JPH11201973A - エンドトキシン特異的ライセートの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 カブトガニ・アメボサイトから簡便かつ安価
にＥｔ特異的ライセートを製造する方法、当該方法によ
り得られるライセート及び当該ライセートからなるＥｔ
特異的測定剤を提供すること。 【解決手段】カブトガニ・アメボサイト、カブトガニ・
アメボサイト懸濁液またはＣ因子及びＧ因子を少なくと
も含む溶液を、Ｇ因子を特異的に不活化させる機械的処
理に付す工程を含むことを特徴とするエンドトキシン特
異的なカブトガニ・アメボサイト・ライセートの製造方
法及びこの製造方法により得られるエンドトキシン特異
的なカブトガニ・アメボサイト・ライセート、及び該ラ
イセートを含有するエンドトキシン特異的測定剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エンドトキシン特異的
なカブトガニ・アメボサイト・ライセートの製造方法、
該方法によって製造されるエンドトキシン特異的なカブ
トガニ・アメボサイト・ライセートおよび該ライセート
を含有するエンドトキシン特異的測定剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】カブトガニ・アメボサイト・ライセート
（以下、単に「ライセート」ともいう）を使用して、エ
ンドトキシン（以下、「Ｅｔ」ともいう）を測定する、
一般的に「リムルステスト」と呼ばれる方法が知られて
おり、検出感度が非常に高いため、医薬品、水などの汚
染試験、臨床検査など多方面に汎用されている。なお、
この測定に関与するライセートの反応は「リムルス反
応」と呼ばれている。この方法は、微量のＥｔによりラ
イセートが凝固することに基づいているが、その後の生
化学的解明により、該反応はいくつかの凝固因子の段階
的活性化より成ることが明らかにされている（J. Prote
in Chem., 5, 255-268(1986)) 。

【０００３】この反応を、例えば日本産カブトガニ（Ta
chypleus tridentatus）から得られるライセートによ
り、図１を用いて説明すると、ライセートにＥｔが加わ
ると、ライセート中に存在するＣ因子が活性化され、生
成した活性型Ｃ因子がＢ因子の特定箇所を限定水解して
活性型Ｂ因子を生成し、活性型Ｂ因子はプロクロッティ
ングエンザイムを活性化してクロッティングエンザイム
に変換し、クロッティングエンザイムはコアギュローゲ
ンのジスルフィド結合で架橋されたループ内の特定箇所
（…Ａｒｇ18−Ｔｈｒ19…の間および…Ａｒｇ46−Ｇｌ
ｙ47…の間）を限定水解してＨ−Ｔｈｒ19…Ａｒｇ46−
ＯＨで表されるペプチドＣを遊離しつつ残余の部分がコ
アギュリンゲルに変換される、という一連の反応（カス
ケード反応とも呼ばれる）である。以下Ｅｔによる活性
化に起因するカスケード反応をＣ因子系反応と言い、そ
してそのＣ因子系反応に関与するＥｔ以外のライセート
由来の成分をＣ因子系反応関与成分と言う。

【０００４】一方、ライセートはＥｔだけでなく（１→
３）−β−Ｄ−グルカン類（以下β−グルカンともい
う）が加わっても凝固することが明らかになった。すな
わち、β−グルカンによって、図１におけるＧ因子が活
性化され、生成する活性型Ｇ因子がプロクロッティング
エンザイムをクロッティングエンザイムに活性化し、コ
アギュリンゲルを生成するというカスケード反応が起こ
る。以下β−グルカンによる活性化に起因するカスケー
ド反応をＧ因子系反応と言う。

【０００５】また、上記の各カスケード反応により生成
するクロッティングエンザイムは、反応系に別に添加さ
れる合成基質、例えばｔ−ブトキシカルボニル−ロイシ
ル−グリシル−アルギニン−パラニトロアニリド（Ｂｏ
ｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）のアミド結合を
水解してパラニトロアニリンを遊離する。したがって、
生成した発色物質（パラニトロアニリン）の吸光度を測
定することによりＥｔまたはβ−グルカンを定量でき
る。

【０００６】このように通常のライセート中にはＣ因子
系反応とＧ因子系反応の両方の反応に関与する成分が含
まれているため、これを用いて検体中のＥｔを測定する
際には検体に含まれる可能性のあるβ−グルカンによっ
てＧ因子系反応が進行して正しい結果が得られない場合
がある。このように、いわゆるリムルステストはＥｔに
特異的な測定法ではないことが明らかにされている。

【０００７】ライセートを調製する方法としては、カブ
トガニ・アメボサイトに蒸留水を加えて４℃で振とうテ
ーブル上で一晩ゆっくりと旋回することによってアメボ
サイトを破裂させ、その上澄液を用いる方法、アメボサ
イトに０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を
加えてホモジナイザーにて均一に破砕および抽出して、
その上澄液を用いる方法等が知られている。もちろん、
これらの方法で調製されたライセート中にはＣ因子系反
応関与成分ならびにＧ因子が特に不活化されることもな
く十分に含有されていることは言うまでもない。

【０００８】また、Ｅｔ特異的なライセートを得る方法
が種々検討されている。例えば、ライセートに、(1)カ
ードラン、パキマン、スクレロタン、レンチナン、シゾ
フィラン、コリオラン、ラミナラン、パラミロン、カル
ボキシメチル化カードランからなる群から選ばれた水溶
性多糖（米国特許第５，１７９，００６号公報）、(2)
特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド（ＷＯ９
０／０２９５１号公報）、(3)Ｇ因子に対する抗体（特
開平４−１０２０６４号公報）、(4)アプロチニン（特
開平６−２５８３２６号公報）、(5)アルキルグルコシ
ド（特開平７−１０３９８２号公報）、(6)β−グルカ
ン結合性タンパク質（ＷＯ９６／０６８５８号公報）ま
たは(7)β−グルカン類のポリカルボン酸誘導体または
グリセリル誘導体（特開平８−１２２３３４号公報）等
を共存させることによって、Ｅｔ特異的なライセートを
得る方法が知られている。

【０００９】また特開平４−１３４２６５号公報には、
ライセートを特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコ
シドを不溶性担体に固定化して得られる不溶性固定化物
に接触させることによって、Ｅｔ特異的なライセートを
得る方法が記載されている。しかしながら、カブトガニ
・アメボサイトを特定条件で抽出することによって、Ｅ
ｔ特異的なライセートを製造する方法、当該方法により
得られるライセート及び当該ライセートからなるＥｔ特
異的測定剤は知られていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】前記公知の方法は、Ｇ
因子の活性化を阻害する物質や、Ｇ因子を吸着除去する
ための不溶性担体を準備する必要があり、かつこれら物
質や不溶性担体をＥｔフリーとする操作がさらに必要で
ある。このような物質や不溶性担体を用いず、又は用い
るとしてもごく少量で足りれば、極めて効率よく、簡便
かつ安価にＥｔ特異的ライセートを製造することができ
る。

【００１１】本発明の目的は、カブトガニ・アメボサイ
トから簡便かつ安価にＥｔ特異的ライセートを製造する
方法、当該方法により得られるライセート及び当該ライ
セートからなるＥｔ特異的測定剤を提供することであ
る。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために鋭意研究を重ね、カブトガニ・アメ
ボサイトの破砕・抽出方法を詳細に検討した結果、驚く
べきことに、カブトガニ・アメボサイトを特定の条件下
で機械的処理することによって、Ｃ因子系反応関与成分
が実質的に不活化されておらず、かつ実質的にＧ因子の
みが不活化されたＥｔ特異的ライセートが得られること
を見出し、本発明を完成するに至った。

【００１３】本発明は、以下により構成される。 （１）カブトガニ・アメボサイト、カブトガニ・アメボ
サイト懸濁液またはＣ因子及びＧ因子を少なくとも含む
溶液を、Ｇ因子を特異的に不活化させる機械的処理に付
す工程を含むことを特徴とするエンドトキシン特異的な
カブトガニ・アメボサイト・ライセートの製造方法。 （２）前記機械的処理は、ホモジナイザーを高速回転さ
せることであることを特徴とする上記（１）に記載のエ
ンドトキシン特異的なカブトガニ・アメボサイト・ライ
セートの製造方法。 （３）前記高速回転の回転速度が１２０００〜３０００
０ｒｐｍであることを特徴とする上記（２）に記載のエ
ンドトキシン特異的なカブトガニ・アメボサイト・ライ
セートの製造方法。 （４）ホモジナイザーを高速回転させることが、４℃〜
５０℃の条件下で１〜２０分間行われることを特徴とす
る上記（２）または（３）に記載のエンドトキシン特異
的なカブトガニ・アメボサイト・ライセートの製造方
法。 （５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載のエンドト
キシン特異的なカブトガニ・アメボサイト・ライセート
の製造方法によって製造されることを特徴とするエンド
トキシン特異的なカブトガニ・アメボサイト・ライセー
ト。 （６）上記（５）に記載のエンドトキシン特異的なカブ
トガニ・アメボサイト・ライセートを含有することを特
徴とするエンドトキシン特異的測定剤。

【００１４】以下、上記（１）〜（４）を「本発明製造
方法」、上記（５）を「本発明ライセート」、上記
（６）を「本発明測定剤」という。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の形態につい
て説明する。 ＜１＞本発明製造方法 本発明製造方法で用いることができるカブトガニ・アメ
ボサイトとしては、リムルス・ポリフェムス（Limulus
polyphemus）、タキプレウス・トリデンタツス（Tachyp
leus tridentatus）、タキプレウス・ギガス（Tachyple
us gigas）、タキプレウス(カルシノスコルピウス）・
ロツンディカウダ（Tachypleus(Carcinoscorpius) rotu
ndicauda）等のカブトガニから通常の方法で血リンパ液
を採血して調製したアメボサイトを挙げることができ
る。

【００１６】本発明に使用するカブトガニ・アメボサイ
ト懸濁液は、このようにして得られたカブトガニ・アメ
ボサイトに、Ｃ因子系反応を阻害する物質を実質的に含
まない抽出溶媒を加えることにより調製することができ
る。抽出溶媒は、Ｃ因子系反応を実質的に阻害しない限
りにおいて特に限定されないが、例えば水や弱酸性〜弱
アルカリ性緩衝液（例えばｐＨ６〜９程度の緩衝液）等
が挙げられる。抽出溶媒の添加量は、当業者が適宜決定
することができる。

【００１７】本発明は、このように調製されたカブトガ
ニ・アメボサイトまたはその懸濁液に対してＧ因子を特
異的に不活化させるように機械的に処理する。この機械
的処理において、カブトガニ・アメボサイトは破砕さ
れ、細胞内内容物が液中に排出され、Ｇ因子が機械的な
力により不活化し、Ｃ因子系反応関与成分は、その活性
を保持する。このような特異的不活化の詳細は、明確で
はないが、両因子の立体構造が機械的に変形されるもの
と推察されると共にＣ因子系反応関与成分とＧ因子との
間に機械的な作用に対する感受性の差異が存在すると考
えられる。

【００１８】本発明は、上述のような特異的不活化が達
成できるならば、特に機械的処理における処理方法は限
定されることはない。具体的な処理方法としては、上記
諸因子と溶媒分子とが激しく衝突するように該液を振盪
したり回転する方法、あるいはこれら方法においてガラ
スや金属等の小球等の補助手段を用いて処理する方法等
が挙げられるが、中でもホモジナイザーを高速回転させ
る処理方法が好ましい。

【００１９】このような処理に用いられるホモジナイザ
ーとしては、周知の装置が挙げられる。ホモジナイザー
の中でも、例えば、モーターによって高速回転させるこ
とが可能な部材、例えば、筒体、棒体、刃等を有するホ
モジナイザーが好ましく、中でも刃を有したものが特に
好ましい。これら部材の素材、サイズ、形状等は、出発
物質がアメボサイト細胞かその内容物かの違い、処理量
等により適宜選定され得る。

【００２０】部材の回転速度は、前記Ｇ因子が実質的に
不活化し、またＣ因子系反応関与成分が実質的に不活化
しない限りにおいて特に限定されるものではないが、通
常、刃の場合、１２０００ｒｐｍよりも回転速度が低い
とＧ因子が十分に不活化しない傾向があり、また３００
００ｒｐｍよりも回転速度が高いとＣ因子系反応関与成
分も不活化する傾向が高まることから、高速回転の回転
速度は１２０００〜３００００ｒｐｍ（回転／分）であ
ることが好ましい。

【００２１】ホモジナイザーによる処理温度は、カブト
ガニ・アメボサイトと前記抽出溶媒を含有する溶液が氷
結せず、またＣ因子系反応関与成分が実質的に不活化し
ない限りにおいて特に限定されないが、５０℃以上だと
Ｃ因子系反応関与成分が不活化する傾向があることか
ら、５０℃以下が好ましく、４℃〜５０℃がより好まし
い。

【００２２】ホモジナイザーによる処理時間は、Ｃ因子
系反応関与成分が実質的に不活化しない限りにおいて特
に限定されないが、２０分以上だとＣ因子系反応関与成
分が不活化する傾向があることから、２０分以下が好ま
しく、１〜２０分がより好ましい。このような特定条件
下で、ホモジナイザーを用いてカブトガニ・アメボサイ
トまたはその懸濁液を機械的に処理することによって、
カブトガニ・アメボサイト・ライセートのＥｔへの特異
性を非常に高めることができる。

【００２３】本発明において、上述のカブトガニ・アメ
ボサイトまたはその懸濁液の代わりに、Ｃ因子及びＧ因
子を少なくとも含む溶液を用いた場合も上記と同様な機
械的処理を行うことができる。このようなＣ因子及びＧ
因子を少なくとも含む溶液としては、カブトガニ・アメ
ボサイトから通常の方法（例えば、J. Biochem., 80,10
11-1021(1976)、特公昭５６−８６１９７号公報等）に
より調製したカブトガニ・アメボサイト・ライセート
や、カブトガニ・アメボサイト・ライセートを用いて調
製された市販のリムルステスト試薬（いずれもＣ因子系
反応関与成分及びＧ因子が含有されており、Ｅｔ及びβ
−グルカンのいずれにも反応するもの）が包含される。
この場合のホモジナイザー等による処理条件はアメボサ
イト細胞を破砕する必要がない点を除けば、基本的には
前記と同様である。これによっても、カブトガニ・アメ
ボサイト・ライセートやリムルステスト試薬のＥｔ特異
性を非常に高めることができる。 ＜２＞本発明ライセート 本発明ライセートは上記＜１＞に記載の製造方法によっ
て製造されるものであり、以下の特性を有する。 (1)Ｅｔに特異的に反応し、β−グルカンには実質的に
反応しない。 (2)Ｇ因子は不活化しており、特に除去する必要がない
ので、通常、Ｇ因子分子自体は不活化した状態でライセ
ート中に含有されている。 (3)Ｃ因子系反応関与成分は実質的に不活化されていな
い状態でライセート中に含有されている。 (4)ライセート中に、所望によりＧ因子系反応を抑制す
る物質（以下、「Ｇ因子系反応抑制剤」という）を添加
してもよい。

【００２４】なお、前記＜１＞で用いる抽出溶媒や、本
発明ライセートに、Ｇ因子系反応抑制剤を共存させても
良い。これによって、仮に前記＜１＞で説明した好まし
い処理条件（回転数、温度、時間）とわずかに異なる条
件で処理を行ったり、また何らかの原因により前記した
処理だけでは十分にＧ因子が不活化していなかったとし
ても、Ｅｔ特異性を十分に保証することができる。なお
このような場合においても、カブトガニ・アメボサイト
・ライセート中のＧ因子の大部分は不活化しているの
で、共存させるＧ因子系反応抑制剤の量は、従来よりも
少量で良い。

【００２５】カブトガニ・アメボサイト・ライセート中
のＧ因子が不活化していることは、例えば、次のように
して確認することができる。氷冷下、一定量のカブトガ
ニ・アメボサイト・ライセートに、通常の測定条件下に
おいてカブトガニ・アメボサイト・ライセートを充分に
活性化する一定量のβ−グルカン（Ｅｔを含有しないも
の）を加えて、通常の条件下で反応させ、カブトガニ・
アメボサイト・ライセートの活性化が起こらない、又は
当該活性化の程度が減少していることを確認する。

【００２６】本発明で用いることができるＧ因子系反応
抑制剤は、カブトガニ・アメボサイト・ライセートのＧ
因子系反応を阻害する又は(1→3)-β-D-グルカンを不活
化するが、Ｃ因子系反応には実質的に影響を及ぼさない
物質ならば特に限定されない。本発明で用いることがで
きる公知のＧ因子系反応抑制剤としては、例えば以下の
物質が例示できるが、これらに限定されるものではな
い。 (1)特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド（Ｗ
Ｏ９０／０２９５１号公報）。 (2)Ｇ因子に対する抗体（特開平４−１０２０６４号公
報）。 (3)アプロチニン（特開平６−２５８３２６号公報）。 (4)アルキルグルコシド（特開平７−１０３９８２号公
報）。 (5)β−グルカン結合性タンパク質（ＷＯ９６／０６８
５８号公報）。 (6)β−グルカン類のポリカルボン酸誘導体またはグリ
セリル誘導体（特開平８−１２２３３４号公報）。

【００２７】カブトガニ・アメボサイト・ライセートに
共存させるＧ因子系反応抑制剤の量は、例えば、次のよ
うにして決定することができる。氷冷下、一定量のカブ
トガニ・アメボサイト・ライセートに、Ｇ因子系反応抑
制剤（Ｅｔを含有しないもの）の量を変えて加え、それ
らに通常の測定条件下においてカブトガニ・アメボサイ
ト・ライセートを充分に活性化する一定量のβ−グルカ
ン（Ｅｔを含有しないもの）を加えて、通常の条件下で
反応させる。この条件下でβ−グルカンによるカブトガ
ニ・アメボサイト・ライセートの活性化を完全に抑制す
るＧ因子系反応抑制剤の量を求める。

【００２８】また、本発明製造方法により製造されたカ
ブトガニ・アメボサイト・ライセートを、以下のＧ因子
系反応抑制剤を固定化した不溶性担体に接触させ、カブ
トガニ・アメボサイト・ライセート中のＧ因子を吸着除
去しても良い。これによっても、Ｅｔ特異性を十分に保
証することができる。 (1)特定構造を有するポリ(1→3)-β-D-グルコシド（Ｗ
Ｏ９０／０２９５１号公報）。 (2)Ｇ因子に対する抗体（特開平４−１０２０６４号公
報）。 (3)アプロチニン（特開平６−２５８３２６号公報）。 (4)アルキルグルコシド（特開平７−１０３９８２号公
報）。 (5)β−グルカン類のポリカルボン酸誘導体またはグリ
セリル誘導体（特開平８−１２２３３４号公報）。

【００２９】Ｇ因子系反応抑制剤を固定化する不溶性担
体としては、水酸基やカルバモイル基などの親水性の基
を有する不溶性担体であれば特に限定されない。例え
ば、セルロース（例えば、セルロースパウダー（アドバ
ンテック東洋販売）、セルロファイン（生化学工業
（株）販売）、アビセル（フナコシ薬品販売）、セレッ
クス（バイオラッド販売）など）、アガロース（例え
ば、セファロース（ファルマシア販売）、バイオゲルＡ
（バイオラッド販売）、クロマゲルＡ（同仁化学販
売）、サガバック（セラバックラボラトリーズ販売）、
ゲラロース（リテックス販売）、Ｐ−Ｌアガロース（Ｐ
−Ｌバイオケミカルズ販売）など）、架橋デキストラン
（例えば、セファデックスＧ、セファクリル（ファルマ
シア販売）、Ｐ−Ｌデックス（Ｐ−Ｌバイオケミカルズ
販売）など）、ポリアクリルアミド（例えば、バイオゲ
ルＰ（バイオラッド販売）、クロマゲルＰ（同仁化学販
売）など）、多孔質ガラス（例えば、バイオグラス（バ
イオラッド販売）など）、親水性ポリビニル系合成ポリ
マー（例えば、トヨパール（東ソー販売）など）等が例
示される。

【００３０】本発明ライセートは、そのままＥｔ特異的
測定のために使用することもできるし、本発明ライセー
トの組成成分の全部またはその一部を本発明測定剤の成
分として用いることもできる。本発明ライセートを用い
るＥｔの測定方法は、本発明測定剤を用いるEtの測定方
法（後述の＜３＞で説明する）と同様である。 ＜３＞本発明測定剤 本発明測定剤は、本発明ライセートを含有するエンドト
キシン特異的測定剤である。ここで、本発明ライセート
を含有するとは、本発明ライセートの組成成分の全てを
含有することのみならず、本発明ライセートの組成成分
のうち少なくともＣ因子系反応関与成分を含みＥｔを特
異的に測定するために必要な成分を少なくとも含有する
ことも意味するが、本発明ライセートの組成成分の全て
を含有することが好ましい。少なくともＣ因子系反応関
与成分を含みＥｔを特異的に測定するために必要な成分
としては、図１に示したように、Ｃ因子、Ｂ因子、凝固
酵素前駆体及びコアギュローゲンからなるものまたはそ
れらからコアギュローゲンを除いたものが挙げられる。
本発明測定剤には、本発明ライセート以外に、Ｃ因子系
反応の活性を阻害しない限りにおいて賦形剤等を含有さ
せても良い。

【００３１】本発明測定剤を使用する際には、リムルス
反応に際し、前記カスケード反応系の活性化に有効な２
価金属塩を共存させる必要がある。このような２価金属
塩としては、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウ
ムなどのアルカリ土類金属のハロゲン化水素酸塩（塩化
物等）、硫酸塩等が例示される。本発明測定剤において
は、上記金属塩をリムルス反応時に別に添加してもよい
が、本発明測定剤に上記２価金属塩を共存させた状態
で、非加熱条件下での乾燥処理（例えば、凍結乾燥）を
行って固体状態にしたものが望ましい。さらに、上記ア
ミダーゼ活性を測定するための測定剤は、２価金属塩の
ほかに前記ペプチド合成基質を共存させたものであるこ
とが好ましく、これを乾燥処理したものであってもよ
い。

【００３２】本発明測定剤を用いてＥｔを測定するに
は、図１のカスケード反応によって生成するクロッティ
ングエンザイムの活性を公知の方法で測定すればよい。
クロッティングエンザイムのアミダーゼ活性の測定に
は、基質として、例えば前記のｐ−ニトロアニリンのよ
うな発色性残基を有するペプチド合成基質もしくは発色
性残基を有するこれと類似の配列のペプチド合成基質、
またはこれと同一もしくは類似の配列のペプチドであっ
て、Ｃ末端のアミノ酸のカルボキシル基に前記発色性残
基の代わりに公知の発蛍光性残基、発光性残基、アンモ
ニアなどがアミド結合により置換したペプチド合成基質
を使用することができる。クロッティングエンザイムが
これらの合成基質に作用して生成する反応生成物を測定
することによって、アミダーゼ活性の測定を行うことが
できる。具体的には、本発明測定剤とＥｔを含む反応系
に上記ペプチド合成基質を共存させ、反応（カスケード
反応および必要に応じて生成物の他色素等への変換反
応）によって生成する色素、蛍光物質またはアンモニア
をそれぞれ分光光度計、蛍光光度計、化学発光測定装
置、アンモニア検出用電極（特開昭６２−１４８８６
０）等によって測定する方法を例示することができる。

【００３３】クロッティングエンザイムのプロテアーゼ
活性の測定には、本発明測定剤中に含まれる（もしくは
別途添加した）コアギュローゲン（基質）にクロッティ
ングエンザイムが作用してコアギュリンゲルが生成する
際のゲル形成反応を、例えば適当な機器（例えば、濁度
測定装置、粘度測定装置等）で測定するか、または肉眼
で判定する方法を採用することができる。

【００３４】本発明測定剤によりＥｔが測定される検体
としては、基本的には特に制限なく、Ｅｔ定量の必要が
あるものあるいはその存否を確認する必要があるもので
あればよい。例えば、生体試料、医薬品、医療分野で使
用する水等を挙げることができる。

【００３５】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。 実施例１：カブトガニ(Limulus polyphemus)のアメボサ
イト約２gに０．０２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）２０ｍＬを加え、ホモジナイザー（ポリトロンＲ
（商品名）、Kinematica社製造）にて回転数、処理温
度、処理時間を種々変化させて均一に破砕および抽出
し、１０，０００×Ｇで３０分間冷却遠心し、種々の条
件で調製した上澄液（ライセート）を得た。

【００３６】この各種ライセート各々０．０４ｍＬに２
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０１ｍＬ、
０．４Ｍ塩化マグネシウム０．０３ｍＬ、３．０ｍＭ合
成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）
０．０２ｍＬを加え、さらに検体として蒸留水（ブラン
ク）、Ｅｔ（大腸菌O111:B4株由来、シグマ社販売のWes
tphal type；20pg/mL）またはβ−グルカン（以下の方
法により調製；20pg/mL）を別々に０．１ｍＬ加えた。

【００３７】それらを３７℃、３０分間加温して反応さ
せ、０．６Ｍ酢酸０．４ｍＬを加えて反応を停止させ、
４０５ｎｍの吸光度を測定して、生じたパラニトロアニ
リンを定量し、反応性を比較検討した。ブランクとの差
（ΔA405nm値）を反応性として、その結果を表１に示し
た。この結果から、カブトガニ・アメボサイトからライ
セートを抽出する際にホモジナイザーを用いて回転数１
２０００〜３００００ｒｐｍ、処理温度４〜５０℃、処
理時間１〜２０分の機械的処理を行えば、(1)Ｅｔに特
異的に反応するがβ−グルカンには実質的に反応せず、
(2)Ｇ因子のみが不活化しており、Ｃ因子系反応関与成
分は実質的に不活化しておらず、(3)Ｃ因子系反応関与
成分及びＧ因子分子自体は一切除去されておらず、(4)
Ｇ因子系反応抑制剤が含有されていない本発明ライセー
ト及び本発明測定剤が得られることが示された。

【００３８】

【表１】 （β−グルカンの調製法）ＰＣＴ国際公開Ｗ０９０／０
２９５１に記載の方法に準じ、カードラン（和光純薬工
業（株）販売）の１ｇを約１００ｍＬの５ｍＭ ＮａＯ
Ｈ水溶液に懸濁し、氷冷下で音波発生機、ソニケーター
TM（大岳製作所、形式５２０２ＰＺＴ、東京）により２
０ｋＨZ、８０Ｗで１２分間音波処理による低分子化を
行った。処理液を５Ｍ ＮａＯＨ水溶液を用い、最終
０．３Ｍ水溶液とし、ゲルパーミエーションクロマトグ
ラフィー（ＧＰＣカラム：ＴＳＫ ｇｅｌ Ｇ３０００
ＰＷXL２本、Ｇ２５００ＰＷXL １本、移動相：０．３
Ｍ ＮａＯＨ水溶液、流速０．５ｍＬ／ｍｉｎ）により
分画採取し、再クロマトグラフィーにより分子量２１
６，０００画分を分画採取し、ＧＰＣ分画精製標品（β
−グルカン標品）を得た。

【００３９】実施例２：実施例１の表１において、24,0
00rpm、４℃、１０分の条件で抽出したライセート0.04m
Lに、２Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH8.0）0.01mL、0.4Ｍ
塩化マグネシウム0.03mL、3.0mM Boc-Leu-Gly-Arg-pNA
0.02mLを加えて本発明測定剤を得た。この測定剤に蒸留
水(ブランク)、種々の濃度のＥｔまたはβ−グルカンを
別々に0.1mL加え、37℃、30分間加温して反応させ、0.6
Ｍ酢酸0.4mLを加えて反応を停止させ、405nmの吸光度を
測定した。ブランクとの差（ΔA405nm値）を縦軸に、Ｅ
ｔおよびβ−グルカン濃度を横軸にプロットしてそれぞ
れの検量線を作成した。その結果を図２に示した。Ｅｔ
濃度と吸光度の間には良好な直線性が得られた。一方、
β−グルカンについてはどの濃度においてもブランク値
と同一で全く反応しなかった。以上の結果により、本発
明測定剤を用いればβ−グルカンに影響されることなく
検体中のＥｔが正確に測定できることがわかる。

【００４０】

【発明の効果】本発明製造方法は、カブトガニ・アメボ
サイトを特定条件下でホモジナイズするだけでＥｔに特
異的なカブトガニ・アメボサイト・ライセートを得るこ
とができる方法であり、これによってＥｔに特異的なカ
ブトガニ・アメボサイト・ライセートを極めて簡便かつ
安価に製造することができる。また本発明ライセートや
本発明測定剤は、本発明製造方法により製造されるもの
であることから、極めて簡便に製造することができ、安
価に提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】リムルス反応の機構を説明する図面である。

【図２】本発明測定剤と種々濃度のエンドトキシン
（●）又はβ−グルカン（○）とを反応させたときの吸
光度を示す図面である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 カブトガニ・アメボサイト、カブトガニ
   ・アメボサイト懸濁液またはＣ因子及びＧ因子を少なく
   とも含む溶液を、Ｇ因子を特異的に不活化させる機械的
   処理に付す工程を含むことを特徴とするエンドトキシン
   特異的なカブトガニ・アメボサイト・ライセートの製造
   方法。
2. 【請求項２】 前記機械的処理は、ホモジナイザーを高
   速回転させることであることを特徴とする請求項１に記
   載のエンドトキシン特異的なカブトガニ・アメボサイト
   ・ライセートの製造方法。
3. 【請求項３】 前記高速回転の回転速度が１２０００〜
   ３００００ｒｐｍであることを特徴とする請求項２に記
   載のエンドトキシン特異的なカブトガニ・アメボサイト
   ・ライセートの製造方法。
4. 【請求項４】 ホモジナイザーを高速回転させること
   が、４℃〜５０℃の条件下で１〜２０分間行われること
   を特徴とする請求項２または３に記載のエンドトキシン
   特異的なカブトガニ・アメボサイト・ライセートの製造
   方法。
5. 【請求項５】 請求項１〜請求項４のいずれか１項に記
   載のエンドトキシン特異的なカブトガニ・アメボサイト
   ・ライセートの製造方法によって製造されることを特徴
   とするエンドトキシン特異的なカブトガニ・アメボサイ
   ト・ライセート。
6. 【請求項６】 請求項５に記載のエンドトキシン特異的
   なカブトガニ・アメボサイト・ライセートを含有するこ
   とを特徴とするエンドトキシン特異的測定剤。