JPH11221096A - β−ラクタム剤に対する感受性誘導薬のスクリーニングシステム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 β−ラクタム剤に対する感受性誘導薬のスク
リーニングシステムを提供する。 【解決手段】 β−ラクタム剤の希釈系列を作成し、そ
の一定量を採り、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定す
る。一方、上記のβ−ラクタム剤の希釈系列と被験威受
性誘導薬の希釈液一定量の混合液のＭＩＣを測定し、混
合液のＭＩＣが低下した場合、感受性誘導の効果がある
と判定する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はβ−ラクタム剤に無
効のＭＲＳＡ（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔ
ａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕ
ｓ：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）を代表とする耐性
菌に対し、β−ラクタム剤に対する感受性を誘導させる
化学物質を検索することを目的とした新しいスクリーニ
ングシステムに関するものである。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】最近
の抗生物質検索のスクリーニングシステムは抗生作用に
関係なく、ある特定の微生物群を選択し、その分離株を
用いて、多種の培養法により、多数の抗生作用および種
々の生理活性について、体系的に調べる方法が一般的で
ある。しかし、このようなスクリーニングシステムを活
用するには、多数の人員と設備を必要とする。より効率
的な研究をすすめるためには、より省力化したスクリー
ニング法の開発が必要である。目標を絞ることによっ
て、新しい観点から工夫を加えれば、効率の高い方法と
して活用できる可能性がある。

【０００３】従来のスクリーニング方法として集落混雑
平板法、細菌寒天平板法、噴霧法、三層平板法、濾紙上
寒天法、レプリカ平板法などが用いられていた。しか
し、これらの方法で見つかった抗生物質は、いずれは耐
性菌を生み出しており、重大な社会問題となってきた。

【０００４】最初の抗生物質であるペニシリンはβ−ラ
クタム環を有し、ブドウ球菌に対して優れた効力を発揮
する。しかし、ブドウ球菌に比較的容易にペニシリナー
ゼ（β−ラクタマーゼ）産生能が誘導され、β−ラクタ
ム環が開裂され、不活性化されてしまう。ペニシリン耐
性菌と称されるものである。このペニシリン耐性菌につ
いては、例えば、メチシリンなどのペニシリナーゼ抵抗
性ペニシリンおよびセフェム系抗生物質の研究開発によ
り臨床的にはほとんど解決されたかに見えたが、すべて
のβ−ラクタム剤が無効のＭＲＳＡが出現した。すなわ
ち、ＭＲＳＡは、ペニシリン系だけでなく、セフェム系
抗生物質、アミノ配糖体抗生物質にも広く耐性をもった
多剤耐性の黄色ブドウ球菌である。近年、ブドウ球菌に
対して抗菌力の弱い第３世代セフェム系抗生物質が乱用
された結果、この耐性菌が選択的に増殖し、病院内で伝
幡するようになり、主要な院内感染菌として重大な社会
問題になってきている。現在用いられているＭＲＳＡ感
染症に対する抗菌薬としてバンコマイシン（ＶＣＭ）等
があるが、ＶＣＭの短時間殺菌作用は決して強力ではな
く聴毒性や腎毒性等の重篤な副作用の問題がある。ま
た、ＭＲＳＡに対して、抗菌力を増強することを目的と
して、複数の抗菌剤を組み合わせることが従来より検討
されている。例えばアミノグリコシド剤とβ−ラクタム
剤あるいはホスホマイシンとβ−ラクタム剤等の併用が
試みられているが、その併用効果は満足できるものとは
言えない。このような耐性菌に対して有効、かつ従来の
抗菌薬の作用機作とは全く異なった作用機作に基づく新
規抗菌薬の開発が急務となっている。

【０００５】本発明者らは副作用がないかあっても弱い
漢方生薬から抗ＭＲＳＡ活性を有する化合物を検索する
うちに、単独では全く抗菌作用をもたない化合物が、β
−ラクタム剤と併用することによって、β−ラクタム剤
に対する耐性を抑制させ、逆に感受性となるという興味
ある事実を発見した。本発明はこのような知見に基づい
て完成された新しいスクリーニングシステムである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発見はβ−ラクタム剤
と併用することを特徴とする抗ＭＲＳＡ活性物質検索の
新しいスクリーニングシステムに関する。従来、複数の
抗菌剤を組み合わせることによる検討は多くなされてい
るが、いずれも満足あるものとはいえない。また、もと
もと抗菌活性の示さない物質とβ−ラクタム剤との組み
合わせによる検討は行われていなく、本発見のスクリー
ニングシステムは新規なものである。

【０００７】本発明において、使用されるβ−ラクタム
剤としてはメチシリン（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ、ＤＭ
ＰＰＣ）、オキサシリン（ｏｘａｃｉｌｌｉｎ、ＭＣＩ
ＰＣ）、ペニシリンＧ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ、Ｐ
ＣＧ）、アンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ、ＡＢＰ
Ｃ）、セファロチン（ｃｅｐｈａｌｏｔｈｉｎ、ＣＥ
Ｔ）、セフォキシチン（ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ、ＣＦ
Ｘ）、セフロキシム（ｃｅｆｕｒｏｘｉｍｅ、ＣＸＭ）
およびセフォタキシム（ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ、ＣＴ
Ｘ）、などが例示される。

【０００８】本発明において例示した抗生物質の一般名
および略号は、遊離酸およびその製薬上許容し得る塩の
全てを包合する。製薬上許容しうる塩とは、例えばナト
リウム、カリウム、カルシウム等の塩、およびプロカイ
ン、ジベンジルアミン等のアミン塩類や塩酸塩等の酸付
加塩など、通常β−ラクタム系抗生物質の塩として用い
られる医薬的に許容可能な塩を意味する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発見のスクリーニングシステム
は例えば日本化学療法学会の定める寒天平板希釈法（Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒｐｙ ２９（１）、７６−７９（１９
８１））に従って行う。感受性測定用平板培地はミュー
ラー・ヒントン培地（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ
Ａｇａｒ）を基礎とした半合成培地を用い、接種用菌液
はミューラー・ヒントンブロス（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉ
ｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ）に被験菌を３７℃にて２０時間
培養後、８．５％生理食塩水で１０^６ＣＦＵ／ｍｌにな
るよう希釈して調整する。β−ラクタム剤は２倍段階希
釈系列で作成した。このβ−ラクタム剤１ｍｌと一定濃
度の非験試料１ｍｌを感受性平板測定用培地８ｍｌに加
える。このようにして作成した感受性平板培地に接種用
菌液をミクロプランター（佐久間製作所）により接種
し、３７℃にて２０時間培養後、最小発育阻止濃度（Ｍ
ＩＣ：ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｃｏｎ
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を判定する。なお、完全に発育
が阻止された最小濃度をもってＭＩＣ値とする。

【００１０】さらに別の方法として日本化学療法学会の
定める微量液体希釈法（Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ３
８（１）、１０２−１０５（１９９０））に従って行
う。感受性測定用培地は、ミューラー・ヒントンブロス
（ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ）を用
い、カルシウム（Ｃａ）イオン５０ｍｇ／ｍｌ、マグネ
シウム（Ｍｇ）イオン２５ｍｇ／ｍｌ及び２％塩化ナト
リウム（ＮａＣｌ）を添加して使用する。接種用菌液は
ミューラー・ヒントンブロスに非験菌を３７℃にて２０
時間培養後、ミューラー・ヒントンブロスで最終接種菌
量１０^５ＣＦＵ／ｍｌとなるように希釈する。β−ラク
タム剤は２倍段階希釈系列で作成し、Ｕ字型ウエルのマ
イクロプレートに１０μｌ、一定濃度の非験試料１０μ
ｌ添加し、感受性測定用培地８０μｌで混和して非験菌
を添加する。３７℃で２０時間培養後、最小発育阻止濃
度（ＭＩＣ）を判定する。なお、判定に際しては、菌の
発育が肉眼的に認められないウエルの最小の薬剤濃度を
もってＭＩＣとする。

【００１１】このスクリーニングシステムは上記の２つ
の方法に限った訳ではない。集落混雑平板法、細菌寒天
平板法、噴霧法、三層平板法、濾紙上寒天法、レプリカ
法、ディスク拡散法等を応用してもよい。ただしこれら
の場合でもβ−ラクタム剤を２倍段階希釈系列で作成
し、培地に加えてスクリーニングしなければならない。

【００１２】またこのスクリーニングシステムに用いる
検体は微生物に限ったものではない。例えば陸上植物、
昆虫、海産植物及び動物等の生薬成分から検索も可能で
あり、合成物質から検索することも可能である。この世
に存在するあらゆるものから検索が可能である。

【００１３】本発明のスクリーニングシステムより発見
された物質はβ−ラクタム剤と併用させることによって
ＭＲＳＡ感染症の予防または治療に際し、抗ＭＲＳＡ活
性医薬組成物となりうる。

【００１４】有効な投与量および投与方法 本発明のスクリーニングシステムより発見された物質
は、通常のβ−ラクタム抗生物質製剤と同様に非経口投
与、経口投与または外部投与があげられる。一般的に
は、注射剤による投与が好適である。この場合注射剤は
常法により調整され、注射形態として、適当なビヒク
ル、例えば滅菌した蒸留水、生理食塩水等で溶解される
場合も含まれる。また様々な投薬型でβ−ラクタム剤と
組み合わせることによって経口投与することができる。
例えば、錠剤、カプセル、糖などで被覆した錠剤、液状
溶液または懸濁液の形態である。

【００１５】本発明のスクリーニングシステムにより発
見された物質はβ−ラクタム剤と併用することによりＭ
ＲＳＡ等を起炎菌とするヒトの細菌感染症の治療に使用
することができる。予防・治療で用いる本発明のスクリ
ーニングシステムにより発見された物質とβ−ラクタム
剤との両剤合計の投与量は、組み合わせる薬剤の種類
や、その併用比、または年令、体重、患者の症状および
投与経路によって変えることができ、例えば、成人（体
重約７０ｋｇ）に対して投与する場合は、１回投与当た
り、組み合わせた両薬剤の和で１０ｍｇ〜１００ｍｇを
１日に１回から３回経口投与する。これらの投与量およ
び投与経路をかえることによって最良の治療効果をあげ
るようにする。

【００１６】本発明において、両薬剤を併用あるいは混
合する際の重量比についても非常に幅広い範囲で適用す
ることが可能である。また、感染症の種類および重傷
度、併用されるβ−ラクタム系抗生物質の種類によって
併用比は変わるので、併用比を特別に限定するわけでは
ないが、常用量の範囲内で組み合わせれば併用効果を期
待できる濃度の組み合わせが実現できる。

【００１７】本発明のスクリーニングシステムで発見さ
れた医薬組成物は、通常、常法に従って調整され、医薬
的に適切な形態で投与される。例えば、固体経口形態
は、活性化合物と共に、ラクトース、デキストロース、
サッカロース、セルロース、トウモロコシ澱粉およびジ
ャガイモ澱粉などの希釈剤、シリカ、タルク、ステアリ
ン酸、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カ
ルシウムおよび／またはポリエチレングリコールなどの
滑沢剤、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピ
ロリジンなどの結合剤、デンプン、アルギン酸、アルギ
ン酸塩、グリコール酸デンプンナトリウムなどの崩壊
剤、発泡剤、色素、甘味料、例えばレシチン、ポリソル
ベート、ラウリル硫酸塩などの湿潤剤、および一般に非
毒性および医薬的処方に用いられる薬学的に非活性な物
質を含んでいても良い。

【００１８】上記医薬調整物は、既知の方法、例えば混
合、粒状化、錠剤化、糖衣、または被覆方法などにより
製造される。

【００１９】非経口投与の場合、直腸への適用を意図し
た座剤でも可能であるが汎用剤形は注射剤である。注射
剤では液体製剤、用時溶解型製剤、懸濁製剤などの外観
を異にする剤形があるが、基本的には活性成分を適当な
方法により無菌化したのち、直接容器に入れ、密封する
点で同一と考えられる。

【００２０】最も簡単な製剤化法としては、活性成分を
適当な方法により無菌化したのち、これを別々に、また
は物理的に混合した後、その一定量を分割製剤化する方
法がある。また、剤液形態を選ぶ場合には活性成分を適
当な媒体に溶解し、これを滅菌濾過したのち適当なアン
プルまたはバイアルに充填、密封する方法をとることが
できる。この場合汎用される媒体は注射用蒸留水である
が、本発見においては、これに約束されるものではな
い。また所量ならば、塩酸プロカイン、塩酸キシロカイ
ン、ベンジルアルコールおよびフェノールなどの局所麻
酔作用を有する無痛化剤、ベンジルアルコール、フェノ
ール、メチル、またはプロピルバクベン、およびクロロ
ブタノールなどの防腐剤、クエン酸、酢酸、リン酸のナ
トリウム塩などの緩衝剤、さらには等張化剤、安定剤、
溶解補助剤などの添加剤を添加することも可能である。

【００２１】

【実施例】実施例１（寒天平板希釈法） 感受性測定用平板培地はミューラー・ヒントン培地（Ｍ
ｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ａｇａｒ）を基礎とした
半合成培地を用い、接種用菌液はミューラー・ヒントン
ブロス（Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ）
に被験菌を３７℃にて２０時間培養後、８．５％生理食
塩水で１０^６ＣＦＵ／ｍｌになるよう希釈して調整し
た。メチシリンは１０ｍｇ／ｍｌから２倍段階希釈系列
で作成した。この希釈したメチシリン１ｍｌと５００μ
ｇ／ｍｌのフラボン１ｍｌを感受性平板測定用培地８ｍ
ｌに加えた。このようにして作成した感受性平板培地に
接種用菌液をミクロプランター（佐久間製作所）により
接種し、３７℃にて２０時間培養後、最小発育阻止濃度
（ＭＩＣ：ｍｉｎｉｍｕｍ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｃｏ
ｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を判定した。なお、完全に発
育が阻止された最小濃度をもってＭＩＣ値とし、８０％
の菌株の増殖を押さえる濃度をＭＩＣ_８０、５０％の菌
株の増殖を押さえる濃度をＭＩＣ_５０とした。

【００２２】結果 単独で抗菌活性を示さなかったフラボンはメチシリンと
併用する事でメチシリン単独のＭＩＣ_５０値＞２５０μ
ｇ／ｍｌに対し、ＭＩＣ_５０値３．９μｇ／ｍｌと非常
に強いβ−ラクタム剤を感受性にさせる効果が現れ（表
１）、結果としてこのスクリーニングシステムによりフ
ラボンがβ−ラクタム剤を誘導させる物質であることが
判明した。

【００２３】

【表１】

【００２４】実施例２（微量液体希釈法） 感受性測定用培地は、ミューラー・ヒントンブロス（Ｍ
ｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ Ｂｒｏｔｈ）を用い、カ
ルシウム（Ｃａ）イオン５０ｍｇ／ｍｌ、マグネシウム
（Ｍｇ）イオン２５ｍｇ／ｍｌ及び２％塩化ナトリウム
（ＮａＣｌ）を添加して使用した。接種用菌液はミュー
ラー・ヒントンブロスに非験菌を３７℃にて２０時間培
養後、ミューラー・ヒントンブロスで最終接種菌量１０
^５ＣＦＵ／ｍｌとなるように希釈した。β−ラクタム剤
は１０ｍＭより２倍段階希釈系列で作成し、Ｕ字型ウエ
ルのマイクロプレートに１０μｌ、５ｍＭのフラボン１
０μｌ添加し、感受性測定用培地８０μｌで混和して非
験菌を添加した。３７℃で２０時間培養後、最小発育阻
止濃度（ＭＩＣ）を判定した。なお、判定に際しては、
菌の発育が肉眼的に認められないウエルの最小の薬剤濃
度をもってＭＩＣとした。

【００２５】結果 ０．５ｍＭフラボン併用によりβ−ラクタム剤単独より
β−ラクタム剤に対して感受性を誘導させることがわか
った（表２）。

【００２６】

【表２】

【００２７】実施例３（錠剤） 常法により、フラボン５０ｍｇ、メチシリン５０ｍｇ、
乳糖１ｇ、デンプン３００ｍｇ、メチルセルロース５０
ｍｇ、タルク３０ｍｇを１０錠の錠剤に調整して白糖で
糖衣する。

【００２８】実施例４（注射剤） フラボン５００ｍｇ、セフォキシチンナトリウム５００
ｍｇからなる無菌混合物を滅菌バイアルに入れ密封す
る。使用時に、この混合物を生理食塩水に溶解し、注射
剤とする。

【００２９】実施例５（注射剤） フラボン４００ｍｇ、セフォキシチンナトリウム４００
ｍｇからなる無菌混合物を生理食塩水２０ｍｌに溶解
し、０．２２μｍのミリポアフィルターにて濾過後、予
め滅菌しておいたガラスボトルに詰め密封し、注射剤と
する。

【００３０】

【発明の効果】本発明のスクリーニングシステムにより
発見された物質はＭＲＳＡ等の耐性菌に対し、β−ラク
タム剤に対して感受性を誘導させる作用を示し、従来の
抗菌薬とは違った新しい医薬組成物を提供する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】β−ラクタム剤に対する感受性誘導薬の新
   しいスクリーニングシステムの方法
2. 【請求項２】請求項１により発見された物質とβ−ラク
   タム剤とを混合してなる抗ＭＲＳＡ活性医薬組成物