JPH11201932A

JPH11201932A - バイオセンサ

Info

Publication number: JPH11201932A
Application number: JP10102767A
Authority: JP
Inventors: Keiko Yugawa; 系子湯川; Toshihiko Yoshioka; 俊彦吉岡; Shiro Nankai; 史朗南海
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1997-04-14
Filing date: 1998-04-14
Publication date: 1999-07-30
Anticipated expiration: 2018-04-14
Also published as: JP3494398B2

Abstract

(57)【要約】【課題】酵素の活性を最大限に発揮させるようにし
て、酵素担持量を削減し、廉価で保存安定性の高いバイ
オセンサを提供する。【解決手段】絶縁性の基板、前記基板上に形成された
少なくとも作用極と対極を有する電極系、前記電極系上
またはその近傍に形成された少なくとも酵素と電子メデ
ィエーターを含む反応層、および前記反応層中または反
応層の近傍に設置された２価金属の水溶性塩を具備す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、試料中の特定成分
について、迅速かつ高精度な定量を簡便に実施すること
ができるバイオセンサに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、試料中の特定成分について、試料
液の希釈や攪拌などを行うことなく簡易に定量する方式
として、様々なバイオセンサが提案されている。バイオ
センサの一例として、次のようなセンサが開示されてい
る（特開平２−０６２９５２号公報）。すなわち、絶縁
性の基板上にスクリーン印刷等の方法で作用極、対極お
よび参照極からなる電極系を形成し、この電極系上に、
電極系に接して親水性高分子と酸化還元酵素と電子受容
体を含む酵素反応層を形成したものである。この酵素反
応層には必要に応じて緩衝剤が加えられる。このように
して作製されたバイオセンサの酵素反応層上に、基質を
含む試料液を滴下すると、酵素反応層が試料液に溶解す
るから、酵素と基質が反応し、これに伴って電子受容体
が還元される。酵素反応終了後、還元された電子受容体
を電気化学的に酸化し、このとき得られる酸化電流値か
ら試料液中の基質濃度を定量することができる。

【０００３】上記のようなバイオセンサは、測定対象物
質を基質とする酵素を選択することで、様々な物質に対
する測定が原理的には可能である。酵素は、蛋白質を主
成分とし、センサに組み込まれる前に精製処理される場
合が多い。この精製課程の条件によっては、酵素の構成
要素であり、また酵素の活性中心となる金属イオンが脱
落し、酵素の立体構造が変化する場合がある。その結
果、酵素の基質特異性が変化したり、活性が低下したり
する。また、センサを保存している間に、雰囲気中の水
分を吸収して変性する場合もある。このため、反応層中
に含有させる酵素の量には、このように変性した酵素の
量を見越さなければならない。一方、酵素反応が反応層
中の酵素量に依存すると、得られる応答電流値は基質の
濃度に比例しなくなる。そのため、反応層中には、試料
液中の基質と十分反応しうる量の酵素が含有されていな
ければならない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】このようにセンサを作
製する際には、試料中に含有されると予期される基質の
量よりも、かなり過剰な量の酵素を反応層中に含有させ
ることが必要になる。したがって、１センサあたり、相
当量の酵素を要するようになり、センサの単価が非常に
高くなる。本発明は、センサ中における酵素の活性を最
大限に発揮させるようにして、１センサあたりの酵素担
持量を削減し、廉価で保存安定性の高いバイオセンサを
提供することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明のバイオセンサ
は、絶縁性の基板、前記基板上に形成された少なくとも
作用極と対極を有する電極系、前記電極系上またはその
近傍に形成された少なくとも酵素と電子メディエーター
を含む反応層、および前記反応層中または反応層の近傍
に反応層と隔離して設置された２価金属の水溶性塩を具
備することを特徴とする。本発明の好ましいバイオセン
サは、電気絶縁性の基板、前記基板上に形成された少な
くとも作用極と対極を有する電極系、前記基板に組み合
わされて基板との間に前記電極系に試料液を供給する試
料液供給路を形成するカバー部材、前記電極系上または
その近傍に形成された少なくとも酵素と電子メディエー
ターを含む反応層、および前記反応層中または前記試料
液供給路の前記反応層とは隔離された場所に設置された
２価金属の水溶性塩を具備する。本発明の好ましいバイ
オセンサにおいては、前記金属塩が、反応層と隔離され
ている。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明によるバイオセンサは、上
記のように反応層中またはその近傍に２価金属の水溶性
塩を有する。血液などの試料溶液をセンサに添加する
と、試料液供給路に金属塩が存在する場合は、試料液は
前記金属塩を溶解させながら反応層へ導入される。金属
塩が反応層に含まれる場合は、試料液が反応層に到達し
たのち、金属塩が試料液に溶解する。溶解された金属塩
は解離して２価金属イオンが生じる。この金属イオン
は、精製や長期間の保存によって金属イオンが脱落し
た、酵素に取り込まれる。その結果、酵素の立体構造が
再構築したり、活性が回復したりする。これによって、
反応層中に含有される酵素の活性が促進され、センサの
酵素担持量を最小限にできるので、廉価なセンサを作製
することが可能となる。このような金属塩としては、カ
ルシウム塩、カドミウム塩、マンガン塩、マグネシウム
塩およびストロンチウム塩から選ばれる少なくとも１種
が好ましい。これら塩は、前記金属の塩化物、硝酸塩、
硫酸塩が好ましい。

【０００７】上記金属塩によって、構造や活性が回復す
る酵素にはデヒドロゲナーゼおよびオキシダーゼが挙げ
られる。デヒドロゲナーゼの中でも特にグルコースデヒ
ドロゲナーゼは２価金属イオン、なかでもカルシウムイ
オンを添加すると酵素の活性がよくなり、特に良好な応
答特性が得られる。また、フルクトースデヒドロゲナー
ゼでも良好な応答が得られる。オキシダーゼとしては、
グルコースオキシダーゼが好適に用いられる。前記金属
塩の多くは、吸湿性である。吸湿性の金属塩を反応層中
や反応層表面に担持させると、センサの保存期間中に金
属塩が空気中の水分を吸収して溶解するため、反応層の
一部が溶解する場合がある。その結果、反応層に含まれ
る酵素は不安定な状態となり、変性などの活性劣化を起
こす。したがって、そのような場合は、金属塩は反応層
と隔離して設置するのがよい。金属塩を反応層から隔離
して設置することにより、水分が存在する雰囲気下での
センサの保存性を高めることができる。一方、水分を考
慮する必要がない雰囲気下でのセンサの保存、例えば、
センサをアルミラミネートフィルムのような気密性のフ
ルムで包装する場合は、金属塩を反応層に含有させても
よい。以上のように、金属塩を設置する場所を、反応層
とするか、反応層から隔離された場所とするかまたはそ
の両方とするかは、保存雰囲気に応じて決定することが
好ましい。

【０００８】また、試料液を供給したとき、前記金属塩
が容易に溶解するために、金属塩は親水性高分子中に担
持された状態でセンサ内に設置させるのが好ましい。こ
のような親水性高分子の例として、カルボキシメチルセ
ルロースが非常に水溶性が高い点で好ましい。また、ヒ
ドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロ
ース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒ
ドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルエチルセ
ルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコー
ル、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリスチレンスル
ホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、アクリル酸および
その塩、メタクリル酸およびその塩、スターチおよびそ
の誘導体、無水マレイン酸およびその塩、アガロースゲ
ルおよびその誘導体も好適に用いられる。

【０００９】本発明における２価金属の水溶性塩の量
は、この塩がセンサに供給される試料液に溶解したと
き、２価金属の濃度が０．０１〜２ｍｇ／ｍｌの範囲と
なるのが好ましい。前記濃度の下限値は、金属、例えば
カルシウムが酵素に結合するために必要な最低限の濃度
である。また、濃度が２ｍｇ／ｍｌを越えると、試料液
がセンサに注入されたとき、反応層が試料液へ速やかに
溶解しがたくなる。本発明のセンサは、特に血液中の基
質の定量に向けられている。そのようなセンサでは、反
応層の単位面積（１ｍｍ²）当たりに担持される酵素量
は、１μｇ〜５０μｇ／ｍｍ²である。従って、反応層
の単位面積を基準にすると、２価金属の水溶性塩の量は
０．００３〜０．６μｇ／ｍｍ²となる。一方、以下の
実施例に示されるように、試料液の量が約３μｌのセン
サにおいては、１センサチップに必要な酵素量は０．０
１〜０．５ｍｇ／チップである。従って、センサの１チ
ップ当たりに用いられる２価金属の水溶性塩は０．０３
〜６μｇとなる。

【００１０】本発明による反応層は、電子メディエータ
ーを含有する。電子メディエーターとしては、フェリシ
アンイオン、ｐ-ベンゾキノンおよびその誘導体、フェ
ナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセン
およびその誘導体から選ばれる少なくとも１種が好適に
用いられる。さらに、反応層には、上記酵素類や電子メ
ディエーターのほかに、親水性高分子を含有させてもよ
い。反応層中に親水性高分子を添加することにより、電
極系表面からの反応層剥離を防ぐことができる。さら
に、親水性高分子は、反応層表面の割れを防ぐ効果も有
しており、バイオセンサの信頼性を高めるのに効果的で
ある。このような親水性高分子としては、カルボキシメ
チルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロ
キシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセ
ルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボ
キシメチルエチルセルロース、ポリビニルピロリドン、
ポリビニルアルコール、ポリリジンなどのポリアミノ
酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導
体、アクリル酸およびその塩、メタクリル酸およびその
塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸および
その塩、アガロースゲルおよびその誘導体が好適に用い
られる。酸化電流の測定方法としては、作用極と対極の
みの二極電極方式と、参照極を加えた三極方式があり、
三極の方がより正確な測定が可能である。

【００１１】

【実施例】以下に、具体的な実施例を挙げて、本発明を
より詳細に説明する。図１は、本発明によるバイオセン
サの反応層を取り除いた概略平面図である。ポリエチレ
ンテレフタレートからなる電気絶縁性の基板１上に、ス
クリーン印刷により銀ペーストを印刷し、リード２、３
を形成している。次いで、樹脂バインダーを含むカーボ
ンペーストを基板１上に印刷して作用極４を形成してい
る。この作用極４は、リード２と接触している。さら
に、この基板１上に、絶縁性ペーストを印刷して絶縁層
６を形成している。絶縁層６は、作用極４の外周部を覆
っており、これにより作用極４の露出部分の面積を一定
に保っている。そして、樹脂バインダーを含むカーボン
ペーストをリード３と接触するように基板１上に印刷し
てリング状の対極５を形成している。電極４および５か
らなる電極系上に反応層を形成する。そして、この反応
層あるいはこの反応層と隔離した場所の少なくとも一方
に２価金属の水溶性塩１０を設置する。

【００１２】図２は、反応層および２価金属の水溶性塩
を除いたバイオセンサの分解斜視図である。図１の絶縁
性基板１と、空気孔１１を備えたカバー９およびスペー
サー８を、図２中に１点鎖線で示すような位置関係をも
って装着することによりバイオセンサが作製される。ス
ペーサー８のスリット１３の部分に、基板１とカバー９
で挟まれて、試料液供給路が形成される。１２は試料液
供給路の開口部である。図３は、スペーサー８とカバー
９を重ね合わせたカバー部材の斜視図であり、図２とは
上下逆に配置してある。１４は、この試料液供給路を構
成する空間部に露出する面のカバー側の面を示す。この
カバー部材の試料液供給路に露出する面に反応層および
／または塩１０を設置してもよい。図４は、本発明によ
るバイオセンサの要部の縦断面図である。図１のように
して電極系を形成した電気絶縁性の基板１上に、酵素お
よび電子メディエーターを含む反応層７が形成され、こ
の反応層７と試料液供給路の開口部１２との間に、反応
層７とは隔離して、２価金属の水溶性塩１０が担持され
ている。

【００１３】《実施例１》図１のようにして電極系を形
成した基板１上に、ピロロキノリンキノン−グルコース
デヒドロゲナーゼ（以下、ＧＤＨと略す。）とフェリシ
アン化カリウムの混合水溶液を５μｌ滴下し、乾燥させ
て反応層７を形成した。この反応層７は、直径３．６ｍ
ｍの円形で、電極４および５をほぼ覆う大きさであっ
た。塩化カルシウム５ｍｇをカルボキシメチルセルロー
スの水溶液（濃度０．５％）１０ｍｌに溶解した溶液を
作製した。この溶液５μｌを基板上の１０で示す位置に
滴下し、５０℃の温風乾燥器中で１０分間乾燥させて、
２価金属の水溶性塩１０を基板１の上に担持させた。上
記の基板１にカバー９およびスペーサー８を図２中、一
点鎖線で示すような位置関係をもって接着し、バイオセ
ンサを作製した。

【００１４】グルコース標準液として、グルコース濃度
が、０、２００、４００、６００、および１０００ｍｇ
／ｄｌのものを調製し、このグルコース標準液を試料液
供給路の開口部１２からセンサに供給した。そして、試
料液を供給して１分後に、対極５を基準にして作用極４
に＋０．５Ｖのパルス電圧を印加し、その５秒後に作用
極と対極との間に流れる電流値を測定して、センサの応
答特性を測定した。その結果を図５に示す。図５に示す
ように、得られる応答電流値は大きく、また応答電流値
とグルコース濃度の相関性は、優れた直線性を有してい
た。また、作製したバイオセンサを、湿度２０％の雰囲
気下で６ヵ月間保存した後、同様にしてセンサの応答特
性を測定した。その結果を図５に示す。図５に示すよう
に、保存後のバイオセンサの応答特性は、バイオセンサ
作製直後のものとほとんど変わらなかった。

【００１５】《比較例１》２価金属の水溶性塩をセンサ
内に担持させない他は、実施例１と同様にしてセンサを
作製した。そして、実施例１と同様にして、センサ作製
直後および湿度２０％で６ヵ月間保存後のバイオセンサ
の応答特性を測定した。その結果を図５に示す。図５に
示すように、得られた応答電流値は、実施例１で作製し
たバイオセンサの約６０％に低下した。また、６ヵ月間
保存後のバイオセンサの応答電流値は、センサ作製直後
のセンサよりもかなり低下し、応答電流値とグルコース
濃度の相関性も著しく低下した。

【００１６】《実施例２》ＧＤＨとフェリシアン化カリ
ウムおよび塩化カルシウムの混合水溶液を滴下乾燥させ
ることによって反応層を形成し、２価金属の水溶性塩を
単独でセンサ内に担持させなかった他は、実施例１と同
様にしてバイオセンサを作製した。そして、センサ作製
直後と湿度２０％で６ヵ月間保存した後のセンサの応答
特性を実施例１と同様にして測定した。その結果を図５
に示す。図５に示すように、６ヵ月間保存後のバイオセ
ンサの応答電流値は、センサ作製直後のセンサの約８５
％に低下し、応答電流値とグルコース濃度の相関性もや
や低下した。

【００１７】《実施例３》酵素に、グルコースオキシダ
ーゼ（以下、ＧＯＸと略す。）を用いる他は、実施例１
と同様にしてセンサを作製した。そして、実施例１と同
様にして、センサ作製直後および湿度２０％で６ヵ月間
保存した後のセンサの応答特性を測定した。その結果を
図６に示す。図６に示すように、本実施例のバイオセン
サは、優れた応答特性と保存性を有していた。

【００１８】《比較例２》２価金属の水溶性塩をセンサ
内に担持させない他は、実施例３と同様にしてセンサを
作製した。そして、実施例３と同様にして、センサ作製
直後および湿度２０％で６ヵ月間保存した後のセンサの
応答特性を測定した。その結果を図６に示す。図６に示
すように、得られた応答電流値は、実施例３で作製した
バイオセンサの約６０％に低下した。また、６ヵ月間保
存後のバイオセンサの応答電流値は、センサ作製直後の
センサよりもかなり低下し、応答電流値とグルコース濃
度の相関性も著しく低下した。

【００１９】《実施例４》ＧＯＸとフェリシアン化カリ
ウムおよび塩化カルシウムの混合水溶液を滴下乾燥させ
ることによって反応層を形成し、２価金属の水溶性塩を
単独でセンサ内に担持させなかった他は、実施例３と同
様にしてバイオセンサを作製した。そして、センサ作製
直後と湿度２０％で６ヵ月間保存した後のセンサの応答
特性を実施例１と同様にして測定した。その結果を図６
に示す。図６に示すように、６ヵ月間保存後のバイオセ
ンサの応答電流値は、センサ作製直後のセンサの約９０
％に低下し、応答電流値とグルコース濃度の相関性もや
や低下した。

【００２０】《実施例５》酵素に、フルクトースデヒド
ロゲナーゼ（以下、ＦＤＨと略す。）を用いる他は、実
施例１と同様にしてセンサを作製した。そして、標準試
料液として、フルクトース標準液を用いる他は、実施例
１と同様にして、センサ作製直後および湿度２０％で６
ヵ月間保存した後のセンサの応答特性を測定した。その
結果を図７に示す。図７に示すように、得られたバイオ
センサは、優れた応答特性と保存性を有していた。

【００２１】《比較例３》２価金属の水溶性塩をセンサ
内に担持させない他は、実施例５と同様にしてセンサを
作製した。そして、実施例５と同様にして、センサ作製
直後および湿度２０％で６ヶ月保存した後のセンサの応
答特性を測定した。その結果を図７に示す。図７に示す
ように、得られた応答電流値は、実施例５で作製したバ
イオセンサの約６５％に低下した。また、６ヵ月間保存
後のバイオセンサの応答電流値は、センサ作製直後のセ
ンサよりもかなり低下し、応答電流値とフルクトース濃
度の相関性も著しく低下した。した。

【００２２】《実施例６》ＦＤＨとフェリシアン化カリ
ウムおよび塩化カルシウムの混合水溶液を滴下乾燥させ
ることによって反応層を形成し、２価金属の水溶性塩を
単独でセンサ内に担持させなかった他は、実施例５と同
様にしてバイオセンサを作製した。そして、センサ作製
直後と湿度２０％で６ヵ月間保存した後のセンサの応答
特性を実施例１と同様にして測定した。その結果を図７
に示す。図７に示すように、６ヵ月間保存後のバイオセ
ンサの応答電流値は、センサ作製直後のセンサの約８５
％に低下し、応答電流値とグルコース濃度の相関性もや
や低下した。

【００２３】

【発明の効果】以上のように本発明によれば、センサ中
における酵素の活性を最大限に発揮させ、酵素担持量を
削減し、廉価で保存安定性の高いバイオセンサを提供す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例におけるバイオセンサの反応
層を除いた概略平面図である。

【図２】本発明の他の実施例におけるバイオセンサの反
応層および２価金属の水溶性塩を除いた分解斜視図であ
る。

【図３】同バイオセンサのカバーとスペーサーを重ね合
わせたカバー部材で、図２とは上下逆に配置した斜視図
である。

【図４】同バイオセンサの要部の縦断面図である。

【図５】本発明の一実施例におけるバイオセンサの標準
試料液に対する応答特性図である。

【図６】本発明の他の実施例におけるバイオセンサの標
準試料液に対する応答特性図である。

【図７】本発明の他の実施例におけるバイオセンサの標
準試料液に対する応答特性図である。

【符号の説明】

１絶縁性の基板２、３リード４作用極５対極６絶縁層７反応層８スペーサー９カバー１０２価の金属の水溶性塩１１空気孔１２試料液供給路の開口部１３スリット１４試料液供給路を構成する空間部に露出する面のカ
バー側の面

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】絶縁性の基板、前記基板上に形成された
少なくとも作用極と対極を有する電極系、前記電極系上
またはその近傍に形成された少なくとも酵素と電子メデ
ィエーターを含む反応層、および前記反応層中または反
応層の近傍で反応層とは隔離された場所の少なくとも一
方に設置された２価金属の水溶性塩を具備することを特
徴とするバイオセンサ。
【請求項２】電気絶縁性の基板、前記基板上に形成さ
れた少なくとも作用極と対極を有する電極系、前記基板
に組み合わされて基板との間に前記電極系に試料液を供
給する試料液供給路を形成するカバー部材、前記電極系
上またはその近傍に形成された少なくとも酵素と電子メ
ディエーターを含む反応層、および前記反応層中または
前記試料液供給路の反応層とは隔離された場所の少なく
とも一方に設置された２価金属の水溶性塩を具備するこ
とを特徴とするバイオセンサ。
【請求項３】前記２価金属の水溶性塩が、親水性高分
子の膜中に担持された請求項１または２記載のバイオセ
ンサ。
【請求項４】前記２価金属の水溶性塩が、カルシウム
塩、カドミウム塩、マンガン塩、マグネシウム塩および
ストロンチウム塩からなる群より選ばれた少なくとも１
種である請求項１〜３のいずれかに記載のバイオセンサ
【請求項５】前記反応層の酵素がデヒドロゲナーゼま
たはオキシダーゼである請求項１〜４のいずれかに記載
のバイオセンサ
【請求項６】前記反応層が担持する酵素量は１〜５０
μｇ／ｍｍ²であり、前記水溶性塩の量が反応層の単位
面積当たり０．００３〜０．６μｇ／ｍｍ²である請求
項１〜５のいずれかに記載のバイオセンサ。