%、moi=100で
は約90%の細胞が青く染色された。また図１９には示し
ていないが、ドナー用組換えアデノウイルスのみ、及び
ドナー用組換えアデノウイルスとCre発現組換えアデノ
ウイルスを同時に感染させても青く染色される細胞は全
く存在しなかった。さらに、Cre発現組換えアデノウイ
ルスをmoi=5で感染させた場合、及びCOS-1細胞を用いて
同じ実験を行った場合も図１９とほぼ同様の結果であっ
た。
【0101】以上の結果は、ドナー用組換えアデノウイルス
のゲノム上に存在するlacZ遺伝子が、ターゲット用組換
えアデノウイルスのゲノム上に挿入され、lacZ遺伝子が
プロモーターと直結しβ-ガラクトシダーゼが発現した
結果、細胞が青く染色されたことを示す。すなわち、ド
ナー用組換えアデノウイルスのゲノム上の野生型loxP配
列と変異型loxP配列との間に存在するlacZ遺伝子が、環
状DNAの形を介して、ターゲット用組換えアデノウイル
スのゲノム上の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間
に非常に高い効率で置換されたことを明らかに証拠づけ
るものである。
【0102】実施例９ ＜細胞の染色体上に存在する遺伝子の置換＞実施例８で
は、環状DNA上に存在する遺伝子をアデノウイルスのゲ
ノムに置換できることを示したが、細胞の染色体上の遺
伝子も置換できることを実証するため以下の実験を行っ
た。その原理は実施例８と同じであるが、ターゲット用
組換えアデノウイルスの代わりに、実施例７で作製した
プロモーター／野生型loxP配列／ハイグロマイシンＢ耐
性遺伝子／変異型loxP配列／ポリＡ配列、のDNAが染色
体上に１コピー挿入された形質転換細胞株（ターゲット
細胞）を用いた（図２０）。
【0103】実施例７で作製したハイグロマイシンＢ耐性の
任意の６株のターゲット細胞（C3、C7、C8、C11、C19、
C28）に、それぞれCre発現組換えアデノウイルスAxCANC
reをmoi=5で、ドナー用組換えアデノウイルスAxALZMOL
をmoi=10、30、100、300で同時に１時間感染させ、培地を
添加し培養した。３日後に、実施例８と全く同じ操作を
行いβ-ガラクトシダーゼが発現した細胞を染色した。
結果を図２１に示す。細胞株により頻度は異なるが、ド
ナー用組換えアデノウイルスをmoi=100で感染した場
合、10%（C19）から30%（C8）の細胞が青く染色され
た。ドナー用組換えアデノウイルスをmoi=300で感染す
ると、青く染色された細胞の割合はさらに増えたが、大
量のアデノウイルス粒子による細胞毒性が認められた。
また図には示していないが、ドナー用組換えアデノウイ
ルスのみをmoi=100で感染しCre発現組換えアデノウイル
スが存在しない場合は青く染色された細胞は全く存在し
なかった。
【0104】以上の結果は、ドナー用組換えアデノウイルス
のゲノム上の野生型loxP配列と変異型loxP配列との間に
存在するlacZ遺伝子が、環状DNAの形を介して、ターゲ
ット細胞の染色体上の野生型loxP配列と変異型loxP配列
との間に高い効率で置換されたことを明らかに証拠づけ
るものである。
【0105】
【発明の効果】本発明によって、リコンビナーゼＣｒｅ
の存在下、野生型loxP配列とは組換え反応が起きず、か
つ同一配列の２つの変異型loxP配列での組換え反応は２
つの野生型loxP配列間と同程度の効率で起こる変異型lo
xP配列が提供される。さらに本発明によって、野生型lo
xP配列と変異型loxP配列、もしくは異なる配列の変異型
loxP配列の組み合わせにより、動物細胞をはじめとする
高等真核細胞で、効率の高い遺伝子挿入もしくは遺伝子
置換を行う方法が提供される。
【0106】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：２ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAGTGTATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATATTGTATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATACTGTATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：５ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAACGTATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAAAGTATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAAGGTATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：８ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATATATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：９ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATCTATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：１０ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATTTATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：１１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGCATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：１２ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGAATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：１３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGGATG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：１４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTGTG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：１５ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTTTG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：１６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTCTG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：１７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTACG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：１８ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTAAG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：１９ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTAGG CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：２０ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTATA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：２１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTATC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：２２ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTATT CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：２３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTATG TTATACGAAG TTAT 34 配列番号：２４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTATG GTATACGAAG TTAT 34 配列番号：２５ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTATG ATATACGAAG TTAT 34 配列番号：２６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAACGTATA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：２７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAACGTATC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：２８ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAACGTATT CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：２９ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAAAGTATA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３０ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAAAGTATC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAAAGTATT CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３２ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAAGGTATA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAAGGTATT CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３５ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATATATA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATATATC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATCTATA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３８ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATCTATC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：３９ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATTTATA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４０ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATTTATC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATTTATT CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４２ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGCATA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGCATC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGAATA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４５ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGAATC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４６ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGGATA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４７ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGGATC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４８ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGGATT CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：４９ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTGTA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：５０ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTTTC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：５１ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTCTT CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：５２ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTACA CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：５３ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTAAC CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：５４ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 配列 ATAACTTCGT ATAATGTAGT CTATACGAAG TTAT 34 配列番号：５５ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 配列 TCGAGGTGCA CATAACTTCG TATAATGTAT GCTATACGAA GTTATACGCG TT 52 配列番号：５６ 配列の長さ：５２ 配列の型：核酸 配列 CTAGAACGCG TATAACTTCG TATAGCATAC ATTATACGAA GTTATGTGCA CC 52 配列番号：５７ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 配列 TCGAGTCCGG AATAACTTCG TATAACGTAT ACTATACGAA GTTATGCTAG CATTTAAATG 60 配列番号：５８ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 配列 TCGACATTTA AATGCTAGCA TAACTTCGTA TAGTATACGT TATACGAAGT TATTCCGGAC 60 配列番号：５９ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 配列 CGCGCATTTA AATTCCGGAA TAACTTCGTA TAACGTATAC TATACGAAGT TATGCTAGCA 60 配列番号：６０ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 配列 CGCGTGCTAG CATAACTTCG TATAGTATAC GTTATACGAA GTTATTCCGG AATTTAAATG 60 配列番号：６１ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 配列 GATTTAAATC 10
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、野生型loxP配列の合成DNAの構造を示
す図である。（ｓ）はセンス鎖を、（ａ）はアンチセン
ス鎖を示す。
【図２】図２は、合成された１塩基置換の変異型loxP配
列のスペーサー領域の配列（センス鎖）を示す。
【図３】図３は、合成された１塩基置換の変異型loxP配
列のスペーサー領域の配列（アンチセンス鎖）を示す。
【図４】図４は、合成された２塩基置換の変異型loxP配
列のスペーサー領域の配列（センス鎖）を示す。
【図５】図５は、合成された２塩基置換の変異型loxP配
列のスペーサー領域の配列（アンチセンス鎖）を示す。
【図６】図６は、直鎖状DNAを基質とした場合の、変異
型loxP配列間でのリコンビナーゼCre依存組換え反応を
示す模式図である。「Ｍ」は変異型loxP配列を意味し、
文字上の矢印はloxP配列の向きを示す。数字はＢｓａＨ
Ｉ消化した場合の断片の長さ（ｂｐ）を示す。
【図７】図７は、プラスミドpBRwtの構造を示す模式図
である。「Ｌ」は野生型loxP配列を意味し、文字上の矢
印はloxP配列の向きを示す。ＡｐＲはアンピシリン耐性
遺伝子、ｏｒｉは大腸菌の複製オリジンを示す。
【図８】図８は、片方の端に野生型loxP配列が、他方の
端に変異型loxP配列が各一ヶ結合した直鎖状DNAを示す
模式図である。「Ｍ」は変異型loxP配列を、「Ｌ」は野
生型loxP配列を意味し、文字上の矢印はloxP配列の向き
を示す（以下の図でも同様である）。また、下向きの矢
印はＢｓａＨＩサイトを示し、数字はＢｓａＨＩ消化断
片の長さ（ｂｐ）を示す。
【図９】図９は、プラスミドpBLAmutantの構造を示す模
式図である。太線部分はpBR322由来であり、細線部分は
アデノウイルス由来である。
【図１０】図１０は、直鎖状DNAを基質とした場合の、
野生型loxP配列と変異型loxP配列間でのリコンビナーゼ
Cre依存組換え反応を示す模式図である。細い矢印はＤ
ｒａＩサイトを示す。
【図１１】図１１は、プラスミドpuLwL（Ａ）、プラス
ミドpuLwM（Ｂ）及びプラスミドpuMwL（Ｃ）の構造を示
す模式図である。
【図１２】図１２は、プラスミドpuLwMの構築に用いた
変異型合成ＤＮＡの配列を示す図である。中央の下線部
がloxP配列(34bp)、二重下線部がスペーサー領域(8bp)
であり、変異を導入した塩基は太字で表示してある。
【図１３】図１３は、プラスミドpuMwLの構築に用いた
変異型合成ＤＮＡの配列を示す図である。中央の下線部
がloxP配列(34bp)、二重下線部がスペーサー領域(8bp)
であり、変異を導入した塩基は太字で表示してある。
【図１４】図１４は、プラスミドpCALwL（Ｄ）及びプラ
スミドpCALwM（Ｅ）の構造を示す模式図である。ＣＡＰ
ｒｏはＣＡＧプロモーター、ＧｐＡはβ−グロビンポリ
Ａ配列を示す。
【図１５】図１５は、プラスミドpuLZM（Ｆ）及びプラ
スミドpuMOL（Ｇ）の構造を示す模式図である。ＳｐＡ
はＳＶ４０のｏｒｉ及びポリＡ配列を示す。
【図１６】図１６は、プラスミドpuLZMOL（Ｈ）及びプ
ラスミドpuALZMOL（Ｉ）の構造を示す模式図である。Ｔ
ｐＡはチミジンキナーゼのポリＡ配列を示す。
【図１７】図１７は、野生型loxP配列と変異型loxP配列
との組み合わせにより、プラスミドDNA（環状DNA）上に
存在するlacZ遺伝子をアデノウイルスゲノム上に挿入で
きることを示すための実験の模式図である。
【図１８】図１８は、プラスミドpCALwMds（Ａ）、プラ
スミドpCALhmBMds（Ｂ）及びプラスミドpCALGFBMds
（Ｃ）の構造を示す模式図である。ｈｍＢはハイグロマ
イシンＢ耐性遺伝子、ＧＦＢはＧＦＰとブレオマイシン
耐性遺伝子との融合遺伝子を示す。
【図１９】図１９は、アデノウイルスゲノム上の遺伝子
の置換実験の結果を示す図である。Cre発現組換えアデ
ノウイルスをmoi=15でターゲット用組換えアデノウイル
スをmoi=9でCV-1細胞に感染させた。ドナー用組換えア
デノウイルスのmoi=60では約60%、moi=100では約90%の
細胞が青く染色された。
【図２０】図２０は、野生型loxP配列と変異型loxP配列
との組み合わせにより、プラスミドDNA（環状DNA）上に
存在するlacZ遺伝子を細胞の染色体上の遺伝子に挿入で
きることを示すための実験の模式図である。
【図２１】図２１は、細胞の染色体上の遺伝子の置換実
験の結果を示す図である。ハイグロマイシンＢ耐性の任
意の６株のターゲット細胞（C3、C7、C8、C11、C19、C2
8）に、それぞれCre発現組換えアデノウイルスAxCANCre
をmoi=5で、ドナー用組換えアデノウイルスAxALZMOLをm
oi=10、30、100、300で同時に１時間感染させた。細胞株に
より頻度は異なるが、ドナー用組換えアデノウイルスを
moi=100で感染した場合、10%（C19）から30%（C8）の細
胞が青く染色された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92）

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の性質をもつ変異型loxP配列。 （ａ）大腸菌P1ファージ由来の下記の野生型loxP配列に
    おいて、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目
    （Ｔ）、３番目（Ｇ）、４番目（Ｔ）又は５番目（Ａ）
    の塩基のうち少なくとも一つの塩基及び６番目（Ｔ）又
    は７番目（Ｇ）の塩基のうち少なくとも一方の塩基が異
    なる塩基に置換され、スペーサー領域以外の領域は任意
    の塩基に置換されていてもよい配列からなり、 【化１】 （ｂ）リコンビナーゼCreの存在下でも野生型loxP配列
    との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらず、（ｃ）リ
    コンビナーゼCreの存在下、同一の配列を有するもう一
    つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が
    起こる。
  2. 【請求項２】 以下の性質をもつ変異型loxP配列。 （ａ）大腸菌P1ファージ由来の下記の野生型loxP配列に
    おいて、中央部の８塩基（スペーサー領域）の２番目
    （Ｔ）、３番目（Ｇ）及び４番目（Ｔ）の塩基から選ば
    れる一つの塩基が異なる塩基に置換され、スペーサー領
    域以外の領域は任意の塩基に置換されていてもよい配列
    からなり、 【化２】 （ｂ）リコンビナーゼCreの存在下でも野生型loxP配列
    との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が起こらず、（ｃ）リ
    コンビナーゼCreの存在下、同一の配列を有するもう一
    つの変異型loxP配列との間で特異的ＤＮＡ組換え反応が
    起こる。
  3. 【請求項３】 リコンビナーゼCreの存在下でも異なる
    配列を有するもう一つの変異型loxP配列との間で特異的
    ＤＮＡ組換え反応が起こらない、請求項１又は２記載の
    変異型loxP配列。
  4. 【請求項４】 配列番号：２６、配列番号：２９、配列
    番号：３０、配列番号：３５、配列番号：３９、配列番
    号：４２又は配列番号：４９で表される配列である請求
    項１記載の変異型loxP配列。
  5. 【請求項５】 請求項１ないし４いずれかに記載の変異
    型loxP配列を有するＤＮＡ。
  6. 【請求項６】 少なくとも一つの野生型loxP配列及び請
    求項１又は２記載の変異型loxP配列を少なくとも一つ有
    するＤＮＡ。
  7. 【請求項７】 野生型loxP配列と変異型loxP配列の間に
    所望の遺伝子が挿入された請求項６記載のＤＮＡ。
  8. 【請求項８】 互いに異なる配列をもつ少なくとも２つ
    の請求項３記載の変異型loxP配列を有するＤＮＡ。
  9. 【請求項９】 互いに異なる配列をもつ２つの変異型lo
    xP配列の間に所望の遺伝子が挿入された請求項８記載の
    ＤＮＡ。
  10. 【請求項１０】 請求項６ないし９いずれかに記載のＤ
    ＮＡによって形質転換された細胞。
  11. 【請求項１１】 下記のＤＮＡ（ａ）及びＤＮＡ（ｂ）
    をリコンビナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、下記のＤ
    ＮＡ（ｃ）を得ることからなる遺伝子置換方法。 （ａ）野生型loxP配列、遺伝子Ａ及び請求項１又は２記
    載の変異型loxP配列をこの順に有するＤＮＡ。 （ｂ）野生型loxP配列、遺伝子Ｂ及びＤＮＡ（ａ）と同
    じ変異型loxP配列をこの順に有する環状ＤＮＡ。 （ｃ）ＤＮＡ（ａ）において遺伝子Ａが遺伝子Ｂに置換
    されたＤＮＡ。 ここで、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺
    伝子である。
  12. 【請求項１２】 下記のＤＮＡ（ａ）及びＤＮＡ（ｂ）
    をリコンビナーゼＣｒｅの存在下に反応させ、下記のＤ
    ＮＡ（ｃ）を得ることからなる遺伝子置換方法。 （ａ）互いに異なる配列をもつ２つの請求項３記載の変
    異型loxP配列（変異型loxP配列１及び変異型loxP配列
    ２）及び遺伝子Ａを変異型loxP配列１／遺伝子Ａ／変異
    型loxP配列２の順に有するＤＮＡ。 （ｂ）変異型loxP配列１、遺伝子Ｂ及び変異型loxP配列
    ２をこの順に有する環状ＤＮＡ。 （ｃ）ＤＮＡ（ａ）において遺伝子Ａが遺伝子Ｂに置換
    されたＤＮＡ。 ここで、遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは互いに異なる任意の遺
    伝子である。
  13. 【請求項１３】 遺伝子Ｂが機能的な遺伝子ではないこ
    とを特徴とする請求項１１又は１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 遺伝子Ａが機能的な遺伝子ではないこ
    とを特徴とする請求項１１又は１２記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ＤＮＡ（ａ）が細胞の染色体ＤＮＡで
    あり、ＤＮＡ（ｂ）がプラスミドＤＮＡ又は二本鎖環状
    ＤＮＡウイルスであることを特徴とする請求項１１ない
    し１４いずれかに記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ＤＮＡ（ａ）が細胞の染色体ＤＮＡで
    あり、ＤＮＡ（ｂ）が細胞内で変換されることにより二
    本鎖環状ＤＮＡとなる性質を有することを特徴とする請
    求項１１ないし１４いずれかに記載の方法。
  17. 【請求項１７】 ＤＮＡ（ａ）が二本鎖ＤＮＡウイルス
    の染色体ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）がプラスミドＤＮ
    Ａ又は二本鎖環状ＤＮＡウイルスであることを特徴とす
    る請求項１１ないし１４いずれかに記載の方法。
  18. 【請求項１８】 ＤＮＡ（ａ）が二本鎖ＤＮＡウイルス
    の染色体ＤＮＡであり、ＤＮＡ（ｂ）が細胞内で変換さ
    れることにより二本鎖環状ＤＮＡとなる性質を有するこ
    とを特徴とする請求項１１ないし１４いずれかに記載の
    方法。
  19. 【請求項１９】 ＤＮＡ（ａ）の二本鎖ＤＮＡウイルス
    がアデノウイルスであることを特徴とする請求項１７又
    は１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 請求項６ないし９いずれかに記載のＤ
    ＮＡを染色体上に有するトランスジェニック動物。
  21. 【請求項２１】 請求項６ないし９いずれかに記載のＤ
    ＮＡからなる医薬。
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