JPH1121298A - 知覚過敏抑制ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】新規の知覚過敏抑制物質を提供する。 【解決手段】ウシノシセプチン前駆体蛋白質の構造解析
を行い、潜在的開列部位ペプチドを合成しスクリーニン
グを実施した結果、111〜127位のアミノ酸配列に相当す
るBRL-3ペプチドが、優れた知覚過敏抑制作用を有する
ことを確認した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は新規な知覚過敏抑制
ペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】脊髄後角は疼痛伝達の重要な部位であり
そして多くの伝達物質が入ってくる疼痛情報の調節に関
与している（Yaksh, T. L. et al, Textbook of Pain,
2nd Edn, 283-320, Churchill Livingstone, Edinburg
h, 1989）。シナプス後ニューロンの興奮性や応答性の
亢進、求心性末端の形態学的又は機能的変化によって明
示されるように、侵襲性刺激や非侵襲性刺激に対する感
受性の亢進が脊髄における長期の機能変化に関与し得る
ことが明白になっている（Woolf, C. J., Textbookof P
ain, 3rd Edn, 101-112, Churchill Livingstone, Edin
burgh, 1994）。オピオイド医薬品は上行性及び下行性
疼痛経路を調節することによって鎮静効果をもたらし、
そしてオピオイドレセプターは疼痛伝達における役割の
究明に多くの研究がなされている。最近、オーファンオ
ピオイド様レセプターの内因性リガンドとして、ラッ
ト、ブタ及びウシ脳からヘプタデカペプチド、ノシセプ
チン（又はオーファニンFQ）が単離同定されたことによ
り、オピオイド研究において非常な注目を浴びている
（Meunier, J. C. et al., Nature, 377, 532-535, 199
5、 Reinscheid, R. K. et al., Science, 270, 792-79
4, 1995、Okuda-Ashitaka, E. et al., Mol. Brain Re
s., 43, 96-104, 1996）。（ヒトではORL1、このラット
対応物はLC132及びROR-C）。生体内ではノシセプチンは
より大きな前駆体蛋白質から産生され、ラット、マウス
及びヒトのプレ体ｃＤＮＡ並びに遺伝子構造はすでに報
告されている（Nothacker, H. P. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 93, 8677-8682, 1996; Pan, Y. X. e
t al., Biochem. J., 315, 11-13, 1996; Houtani, T.
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 219, 714-7
19, 1996; Mollereau, C. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 93, 8666-8670, 1996）。

【０００３】ノシセプチンの生理作用としてこれまで、
運動活性の低下（Reinsheid,R.K. et al., Science, 27
0, 792-794, 1995）、末梢の感覚神経終末からのタキキ
ニンの分泌の抑制（Guiliani, S., et al., Br. J. Pha
rmacol., 118, 1567-1569, 1996）、ラット大脳皮質か
らのグルタミン酸分泌の抑制（Nicol, B. et al., Br.
J. Pharmacol., 119, 1081-1083, 1996）、カエルの卵
におけるＫ⁺チャンネルの抑制（Matthes, H. et al., M
ol. Pharmacol., 50, 447-450, 1996）作用などが報告
されており、本発明者らも最近、i.t.（髄腔内）投与で
ノシセプチンが覚醒マウスでの、非侵襲性の触覚刺激に
応答して異痛応答（アロディニア、Allodynia）を、そ
して侵襲性の刺激に応答して知覚過敏応答を誘導するこ
とを報告した（Hara, N. et al., Br. J. Pharmacol.,
121, 401-408, 1997）。しかしながら、ノシセプチンの
生理作用に影響を与える生体成分についてはなにも知ら
れていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ノシセプチンによる知
覚過敏誘導作用を抑制するペプチドを提供することにあ
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ウシノシ
セプチン前駆体を解析するために、プローブとしてラッ
トのノシセプチン前駆体ｃＤＮＡフラグメント（225〜4
90）を使用して、1,019 bp長のｃＤＮＡ挿入物を含有す
るクローンをウシ脳ｃＤＮＡライブラリーから単離した
（Okuda-Ashitaka, E., et al., Mol. Brain Res., 43,
96-104, 1996）。ウシのノシセプチン前駆体蛋白質
は、176個のアミノ酸残基からなっている（図１）。ヒ
ト、マウス及びラットのノシセプチン前駆体に対してそ
れぞれ86、74及び72％の相同性が存在する。これら４種
の前駆体のアミノ酸配列を比較検討すると、ノシセプチ
ン配列は塩基性アミノ酸残基Ｌys-Ａrg対に挟まれた形
で位置している。ウシの前駆体蛋白質はさらに３つの潜
在的開裂部位を有している: ２つの部位、Ｌys-Ａrgは
ノシセプチンの上流に位置し、そして１つの部位、Ａrg
-Ａrg-Ａrgはノシセプチンの下流に位置している。これ
らの潜在的開裂部位から４つのプロセッシング生成物の
可能性が示唆された。すなわち、 BRL-2（98〜108位に1
1個のアミノ酸残基）、BRL-3（111〜127位に17個のアミ
ノ酸残基）、BRL-4（149〜165位に17個のアミノ酸残
基）及びBRL-5（169〜176位に８個のアミノ酸残基）で
ある。このように、前駆体中、ノシセプチンは二つの塩
基性アミノ酸に挟まれた形で存在し、さらに他の部位に
おいても塩基アミノ酸を両端に保持するペプチドが存在
する。このことは、生体内で産生され生理機能を発現す
る可能性を有する。そこで本発明者らは、これらの推定
上のペプチドが生体内で生物学的に活性であるかどうか
を解明するために、我々はこれらペプチドを化学的に合
成しそして覚醒マウスにおけるノシセプチン誘発性の疼
痛応答に与える効果を研究した。その結果、驚くべきこ
とに、BRL-3がノシセプチンによる知覚過敏誘導作用を
抑制することを見いだした。さらに、BRL-3部位に相当
するヒト、マウスのプレノシセプチン部位の合成ペプチ
ドも同作用を有し、活性中心がそのＣ末端側にあること
を見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち本発
明は、配列番号１、２、３及び４に記載される知覚過敏
抑制ペプチド、配列番号３に記載のペプチドのアミノ酸
配列の１つ又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換、又は
付加されたアミノ酸配列を有する知覚過敏抑制作用を有
するペプチド、配列番号４に記載にペプチドを一部とし
て保有する知覚過敏抑制ペプチド、これらペプチドの化
学修飾された知覚抑制作用を有するペプチド誘導体、配
列番号３に記載のヒトペプチドと反応する抗体、及びこ
れらペプチドを有効成分とする医薬組成物、知覚過敏抑
制剤、に関する。

【０００６】本発明者らが解析したウシプレノシセプチ
ンアミノ酸配列とヒト、マウス及びラットのそのアミノ
酸配列を比較し、塩基性アミノ酸の間に位置するペプチ
ド、すなわちプロセシングにより生体内で生成され生理
活性を発現すると予想されるペプチドを合成し、初め
て、BRL-3に相当するペプチドが知覚過敏抑制作用を有
することを開示したものである。本発明は、配列番号３
に記載のペプチドのアミノ酸を１つ又は複数個、欠失、
付加又は置換された、該活性を有するペプチドも含まれ
る。また、活性中心がＣ末端部ヘキサペプチドに存在す
ることが確認されたことから、このペプチドを一部とし
て含む、該活性を有するペプチドも本発明に含まれる。
このヘキサペプチドはさらに短くしても活性を発現する
と予想される。さらに、経口投与などを目的として、本
発明の活性ペプチドを基に、化学修飾を施したペプチド
誘導体も本発明に含まれる。

【０００７】

【発明の実施の形態】ペプチドの合成は、液相法、固相
法など常法に従い合成することが可能であり、通常、自
動合成機を利用することができる。化学修飾物の合成は
常法により行うことができる。抗体の作製は、常法に従
い作製することができ、例えば、ペプチドとキャリア蛋
白質との複合体を抗原として、マウス、兎、モルモット
などに接種免疫することによりポリクロナール抗体を作
製することができる。モノクロナール抗体の作製は、免
疫された動物の脾臓又はリンパ節から得られた抗体産生
細胞と骨髄腫細胞と細胞融合させ、ハイブリドーマとし
て単離されるが、いずれも公知の方法に準ずることがで
きる。抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び
抗体断片も本発明に含まれる。これら抗体は、生体試料
中の本発明ペプチド濃度の測定に利用することができ、
疾患との相関性研究に、また医薬として利用することが
期待される。本発明のペプチドは、知覚過敏抑制剤とし
て有効であり、経口的、局所的静注的、皮下注的などに
より投与することができ、局所もしくは静脈内投与が好
ましい。体重に応じて有効量を１〜20mlの生理食塩水に
溶解して用いる。製剤の形としては、水和剤、水溶剤、
錠剤、カプセル剤、粉剤、座剤などが使用でき、これら
製剤の担体としては薬学的に許容される賦形剤、崩壊剤
など通常の医薬品に使用されているものが用いられる。

【０００８】

【実施例】以下に本発明を具体的に説明するが、本発明
はこれらに限定されない。 実施例１ ペプチド合成 保護ペプチド樹脂の合成は、Wang樹脂（p-benzyloxyben
zyl alcohol resin）を出発原料とし、Fmoc法を適用し
たABI433A自動合成機を用いて行った。FastMoc ^TM 0.25
MonPvPk（Monitor Previous Peak）のプロトコールに従
い、0.25mmolスケールで、遂次アミノ酸誘導体を伸長し
保護ペプチド樹脂を合成した。ただし、縮合剤はHBTUに
換えてHATUを用いた。従って、実際の縮合条件は、Fmoc
-アミノ酸誘導体/HATU/DIEA（4/4/6当量）である。ま
た、用いたアミノ酸側鎖保護基は以下に示すとおりであ
る。アルギニンはPmc（2,2,5,7,8-pentamethylchroman-
6-sulphonyl）基、セリン、スレオニン、チロシン、ア
スパラギン酸、グルタミン酸はtart-butyl基、グルタミ
ン酸はtrityl基で側鎖官能基が保護されている。保護ペ
プチド樹脂のＮ末端Fmoc基を20％ピペリジンで除去した
後、適当な添加剤を含むTFA（トリフルオロ酢酸）で処
理することにより、残る全保護基の除去及びペプチドを
樹脂から切断し、粗遊離ペプチドを得た。粗ペプチドは
0.1％TFA含有アセトニトリル水溶液を溶離液とした逆相
HPLCで精製した。本発明にて使用したペプチドの合成
法、精製法とも同じ操作で行っているので、ROR-C3（17
アミノ酸残基、ウシ）の結果を代表例として掲げる。得
られた保護ペプチド樹脂0.995gをTFA（TFA/H2O/triisop
ropyl saline＝95/2.5/2.5）30mlを用い、室温で２時間
処理した。樹脂を濾去し、濾液を減圧濃縮した。得られ
た油状残査にエーテルを加え粉末とした。粉末を濾取
し、エーテルで洗浄した。粉末を乾燥後、50％酢酸100m
lに溶解し、水で希釈した後凍結乾燥した。凍結乾燥品4
60mg（Wang resinからの収率：95.5％）を得た。このう
ち100mgを飽和グアニジン塩酸水で調製した25％酢酸水3
0mlに溶かし、YMC pack ODS（SH-363-5,30×250mm）カ
ラムに適用した。16％アセトニトリル/0.1％TFAから40
％アセトニトリル/0.1％TFAへの直線勾配による溶出（8
0分、流速：20ml/min）で精製した。当該ペプチドを含
む画分を集め、アセトニトリルを減圧留去後、凍結乾燥
し80mg得た。 アミノ酸分析（6N塩酸加水分解、110度、22時間） Thr(1)0.93, Glu(8)8.28, Gly(2)1.98, Val(1)1.00, Il
e(1)0.98, Leu(2)2.06,Lys(1)1.01, NH3(3)3.04,Pro(1)
0.95 質量分析：FD MS[M+II]+ 1929.9(理論値：1929.1)

【０００９】実施例２ ノシセプチンによる知覚過敏に
対する作用 異痛（アロディニア、Allodynia）に関する実験は、南
の方法に準じて行った（Minami, T. et al., Pain, 57,
217-223, 1994）。22±2ｇの体重の雄ddＹマウスを使
用し、マイクロシリンジに取り付けた27ゲージのステン
レス鋼針（0.35mm、外径）を、Ｈylden及びＷilcoxの方
法（Hylden, J. L. K. et al., Eur. J.Pharmacol., 6
7, 313-316, 1980）を少し修正してＬ５とＬ６椎骨の間
に挿入した。媒体中の医薬品を覚醒マウスのi.t.（髄
腔）に徐々に注入した。注入量は５μlであった。i.t.
注入後、各マウスは、床に木製チップを敷いた13×8.5
×13cmのPlexiglass個室に入れた。機械的異痛は、本質
的にＹaksh及びＨartyの方法（Yaksh, T. L. et al.,
J. Pharmacol. Exp. Ther., 224, 501-507, 1988）に従
って絵筆でマウスの側腹部を軽くなでて５分毎に１回50
分間に亘って評価した。異痛応答は次のようにランク付
けた: ０、応答無し; １、軽くきーきー鳴いてなでてい
るプローブから逃れようと試みる; ２、なでているプロ
ーブで誘発されて激しくきーきー鳴き、プローブを咬む
か又は逃れようとする強い作用。かくして、６匹のマウ
スの考えられる最高累積得点はどの５分間であっても 2
×6＝12であり、そしてこれを100％とした。異痛に与え
る合成ペプチドの効果を評価するために、ノシセプチン
50pgをi.t.注入して10分後及び５分後に得られた異痛の
最高得点で効果を評価した。

【００１０】ノシセプチン（50pg／マウス）のi.t.注入
５分後、最初の刺激により顕著な異痛応答が誘発され、
10〜15分で最高値に達し、そして50分の実験期間中続い
た。ノシセプチンと等量のBRL-3の同時注入はノシセプ
チン誘導異痛を50分の実験期間中顕著に阻止した。i.t.
ノシセプチンの５分前にBRL-3を投与することによって
同じ阻止効果が観察されたことから、BRL-3とノシセプ
チンの直接的相互作用はないことが確認された。

【００１１】ノシセプチンと各合成ペプチドを同時に覚
醒マウスのくも膜下腔に注入した。対照マウスには生理
食塩水を与えた。ノシセプチン誘導異痛の評価はi.t.注
入10分後に行い、ノシセプチン単独に対する異痛得点を
100％とした。その結果、図２に示されるように、ノシ
セプチン（50pg）によって生じた異痛は、BRL-3によっ
て用量依存的に抑制され、ID₅₀値は400fgであった（表
１）。しかし乍ら、BRL-2、BRL-4及びBRL-5は500ngまで
の投与量でノシセプチン誘導異痛に影響を与えなかっ
た。BRL-3のi.t.投与はそれ自体では異痛を誘導しなか
った。

【００１２】実施例３ ホットプレート試験 マウスを55℃に維持したホットプレート上に置き、そし
てマウスが最初の回避応答（足をなめるか、跳び上がる
か又は素早く足を踏み鳴らす）を示すまでの経過時間を
Woolfeの方法に準じて記録した（Woolfe, G. and MacDo
nald, J. Pharmacol. Exp. Ther., 80, 300-307, 194
4）。ホットプレートに対するマウスの応答時間はノシ
セプチン50pgと500pgのBRL-2, -3, -4, -5 それぞれと
同時に覚醒マウスのくも膜下腔に注入し、15分後に測定
した。動物は各実験で１回の測定にしか使用しなかっ
た。異痛及び痛覚過敏に関する研究は、当地の倫理委員
会の承認を受け、そしてEthics Committee of the Inte
rnational Association for the Study of Painの指針
に従って実施した。

【００１３】図３に、ノシセプチン誘発痛覚過敏に与え
る合成ペプチドの効果を示した。i.t.生理的食塩水（1
7.6±0.85秒、ｎ＝8）と比較して、ノシセプチン50pgの
i.t.投与はi.t.注入15分後に応答潜伏期間を8.7±0.63
秒にまで短縮した。ノシセプチン誘発痛覚過敏は500pg
のBRL-3及びBRL-4によって顕著に減弱された（それぞ
れ、15.2±1.03秒及び14.0±0.31秒）。BRL-2及びBRL-5
はノシセプチン誘発痛覚過敏には影響を与えなかった。
これらの結果は、BRL-3がノシセプチンによって誘発さ
れた異痛応答及び痛覚過敏応答を共に抑制したことを示
している。

【００１４】実施例４ PGE2による異痛及び痛覚過敏に
対する効果 本発明者らは、プロスタグランジンＥ２（PGE2）のi.t.
投与が覚醒マウスで異痛及び痛覚過敏を誘導することを
報告した（Uda, R. et al., Brain Res., 510,26-32, 1
990）。そこで、BRL-3がPGE2誘導疼痛応答を減弱させ得
るかどうかを試験した。実験方法は、実施例２に記載と
同じ方法で、ノシセプチンの代わりにPGE2 10ngとBRL-3
を同時にi.t.投与して５分後に得られた異痛の最高得点
で効果を評価した。対照マウスには生理食塩水を与え、
PGE2単独投与に対する得点を100％とした。その結果、
図４に示されるように、PGE2によって誘発された異痛は
BRL-3によって用量依存的に抑制され、ID₅₀値（95％の
信頼限界）は56.8pg（2.49pg〜739pg）であった。

【００１５】痛覚過敏に対する効果は、実施例３に記載
の方法で行った。PGE2（10ng）を単独で又は10ngのBRL-
3と同時に覚醒マウスのくも膜下腔に注入した。i.t.注
入30分後に評価した。その結果、図５に示すように、生
理的食塩水を注入した対照マウスは14.7±0.85秒の潜伏
期間でホットプレートに応答した。i.t.投与したPGE2
（10ng）は応答潜伏期間を8.5±0.58秒にまで短縮し、
そしてこれもまた、１ngのBRL-3の同時注入によって、
対照と同じレベル（14.0±0.81秒）に戻された。これら
の結果はBRL-3が、ノシセプチンだけでなくPGE2によっ
て誘発された異痛や痛覚過敏も阻止したことを示してお
り、そしてBRL-3が脊髄レベルでの疼痛伝達で調節役割
を果たし得ることを示唆している。

【００１６】実施例５ 構造活性相関 次に、本発明者らは、他動物種の前駆体蛋白質のプロセ
ッシングされた部分が同じ生物学的活性を有しているか
どうかを確認した。BRL-3の両側にはＬys-Ａrg対が109
〜110位と128〜129位に配置されていたが、ヒト、ラッ
ト及びマウスの前駆体蛋白質には前者の開裂部位が無
く、それぞれ30、35及び41個のアミノ酸残基のプロセッ
シングされる生成物の可能性が示唆される（図１）。こ
れは長さが変動しそして種間保持の低いアミノ酸配列を
限定しているように思われるが、ペプチド間の長さの変
動は６個のアミノ酸モチーフＤＡＥＰＧＡ及びれに類し
たアミノ酸配列の繰り返し: マウスで３回、ラットで２
回、そしてヒトで１回によるものであり、そしてBRL-3
に対応するこれらペプチドのＣ末端の半分は種間でかな
り保持されている。我々はマウス前駆体蛋白質のBRL-3
対応部位（MRL-3と記す）及びヒト前駆体蛋白質のBRL-3
対応部位（HRL-3と記す）ヘプタデカペプチド、BRL-3の
カルボキシル末端オクタペプチド（ＥＩＥＱＫＱＬＱ）
（BRL-3-8Ｐと記す）及び種間で100％保持されているヘ
キサペプチド（ＥＱＫＱＬＱ）（RL-3-6Ｐと記す）を合
成し、そしてこれらがノシセプチン誘発異痛を抑制する
能力を試験した。その結果、これらの合成ペプチド、MR
L-3、HRL-3、BRL-3-8Ｐ及びRL-3-6Ｐは全て用量依存的
に異痛を抑制し、ID₅₀値はそれぞれ５pg、500pg、400fg
及び20pgであった（表１、図６）。これらの結果は、ノ
シセプチン前駆体のプロセッシングされたペプチドのカ
ルボキシル末端共用部分が生物学的活性に重要であるこ
とを示している。合成したペプチドの活性は表１に示し
た。

【００１７】

【表１】

【００１８】実施例６ BRL-3の生体内分布 マウス脊髄におけるこの新規ペプチドの分布を抗MRL-3
抗体を用いて試験した。抗BRL-3及び抗MRL-3 ポリクロ
ーナル抗血清は、以前に報告された方法（Okuda-Ashita
ka, E. et al., J. Biol. Chem., 271, 31255-31261, 1
996）に従って、抗原としてアオガイヘモシアニンとの
抱合体を用い、ウサギに免疫し作製した。得られた抗BR
L-3抗体は、BRL-3-8Ｐ抱合セファロース 4Ｂカラムで精
製した。免疫学的組織染色は以下に手法で行った。ddＹ
マウスをフェノバルビタールで麻酔し、リン酸緩衝生理
的食塩液（PBS）、続いてリン酸緩衝液中４％のパラホ
ルムアルデヒドで潅流した。脊髄を取り出し、同じ固定
液中４℃で一夜固定し、そして30％蔗糖を含有する冷リ
ン酸緩衝液中に保持した。切片（40μm）は凍結ミクロ
トームで切断した。これらの切片を、MRL-3又はノシセ
プチンに対する抗血清（Phoenix Pharmaceuticals, In
c.）と共に室温で一夜インキュベートし、10％の正常ヤ
ギ血清及び0.2％のトリトンＸ-100を含有するＰＢＳで
洗浄し、そしてＣy3抗ウサギIgＧで処理した。クリプト
ン／アルゴンレーザーを備えたBioRadMCR-1000共焦点顕
微鏡上でデジタル画像をとらえ、そしてFuji Pictograp
hy 3000プリンターで印刷した。

【００１９】MRL-3 様の免疫反応性は脊髄後角の浅層に
豊富であったが、脊髄灰白質の深層にも存在した。この
染色は反応混合物にMRL-3を添加することによって消失
した。更に、MRL-3 様の免疫反応性の分布は、抗ノシセ
プチン抗体を使用して検出されるノシセプチンの分布と
殆ど同一であるように思われた。MRL-3様免疫反応性も
またノシセプチン様免疫反応性もカプサイシン処理によ
って影響を受けず、これらのペプチドが一次求心性ニュ
ーロンよりはむしろ中枢性ニューロンで生成、放出さ
れ、そしてそれによって疼痛伝達を反対方向に調節する
ことを示している。

【００２０】実施例７ ウシ脳内因性BRL-3の確認 生体内でのBRL-3ペプチドの存在を確認するために、我
々はウシ脳の海馬、視床下部、内側嗅皮質及び中隔から
得られる内因性BRL-3の精製を試みた。ウシ脳の海馬、
視床下部、内側嗅皮質及び中隔を地方屠殺場で残りの領
域から分離し、ドライアイスで急速冷凍し、そして使用
まで−80℃で貯蔵した。冷凍ウシ脳（203ｇ）を小片に
切断しそして２容量（ｖ/ｗ）の沸騰水中で10分間熱処
理して内在性プロテアーゼを不活性化した。冷却後、水
層を0.5Ｍの酢酸（AcOH）の最終濃度にし、そして沸騰
させた組織はUltra-Turraxホモジナイザーを用いて最高
速度で２分間ホモジネートして抽出した。このホモジネ
ートを8,500×ｇで30分間遠心し、そして上清液（280m
l）を粗抽出物として使用した。凍結乾燥後、粗抽出物
を0.1Ｍ AcOH 5mlに溶解し、そして0.1Ｍ AcOHで平衡化
したBio-Gel P-4カラム（1.5×100cm）に適用した。ノ
シセプチン（分子量 1,810）を含有する溶出物で推定し
た分子量1,900程度のフラクションを集め、中和し、そ
して抗BRL-3 抗体を抱合したアフィニティクロマトグラ
フィーに付した。カラム（0.7×３cm）は、100mＭ Ｎa
Ｃlを含有する0.1Ｍ トリス-ＨＣl 50mlで洗浄し、そし
て次に吸着された物質を0.2Ｍ グリシン-ＨＣl、pH 2.5
で溶出した。溶出物の分別物をグルタールアルデヒドで
ウシ血清アルブミンと結合させ、そしてドットブロット
装置を使用してニトロセルロース膜に適用し、抗BRL-3
抗体を使用して免疫ブロット法で評価した。BRL-3 免疫
反応性物質を含有する溶出物を合わせ、そしてTSK ODS-
120Ｔカラム（4.6×250mm、Tosoh、東京都）を使用して
RP-HPLCに付し、そして0.1％トリフルオロ酢酸中30〜45
％のCH₃CNの40分間直線的勾配で溶出した。免疫反応性
フラクションは、気相自動蛋白質シークエンサーを使用
して直接アミノ酸配列決定に付した。その結果、図１の
ウシプレノシセプチンアミノ酸配列、No.111-127位に相
当する、BRL-3と同一であった。このペプチドの収量は
概ね300pmolであると推定された。このペプチドの同一
性は、マトリックス補助レーザー脱着イオン化を有する
飛行時間マススペクトロメーターによる質量分析法で確
認され、コンピューター検索（PRF/SEQDBデータベー
ス、Protein Research Foundation、日本国大阪府）は
既知のペプチドとの相同性を全く示さない。

【００２１】以上の結果から、BRL-3がこのペプチドに
特異的なレセプターと相互作用し、そしてそれによって
中枢神経系で新しい神経伝達物質系が構築されることを
示唆している。新規な知覚過敏抑制剤として期待され
る。

【００２２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Thr Glu Pro Gly Leu Glu Glu Val Gly Glu Ile Glu Gln Lys Gln Leu 1 5 10 15 Gln

【００２３】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ala Glu Pro Gly Ala Asp Asp Ala Glu Glu Val Glu Gln Lys Gln Leu 1 5 10 15 Gln

【００２４】配列番号：３ 配列の長さ：１７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Pro Glu Pro Gly Met Glu Glu Ala Gly Glu Met Glu Gln Lys Gln Leu 1 5 10 15 Gln

【００２５】配列番号：４ 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Glu Gln Lys Gln Leu Gln 1 5

【００２６】

【図面の簡単な説明】

【図１】ウシ、ヒト、マウス及びラットのノシセプチン
前駆体のアミノ酸配列。

【図２】ノシセプチンによる異痛に対するペプチドの効
果。ノシセプチン（50pg／マウス）単独（白丸）、BRL-
2（黒丸）、BRL-3（白三角)、BRL-4（黒三角）、BRL-5
（白四角）。平均値±s.e.m.（ｎ＝６）、ノシセプチン
注入群と比較して、*ｐ＜0.05、**ｐ＜0.01。

【図３】ノシセプチンによる痛覚過敏に対するペプチド
の効果。ノシセプチン（50pg／マウス）を500pgのBRL-
2、BRL-3、BRL-4又はBRL-5と同時に覚醒マウスの髄腔内
に注入。各点は平均値±s.e.m.（ｎ＝８）。ノシセプチ
ン注入群と比較して、**ｐ＜0.01。

【図４】PGE2による異痛に対するBRL-3の効果。平均値
±s.e.m.（ｎ＝６）。PGE2注入群と比較して、**ｐ＜0.
01。

【図５】PGE2による痛覚過敏に対するBRL-3の効果。平
均値±s.e.m.（ｎ＝10）。PGE2注入群と比較して、**ｐ
＜0.01。

【図６】ノシセプチンによる異痛に対する各種合成ペプ
チド（i.t.注入）の効果。ノシセプチン（50pg／マウ
ス）単独（×）、BRL-3（黒丸）、MRL-3（白丸）、HRL-
3（黒三角）、BRL-3-8Ｐ（白三角）、MRL-3-8Ｐ（黒四
角）及びRL-3-6Ｐ（白四角）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＱ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】配列番号１に記載の知覚過敏抑制ペプチ
   ド。
2. 【請求項２】配列番号２に記載の知覚過敏抑制ペプチ
   ド。
3. 【請求項３】配列番号３に記載の知覚過敏抑制ペプチ
   ド。
4. 【請求項４】配列番号４に記載の知覚過敏抑制ペプチ
   ド。
5. 【請求項５】配列番号３に記載のペプチドのアミノ酸配
   列の、１つ又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換、又は
   付加されたアミノ酸配列を有する、知覚過敏抑制作用を
   有するペプチド。
6. 【請求項６】配列番号４に記載のペプチドを一部として
   含むことを特徴とする、知覚過敏抑制作用を有するペプ
   チド。
7. 【請求項７】請求項５に記載のペプチドを化学的に修飾
   した、知覚過敏抑制作用を有するペプチド誘導体。
8. 【請求項８】請求項１ないし７に記載のペプチドを有効
   成分とする知覚過敏抑制剤。
9. 【請求項９】配列番号３に記載の知覚過敏抑制ペプチド
   に対する抗体。