JPH11221076A - 特異的遺伝子のクローニング法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 被検ｃＤＮＡに、制限酵素ＲｓａＩ処
理、任意のリンカーＸ連結、制限酵素ＢｓｍＦＩ処理及
びリンカーＸとは異なる任意のリンカーＹ連結を行うこ
とにより、５′−リンカーＸ−（５′側にＲｓａＩ切断
部位（ＡＣ）を有する１６塩基）−リンカー−Ｙ−３′
からなるｃＤＮＡ小断片ライブラリーを得、該ライブラ
リーから被検ｃＤＮＡに特異的なＲｓａＩ切断部位（Ａ
Ｃ）に引き続く１４塩基をクローニングすることを特徴
とする被検ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子のクローニング
法；及び当該１４塩基からなるｃＤＮＡ断片。 【効果】 被検細胞に特異的に発現している遺伝子を再
現性よく正確に検出し、クローニングすることができ
る。本発明によれば、任意の二つの細胞における機能、
形態上の違いを遺伝子発現状態の差として明らかにでき
るので、生理的条件下、あるいは病的状態におけるあら
ゆる生物現象の解析に広く応用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は細胞又はｃＤＮＡに
特異的に発現又は発現量が増減している遺伝子のクロー
ニング法、被検細胞に特異的なｃＤＮＡ断片及びプロー
ブに関する。

【０００２】

【従来の技術】ひとつの生物種はある特定の遺伝子を持
ち、免疫細胞など一部の例外を除き、いかに分化しよう
と、この遺伝子配列は共通であるとされている。ヒトの
場合、全遺伝子数は高々十万個程度と見積もられてい
る。細胞の分化、増殖を始め、癌や老化、感染症、免疫
病など各種病的状態、あるいは正常な生理現象など、あ
らゆる生物現象はほとんどの場合、発現される遺伝子の
種類と量の多寡によって規定される、ということが今日
明らかになってきている。

【０００３】つまり、細胞のある状況において特異的に
発現が高まる、又は逆に低下する遺伝子を明らかにでき
れば、それら遺伝子の消長を測定するだけで、その細胞
の状況についてのおおよその推定が可能になる。そのよ
うなわけで、現在細胞の状況特異的遺伝子を明らかにす
るための努力が世界各地でなされているが、遺伝子の総
数は上述のごとくヒトで十万種といわれるぐらいに多
い。細胞のあらゆる状況下における全遺伝子の発現状態
を把握するのは事実上不可能に近いし、あらゆる細胞に
共通して発現される遺伝子の種類も多いので、このやり
かたでは無駄も大きい。そこで状況に特異的な遺伝子の
みを選択的に抽出し、調べることができれば、時間的、
経済的、人的資源の費用対効果面から考えて、大いに資
することになる。

【０００４】この目的のために、今まで多くのいわゆる
“差スクリーニング”と呼ばれる方法が考案され、試さ
れてきた。これらは古典的な分別的コロニー（プラー
ク）ハイブリダイゼーションであり、また最近のポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いたり、ＤＮＡ結合試薬
を用いたいくつかの方法である。これらは互いに相手の
ｃＤＮＡやＲＮＡとハイブリダイズさせることにより共
通部分を除いたり、ＤＮＡにクロスリンクする特殊な試
薬を用いたり、またアイソトープラベルした微量のサン
プルをシークエンスゲルで展開した後、直接比較する方
法などと組み合わせて特異的な遺伝子を見いだそうとす
る工夫がなされている。

【０００５】しかしながら、これらは実際のところ、大
量の原材料（例えば、ヒトの組織）が必要である、ＰＣ
Ｒを繰り返すためバイアスがかかる、結果に再現性がな
い等の理由によりごく限られた研究室でのみかろうじて
成功裏に動いている、というのが現状である。従って、
これらの施行困難な諸点がクリアされた簡潔な方法の開
発が、各方面の医学生物学研究者の間で切に要望されて
いる。

【０００６】これに対し、Okuboらは二重鎖ｃＤＮＡを
４ｂ酵素Ｓａｕ３ＡＩで切断し、ｍＲＮＡの３′末端部
分だけからなるｃＤＮＡライブラリーを得、これをクロ
ーニングしてランダムに塩基配列決定を行い遺伝子発現
プロフィールを得ることを報告した（Nature Genet. 2,
173(1992)）。しかしながら、この方法により得られる
それぞれのクローンの長さは平均約３００塩基であり、
配列決定は一クローンずつ行わねばならない。このため
最終的に配列決定されたｍＲＮＡの総数は一つの細胞種
あたりわずか１０００個程度であり、細胞における真の
遺伝子発現プロフィールからは程遠かった。

【０００７】また、Velculescu等は制限酵素ＮｌａIII
とＦｏｋＩを組み合わせることにより、９塩基のライブ
ラリーを（Science 270, 484(1995)）、またＮｌａIII
とＢｓｍＦＩの組み合わせにより１０塩基のライブラリ
ーを得ている（Cell 88, 243(1997)）。しかしながら、
この方法では、ｍＲＮＡを代表する信頼性という点にお
いて格段に劣る。すなわち、例えば１０塩基では４の１
０乗、つまり１０４８５７６通りの組み合わせが可能で
あるが、これはすなわち約１００万塩基に一回はいかな
る種類の１０塩基配列も現れる、ということを示す。ｍ
ＲＮＡの種類は上述のごとく約１０万種、平均鎖長は約
２０００塩基とされるから、全部で約２億塩基の長さが
あることになる。この長さの塩基配列の中には１０塩基
によるいかなる配列も、平均して２００回ずつ現れるこ
とになる。これでは１個の小断片が１個のｍＲＮＡを代
表するか否かの判断を困難にする。９塩基ではさらに不
確定性が増し、問題にならない。さらにVelculescu等は
ライブラリーを作製するにあたって小断片どうしの尾対
尾（tail-to-tail）の平滑末端接続を行っている。この
操作は小断片の長さの不確定性を招来し、しかも効率の
極端な低下をもたらすという問題があった。

【０００８】従って、本発明の目的はより再現性よく、
細胞又はｃＤＮＡに特異的に発現している遺伝子を正確
かつ効率よくクローニングする方法、該細胞に特異的に
発現しているｃＤＮＡ断片及びそれを含むプローブを提
供することにある。

【０００９】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、上記
課題を解決すべく種々検討した結果、４塩基認識酵素の
一種であるＲｓａＩとタイプIIＳ酵素であるＢｓｍＦＩ
とを用い、これら両酵素により切断される１６塩基の両
端にそれぞれ異なるリンカーをはさむ形で接続したｃＤ
ＮＡ小断片ライブラリーを得、これをスクリーニングす
れば細胞に特異的に発現している１４塩基の遺伝子が正
確で効率よく、かつ再現性よくクローニングできること
を見出し、さらに当該１４塩基及びこれを含む１８塩基
からなるＤＮＡ断片は、細胞特異的遺伝子検出用プロー
ブとして有用であることを見出し、本発明を完成するに
至った。

【００１０】すなわち、本発明は、被検ｃＤＮＡに、制
限酵素ＲｓａＩ処理、任意のリンカーＸ連結、制限酵素
ＢｓｍＦＩ処理及びリンカーＸとは異なる任意のリンカ
ーＹ連結を行うことにより、５′−リンカーＸ−（５′
側にＲｓａＩ切断部位（ＡＣ）を有する１６塩基）−リ
ンカーＹ−３′からなるｃＤＮＡ小断片ライブラリーを
得、該ライブラリーから被検ｃＤＮＡに特異的なＲｓａ
Ｉ切断部位（ＡＣ）に引き続く１４塩基をクローニング
することを特徴とする被検ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子の
クローニング法を提供するものである。

【００１１】また、本発明は、上記被検ｃＤＮＡとし
て、被検細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡを用いて上記の操作を
行うことを特徴とする被検細胞特異的遺伝子のクローニ
ング法を提供するものである。

【００１２】さらに本発明は、５′側制限酵素ＲｓａＩ
切断部位（ＡＣ）に引き続く１４塩基からなるｃＤＮＡ
断片を提供するものである。

【００１３】さらに、本発明は、５′側にＧＴＡＣ配列
を有する１８塩基からなるｃＤＮＡ断片を提供するもの
である。

【００１４】さらにまた、本発明は、上記１４塩基又は
１８塩基からなるｃＤＮＡ断片又はその標識体からなる
特異的遺伝子検出用プローブを提供するものである。

【００１５】

【発明の実施の形態】本発明方法に用いられる被検ｃＤ
ＮＡは、ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡであれば特に制限さ
れず、ｍＲＮＡに逆転写酵素を作用させて得られるｃＤ
ＮＡである。被検細胞の全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成
し、そのｃＤＮＡを被検体として用いて本発明方法を行
えば、その被検細胞の特異的遺伝子のクローニングが可
能となる。本発明で用いる全ＲＮＡは１μｇでも十分で
ある。１μｇの全ＲＮＡは細胞１mgに相当する。従っ
て、本発明は、ニードルバイオプシーなどでしか得るこ
とのできない貴重な人体組織サンプルなどを取り扱う際
には特に有効である。また、被検細胞としては、ｍＲＮ
ＡとしてポリＡ尾を有する細胞ならいずれでもよく、真
核細胞の場合、原生動物、真菌類、植物細胞あるいは動
物細胞であるかを問わない。

【００１６】本発明に用いられる制限酵素ＲｓａＩは、
塩基配列ＧＴＡＣを認識し、当該ＴとＡの間でＤＮＡを
切断する酵素である。一方、制限酵素ＢｓｍＦＩは、塩
基配列ＧＧＧＡＣを認識し、当該配列の３′側１４塩基
後を切断する酵素である。

【００１７】本発明に用いられるリンカーＸとリンカー
Ｙは、目的とする５′側にＲｓａＩ切断部位（ＡＣ）を
有する１６塩基との接着末端を有する限り、特に制限さ
れないが、当然、相互に自分自身あるいはもう一方のリ
ンカーと相補的であってはならない。また、目的とする
ＤＮＡ断片を得た後、ＰＣＲにより該断片を増幅させる
際のプライマー設計の観点から、これらのリンカーは既
知の塩基配列になるべく一致しないものを選ぶのが好ま
しい。

【００１８】より好ましいリンカーＸは、３′末端に塩
基配列ＧＧＧを有するものである。なぜなら、ｃＤＮＡ
のＲｓａＩ断片のリンカーＸを５′側に連結した後、Ｂ
ｓｍＦＩを作用させれば、当該ＧＧＧＡＣに引き続く
３′側１４塩基の部位が選択的に切断され、目的とする
１４塩基が容易に得られるからである。

【００１９】ところで、前記のVelculescu等の方法を本
発明者が追試したところ、すべて人工産物のみを生じ、
信頼できるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）由来の小断片の集合を
生じなかった。これは彼らの用いたリンカーが全く同じ
３′末端配列を持つため、ｃＤＮＡへのリンカー接続の
際、リンカーダイマーが優先的に形成されるためと考え
られる。このリンカーダイマーはＰＣＲの際、好んで増
幅され、人工産物の有力な発生源となる。またリンカー
が同じ３′末端構造を持つという同じ理由により、彼ら
はプライマーダイマーの発生を避けるため、リンカーの
より外側部分にプライマーを設けている。この工夫もし
かしながら、増幅効率の低下を来しこそすれ、リンカー
ダイマー増幅という致命的な欠陥に対しては何らの改善
ももたらさない。これに対して本発明のリンカー接続法
は、相互に異なる二種のリンカーＸ及びＹで小断片ｃＤ
ＮＡモノマーを両側からはさむ形で行うものであり、二
つのリンカー３′末端構造から見てもダイマー形成の可
能性がない。またＰＣＲのための二つのプライマーも
３′末端構造を含め、互いに配列が全く異なり、しかも
リンカー接続部位より数塩基内側（ｃＤＮＡ側）にまで
設定できるので、理論的にリンカーとｃＤＮＡとがうま
く接続されたもののみが増幅される。

【００２０】本発明方法は、５′−リンカーＸ−（５′
側にＲｓａＩ切断部位（ＡＣ）を有する１６塩基）−リ
ンカーＹ−３′からなるｃＤＮＡ小断片ライブラリーを
得るステップ（ステップ（ａ））と、該ライブラリーか
ら被検ｃＤＮＡに特異的なＲｓａＩ切断部位（ＡＣ）に
引き続く１４塩基をクローニングするステップ（ステッ
プ（ｂ））とに分けることができる。

【００２１】ステップ（ａ）は、例えば、（１）３′側
に標識オリゴヌクレオチドが結合した被検ｃＤＮＡを制
限酵素ＲｓａＩ処理して、５′−ＲｓａＩ部位（ＡＣ）
−標識オリゴヌクレオチドＤＮＡ断片を得、（２）
（１）で得たＤＮＡ断片のＲｓａＩ部位（ＡＣ）に、
３′側にＧＧＧを有するリンカーＸを連結し、（３）
（２）で得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｍＦＩ処理し
て、被検ｃＤＮＡ由来のＲｓａＩ切断部位（ＡＣ）を有
する１６塩基の５′側にリンカーＸが連結したＤＮＡ断
片を得、（４）（３）で得たＤＮＡ断片の３′側にリン
カーＹを連結することにより、５′−リンカーＸ−（被
検ｃＤＮＡ由来のＲｓａＩ切断部位（ＡＣ）を有する１
６塩基）−リンカーＹ−３′からなるｃＤＮＡ小断片ラ
イブラリーを得ることにより行うのが好ましい。

【００２２】ここで、標識オリゴヌクレオチドとして
は、固相固定化オリゴヌクレオチド、補酵素標識オリゴ
ヌクレオチド等が挙げられるが、再現性や目的断片の回
収性の点から固相固定化オリゴヌクレオチドが好まし
く、ラテックスビーズ固定化オリゴヌクレオチド、マグ
ネットビーズ固定化オリゴヌクレオチド等がより好まし
く、さらにラテックスビーズ固定化オリゴヌクレオチド
が特に好ましい。さらにまた、標識オリゴヌクレオチド
のオリゴヌクレオチド部分としては、オリゴｄＴが特に
好ましい。標識オリゴヌクレオチドとして、固相固定化
オリゴｄＴを用いた場合のステップ（ａ）の概略図を、
図１に示す。

【００２３】被検ｃＤＮＡとして３′側標識オリゴヌク
レオチド結合ｃＤＮＡを用いた場合には、これをＲｓａ
Ｉで処理し、該標識に基づいて回収すれば５′側にＲｓ
ａＩ部位（ＡＣ）を有するＤＮＡ−標識オリゴヌクレオ
チドＤＮＡ断片のみが得られる。ここで、標識体として
ラテックスビーズのような固相固定化体を用いた場合に
は、単に固相のみを回収すれば目的とする断片が容易に
得られる。

【００２４】次に得られたＤＮＡ断片の、３′側に塩基
配列ＧＧＧを有するリンカーＸを連結させれば、５′−
リンカー−ＲｓａＩ断片結合物が得られる。

【００２５】さらに、５′−リンカーＸ−ＲｓａＩ断片
結合物をＢｓｍＦＩで処理すれば、前記の如くＢｓｍＦ
ＩはＧＧＧＡＣを認識してその３′側１４塩基の部位を
切断するから、被検ｃＤＮＡ由来のＲｓａＩ切断部位
（ＡＣ）を有する１６塩基の５′側にリンカーＸが連結
したＤＮＡ断片が得られる。ここで、目的とする断片の
回収は、標識体として固相固定化体を用いた場合には、
固相を除去し、液相を回収するだけでよい。

【００２６】次に得られた断片の３′側に、リンカーＹ
を連結させれば、「５′−リンカー−Ｘ−（被検ｃＤＮ
Ａ由来のＲｓａＩ切断部位（ＡＣ）を有する１６塩基）
−リンカーＹ−３′」からなるｃＤＮＡ小断片ライブラ
リーが得られる。

【００２７】かくして得られたライブラリーは両端に任
意のリンカーが接続されているので、このリンカー部分
をプライマーとするポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に
より容易に増幅可能である。また二つのリンカーＸ及び
ＹにはさまれたｃＤＮＡ由来の部分がわずか５′側ＡＣ
を除いて１４塩基と短く、しかもすべてのｃＤＮＡに対
して一定の長さで代表させてあるため、ＰＣＲによる増
幅効率の差に基づくアーティファクトを生じる危険性は
最小限である。

【００２８】次にステップ（ｂ）について説明する。ス
テップ（ｂ）は、被検ｃＤＮＡに特異的なＲｓａＩ切断
部位（ＡＣ）に引き続く１４塩基を選別するのであるか
ら、被検ｃＤＮＡと異なるコントロールｃＤＮＡについ
ても、前記と同様の操作を行ってコントロールｃＤＮＡ
由来の小断片ライブラリーを得、両小断片ライブラリー
を用いたハイブリダイゼーション法により共通する１４
塩基を除き、被検ｃＤＮＡに特異的なＲｓａＩ切断部位
（ＡＣ）に引き続く１４塩基をクローニングすればよ
い。

【００２９】当該ハイブリダイゼーション法としては、
詳細にはＲＮＡを用いる方法（例えば図２）とＤＮＡを
用いる方法（例えば図３）が考えられる。ｃＤＮＡ小断
片ライブラリーは、被検体及びコントロールとも同じリ
ンカー（リンカーＸ及びＹ）を用いて作製されているの
で、ハイブリダイズさせる際お互いのサンプル中に同じ
リンカーが入ってこないよう前以てそれぞれ別の制限酵
素（例えば、ＮｃｏＩ及びＢｓｐＬＵ１１Ｉ、以下それ
ぞれＮｃｏ及びＢｓｐと略す）で片方ずつ取り除いてお
く。この処置により、ハイブリッドはｃＤＮＡに由来す
る部分でのみ形成される。すなわち被検ｃＤＮＡに特異
的なｃＤＮＡを同定、クローンしたい場合には、該被検
ｃＤＮＡ小断片ライブラリーをＢｓｐで切断したものか
ら、センス鎖を適当なプライマーと耐熱ＤＮＡポリメラ
ーゼを用いて作り、ハイブリダイズさせるアンチセンス
鎖はＮｃｏで切断したコントロールｃＤＮＡ小断片ライ
ブラリーから、ＲＮＡポリメラーゼもしくは耐熱ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて作る。これらを（例えば約前者
１、後者１０程度の分子比で）混合し、ハイブリダイズ
させる。一定時間の保温の後、ハイブリダイズした画分
（両ｃＤＮＡライブラリーに共通なｃＤＮＡ部分）を除
き、残った非ハイブリダイズ画分に今度は被検ｃＤＮＡ
小断片ライブラリーをＮｃｏで切断したものから作った
過剰量のアンチセンス鎖を加え、再びハイブリダイゼー
ションを行う。ハイブリッドを形成した画分が目的とす
る特異的遺伝子由来のものなので、これを回収する。こ
れを逆転写酵素又はＤＮＡポリメラーゼで伸長させた
後、ＰＣＲで増幅し、クローニングから塩基配列決定と
いう通常の手段を行えばよい。

【００３０】好ましいクローニング手段としては、分取
したバンドをアイソトープを含まない条件下でＰＣＲを
行い、次いで既知のプラスミドへ組み込んでシークエン
スする方法が挙げられる。また、ＴＡクローニングキッ
トを用いることもできる。

【００３１】かくして得られる５′側制限酵素ＲｓａＩ
切断部位（ＡＣ）に引き続く１４塩基からなるｃＤＮＡ
断片は、被検ｃＤＮＡに特異的な遺伝子、すなわち被検
細胞のｍＲＮＡに特異的である。従って、本発明方法を
用いて、ある細胞由来のｃＤＮＡのクローニングを行え
ば、当該細胞がおかれた状況に特異的に発現している遺
伝子の定量的解析が可能である。そして、かかる情報を
蓄積すれば、疾病（例えば、癌、感染症など）の診断が
可能である。

【００３２】また、前記１４塩基からなるｃＤＮＡ断片
の５′側にＧＴＡＣを連結して得られる１８塩基からな
るＤＮＡ断片も、被検ｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡ断片であ
る。そして、この１８塩基からなるｃＤＮＡ断片もま
た、被検細胞に特異的である。

【００３３】従って、前記１４塩基からなるｃＤＮＡ断
片、前記１８塩基からなるｃＤＮＡ断片又はこれらの標
識体は、被検ｃＤＮＡの良好なプローブであり、これら
をプローブとして用いることにより、被検ｃＤＮＡ、ひ
いては被検細胞の測定が可能である。よって、これらの
プローブは、被検細胞の診断用プローブ、例えば各種疾
患診断用のプローブとして有用である。ここで、標識体
としては、放射性同位元素、酵素等による標識が挙げら
れる。

【００３４】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。

【００３５】実施例１ （ａ）培養Ｔ細胞株Ｍｏｌｔ４及びこれにＨＩＶ ＮＬ
−４株を感染させた細胞からｍＲＮＡを分離し、逆転写
酵素を用いてｃＤＮＡを得た。それぞれのｃＤＮＡにつ
いて以下の如くして特異的遺伝子のクローニングを行っ
た。

【００３６】まず、二本鎖ｃＤＮＡをオリゴｄＴラテッ
クスビーズをプライマーとして合成した（以下、図１参
照）。次に、このｃＤＮＡをＲｓａＩで切断し、遠心し
て沈殿したラテックスビーズ部分を回収し、図のように
ｃＤＮＡの最も３′末端に近いＲｓａＩ部位を持つｃＤ
ＮＡ断片が存在する分画を得た。次にリンカー（リンカ
ーＸ）を切断端にＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し
た。これには少なくとも３つの方法があり、いずれでも
可能であった。

【００３７】１）ＲｓａＩ切断で生じた平滑末端に直
接、平滑末端接続を行う。この場合のリンカーは

【００３８】 ５′−ＴＡＣＡＧＧＡＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＧ−３′ ３′−ＡＴＧＴＣＣＴＡＴＧＣＧＧＴＡＣＣＣ−５′

【００３９】であった。

【００４０】２）ｄＣＴＰの存在下にＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼでＲｓａＩ末端を処理し、１塩基のＣを３′端
に付加し、

【００４１】 ５′− ＡＣ・・・・・ ３′−ＣＴＧ・・・・・

【００４２】という突出末端を形成する。これに接着末
端接続を行うのであるが、この場合のリンカーは

【００４３】 ５′−ＴＡＣＡＧＧＡＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＧ−３′ ３′−ＡＴＧＴＣＣＴＡＴＧＣＧＧＴＡＣＣ−５′

【００４４】であった。

【００４５】３）ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰの存
在下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼでＲｓａＩ末端を処理
し、１塩基のＴを３′末端から除去し、

【００４６】 ５′−ＡＣ・・・・・ ３′− Ｇ・・・・・

【００４７】という突出末端を形成する。これに接着末
端接続を行うのであるが、この場合のリンカーは

【００４８】 ５′−ＴＡＣＡＧＧＡＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＧ−３′ ３′−ＡＴＧＴＣＣＴＡＴＧＣＧＧＴＡＣＣＣＴ−５′

【００４９】であった。

【００５０】次にこれらのリンカー接続により生じた制
限酵素ＢｓｍＦＩ部位（ＧＧＧＡＣ）を利用して、Ｂｓ
ｍＦＩ切断を行い、今度は前回とは逆にラテックスビー
ズでない部分、すなわち遠心上清を回収した。この酵素
の切断部位はＧＧＧＡＣＮ（10／14）であるから、回収
された部分にはリンカーに引き続くｃＤＮＡ由来の１４
塩基が含まれることになる（ＲｓａＩ部位由来の共通の
ＡＣ２残基を除く）。

【００５１】この部分をｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
及びｄＴＴＰの存在下にＴａｑＤＮＡポリメラーゼ反応
を行えば、３′末端に一個のＡがついた突出末端を生じ
るので、これに第二のリンカー（リンカーＹ）を接着末
端接続を行った。この場合のリンカーは

【００５２】 ５′− ＣＡＴＧＴＧＴＣＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴ−３′ ３′−ＴＧＴＡＣＡＣＡＧＣＧＴＴＧＡＣＴＧＡ−５′

【００５３】であった。

【００５４】いまや両端を既知のリンカーではさまれた
ｃＤＮＡ由来の１４塩基対を含む総延長５３塩基対のＤ
ＮＡの一群、つまり小断片ｃＤＮＡライブラリーが得ら
れたわけである。これはプライマー５′−ＴＡＣＡＧＧ
ＡＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣ−３′（プライマーｘ）
及び５′−ＴＡＧＴＣＡＧＴＴＧＣＧＡＣＡＣＡＴＧＴ
−３′（プライマーｙ）を用いて、ＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼでＰＣＲにより容易に増幅できる。本実施例にお
いては１５回の増幅を行い、これを小断片ｃＤＮＡライ
ブラリーとして保存し、また一部を取り出しては以下の
特異的クローンの選別に用いた。

【００５５】（ｂ）特異的クローンの選別はハイブリダ
イゼーションの原理に依存したが、二つのライブラリー
に共通の塩基配列小断片を除くのに、ＲＮＡを用いる方
法（図２）とＤＮＡを用いる方法（図３）の二つの方法
で行った。

【００５６】１）ＲＮＡを用いる選別法（図２） まず、一方の小断片ｃＤＮＡライブラリー（例えば図２
においてはＡ−ライブラリー）をＢｓｐで切断し、ＸＮ
部分を回収、これをプライマーｘとＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼを用いて、不均等増幅反応を行い、センス鎖ＸＮ
配列からなる一本鎖ＤＮＡを調製する。次にプライマー
ｘとＴ３のプロモーター配列を５′末につないだプライ
マーｙ（プライマーＴ３ｙ）でＰＣＲを行い、Ｔ３プロ
モーター配列がついた小断片ｃＤＮＡライブラリーを作
る（プライマーｙにつなぐのはＴ７プロモーター配列で
もＳＰ６プロモーター配列でも可能である）。プライマ
ーＴ３ｙの配列は

【００５７】５′−ＧＧＧＴＴＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡ
ＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＴＡＧＴＣＡＧＴＴＧＧＧＡＣ
ＡＣＡＴＧＴ−３′

【００５８】であった。

【００５９】このライブラリーを制限酵素ＮｃｏＩで切
断後、Ｘ部分を除き、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼを用いて
in vitro転写反応を行い、図２のようなＮＹ部分に対す
るアンチセンス鎖ＲＮＡを作製する。

【００６０】同様にＢ−ライブラリーからもセンスＤＮ
ＡとアンチセンスＲＮＡを作製する。次にこれらのセン
ス鎖ＤＮＡとアンチセンス鎖ＲＮＡをクロスワイズに
（すなわち、Ａ−ライブラリーからのＤＮＡにはＢ−ラ
イブラリーのＲＮＡ、Ｂ−ライブラリーからのＤＮＡに
対してはＡ−ライブラリーのＲＮＡ）分子比にして約１
対１０で混合、ハイブリダイゼーション反応を行う。こ
の反応でハイブリッドを形成した画分は両方のライブラ
リーに共通したものであるので除き、ＲＮａｓｅ処理後
残った一本鎖ＤＮＡを回収する。このＤＮＡに今度は、
同じライブラリーから作ったアンチセンスＲＮＡを加え
ると、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドとして回収できる。
これを用いて逆転写反応を行えば、ＸＮＹとなったそれ
ぞれのライブラリーに特異的な部分が一本鎖ＤＮＡとし
て回収できる。これをプライマーｘ及びプライマーｙを
用いてＰＣＲ後、ＮｃｏとＢｓｐで切断、これらの酵素
は同じ接着末端を生じるので、このＤＮＡ断片をプラス
ミドベクターｐＮｃｏ１のＮｃｏＩ部位に組み込み、塩
基配列を決定する。ｐＮｃｏ１はプラスミドｐＵＣ１１
９のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄIII 部位の間にあるマルチプ
ルクローニングサイトを除去し、替わりに

【００６１】 ５′−ＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＡＴＧＡ −３′ ３′− ＧＧＴＡＣＣＴＡＴＡＧＴＡＣＴＴＣＧＡ−５′

【００６２】を組み込んだものである。

【００６３】２）ＤＮＡを用いる選別法（図３） 比較を行いたい二つの細胞から得られた小断片ｃＤＮＡ
ライブラリーを、それぞれＮｃｏ、もしくはＢｓｐで切
断し、ＮＹ及びＸＮ断片を回収する。これらをそれぞれ
プライマーｙもしくはプライマーｘとＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼを用いて、不均等増幅反応を行い、一本鎖のア
ンチセンスＮＹ鎖及びセンスＸＮ鎖を合成する。これら
センス鎖とアンチセンス鎖を上記１）と同様にクロスワ
イズに、同様の分子比において混合し、ハイブリダイゼ
ーションを行う。ハイブリッドを形成しない画分を回収
し、今度はセンス鎖自身が由来したライブラリーからの
アンチセンス鎖ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせる。ハ
イブリッド画分を回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（も
しくはクレノウＤＮＡ断片、あるいはその他のＤＮＡポ
リメラーゼ）で部分的ハイブリッドの伸長反応を行い、
完全な二本鎖ＤＮＡとする。これをプライマーｘ及びプ
ライマーｙを用いて、ＰＣＲにより増幅を行う。これを
上記１）と同様にＮｃｏ及びＢｓｐで切断後、ｐＮｃｏ
１に組み込み、塩基配列決定を行う。

【００６４】（ｃ）上記の如くして、Ｔ細胞株のＭｏｌ
ｔ４と、これにＨＩＶ ＮＬ−４を感染させた細胞との
比較を行った。つまりＨＩＶ感染により特異的に発現が
高まってくる遺伝子と、逆に特異的に発現が抑制される
遺伝子の同定とクローニングである。

【００６５】表１及び表２にこの方法で同定された小断
片をいくつか示した。これらの塩基配列を既存のデータ
ベースに対しホモロジー検索を行った。表１にはＨＩＶ
の感染により発現が上昇すると考えられる小断片の一部
が示されており（つまり、ＨＩＶ感染細胞のライブラリ
ーに特異的に見られる小断片）、表２には逆にＨＩＶ感
染で発現が抑えられる小断片（つまり非感染細胞のライ
ブラリーに特異的に見られるもの）である。

【００６６】

【表１】

【００６７】

【表２】

【００６８】表１の１行目に見られるＴＧＧＧＴＣＴＣ
ＴＣＴＧＧＴ配列はＨＩＶの配列の一部であり、ＨＩＶ
感染細胞に特異的に見られたというのは本発明方法が正
確であることを示している。この他、アポリポプロテイ
ンＡＩＩ、チューブリン、血清アルブミンやβ２インテ
グリンＤサブユニットなど、意外なものもあり、また未
知の塩基配列もいくつか含まれていた。一方、ＨＩＶ非
感染Ｍｏｌｔ４細胞からのライブラリーから得られた小
断片（つまりＨＩＶ感染で発現が抑制されると考えられ
るｍＲＮＡ）には、リボソーマルプロテインＬ７、Ｌ３
１、スタスミン、サイトスケレタール γ−アクチン、
ユビキチン、ジヒドロリポエートデヒドロゲナーゼ、ラ
クテートデヒドロゲナーゼ等に加えていくつか未知の配
列も含まれていた。

【００６９】なお、表１及び２中、ｍｆ ＩＤとして塩
基配列の前に示してある数字はコンピューター処理のた
めに１４塩基によるランダムな組み合わせ（全部で268,
435,456 通りある）に対し、ＡＣＧＴの順に番号をふっ
たものである。すなわち、以下の如くである。

【００７０】 ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡを００００００００１（又は単に１） ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣを００００００００２（又は単に２） ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧを００００００００３（又は単に３） ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴを００００００００４（又は単に４） ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＡを００００００００５（又は単に５） ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＴを２６８４３５４５２ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡを２６８４３５４５３ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣを２６８４３５４５４ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧを２６８４３５４５５ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴを２６８４３５４５６

【００７１】これにより如何なる１４塩基よりなる配列
が現れても、すべてこれらの９桁の数字の一つに割り当
てることができる。これらの数字をｍｆ ＩＤ（小断片
ＩＤ）と呼ぶ。

【００７２】（ｄ）次に本法により同定された小断片
が、実際のそれぞれの細胞における発現特異性を正確に
反映しているかどうかを確かめるために、同定された配
列が細胞中で実際どれくらいの頻度で発現されているか
を測定した。この目的のためには本法の最初のステップ
で得られた小断片ｃＤＮＡライブラリーが役に立つ。す
なわちｍＲＮＡに１対１の対応をする１４塩基で代表さ
れた小断片ｃＤＮＡライブラリーに含まれる小断片をラ
ンダムに多数、塩基配列決定すればよいからである。本
発明による小断片ｃＤＮＡライブラリーを構成する個々
の小断片はＮｃｏとＢｓｐで切り出すことができ、しか
もこれらの酵素によって生じる接着末端は同一であるた
め、多数の小断片を連結することができる。これは連結
のために用いる酵素（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）の性格であ
り、この酵素の発見当初より認識されていた（J. Biol.
Chem. 234, 4543(1968)）。連結した小断片をｐＮｃｏ
１に組み込み、塩基配列の決定を行えば、一回の操作で
約２０個程度の小断片の配列を明らかにできる。細胞で
発現されているｍＲＮＡの種類とそれぞれの個数をおお
むね明らかにできると考えられる５万個の配列を明らか
にするのに、約２５００サンプルのシークエンシングを
行った。

【００７３】表３及び表４に二つのライブラリーから
の、約５万個ずつの小断片の塩基配列決定の結果得られ
たｍＲＮＡの出現回数の一部が示されている。表１及び
２に示されたすべての配列が二つのライブラリーを直接
比較した場合から得られる結果により完全に支持される
ということが明らかであった。さらに、小断片ｃＤＮＡ
ライブラリーの直接塩基配列決定は、より多数のｍＲＮ
Ａの発現における差異を明らかにした（表３及び４には
そのような発現に差のあるｍＲＮＡもいくつか示してあ
る）。

【００７４】

【表３】

【００７５】

【表４】

【００７６】（ｅ）次に、このようにして得られた小断
片を用いて、そもそもその小断片が由来したｍＲＮＡそ
のものをクローニングできるかどうか、すなわちその小
断片がプローブとして有用か否かを試した。本発明で明
らかにされるｍＲＮＡ由来の小断片の塩基長は１４であ
るが、この５′上流には必ずＲｓａＩ部位が存在してい
るはずなので、この認識配列ＧＴＡＣの４塩基を加えて
計１８塩基のプローブとすることができる。表１及び２
に見られた小断片の任意の１８塩基（５′−ＧＴＡＣＣ
ＡＴＧＣＧＧＣＣＡＣＡＣＧ−３′）を合成し、その
５′末を³²Ｐで標識し、通常の方法で作製したＭｏｌｔ
４のｃＤＮＡライブラリーに対し、プラークハイブリダ
イゼーションを行った結果を図４に示す。陽性のクロー
ンは図４から明らかなように容易に同定でき、二次、三
次スクリーニングによるクローンの純化にも全く問題な
かった。１８塩基はこのように安定なハイブリドを形成
するのに十分な長さであり、完全長ｃＤＮＡクローニン
グのためのプローブとして完璧に機能し得ることが判明
した。

【００７７】

【発明の効果】本発明によれば被検ｃＤＮＡ又は被検細
胞に特異的に発現している遺伝子を再現性よく正確に検
出し、クローニングすることができる。本発明によれ
ば、任意のふたつの細胞における機能、形態上の違いを
遺伝子発現状態の差として明らかにできるので、生理的
条件下、あるいは病的状態におけるあらゆる生物現象の
解析に広く応用できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明方法におけるステップ（ａ）（小断片ｃ
ＤＮＡライブラリーの作製法）の一実施態様を示す概略
図である。

【図２】本発明方法におけるステップ（ｂ）のうち、相
補鎖ＲＮＡを用いるスクリーニング法の一実施態様を示
す概略図である。

【図３】本発明方法におけるステップ（ｂ）のうち、相
補鎖ＤＮＡを用いるスクリーニング法の一実施態様を示
す概略図である。

【図４】本発明１８塩基プローブを用いたプラークハイ
ブリダイゼーションの結果を示す図である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検ｃＤＮＡに、制限酵素ＲｓａＩ処
   理、任意のリンカーＸ連結、制限酵素ＢｓｍＦＩ処理及
   びリンカーＸとは異なる任意のリンカーＹ連結を行うこ
   とにより、５′−リンカーＸ−（５′側にＲｓａＩ切断
   部位（ＡＣ）を有する１６塩基）−リンカーＹ−３′か
   らなるｃＤＮＡ小断片ライブラリーを得、該ライブラリ
   ーから被検ｃＤＮＡに特異的なＲｓａＩ切断部位（Ａ
   Ｃ）に引き続く１４塩基をクローニングすることを特徴
   とする被検ｃＤＮＡ中の特異的遺伝子のクローニング
   法。
2. 【請求項２】 ｃＤＮＡ小断片ライブラリーの取得が、 （１）３′側に標識オリゴヌクレオチドが結合した被検
   ｃＤＮＡを制限酵素ＲｓａＩ処理して、５′−ＲｓａＩ
   部位（ＡＣ）−標識オリゴヌクレオチドＤＮＡ断片を
   得、 （２）（１）で得たＤＮＡ断片のＲｓａＩ部位（ＡＣ）
   に、３′側にＧＧＧを有するリンカーＸを連結し、 （３）（２）で得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｍＦＩ処
   理して、被検ｃＤＮＡ由来のＲｓａＩ切断部位（ＡＣ）
   を有する１６塩基の５′側にリンカーＸが連結したＤＮ
   Ａ断片を得、 （４）（３）で得たＤＮＡ断片の３′側にリンカーＹを
   連結することにより、５′−リンカーＸ−（被検ｃＤＮ
   Ａ由来のＲｓａＩ部位（ＡＣ）を有する１６塩基）−リ
   ンカーＹ−３′からなるｃＤＮＡ小断片ライブラリーを
   得るものである請求項１記載のクローニング法。
3. 【請求項３】 標識オリゴヌクレオチドが、ラテックス
   ビーズ結合オリゴｄＴである請求項２記載のクローニン
   グ法。
4. 【請求項４】 被検ｃＤＮＡに特異的なＲｓａＩ切断部
   位（ＡＣ）に引き続く１４塩基遺伝子のクローニング
   が、被検ｃＤＮＡ由来小断片ライブラリーとコントロー
   ルｃＤＮＡ由来小断片ライブラリーとのハイブリダイゼ
   ーションにより、共通する１４塩基を除去するものであ
   る請求項１〜３のいずれか１項記載のクローニング法。
5. 【請求項５】 請求項１〜４における被検ｃＤＮＡとし
   て被検細胞ｍＲＮＡのｃＤＮＡを用いることを特徴とす
   る被検細胞特異的遺伝子のクローニング法。
6. 【請求項６】 ５′側制限酵素ＲｓａＩ切断部位（Ａ
   Ｃ）に引き続く１４塩基からなるｃＤＮＡ断片。
7. 【請求項７】 ５′側にＧＴＡＣ配列を有する１８塩基
   からなるｃＤＮＡ断片。
8. 【請求項８】 請求項６又は７記載のｃＤＮＡ断片又は
   その標識体からなる特異的遺伝子検出用プローブ。