JPH11201903A - Calcium ion analyzing method and reagent used for same - Google Patents
Calcium ion analyzing method and reagent used for sameInfo
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Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、カルシウムイオン
を分析する技術分野に属し、特に、エクオリンの発光を
利用して細胞内等における低濃度のカルシウムイオンを
分析する方法の改良および該方法に用いられる新規な試
薬に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention belongs to the technical field of analyzing calcium ions, and more particularly to an improvement in a method for analyzing low-concentration calcium ions in cells or the like utilizing the emission of aequorin and the use in the method. New reagents.
【０００２】[0002]
【従来の技術】エクオリン（aequorin) は発光オワンク
ラゲ(Aequorea)から単離された発光蛋白質であり、蛋白
質部分であるアポエクオリン(apoaequorin) 、発光種で
あるセレンテラジン(coelenterazine)、および分子状酸
素から成る複合体である。この複合体にカルシウムイオ
ン（Ｃａ2+) が結合すると、蛋白質のコンフォメーショ
ンが変化し、セレンテラジンが酸化的分解する過程で生
じる励起カルボニル基が基底状態に戻るときのエネルギ
ーが発光として放出されることが知られている。2. Description of the Related Art Aequorin is a photoprotein isolated from luminescent jellyfish (Aequorea) and comprises a protein portion, apoaequorin, a luminescent species, coelenterazine, and molecular oxygen. Complex. When calcium ion (Ca 2+ ) binds to this complex, the conformation of the protein changes, and the energy when the excited carbonyl group generated in the process of coelenterazine oxidative degradation returns to the ground state is emitted as luminescence. It has been known.
【０００３】このエクオリンの発光は、極めて低濃度の
カルシウムイオンの存在により起こるので、生理的条件
下のカルシウムイオン濃度の測定に適している。したが
って、エクオリンは、その発見以来、細胞の研究等に際
して細胞内にマイクロインジェクションされ、細胞内の
遊離カルシウムイオン濃度を測定するのに採用されてき
た。それとともに、発光種であるセレンテラジンについ
ても化学発光物質として研究が進められＭＣＬＡに代表
する各種の類縁化合物（アナログ）の合成が試みられて
きた。しかし、このエクオリンの発光を利用するカルシ
ウムイオン分析法は、精製されたエクオリン（アポエ
クオリン）を入手するのが難しいこと、アポエクオリ
ンやセレンテラジンを小さな細胞に注入するのに困難を
伴うという欠点があるため、最近の細胞研究などにおい
てはFura２に代表されるＣａ2+蛍光指示薬にとって代わ
られつつある。[0003] Since the emission of aequorin is caused by the presence of calcium ions at a very low concentration, it is suitable for measuring the calcium ion concentration under physiological conditions. Therefore, since its discovery, aequorin has been microinjected into cells during cell research and the like, and has been employed to measure the concentration of free calcium ions in cells. At the same time, coelenterazine, a luminescent species, has been studied as a chemiluminescent substance, and attempts have been made to synthesize various analogous compounds represented by MCLA. However, the calcium ion analysis method using luminescence of aequorin has a drawback that it is difficult to obtain purified aequorin (apoaequorin) and it is difficult to inject apoaequorin or coelenterazine into small cells. For this reason, in recent cell research and the like, Ca 2+ fluorescent indicators represented by Fura2 are being replaced.
【０００４】しかしながら、エクオリンはＣａ2+蛍光指
示薬に比較すると、励起光を必要としないので細胞に
損傷を与えず、また、細胞自身の自己蛍光の影響も受け
ない、エクオリンの発光は微弱であるので、蛍光光度
計に比べ安価な光電子倍増管やフォトカウンターで測定
できる、Ｃａ2+蛍光指示薬のように細胞内オルガネラ
に入ることもなく細胞質に局在化するので解析が容易で
あるという利点を有するので、上記のごとき欠点が解消
されれば、細胞の機能や状態を調べる研究などにおいて
理想的なカルシウムイオン分析手段となり得る可能性を
残している。However, compared to Ca 2+ fluorescent indicators, aequorin does not damage the cells because it does not require excitation light and is not affected by autofluorescence of the cells itself. Therefore, it can be measured with a photomultiplier tube or photocounter, which is less expensive than a fluorometer, and has the advantage of being easy to analyze because it is localized in the cytoplasm without entering the intracellular organelle unlike Ca 2+ fluorescent indicators. Therefore, if the above-mentioned drawbacks are eliminated, there remains a possibility that the calcium ion analysis means can be an ideal calcium ion analysis means in studies for examining the function and state of cells.
【０００５】最近、組換えＤＮＡ法によるアポエクオリ
ンを入手する試みがなされ、例えば、アポエクオリンｃ
ＤＮＡを酵母の高発現プロモーターの１つであるＧＡＰ
プロモーターの下流につないだプラスミドを作製し、酵
母細胞でアポエクオリンを発現させるとともに、該細胞
にセレンテラジンを加えることにより生きている細胞内
でエクオリンを再生させ、カルシウムイオン濃度変化を
測定する実験系が開発されている（嶋田ら：Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 88, 6878-6882 (1991)）。このよ
うな手法により、高純度のアポエクオリンを入手できる
ようになったので、残された課題はセレンテラジンを細
胞内等の被分析系に効率よく導入するということであ
る。[0005] Recently, attempts have been made to obtain apoaequorin by the recombinant DNA method.
GAP which is one of the yeast high expression promoters
An experimental system that produces a plasmid ligated downstream of the promoter, expresses apoaequorin in yeast cells, and regenerates aequorin in living cells by adding coelenterazine to the cells to measure changes in calcium ion concentration. (Shimada et al .: Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 88 , 6878-6882 (1991)). With such a method, high-purity apoaequorin can be obtained, and the remaining problem is to efficiently introduce coelenterazine into a system to be analyzed, such as in a cell.
【０００６】このセレンテラジン（およびその類縁化合
物）は、生体試料において一般的な中性近傍のｐＨにお
ける水溶性が低いために、細胞内等の被分析系への注入
が難しく、細胞表面に吸着して有効に利用されず、発光
性能を低下させるという問題点を有している。このた
め、セレンテラジン系化合物は、一般にメタノールに溶
解して使用されるが、メタノール溶媒は生体組織に毒性
を与えるので回避することが好ましい。また、セレンテ
ラジン系化合物は、アルカリ水溶液中では溶解度が増す
が、ｐＨをアルカリ領域にすると自動酸化が起こり易く
なり安定性に欠け、実用的ではなくなる。Since coelenterazine (and its analogous compounds) has low water solubility at a pH near neutrality, which is common in biological samples, it is difficult to inject the coelenterazine into a system to be analyzed, such as in a cell, and adsorb to the cell surface. However, it has a problem that the light emitting performance is not effectively utilized and the light emitting performance is deteriorated. For this reason, the coelenterazine-based compound is generally used by dissolving it in methanol, but it is preferable to avoid the methanol solvent because it gives toxicity to living tissues. Further, the solubility of the coelenterazine-based compound in an alkaline aqueous solution increases, but when the pH is set in an alkaline region, autoxidation easily occurs, the stability is poor, and the coelenterazine-based compound is not practical.
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エク
オリンの発光を利用して細胞内等のカルシウムイオンを
分析するに当たり、セレンテラジンまたはその類縁化合
物を効率的に被分析系に導入することにより、発光性能
が優れ高感度にカルシウムイオンを分析することのでき
る技術を提供することにある。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to efficiently introduce coelenterazine or its analogous compound into a system to be analyzed in analyzing calcium ions in cells or the like using luminescence of aequorin. Another object of the present invention is to provide a technique capable of analyzing calcium ions with excellent luminous performance and high sensitivity.
【０００８】[0008]
【課題を解決するための手段】本発明に従えば、上記の
目的を達成するものとして、アポエクオリン、セレンテ
ラジンまたはその類縁化合物、および分子状酸素から形
成されるエクオリンの発光によってカルシウムイオンを
分析するに当たり、シクロデキストリンを添加すること
を特徴とするカルシウムイオン分析法が提供される。According to the present invention, calcium ions are analyzed by the emission of aequorin formed from apoaequorin, coelenterazine or its analogous compounds, and molecular oxygen. , A method for analyzing calcium ions, characterized by adding cyclodextrin, is provided.
【０００９】本発明に従えば、さらに、該分析法を実施
するのに使用される試薬であって、セレンテラジンまた
はその類縁化合物とシクロデキストリンとを含有する乾
燥固体状または液状の混合物から成ることを特徴とする
カルシウムイオン分析用試薬が提供される。本発明のカ
ルシウムイオン分析法およびカルシウムイオン分析用試
薬に使用されるのに特に好適なシクロデキストリンは、
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。According to the present invention, there is further provided a reagent used for carrying out the analytical method, comprising a dry solid or liquid mixture containing coelenterazine or an analog thereof and cyclodextrin. A reagent for analyzing calcium ions is provided. Particularly suitable cyclodextrins for use in the calcium ion analysis method and calcium ion analysis reagent of the present invention include:
Hydroxypropyl-β-cyclodextrin.
【００１０】[0010]
【発明の実施の形態】本発明に従えば、シクロデキスト
リンを使用することにより、中性ｐＨ域を含む広範囲の
ｐＨ域においてセレンテラジンまたはその類縁化合物の
水溶性が高められて確実に被分析系に導入されるために
エクオリンの発光性能が著しく高められる。このよう
に、シクロデキストリンを使用することによりセレンテ
ラジンまたはその類縁化合物（アナログ）の水溶性が高
められるのは、シクロデキストリンの疎水性空孔内にセ
レンテラジンまたはその類縁化合物が包接されてその見
かけの溶解性が向上し、とりわけ、ヒドロキシプロピル
−β−シクロデキストリンは、その空孔の大きさがセレ
ンテラジンに適合すること、および、ヒドロキシプロピ
ル基の存在により特にそのような効果を高めるためと推
測される。According to the present invention, the use of cyclodextrin enhances the water solubility of coelenterazine or its analogs in a wide range of pH, including the neutral pH range, and ensures that the system to be analyzed can be used. The luminescence performance of aequorin is significantly enhanced by the introduction. Thus, the use of cyclodextrin to increase the water solubility of coelenterazine or its analogous compound (analog) is due to the inclusion of coelenterazine or its analogous compound in the hydrophobic pores of cyclodextrin and its apparent It is presumed that the solubility is improved, and in particular, hydroxypropyl-β-cyclodextrin has a pore size compatible with coelenterazine and that the presence of the hydroxypropyl group enhances such an effect. .
【００１１】本発明に従いヒドロキシプロピル−β−シ
クロデキストリンのようなシクロデキストリンによって
溶解されたセレンテラジンまたはその類縁化合物を被分
析系に導入するには、分析時に適当な緩衝液中でセレン
テラジンまたはその類縁化合物とシクロデキストリンを
混合して注入してもよいが、セレンテラジンまたはその
類縁化合物とシクロデキストリンを含有する混合物を予
め調製して、分析用試薬として使用に供すると取扱い上
も便利で好ましい。そのような試薬を構成する混合物
は、適当な緩衝液（一般に、メタノールを含有する水性
緩衝液）中にセレンテラジンまたはその類縁化合物とシ
クロデキストリンとが含有された液状混合物（水溶液）
でもよいが、乾燥固体状の混合物が特に好ましい。In order to introduce coelenterazine or an analog thereof dissolved in a cyclodextrin such as hydroxypropyl-β-cyclodextrin into a system to be analyzed according to the present invention, coelenterazine or an analog thereof in a suitable buffer during analysis is used. And cyclodextrin may be mixed and injected. However, it is convenient and preferable in terms of handling that a mixture containing coelenterazine or its analogous compound and cyclodextrin is prepared in advance and used as an analytical reagent. The mixture that constitutes such a reagent is a liquid mixture (aqueous solution) containing coelenterazine or an analog thereof and cyclodextrin in a suitable buffer (generally, an aqueous buffer containing methanol).
However, a dry solid mixture is particularly preferred.
【００１２】この乾燥固体状の試薬は次のように調製す
ることができる：セレンテラジンまたはその類縁化合物
のメタノール溶液とシクロデキストリン（例えばヒドロ
キシプロピル−β−シクロデキストリン）の水溶液とを
混合し、室温において減圧下でメタノールおよび水を留
去し、乾固した後、得られた乾固体を水に溶解し、室温
において減圧で水を留去し、乾固する。得られる乾固体
はそのままでも使用できるが、一般的には、この水への
溶解および乾固を数回繰り返すことにより、セレンテラ
ジン（またはその類縁化合物）とシクロデキストリン
（例えばヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ
ン）とから成る乾燥固体状のカルシウムイオン分析用試
薬が調製される。通常、最終的に得られる乾固体は粉末
化して、使用に供されるまで密閉し低温化（−20℃程
度）に保存する。かくして、本発明に従うこの乾燥固体
状の試薬は、保存や運搬が容易であり、使用時に適当な
緩衝液に溶解させるだけで、高濃度のセレンテラジンま
たはその類縁化合物が溶解された水溶液が得られ、被分
析系にセレンテラジン（またはその類縁化合物）を効率
的に導入することができる。This dry solid reagent can be prepared as follows: a methanol solution of coelenterazine or an analog thereof is mixed with an aqueous solution of cyclodextrin (for example, hydroxypropyl-β-cyclodextrin), and the mixture is mixed at room temperature. After distilling off methanol and water under reduced pressure and evaporating to dryness, the obtained dry solid is dissolved in water, and water is distilled off at room temperature under reduced pressure to dryness. The obtained dry solid can be used as it is. However, generally, by repeating this dissolution in water and drying to dryness several times, coelenterazine (or an analog thereof) and cyclodextrin (for example, hydroxypropyl-β-cyclodextrin) are obtained. ) Is prepared. Usually, the finally obtained dry solid is powdered, sealed and stored at a low temperature (about -20 ° C) until it is used. Thus, the dry solid reagent according to the present invention can be easily stored and transported, and can be easily dissolved in an appropriate buffer at the time of use to obtain an aqueous solution in which a high concentration of coelenterazine or an analog thereof is dissolved, Coelenterazine (or its analogous compound) can be efficiently introduced into the analyte system.
【００１３】使用するセレンテラジン（またはその類縁
化合物）とシクロデキストリンの混合比およびそれらの
濃度は、特に限定的なものではなく、対象となる被分析
系に応じて定められる。１例として、重量比で、セレン
テラジン２％に対してヒドロキシプロピル−β−シクロ
デキストリン98％の割合で混合される。The mixing ratio of coelenterazine (or its analogous compound) to cyclodextrin and the concentration thereof are not particularly limited, and are determined according to the target analyte system. As an example, 98% of hydroxypropyl-β-cyclodextrin is mixed with 2% of coelenterazine by weight.
【００１４】なお、本発明において用いるセレンテラジ
ンの類縁化合物とは、アポエクオリンおよび分子状酸素
と複合体を形成してセレンテラジンと同様の発光機能を
有するものであり、一般に「３，７−ジヒドロイミダゾ
ール〔１，２−ａ〕ピラジン−３−オン」構造を有し、
その代表例はＭＣＬＡ「２−メチル−６−（４−メトキ
シフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾール〔１，２
−ａ〕ピラジン−３−オン」である。その他のセレンテ
ラジン類縁化合物（アナログ）は、例えば、本発明者ら
による論文「Bull. Chem. Soc., Jpn., 63, 3132-3140
(1990)」に記載されており、それらの化合物も本発明に
従いヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンによ
り水溶性を高めて使用することができる。The analogous compound of coelenterazine used in the present invention is a compound which forms a complex with apoaequorin and molecular oxygen and has a light-emitting function similar to that of coelenterazine, and is generally referred to as "3,7-dihydroimidazole [ 1,2-a] pyrazin-3-one "structure,
A typical example is MCLA "2-methyl-6- (4-methoxyphenyl) -3,7-dihydroimidazole [1,2
-A] pyrazin-3-one ". Other coelenterazine analogs (analogs) are described, for example, in the paper by the present inventors, "Bull. Chem. Soc., Jpn., 63 , 3132-3140."
(1990) ", and these compounds can also be used according to the present invention with increased water solubility with hydroxypropyl-β-cyclodextrin.
【００１５】[0015]
【実施例】以下に本発明の特徴をさらに明らかにするた
め実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制
限されるものではない。 〔実施例１：水溶性試験〕この実施例は、シクロデキス
トリン、特にヒドロキシプロピル−β−シクロデキスト
リンによりセレンテラジンの水溶性が高められることを
示すものである。 セレンテラジン／シクロデキストリン乾固試薬の調製 3.0mM のセレンテラジンのメタノール溶液0.1ml と45mM
のα−シクロデキストリン（α−ＣｙＤ）、ヒドロキシ
プロピル−α−シクロデキストリン（ＨＰ−α−Ｃｙ
Ｄ）、β−シクロデキストリン（β−ＣｙＤ）およびヒ
ドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β
−ＣｙＤ）の水溶液各0.2ml とを混合し室温において真
空ポンプを用いて減圧下で突沸に注意しながら約40℃に
加熱してメタノールおよび水を留去し、乾燥固体状のセ
レンテラジン／シクロデキストリン混合試薬を調製し
た。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS The characteristics of the present invention will be described below.
Examples will be described, but the present invention is limited by these Examples.
It is not limited. [Example 1: Water solubility test]
Trines, especially hydroxypropyl-β-cyclodexto
Phosphorus enhances the water solubility of coelenterazine
It is shown. Preparation of coelenterazine / cyclodextrin dry reagent 0.1 ml of methanol solution of 3.0 mM coelenterazine and 45 mM
Α-cyclodextrin (α-CyD), hydroxy
Propyl-α-cyclodextrin (HP-α-Cy
D), β-cyclodextrin (β-CyD) and
Droxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β
-CyD) and 0.2 ml each at room temperature.
Use an empty pump to reduce the temperature to about 40 ° C
Heat to distill off methanol and water and dry solid
Preparation of Lenterazine / Cyclodextrin mixed reagent
Was.
【００１６】水溶性テスト 上記のように調製したセレンテラジン／シクロデキスト
リン乾固体を２mMのＥＤＴＡを含有する10mMのリン酸緩
衝液（ｐＨ5.5 、6.5 または7.5)1.0ml に混合し、該混
合物を室温で約30秒間撹拌した後、０℃で５分間遠心分
離（10,000rpm）した。上澄液中のセレンテラジンの濃
度を430nm における吸光度（Ａ430)を測定することによ
り評価した。その結果を図１に示す。図１に示されるよ
うに、セレンテラジンを可溶化するのにＨＰ−β−Ｃｙ
Ｄが特に効果的であり、次いでβ−ＣｙＤが効果的であ
る。 Water solubility test The coelenterazine / cyclodextrin dry solid prepared as described above is mixed with 1.0 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 5.5, 6.5 or 7.5) containing 2 mM EDTA, and the mixture is brought to room temperature. And then centrifuged (0,000 rpm) at 0 ° C for 5 minutes. The coelenterazine concentration in the supernatant was evaluated by measuring the absorbance at 430 nm (A 430 ). The result is shown in FIG. As shown in FIG. 1, HP-β-Cy was used to solubilize coelenterazine.
D is particularly effective, followed by β-CyD.
【００１７】β−ＣｙＤおよびＨＰ−β−ＣｙＤについ
ては、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によっ
てもセレンテラジンの溶解量を測定した。このＨＰＬＣ
分析においてはセレンテラジンの自動酸化によりＡ430
の値が減少することはないと考えられる。ＨＰＬＣ分析
はＯＤＳカラム（4.6mm ×250mm)中で0.3%のＣＦ3 ＣＯ
ＯＨを含有する40％ＣＨ3 ＣＮから成る無勾配溶出液を
用いてＡ430 を測定することにより行った。For β-CyD and HP-β-CyD, the dissolved amount of coelenterazine was also measured by HPLC (high performance liquid chromatography). This HPLC
A 430 by autoxidation of coelenterazine in the analysis
Is not considered to decrease. HPLC analysis was performed using 0.3% CF 3 CO in an ODS column (4.6 mm x 250 mm).
And measuring the A 430 using isocratic eluent consisting of 40% CH 3 CN containing OH.
【００１８】結果を図２に示す。図２に示されるよう
に、ＨＰ−β−ＣｙＤはβ−ＣｙＤよりもセレンテラジ
ンの水溶性を高めるのに効果的である。β−ＣｙＤを含
有するセレンテラジン水溶液においては、ｐＨ値が7.0
以下になると１〜３時間内にセレンテラジンまたはセレ
ンテラジン−ＣｙＤコンプレックスの一部が沈殿するこ
とが認められた。これに対して、ＨＰ−β−ＣｙＤを用
いた場合は、ｐＨ値が6.0 以下においても24時間経過し
てもそのような沈降は見られなかった。このようにＨＰ
−β−ＣｙＤは、中性域を含む広範囲のｐＨ域において
セレンテラジンの水溶性を高めるのにきわめて効果的で
ある。FIG. 2 shows the results. As shown in FIG. 2, HP-β-CyD is more effective than β-CyD in increasing the water solubility of coelenterazine. In a coelenterazine aqueous solution containing β-CyD, the pH value is 7.0.
In the following cases, it was recognized that a part of coelenterazine or a part of coelenterazine-CyD complex was precipitated within 1 to 3 hours. In contrast, when HP-β-CyD was used, no such sedimentation was observed even when the pH value was 6.0 or less even after 24 hours. Thus HP
-Β-CyD is extremely effective in increasing the water solubility of coelenterazine in a wide pH range including a neutral range.
【００１９】次に、ｐＨ7.0 におけるＨＰ−β−ＣｙＤ
の濃度と溶解セレンテラジンの濃度の関係を調べた。こ
のために、セレンテラジン溶液（0.8 ％メタノール溶
液、0.5ml)と濃度を変えたＨＰ−β−ＣｙＤ水溶液とを
混合して、該混合液から室温において減圧下にメタノー
ルと水を蒸発、除去した。得られた乾燥サンプルの各々
に、２mMのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ7.0)
を添加、混合し、必要に応じてＨＣｌまたはＮａＯＨを
用いてｐＨを7.0 に調製した。混合液を室温で約30秒攪
拌し、遠心分離した後、直ちにＨＰＬＣ分析によりセレ
ンテラジンの溶解量を測定した。Next, HP-β-CyD at pH 7.0
The relationship between the concentration of coelenterazine and that of dissolved coelenterazine was examined. For this purpose, a coelenterazine solution (0.8% methanol solution, 0.5 ml) was mixed with an aqueous HP-β-CyD solution having a different concentration, and methanol and water were evaporated and removed from the mixture at room temperature under reduced pressure. A phosphate buffer (pH 7.0) containing 2 mM EDTA was added to each of the obtained dried samples.
Was added and mixed, and the pH was adjusted to 7.0 with HCl or NaOH as needed. The mixture was stirred at room temperature for about 30 seconds, and after centrifugation, immediately, the dissolved amount of coelenterazine was measured by HPLC analysis.
【００２０】結果を図３に示す。図３に示されるよう
に、ＨＰ−β−ＣｙＤの濃度が増加するに従ってセレン
テラジンの溶解量も増大しており、セレンテラジンの溶
解量の最大値は、ＨＰ−β−ＣｙＤの濃度が50mMのとき
に3.7mM となっており、この値は該シクロデキストリン
を添加しない場合の約 280倍であった。FIG. 3 shows the results. As shown in FIG. 3, as the concentration of HP-β-CyD increases, the amount of coelenterazine dissolved also increases, and the maximum value of coelenterazine dissolution increases when the concentration of HP-β-CyD is 50 mM. The value was 3.7 mM, which was about 280 times that in the case where the cyclodextrin was not added.
【００２１】〔実施例２：エクオリン発光試験〕この実
施例は、セレンテラジンとＨＰ−β−ＣｙＤとを含有す
る乾燥固体状の試薬を用いて、生細胞でのエクオリン発
光性能を試験した結果を示すものである。上述のように
調製したセレンテラジン／ＨＰ−β−ＣｙＤ乾燥固体
（10mg、重量でセレンテラジン２％およびＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ98％から成る）を、10mMのリン酸緩衝液（ｐＨ7.0)
0.1ml に溶かした。このセレンテラジン／ＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ溶液を用い、前述の嶋田らの方法（Proc. Natl. Ac
ad. Sci., USA, 88, 6878 (1991)) に従い、アポエクオ
リン発現酵母細胞に導入し、Ｃａ2+による発光をＡＲＵ
ＧＵＳ−50（浜松ホトニクス）で測定した。[Example 2: Aequorin luminescence test] This example shows the results of a test on the aequorin luminescence performance in living cells using a dry solid reagent containing coelenterazine and HP-β-CyD. Things. Coelenterazine / HP-β-CyD dry solid prepared as described above (10 mg, coelenterazine 2% by weight and HP-β-C
yD98%) in 10 mM phosphate buffer (pH 7.0)
Dissolved in 0.1 ml. This coelenterazine / HP-β-C
Using the yD solution, the method of Shimada et al. (Proc. Natl.
ad. Sci., USA, 88 , according to 6878 (1991)), was introduced into apoaequorin-expressing yeast cells, ARU light emission by Ca 2+
It was measured with GUS-50 (Hamamatsu Photonics).
【００２２】定常状態において、従来用いられていたセ
レンテラジン／メタノール溶液（実験ａ）に比べ、セレ
ンテラジン／ＨＰ−β−ＣｙＤ溶液を加えた場合（実験
ｂ）では、およそ２〜３倍高い発光強度が得られた。ま
た、TritonＸ−100 を加えて酵母細胞を壊し、大過剰の
Ｃａ2+と反応させると、従来のセレンテラジン／メタノ
ール溶液（実験ｃ）よりセレンテラジン／ＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ溶液（実験ｄ）の方が３倍以上高い発光強度を示し
た。発光強度の経時変化を図４に示す。従来のセレンテ
ラジン／メタノール溶液の系にくらべ、発光強度が大き
くなり、Ｓ／Ｎ比が向上していることが分かる。In the steady state, when the coelenterazine / HP-β-CyD solution was added (experiment b), the emission intensity was about 2-3 times higher than that of the conventionally used coelenterazine / methanol solution (experiment a). Obtained. When Triton X-100 was added to break yeast cells and reacted with a large excess of Ca 2+ , coelenterazine / HP-β-C was removed from the conventional coelenterazine / methanol solution (experiment c).
The yD solution (Experiment d) showed an emission intensity three times or more higher. FIG. 4 shows the change over time in the emission intensity. It can be seen that the emission intensity is increased and the S / N ratio is improved as compared with the conventional coelenterazine / methanol solution system.
【００２３】ＨＰ−β−ＣｙＤを使用することにより、
セレンテラジンの水溶性が高められ、充分量のセレンテ
ラジンが酵母内に導入されて、エクオリンの発光に有効
的に利用されたものと思われる。 By using HP-β-CyD,
It is presumed that the water solubility of coelenterazine was increased, and a sufficient amount of coelenterazine was introduced into the yeast and effectively used for the emission of aequorin.
【００２４】[0024]
【発明の効果】本発明の分析法によれば、ＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ（ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）
のようなシクロデキストリンを使用することによりセレ
ンテラジン（またはその類縁化合物）を、その水溶性を
高めて確実に被分析系に導入することができるので、エ
クオリンの発光性能が著しく向上し、極めて高感度にカ
ルシウムイオンを分析することができる。本発明のシク
ロデキストリン／セレンテラジン（またはその類縁化合
物）の混合物から成るカルシウムイオン分析用試薬は取
扱い易く、特に、乾燥固体状のカルシウムイオン分析用
試薬は使用時に適当な緩衝液に溶解させるだけで高濃度
のセレンテラジンまたはその類縁化合物の水溶液が得ら
れ被分析系に効率的に導入することができる。According to the analysis method of the present invention, HP-β-C
yD (hydroxypropyl-β-cyclodextrin)
By using a cyclodextrin such as described above, coelenterazine (or its analogous compound) can be reliably introduced into the analyte system by increasing its water solubility, so that the luminescence performance of aequorin is remarkably improved, and extremely high sensitivity is achieved. Can be analyzed for calcium ions. The calcium ion analysis reagent comprising a mixture of cyclodextrin / coelenterazine (or analogs thereof) of the present invention is easy to handle, and in particular, the dry solid calcium ion analysis reagent is required only to be dissolved in an appropriate buffer at the time of use. An aqueous solution of coelenterazine or an analog thereof can be obtained at a high concentration, and can be efficiently introduced into the system to be analyzed.
【図１】各種のシクロデキストリンによるセレンテラジ
ンの溶解効果を比較して示すグラフである。FIG. 1 is a graph comparing the effect of various cyclodextrins to dissolve coelenterazine.
【図２】シクロデキストリンによるセレンテラジンの溶
解濃度とｐＨの関係を示すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the relationship between the concentration of coelenterazine dissolved by cyclodextrin and pH.
【図３】セレンテラジンの溶解濃度とヒドロキシプロピ
ル−β−シクロデキストリンの濃度の関係を示すグラフ
である。FIG. 3 is a graph showing the relationship between the dissolved concentration of coelenterazine and the concentration of hydroxypropyl-β-cyclodextrin.
【図４】本発明のヒドロキシプロピル−β−シクロデキ
ストリン／セレンテラジン混合試薬を用いたエクオリン
発光試験の結果の１例を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing an example of the results of an aequorin luminescence test using a mixed reagent of hydroxypropyl-β-cyclodextrin / coelenterazine of the present invention.
Claims (4)
その類縁化合物、および分子状酸素から形成されるエク
オリンの発光によってカルシウムイオンを分析するに当
たり、シクロデキストリンを添加することを特徴とする
カルシウムイオン分析法。1. A calcium ion analysis method comprising adding cyclodextrin to analyze calcium ions by luminescence of aequorin, coelenterazine or its analogous compound, and aequorin formed from molecular oxygen.
プロピル−β−シクロデキストリンを用いることを特徴
とする請求項１のカルシウムイオン分析法。2. The calcium ion analysis method according to claim 1, wherein hydroxypropyl-β-cyclodextrin is used as the cyclodextrin.
シクロデキストリンとを含有する乾燥固体状または液状
の混合物から成ることを特徴とするカルシウムイオン分
析用試薬。3. A calcium ion analysis reagent comprising a dry solid or liquid mixture containing coelenterazine or an analog thereof and cyclodextrin.
ピル−β−シクロデキストリンであることを特徴とする
請求項３のカルシウムイオン分析用試薬。4. The reagent according to claim 3, wherein the cyclodextrin is hydroxypropyl-β-cyclodextrin.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2279798A JPH11201903A (en) | 1998-01-19 | 1998-01-19 | Calcium ion analyzing method and reagent used for same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2279798A JPH11201903A (en) | 1998-01-19 | 1998-01-19 | Calcium ion analyzing method and reagent used for same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11201903A true JPH11201903A (en) | 1999-07-30 |
Family
ID=12092683
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2279798A Pending JPH11201903A (en) | 1998-01-19 | 1998-01-19 | Calcium ion analyzing method and reagent used for same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11201903A (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009153444A (en) * | 2007-12-26 | 2009-07-16 | Chisso Corp | Luminescent substrate aqueous solution and method for producing the same |
| US11103528B1 (en) | 2019-07-18 | 2021-08-31 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | Slow release calcium composition |
| JP2022512611A (en) * | 2018-10-03 | 2022-02-07 | プロメガ コーポレイション | Compositions and Methods for Stabilizing Coelenterazine and its Analogues and Derivatives |
-
1998
- 1998-01-19 JP JP2279798A patent/JPH11201903A/en active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009153444A (en) * | 2007-12-26 | 2009-07-16 | Chisso Corp | Luminescent substrate aqueous solution and method for producing the same |
| JP2022512611A (en) * | 2018-10-03 | 2022-02-07 | プロメガ コーポレイション | Compositions and Methods for Stabilizing Coelenterazine and its Analogues and Derivatives |
| JP2024095651A (en) * | 2018-10-03 | 2024-07-10 | プロメガ コーポレイション | Compositions and methods for stabilizing coelenterazine and its analogs and derivatives - Patents.com |
| US11103528B1 (en) | 2019-07-18 | 2021-08-31 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | Slow release calcium composition |
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