JPH11225763A - タンパク質の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】効率的かつ経済的にタンパク質の生産と精製を
行なうための方法を提供する。 【解決手段】セルロース分解酵素のセルロール結合ドメ
インを有するタンパク質を含む溶液をセルロース担体に
作用させて、該担体に該タンパク質を吸着させ、次いで
糖類を作用させて、該担体から該タンパク質を溶出する
タンパク質の精製方法、目的のタンパク質とセルロース
結合ドメインを有するタンパク質との融合タンパク質、
該タンパク質をコードする遺伝子、該遺伝子を組み込ん
だベクター、該ベクターで形質転換された宿主細胞形質
転換体および該融合タンパク質を遺伝子組み換え技術に
より製造する方法ならびに該融合タンパク質から目的タ
ンパク質を製造する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子工学技術を
用いた組換えタンパク質の生産及び精製方法に関し、さ
らに詳しくは、固相担体を用いて、宿主細胞の形質転換
体から目的のタンパク質を簡便かつ純度よく精製する方
法に関する。また、この方法は、組換えタンパク質を生
産するためのベクターや、融合タンパク質を精製するた
めの試薬にも応用しうる。

【０００２】

【従来の技術】組換えＤＮＡ技術の出現により、外来遺
伝子を動植物、酵母、細菌などの細胞中に導入すること
により、異種タンパク質として発現させることが可能に
なった。現在では、この技術を利用して、ホルモンや酵
素などの有用な様々な組換えタンパク質の生産が可能に
なっている。

【０００３】従来、このような組換えタンパク質の生産
に際しては、グラム陰性細菌である大腸菌が宿主として
広く用いられてきた。一般に、この大腸菌を宿主に用い
て組換えタンパク質の生産を行う場合、菌体を破砕した
後、菌体が本来保持している大量のタンパク質や核酸、
多糖類などの夾雑物から目的のタンパク質を分離、精製
する必要がある。また、組換えタンパク質の生産を行う
に際し、大腸菌以外の細胞を宿主に用いる場合にも、同
様である。従って、大腸菌等の細胞を宿主とした組換え
タンパク質の生産においては、目的とする組換えタンパ
ク質の分離、精製を効率よく行うことが、効率的な生産
活動のために重要な課題となっている。

【０００４】このような課題を達成するための有効な手
段のひとつが、タンパク質の融合技術とアフィニティー
クロマトグラフィー技術を用いた方法である。この方法
は、目的とするタンパク質を、特定のリガンドに親和性
を持ったタンパク質（アフィニティータグ）との融合タ
ンパク質として生産し、さらに、この融合タンパク質を
リガンドを担体としたアフィニティークロマトグラフィ
ーにより、効率的に精製する方法である。

【０００５】また、目的とするタンパク質とアフィニテ
ィータグとの間に特異的プロテアーゼにより認識され、
切断を受けるアミノ酸配列を予め挿入しておくことによ
り、融合タンパク質を開裂させて、目的のタンパク質の
みを回収することが可能である。例えば、アフィニティ
ータグとして、マルトース結合タンパク質（分子量４３
Ｋダルトン）やグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ
（分子量２６Ｋダルトン）、プロテインＡ（分子量５２
Ｋダルトン）などを、また、融合タンパク質の開裂にフ
ァクターＸａやトロンビン、コラゲナーゼ等を特異的プ
ロテアーゼとして用いたものが代表例である（Sassenfe
ld, H. M., TIBTECH 8: 88-93, 1990)。

【０００６】しかしながら、これまでに開発された方法
の多くには、以下のような問題があった。 １．融合タンパク質をアフィニティークロマトグラフィ
ーにより精製する際の担体からの溶出条件が、目的タン
パク質の失活を招くような低いｐＨ（pH< 3）であった
り、グアニジン、エチレングリコール、還元剤などの目
的タンパク質にとって阻害物質ともなり得る物質の添加
を必要とする場合が多い。 ２．担体に、非常に高価なものや、比較的失活し易く安
定性の低いリガンドを用いたものが多い。 ３．アフィニティータグとの開裂に使用される特異的プ
ロテアーゼが非常に高価なものが使用されていることが
多い。

【０００７】一方、ほとんどのセルロース分解酵素は、
セルロース分解活性を有するドメインとセルロースに結
合するドメイン（セルロース結合ドメイン；以下、ＣＢ
Ｄと略す）を持っている。これらのＣＢＤは、そのアミ
ノ酸配列の相同性より、９つのファミリー（ファミリー
I 〜IX）に分類されている（Tomme, P. et al., Adv.Mi
crobiol. Physiol., 37, 1-81 (1995) ）。

【０００８】ＣＢＤが結合するセルロースは、他の担体
と比べて非常に安価であるため、これらのＣＢＤをアフ
ィニティータグとして使用する試みが、今までに数多く
なされている。例えば、Greenwood ら（FEBS Letter, 2
24: (1) 127-131 (1989) ）はセルロモナス フィミ
（Cellulomonas fimi ）エンドグルカナーゼのＣＢＤ
（ファミリーII）をアルカリホスファターゼと融合させ
ることに成功している。しかしながら、このセルロモナ
ス フィミのＣＢＤは、セルロースに対する親和性が低
く、融合タンパク質の３０％以上がバッファー（50mM T
ris-HCl (pH7.5), 0.5M NaCl）によって溶出されてしま
う。その上、セルロモナス フィミのＣＢＤは、セルロ
ース繊維を破壊してしまう（Din ら, Bio Technology,
9: 1096-1098(1991) ）という欠点も持っている。

【０００９】また、シュードモナス フルオレセンス
セルローサ（Pseudomonas fluorescens subsp. cellulo
sa）から得られたセルラーゼやキシラナーゼのＣＢＤ
（ファミリーX ）は、セルロースに対して非常に強く結
合する。そのため、セルロースから、これらの酵素を溶
出するには、多くのタンパク質が変性されてしまうよう
な条件である１０％ＳＤＳ中で煮沸することにより行わ
れる（Poole, D. M. etal., Biochem. J., 279: 787-79
2 (1991) ）。従って、これらのＣＢＤが、融合タンパ
ク質精製用のアフィニティータグとして最適でないこと
は明らかである。

【００１０】一方、クロストリジウム ステルコラリウ
ム（Clostridium stercorarium）の産生するセルロース
分解酵素のうち、キシラナーゼＡについては、既にその
遺伝子がクローニングされ、塩基配列が明らかになって
いる（Sakka, K. et al., Biosci. Biotech. Biochem.,
57, 237-277 (1993) ）。さらに、この塩基配列より推
定されるアミノ酸配列から、このキシラナーゼＡのＣ末
端近傍には、いずれも約１３０個のアミノ酸からなり、
ファミリーVIに属する２つのＣＢＤ（CBD I とCBD II）
が存在し、それらはアルギニンを含み、セリンとプロリ
ンに富む約１０個のアミノ酸からなるリンカーにより結
合されていることも明らかにされている（Sakka, K. et
al., Biosci. Biotech. Biochem., 57, 237-277 (199
3) ）。

【００１１】最近、これら２つのＣＢＤをルミノコッカ
ス アルブス（Ruminococcus albus）由来のエンドグル
カナーゼIVと融合させる試みがなされ、これら２つのＣ
ＢＤが、セルロース構造を破壊することなく不溶性セル
ロースへの結合力を高めることが示されている（Karit
a, S. et al., J. Ferment. Bioeng., 81, 553-556 (19
96)）。しかしながら、クロストリジウム ステルコラ
リウム由来キシラナーゼＡのＣＢＤをはじめ、ファミリ
ーVIに属する単一のＣＢＤをアフィニティータグとして
利用して、タンパク質のアフィニティークロマトグラフ
ィーによる精製を試みた例はいまだない。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、効率
的かつ経済的にタンパク質の生産と精製を行うための方
法を提供することである。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討した結果、クロストリジウム
ステルコラリウム由来のキシラナーゼＡのＣＢＤをア
フィニティータグとして用いることにより、効率的かつ
経済的に組換えタンパク質の精製が行えることを見いだ
し、本発明に達した。

【００１４】すなわち、本発明はセルロース分解酵素の
セルロース結合ドメインを有するタンパク質が含まれる
溶液をセルロース担体に作用させることにより、該担体
に該タンパク質を吸着させ、次いで糖類を作用させて、
該担体から該タンパク質を溶出することを特徴とするタ
ンパク質精製方法である。

【００１５】本発明は、（ａ）精製しようとするタンパ
ク質および（ｂ）セルロース分解酵素のセルロース結合
ドメインを含むポリペプチド鎖からなる融合タンパク質
である。

【００１６】また、本発明はタンパク質をコードする遺
伝子およびセルロース分解酵素のセルロース結合ドメイ
ンを含むポリペプチド鎖をコードする遺伝子をベクター
に挿入し、該ベクターで宿主細胞を形質転換し、該宿主
細胞を培養し、該宿主細胞中で、タンパク質およびセル
ロース分解酵素のセルロース結合ドメインを含むポリペ
プチド鎖の融合タンパク質を発現させ、該宿主細胞中か
ら該融合タンパク質を採取することを特徴とする融合タ
ンパク質の製造方法である。

【００１７】さらに、本発明は上記融合タンパク質を、
さらに、特異的プロテアーゼで処理することにより、該
融合タンパク質からセルロース結合ドメインを含むポリ
ペプチド鎖を分離して、タンパク質のみを回収すること
を特徴とするタンパク質の製造方法である。

【００１８】

【発明の実施の形態】本発明は、目的とするタンパク質
をコードする遺伝子とセルロース分解酵素、例えばクロ
ストリジウム ステルコラリウム由来のキシラナーゼＡ
のＣＢＤをコードする遺伝子とから構成される融合タン
パク質遺伝子を合成する工程と、該遺伝子から合成され
た該融合タンパクを含む混合物から目的の融合タンパク
質を精製する工程とを含んでいる。

【００１９】目的とするタンパク質としては、産業上あ
るいは学術的に有用な酵素、抗体、ホルモンなどが挙げ
られるが、一般に、試験管内（in vitro）での合成系や
宿主細胞を利用した発現系で合成しうるものであれば、
いかなるタンパク質でも本発明の方法に利用しうる。例
えば、ルミノコッカス アルブス(Ruminococcus albus
) の産生するエンドグルカナーゼIVなどが含まれる。

【００２０】セルロース分解酵素としては、キシラナー
ゼ（EC 3.2.1.8）、セロビオハイドロラーゼ(EC 3.2.1.
91) 、エンドグルカナーゼ(EC 3.2.1.4)などがあり、例
えばクロストリジウム ステルコラリウム(Clostridium
stercorarium)の産生するキシラナーゼＡがある。

【００２１】セルロース結合ドメインは、配列表１また
は２に示したアミノ酸配列の連続した部分に対して、少
なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％の相同ア
ミノ酸配列を含むポリペプチド鎖、さらに好ましくは配
列表１または２に示したアミノ酸配列を含むポリペプチ
ド鎖である。

【００２２】セルロース分解酵素のセルロース結合ドメ
インを有するタンパク質は、精製しようとするタンパク
質およびセルロース分解酵素のセルロース結合ドメイン
を含むポリペプチド鎖の融合タンパク質である。

【００２３】本発明で用いられるＣＢＤをコードするＤ
ＮＡ断片の調製のためには、まず、本発明の実施に好適
なセルラーゼ遺伝子を有する生物からゲノムＤＮＡライ
ブラリーを調製して行う。例えば、そのようなセルラー
ゼ遺伝子はクロストリジウムステルコラリウム等の菌株
から得ることができる。そのような菌株からゲノムＤＮ
Ａを調製した後、適当な制限酵素、例えばSau 3AI によ
って部分的に切断し、得られた断片を適当なベクター、
例えばｐＢＲ３２２に組み込み、大腸菌を形質転換する
ことにより、ゲノムＤＮＡライブラリーを得る。得られ
たライブラリーから、セルラーゼ遺伝子を有するクロー
ンを見つけるには、例えば、無作為に選択したクローン
についてセルラーゼ活性を測定し、活性が見られたクロ
ーンを分離することにより行うことができる。さらに、
このように選択されたセルラーゼ活性を有するクローン
からプラスミドＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断
することにより、セルラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ断片
を得ることができる。

【００２４】セルラーゼ活性を測定するために使用され
る基質としては、キシラン、カルボキシメチルセルロー
ス等が用いられるが、例えばキシラナーゼ活性の測定に
はキシランが好適である。

【００２５】さらに、セルラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ
断片からＣＢＤをコードするＤＮＡ断片を得るために
は、例えば、制限酵素やエクソヌクレアーゼを用いてセ
ルラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ断片を適当な長さに切
断、あるいは末端より切除することにより、まず、欠損
したセルラーゼ遺伝子断片を得る。続いて、この欠損セ
ルラーゼ遺伝子断片を再び適当なベクターへ挿入後、宿
主細胞、例えば大腸菌へ導入し、この形質転換体から産
生される欠損タンパク質のセルロース結合能を測定し、
これを指標とすることにより、ＣＢＤをコードするＤＮ
Ａ断片を調製することが可能である。

【００２６】セルロース結合能を調べるために用いられ
るセルロースとしては、アビセル（商品名、ＦＭＣ社）
などの結晶性セルロースや非結晶性セルロース等が用い
られるが、例えばクロストリジウム ステルコラリウム
の産生するキシラナーゼＡのＣＢＤのセルロース結合能
の測定には非結晶性セルロースが好適である。

【００２７】このようにして調製されたＣＢＤをコード
する遺伝子を含むＤＮＡ断片をハイブリダイゼーション
のプローブとして用いることによって、他の生物に存在
する構造的に類似したＣＢＤ遺伝子を分離してくること
も可能である。例えば、クロストリジウム ステルコラ
リウムの産生するキシラナーゼＡのＣＢＤをコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片をプローブとすれば、同じファ
ミリーVIに属するＣＢＤをコードする遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を他の生物から得ることが可能となる。

【００２８】本発明では、まず、目的とするタンパク質
とセルロース分解酵素のＣＢＤとから構成される融合タ
ンパク質を合成する。例えば、該融合タンパク質をコー
ドする遺伝子を組換えタンパク質生産に好適な発現ベク
ターに挿入し、これを大腸菌などの宿主生物へ導入し、
好適な条件の下で増殖させ、目的の融合タンパク質を発
現させてもよい。

【００２９】また、あらかじめ挿入されているＣＢＤを
コードする遺伝子にマルチクローニングサイトを隣接さ
せた発現ベクターを使用してもよい。この場合、目的の
タンパク質をコードする遺伝子は、このマルチクローニ
ングサイトを利用して発現ベクターへ挿入されるが、種
々のプロモーターや制限酵素認識配列の組み合わせから
なるＤＮＡの塩基配列をそれぞれ遺伝子カセットとして
用意しておけば、目的とする融合タンパク質の生産に好
適な組み合わせを持つ発現ベクターを得ることも容易に
なる。

【００３０】また、目的とする融合タンパク質が元来分
泌性のタンパク質である場合には、適当な分泌シグナル
をコードするサブ配列を、融合タンパク質をコードする
遺伝子の上流に配置することにより、融合タンパク質を
ペリプラズム中に分泌させることも可能である。

【００３１】一方、融合タンパク質を精製する方法とし
ては、合成された融合タンパク質を含む混合物を出発材
料とし、セルロース担体を利用したアフィニティークロ
マトグラフィーにより行われる。目的の融合タンパク質
を宿主細胞による発現系で合成する場合には、宿主細胞
を超音波または機械的破砕を行うことにより得られる融
合タンパク質を含む菌体抽出物が出発材料となる。

【００３２】アフィニティークロマトグラフィー用のセ
ルロース担体としては、不溶性セルロース、例えば市販
されているセルロース担体を利用することができる。ク
ロストリジウム ステルコラリウム由来キシラナーゼＡ
のＣＢＤをアフィニティータグとして用いる場合には、
不溶性の非結晶性セルロースが好ましい。また、市販の
セルロース担体をボールミル等の粉砕機を使用して粉砕
することにより、吸着容量を上げることも可能である。
さらに、担体と液体を効率よく分離するための加工、例
えば、超常磁性金属化合物をセルロース担体と結合させ
てもよい。この場合には、磁石を用いることにより、迅
速かつ簡便に担体と液体を分離することが可能である。

【００３３】アフィニティークロマトグラフィーによる
精製工程では、まず、目的の融合タンパク質を含む混合
物をセルロース担体への吸着に適したバッファー条件に
調製した後、セルロース担体に接触させ、該融合タンパ
ク質のみを吸着させる。例えば、クロストリジウム ス
テルコラリウム由来キシラナーゼＡのＣＢＤをアフィニ
ティータグとして用いる場合には、好ましくはｐＨ７の
リン酸カリウムバッファーが吸着用バッファーとして用
いられる。

【００３４】また、吸着方法としてはバッチ法とカラム
法のいずれの方法でもよい。いずれの方法でも、適した
バッファー条件に調製された目的の融合タンパク質を含
む混合物とセルロース担体を接触させ、必要であれば一
定時間放置することにより、該融合タンパク質のみをセ
ルロース担体に吸着させ、不要物はセルロース担体を吸
着用バッファーで洗浄することにより除去することが可
能である。

【００３５】セルロース担体に吸着した目的の融合タン
パク質の回収は、セルロース担体と該融合タンパク質間
の結合を妨げる物質を含む溶出液をセルロース担体に接
触させることにより行われる。例えば、クロストリジウ
ム ステルコラリウム由来キシラナーゼＡのＣＢＤをア
フィニティータグとして用いる場合には、セロビオー
ス、マルトース、グルコース、キシロースなどの糖類が
含まれていることが好ましく、中でも、セロビオースが
より好適である。また、これらの糖類は比較的安価に入
手することが可能である。使用される溶出液中の糖類の
濃度としては、ＣＢＤとセルロース担体の結合を十分に
妨げ、かつ目的のタンパク質の活性に影響を与えない程
度であればよく、より好適には１〜１０％の濃度が望ま
しい。

【００３６】本発明の方法によれば、特異的プロテアー
ゼの認識部位を含むリンカー領域をコードする遺伝子を
該目的タンパク質をコードする遺伝子と該ＣＢＤをコー
ドする遺伝子の間に配置することによって、該プロテア
ーゼ処理による目的タンパク質とＣＢＤとの開裂が可能
である。これは、発現した融合タンパク質中でリンカー
領域が目的タンパク質とＣＢＤとを結ぶフレキシブルな
ヒンジとして働くため、特異的プロテアーゼの認識部位
が融合タンパク質表面に露出されるからと推察される。
例えば、溶出された融合タンパク質をプロテアーゼによ
る処理を行った後、必要があれば、各種クロマトグラフ
ィーなどの既存の分離手段を用いて目的タンパク質のみ
を分離することが可能である。あるいは、融合タンパク
質のプロテアーゼ消化産物を再度、セルロース担体に接
触させることにより、精製用タグとして用いたＣＢＤを
含むペプチド鎖をセルロース担体に吸着させることによ
り、目的タンパク質を回収してもよい。また、融合タン
パク質をセルロースに結合させた状態で、プロテアーゼ
による処理を行えば、より簡単に目的タンパク質のみを
分離することが可能となる。

【００３７】特異的プロテアーゼとしては、周知の種々
のプロテアーゼを使用することが可能である。例えば、
ファクターＸa 、コラゲナーゼ、エンテロキナーゼ、ト
ロンビンなどが非常に高い特異性を持つことから好適で
ある。特異的プロテアーゼによる融合タンパク質の処理
条件については、それぞれのプロテアーゼの最適反応条
件を考慮すればよい。

【００３８】しかし、目的とするタンパク質がプロテア
ーゼによって認識され、切断されるアミノ酸を含まない
か、またはリンカー配列中の認識部位のみを選択的に開
裂させるような処理条件を選択することが必要である。
また、クロストリジウム ステルコラリウム由来キシラ
ナーゼＡのＣＢＤをアフィニティータグとして用いる場
合には、その２つのＣＢＤ間に存在するリンカー配列を
いずれかのＣＢＤとともに目的のタンパク質と融合させ
るように発現ベクターを設計してもよい。この場合に
は、特異的プロテアーゼであるトリプシンを穏やかな条
件で作用させることによって、リンカー配列中に存在す
るアルギニン残基のカルボキシ末端特異的に開裂させる
ことが可能である。

【００３９】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。なお、特に断りのない限り、実施例の中で用
いている遺伝子操作方法は、Maniatisらの文献（Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual; 2nd. Edition, Co
ld Spling Harbour Laboratry, 1989.）に記載されてい
る方法に従った。

【００４０】実施例１ クロストリジウム ステルコラ
リウム(Clostridium stercorarium)由来キシラナーゼＡ
のＣＢＤをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片の調
製 本実施例では、クロストリジウム ステルコラリウムの
産生するセルロース分解酵素の一つであるキシラナーゼ
ＡのＣＢＤをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を
調製した。なお、このキシラナーゼＡには約１０個のア
ミノ酸配列からなるリンカーを介して，二つのＣＢＤが
存在しているが（Sakka, K. et al., Biosci. Biotech.
Biochem., 57, 237-277 (1993) ）、本実施例では、リ
ンカー配列と、よりカルボキシ末端側に存在するＣＢＤ
IIをコードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ断片（配列番
号４）を調製した（図１参照）。

【００４１】また、本ＤＮＡ断片の調製に際しては、そ
れぞれ、Nsp V またはKpn I 認識配列を有する二種類の
プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応(PCR) を利用
することにより、5'側にNsp V サイト、3'側にKpn I サ
イトを導入した。

【００４２】まず、クロストリジウム ステルコラリウ
ムからゲノムＤＮＡを調製した後、制限酵素、Sau3AIに
よって部分的に切断し、得られた断片をプラスミドベク
ターに組み込み、大腸菌を形質転換することにより、ゲ
ノムＤＮＡライブラリーを得た。続いて、このライブラ
リーに含まれるクローンをランダムに選択することによ
って、キシラナーゼＡをコードする遺伝子を含む6kb の
ＤＮＡ断片をインサートに持つプラスミドpYK208を得
た。さらに、この6kb のＤＮＡ断片をEcoRV で切断して
得られた4.5kb の断片をpBluescript II KS (+) （スト
ラタジーン社製）へサブクローニングすることによっ
て、キシラナーゼＡをコードする遺伝子を含むプラスミ
ドpXYNを得た。なお、これらの方法は文献（Sakka et.
al., Agric.Biol. Chem., 54 (2), 337-342 (1990) ま
たはSakka et. al.,Biosci. Biotech.Biochem., 57
(2), 273-277 (1993) ）に記載されている。

【００４３】次に、リンカー配列とＣＢＤIIをコードす
るＤＮＡを増幅させるようなＰＣＲ用プライマーとし
て、Nsp V またはKpn I 認識配列を有する二種類のオリ
ゴヌクレオチド（配列番号５および６）を合成した。そ
れぞれのプライマーのアニーリングサイトを図２に示
す。

【００４４】次に、プラスミドpXYNのＤＮＡを鋳型に、
AmpliTaqポリメラーゼ(PE アプライド バイオシステム
ズ社製）と合成された二種類のプライマー１およびプラ
イマー２（配列番号５および６）を用いて、ＰＣＲを行
った。続いて、得られた増幅産物をNsp V （東洋紡績社
製）及びKpn I （東洋紡績社製）で消化することによ
り、ＣＢＤをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片
（配列番号４）を調製した。

【００４５】実施例２ ルミノコッカス アルブス(Rum
inococcus albus)由来エンドグルカナーゼIVとＣＢＤを
コードする発現ベクター（pCsCBD2 ）の構築 本実施例では、ルミノコッカス アルブスの産生するセ
ルロース分解酵素の一つであるエンドグルカナーゼIV
（EGIV）をコードする遺伝子が挿入された発現ベクター
pRA11 （Karita, S. et al., J. Ferment. Bioeng., 7
6, 439-444 (1993)）に、実施例１で調製したＣＢＤを
コードするＤＮＡ断片（配列番号４）を挿入し、ＥＧＩ
ＶとＣＢＤの融合タンパク質(EGIV-CBD 融合タンパク
質）の発現ベクターpCsCBD2 を構築した。

【００４６】なお、EGIV遺伝子のコード領域3'末端部の
停止コドン近傍に存在するNsp V サイトとEGIV遺伝子の
下流に存在するKpn I サイト間へ、ＣＢＤをコードする
ＤＮＡ断片を挿入し、オープンリーディングフレームが
ＥＧＩＶとＣＢＤ間で分断されないように融合遺伝子を
構築した（図１および図３参照）。

【００４７】まず、ルミノコッカス アルプスからゲノ
ムＤＮＡを調製した後、PstIによって部分的に切断し、
得られた断片をプラスミドベクターに組み込み、大腸菌
を形質転換することにより、ゲノムＤＮＡライブラリー
を得た。続いて、このライブラリーに含まれるクローン
のうち、エンドグルカナーゼ活性を有するものを選択す
ることによって、ＥＧＶＩをコードする遺伝子を含む4.
4kb のＤＮＡ断片をインサートにもつプラスミドpRA102
を得た。さらに、この4.4kb のＤＮＡをBglIIで切断し
て得られた2.3kb の断片をpUC119 (宝酒造製) へサブク
ローニングすることによって、ＥＧＶＩをコードする遺
伝子を含むプラスミドpRA11 を得た。なお、これらの方
法は文献 (Karita et al., J.Ferment. Bioeng. 76(6),
439-444(1993))に記載されている。

【００４８】次に、pRA11 のＤＮＡをNsp V 及びKpn I
で消化させ、これをアガロースゲル電気泳動法により分
離し、EGIV遺伝子のコード領域を含む断片を得た。次
に、この断片と実施例１で得られたＤＮＡ断片を市販の
ライゲーションキット（東洋紡績社製）を使用してライ
ゲーションさせ、得られた産物の一部を使用して大腸菌
JM109 コンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換す
ることにより、EGIV-CBD融合タンパク質の発現ベクター
を持つ組換え大腸菌JM109/pCsCBD2 株を得た。

【００４９】実施例３ 組換え大腸菌JM109/pCsCBD2 株
の培養によるEGIV-CBD融合タンパク質の生産及び精製 本実施例では、組換え大腸菌JM109/pCsCBD2 株を培養す
ることによって、EGIV-CBD融合タンパク質の生産を行
い、さらに、セルロースを精製用担体として使用するこ
とによって、該融合タンパク質を精製した。

【００５０】まず、組換え大腸菌JM109/pCsCBD2 株を10
0ml のＬＢ培地（100 μg/mlのアンピシリンを含む）に
植菌し、37℃で終夜培養を行った。培養終了後、菌体を
遠心分離にて集め、10mlの100mM リン酸カリウムバッフ
ァー(5mMβ- メルカプトエタノールを含む) で洗浄後、
10mlの同バッファーで懸濁した。続いて、菌体を超音波
ホモジナイザー（Sonifier 250: Branson 社製) を用い
て破砕し、遠心分離を行なうことにより、菌体破砕液を
回収した。

【００５１】セルロースKC flock W-300（山陽国策パル
プ社製）を粉砕し（Takano, M. etal., J. Ferment. Bi
oeng., 73, 79-88 (1992)）、5mM のβ−メルカプトエ
タノールを含む100mM リン酸カリウムバッファーで3%の
濃度に調整されたボールミルセルロース（BMC ）5ml と
先に調製した細胞破砕液 5mlを混合し、氷上で10分間放
置した。これを遠心分離（1,000 x g 、10分間）した
後、上清を除去した。5ml の100mM リン酸カリウムバッ
ファー（5mM β−メルカプトエタノールを含む）でセル
ロースを懸濁し、再度、遠心分離（1,000 x g 、10分
間）することにより、セルロースを洗浄した。セルロー
スを３回洗浄した後、5ml の100mM ン酸カリウムバッフ
ァー（5mM β−メルカプトエタノールを含む）で溶解し
た１％セロビオースで懸濁し、遠心分離（1,000 x g 、
20分間）することにより融合タンパク質を含む上清を回
収した。

【００５２】菌体破砕液と回収液について、タンパク質
量とセルラーゼ活性を測定した結果を表１に示す。な
お、タンパク質濃度の測定は市販のプロテインアッセイ
キット（バイオラッド社製）を用いて、また、活性測定
は文献（Karita, S. et al., J. Ferment. Bioeng., 8
1, 555-558 (1996)）に記載された方法により行い、１
分間に１μmol のグルコースを遊離する量を１ユニット
と定義した。

【００５３】

【表１】

【００５４】その結果、このセルロース担体を利用した
精製により、39％の融合タンパク質が回収され、また、
その比活性が15倍に上昇したことが確認された。また、
純度を調べるために、SDS-PAGE電気泳動を実施した結
果、得られた融合タンパク質はほぼ単一のタンパク質で
あることが確認された（図４中、レーン２参照）。

【００５５】実施例４ トリプシン消化によるEGIV-CBD
融合タンパク質の特異的切断 本実施例では、特異的プロテアーゼであるトリプシンを
使用して、融合タンパク質からＣＢＤを切除し、ＥＧＩ
Ｖを得た。なお、トリプシンを低濃度かつ低温で作用さ
せることにより、ＥＧＩＶとＣＢＤ間にあるリンカー配
列中に存在するアルギニン残基のカルボキシ末端部に特
異的な加水分解を行った。

【００５６】350 μg のEGIV-CBD融合タンパク質に対
し、１μg のトリプシン（和光純薬工業社製）を４℃で
一晩作用させ、一部をSDS-PAGEに供した。その結果、Ｅ
ＧＩＶとＣＢＤに相当する２本のバンドが確認できた
（図４中、レーン３参照）。

【００５７】さらに、融合タンパク質の切断箇所を調べ
るために、ＣＢＤに相当することが推定されるサイズの
小さいほうのバンドをプロブット（ProBlott）メンブレ
ン（PEアプライド バイオシステムズ社製）上へエレク
トロブロッティングし、これをサンプルとして、モデル
476Aプロテインシーケンサー（PEアプライド バイオシ
ステムズ社製）により、Ｎ末端アミノ酸配列解析を実施
した。

【００５８】その結果、この切除されたタンパク質のＮ
末端アミノ酸配列は、SSPVPAPGDNで始まることが確認さ
れた。すなわち、EGIV-CBD融合タンパク質のアミノ酸配
列中にはトリプシンと標的となるアルギニン酸残基やリ
ジン残基が数多く存在するにもかかわらず、ＥＧＩＶと
ＣＢＤ間にあるリンカー配列中に存在するアルギニン残
基のカルボキシ末端部に特異的な加水分解が行われたこ
とを示している。これは、親水性のアミノ酸に富む配列
からなるリンカーが、融合タンパク質中でＥＧＩＶとＣ
ＢＤを結ぶフレキシブルなヒンジとして働き、さらに融
合タンパク質表面に露出するために、リンカー配列中の
アルギニン残基が優先的にトリプシンの標的となったと
推察された。

【００５９】実施例５ イオン交換カラムクロマトグラ
フィーによるEGIVの精製 本実施例では、融合タンパク質のトリプシン消化物につ
いてイオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、目的
のＥＧＩＶを単離した。実施例４で得られたトリプシン
消化物をハイトラップ（HitrapQ ）（ファルマシア社
製）へアプライし、イオン交換カラムクロマトグラフィ
ーを実施した。得られたＥＧＩＶに相当する画分の一部
をSDS-PAGE電気泳動に供した結果、ＥＧＩＶに相当する
単一バンドが確認できた（図４中、レーン４参照）。図
４中、レーンＭ：サイズマーカー、レーン１：組換え大
腸菌JM109/pCsCBD2株の培養物の菌体破砕液、レーン
２：BMC で精製されたEGIV-CBD融合タンパク質、レーン
３：EGIV-CBD融合タンパク質のトリプシン消化物、レー
ン４：イオン交換クロマトグラフィーで精製されたＥＧ
ＩＶを示す。

【００６０】

【発明の効果】本発明のＣＢＤは、従来のＣＢＤに比べ
て、セルロースに対する親和性が高く、トリス塩酸緩衝
液では全く溶出されないことから、目的とするタンパク
質をセルロース担体に多量に吸着させることができ、ま
た、該ＣＢＤを含むタンパク質のセルロース担体からの
タンパク質の溶出は、糖の水溶液を使用する温和な条件
で、タンパク質の変性がなく、さらに、セルロースの破
壊が見られないという特長を有する。したがって、本発
明によれば、効率的かつ経済的に組換えタンパク質の生
産及び精製を行うことができる。

【００６１】

【配列表】

配列番号１ 配列の長さ：126 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列の特徴 クロストリジウム ステルコラリウム由来キシラナーゼ
ＡのＣＢＤＩを構成する。 配列 Ile Arg Arg Asp Ala Phe Ser Ile Ile Glu Ala Glu Glu Tyr Asn Ser 1 5 10 15 Thr Asn Ser Ser Thr Leu Gln Val Ile Gly Thr Pro Asn Asn Gly Arg 20 25 30 Gly Ile Gly Tyr Ile Glu Asn Gly Asn Thr Val Thr Tyr Ser Asn Ile 35 40 45 Asp Phe Gly Ser Gly Ala Thr Gly Phe Ser Ala Thr Val Ala Thr Glu 50 55 60 Val Asn Thr Ser Ile Gln Ile Arg Ser Asp Ser Pro Thr Gly Thr Leu 65 70 75 80 Leu Gly Thr Leu Tyr Val Ser Ser Thr Gly Ser Trp Asn Thr Tyr Gln 85 90 95 Thr Val Ser Thr Asn Ile Ser Lys Ile Thr Gly Val His Asp Ile Val 100 105 110 Leu Val Phe Ser Gly Pro Val Asn Val Asp Asn Phe Ile Phe 115 120 125

【００６２】配列番号２ 配列の長さ：132 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列の特徴 クロストリジウム ステルコラリウム由来キシラナーゼ
ＡのＣＢＤIIを構成する。 配列 Asp Asn Thr Arg Asp Ala Tyr Ser Ile Ile Gln Ala Glu Asp Tyr Asp 1 5 10 15 Ser Ser Tyr Gly Pro Asn Leu Gln Ile Phe Ser Leu Pro Gly Gly Gly 20 25 30 Ser Ala Ile Gly Tyr Ile Glu Asn Gly Tyr Ser Thr Thr Tyr Lys Asn 35 40 45 Ile Asp Phe Gly Asp Gly Ala Thr Ser Val Thr Ala Arg Val Ala Thr 50 55 60 Gln Asn Ala Thr Thr Ile Gln Val Arg Leu Gly Ser Pro Ser Gly Thr 65 70 75 80 Leu Leu Gly Thr Ile Tyr Val Gly Ser Thr Gly Ser Phe Asp Thr Tyr 85 90 95 Arg Asp Val Ser Ala Thr Ile Ser Asn Thr Ala Gly Val Lys Asp Ile 100 105 110 Val Leu Val Phe Ser Gly Pro Val Asn Val Asp Trp Phe Val Phe Ser 115 120 125 Lys Ser Gly Thr 130

【００６３】配列番号３ 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：オリゴペプチド 配列の特徴 クロストリジウム ステルコラリウム由来キシラナーゼ
ＡのＣＢＤＩとＣＢＤII間に存在するリンカーを構成す
る。

【００６４】配列番号４ 配列の長さ：432 配列の型：核酸（DNA） 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA 配列の特徴 クロストリジウム ステルコラリウム由来キシラナーゼ
ＡのCDB IIとリンカーを構成する。 配列 CGA AGT TCA CCA GTG CCT GCA CCT GGT GAT AAC ACA AGA GAC GCA TAT 48 Arg Ser Ser Pro Val Pro Ala Pro Gly Asp Asn Thr Arg Asp Ala Tyr 1 5 10 15 TCT ATC ATT CAG GCC GAG GAT TAT GAC AGC AGT TAT GGT CCC AAC CTT 96 Ser Ile Ile Gln Ala Glu Asp Tyr Asp Ser Ser Tyr Gly Pro Asn Leu 20 25 30 CAA ATC TTT AGC TTA CCA GGT GGT GGC AGC GCC ATT GGC TAT ATT GAA 144 Gln Ile Phe Ser Leu Pro Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gly Tyr Ile Glu 35 40 45 AAT GGT TAT TCC ACT ACC TAT AAA AAT ATT GAT TTT GGT GAC GGC GCA 192 Asn Gly Tyr Ser Thr Thr Tyr Lys Asn Ile Asp Phe Gly Asp Gly Ala 50 55 60 ACG TCC GTA ACA GCA AGA GTA GCT ACC CAG AAT GCT ACT ACC ATT CAG 240 Thr Ser Val Thr Ala Arg Val Ala Thr Gln Asn Ala Thr Thr Ile Gln 65 70 75 80 GTA AGA TTG GGA AGT CCA TCG GGT ACA TTA CTT GGA ACA ATT TAC GTG 288 Val Arg Leu Gly Ser Pro Ser Gly Thr Leu Leu Gly Thr Ile Tyr Val 85 90 95 GGG TCC ACA GGA AGC TTT GAT ACT TAT AGG GAT GTA TCC GCT ACC ATT 336 Gly Ser Thr Gly Ser Phe Asp Thr Tyr Arg Asp Val Ser Ala Thr Ile 100 105 110 AGT AAT ACT GCG GGT GTA AAA GAT ATT GTT CTT GTA TTC TCA GGT CCT 384 Ser Asn Thr Ala Gly Val Lys Asp Ile Val Leu Val Phe Ser Gly Pro 115 120 125 GTT AAT GTT GAC TGG TTT GTA TTC TCA AAA TCA GGA ACT TAA GGG TAC 432 Val Asn Val Asp Trp Phe Val Phe Ser Lys Ser Gly Thr *** 130 135 140

【００６５】配列番号５ 配列の長さ：28 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド TTTTCGAAGT TCACCAGTGC CTGCACCT 28

【００６６】配列番号６ 配列の長さ：24 配列の型：核酸（ＤＮＡ） 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド TTGGTACCCT TAAGTTCCTG ATTT 24

【図面の簡単な説明】

【図１】 EGIV-CBD融合タンパク質をコードする発現プ
ラスミドの構築図を示す図である。

【図２】 リンカーのアミノ末端近傍およびＣＢＤのカ
ルボキシ末端近傍に相当する塩基およびアミノ酸配列と
プライマー１および２のアニーリングサイトを示す図で
ある。

【図３】 EGIVとリンカーの接合部近傍に相当する塩基
およびアミノ酸配列を示す図である。

【図４】 SDS-PAGE電気泳動の結果を示す図に代わる写
真である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 9/24 9/24 11/12 11/12 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:145） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:145） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 セルロース分解酵素のセルロース結合ド
   メインを有するタンパク質が含まれる溶液をセルロース
   担体に作用させることにより、該担体に該タンパク質を
   吸着させ、次いで糖類を作用させて、該担体から該タン
   パク質を溶出することを特徴とするタンパク質精製方
   法。
2. 【請求項２】 セルロース分解酵素が、キシラナーゼで
   ある請求項１記載のタンパク質精製方法。
3. 【請求項３】 セルロース分解酵素が、クロストリジウ
   ム ステルコラリウム(Clostridium stercorarium)の産
   生するキシラナーゼＡである請求項１記載のタンパク質
   精製方法。
4. 【請求項４】 セルロース結合ドメインが、配列番号１
   または２に示したアミノ酸配列の連続した部分に対し
   て、少なくとも４０％の相同アミノ酸配列を含むポリペ
   プチド鎖である請求項１記載のタンパク質精製方法。
5. 【請求項５】 セルロース結合ドメインが、配列番号１
   または２に示したアミノ酸配列の連続した部分に対し
   て、少なくとも６０％の相同アミノ酸配列を含むポリペ
   プチド鎖である請求項１記載タンパク質精製方法。
6. 【請求項６】 セルロース結合ドメインが、配列番号１
   または２に示したアミノ酸配列のいずれかを含むポリペ
   プチド鎖である請求項１記載のタンパク質精製方法。
7. 【請求項７】 セルロース分解酵素のセルロース結合ド
   メインを有するタンパク質が、精製しようとするタンパ
   ク質およびセルロース分解酵素のセルロース結合ドメイ
   ンを含むポリペプチド鎖の融合タンパク質である請求項
   １記載のタンパク質精製方法。
8. 【請求項８】 精製しようとするタンパク質が、組換え
   タンパク質である請求項７記載のタンパク質精製方法。
9. 【請求項９】 セルロース担体が、不溶性セルロースで
   ある請求項１記載のタンパク質精製方法。
10. 【請求項１０】 不溶性セルロースが、非結晶性セルロ
    ースである請求項９記載のタンパク質精製方法。
11. 【請求項１１】 糖類がセロビオース、マルトース、グ
    ルコースまたはキシロースである請求項１記載のタンパ
    ク質精製方法。
12. 【請求項１２】 糖類がセロビオースである請求項１記
    載のタンパク質精製方法。
13. 【請求項１３】 セロビオースの濃度が、１〜１０％の
    範囲で使用される請求項１２記載のタンパク質精製方
    法。
14. 【請求項１４】 溶出した融合タンパク質を、さらに、
    特異的プロテアーゼで処理することにより、該融合タン
    パク質からセルロース結合ドメインを含むポリペプチド
    鎖を分離して、タンパク質のみを回収する請求項７記載
    のタンパク質精製方法。
15. 【請求項１５】 融合タンパク質が、（ａ）精製しよう
    とするタンパク質、（ｂ）配列番号３に示したアミノ酸
    配列からなるリンカー、さらに（ｃ）セルロース分解酵
    素のセルロース結合ドメインを含み、さらに（ｄ）特異
    的プロテアーゼにより該リンカー部分において切断され
    る部位を含む請求項７記載のタンパク質精製方法。
16. 【請求項１６】 特異的プロテアーゼが、トリプシンで
    ある請求項１５記載のタンパク質精製方法。
17. 【請求項１７】 （ａ）精製しようとするタンパク質お
    よび（ｂ）セルロース分解酵素のセルロース結合ドメイ
    ンを含むポリペプチド鎖からなる融合タンパク質。
18. 【請求項１８】 セルロース分解酵素が、キシラナーゼ
    である請求項１７記載の融合タンパク質。
19. 【請求項１９】 セルロース分解酵素が、クロストリジ
    ウム ステルコラリウム(Clostridium stercorarium)の
    産生するキシラナーゼＡである請求項１７記載の融合タ
    ンパク質。
20. 【請求項２０】 セルロース結合ドメインが、配列番号
    １または２に示したアミノ酸配列の連続した部分に対し
    て、少なくとも４０％の相同アミノ酸配列を含むポリペ
    プチド鎖である請求項１７記載の融合タンパク質。
21. 【請求項２１】 セルロース結合ドメインが、配列番号
    １または２に示したアミノ酸配列の連続した部分に対し
    て、少なくとも６０％の相同アミノ酸配列を含むポリペ
    プチド鎖である請求項１７記載の融合タンパク質。
22. 【請求項２２】 セルロース結合ドメインが、配列番号
    １または２に示したアミノ酸配列を含むポリペプチド鎖
    である請求項１７記載の融合タンパク質。
23. 【請求項２３】 （ａ）精製しようとするタンパク質、
    （ｂ）配列番号３に示したアミノ酸配列からなるリンカ
    ー、さらに（ｃ）セルロース分解酵素のセルロース結合
    ドメインを含み、さらに（ｄ）特異的プロテアーゼによ
    り該リンカー部分において切断される部位を含む融合タ
    ンパク質。
24. 【請求項２４】 特異的プロテアーゼが、トリプシンで
    ある請求項２３記載の融合タンパク質。
25. 【請求項２５】 請求項１７〜２４のいずれか１項記載
    の融合タンパク質をコードする組み換えＤＮＡ。
26. 【請求項２６】 請求項２５記載の融合タンパク質をコ
    ードする組み換えＤＮＡを含む組み換えベクター。
27. 【請求項２７】 請求項２６記載の組み換えベクターで
    形質転換された宿主細胞形質転換体。
28. 【請求項２８】 宿主細胞が大腸菌である請求項２７記
    載の宿主細胞形質転換体。
29. 【請求項２９】 タンパク質をコードする遺伝子および
    セルロース分解酵素のセルロース結合ドメインを含むポ
    リペプチド鎖をコードする遺伝子をベクターに挿入し、
    該ベクターで宿主細胞を形質転換し、該宿主細胞を培養
    し、該宿主細胞中で、タンパク質およびセルロース分解
    酵素のセルロース結合ドメインを含むポリペプチド鎖の
    融合タンパク質を発現させ、該宿主細胞中から該融合タ
    ンパク質を採取することを特徴とする融合タンパク質製
    造方法。
30. 【請求項３０】 さらに、タンパク質およびセルロース
    分解酵素のセルロース結合ドメインを含むポリペプチド
    鎖との融合タンパク質を含む宿主細胞抽出液をセルロー
    ス担体に作用させることにより、該融合タンパク質を担
    体に吸着させ、次いで糖類を作用させて、該担体から融
    合タンパク質を溶出する請求項２９記載の融合タンパク
    質製造方法。
31. 【請求項３１】 セルロース分解酵素が、キシラナーゼ
    である請求項２９記載の融合タンパク質製造方法。
32. 【請求項３２】 セルロース分解酵素が、クロストリジ
    ウム ステルコラリウム(Clostridium stercorarium)の
    産生するキシラナーゼＡである請求項２９記載の融合タ
    ンパク質製造方法。
33. 【請求項３３】 セルロース結合ドメインが、配列番号
    １または２に示したアミノ酸配列の連続した部分に対し
    て、少なくとも４０％の相同アミノ酸配列を含むポリペ
    プチド鎖である請求項２９記載の融合タンパク質製造方
    法。
34. 【請求項３４】 セルロース結合ドメインが、配列番号
    １または２に示したアミノ酸配列の連続した部分に対し
    て、少なくとも６０％の相同アミノ酸配列を含むポリペ
    プチド鎖である請求項２９記載の融合タンパク質製造方
    法。
35. 【請求項３５】 セルロース結合ドメインが、配列番号
    １または２に示したアミノ酸配列のいずれかを含むポリ
    ペプチド鎖である請求項２９記載の融合タンパク質製造
    方法。
36. 【請求項３６】 酵素、抗体又はホルモンである請求項
    ２９記載の融合タンパク質製造方法。
37. 【請求項３７】 セルロース担体が、不溶性セルロース
    である請求項３０記載の融合タンパク質製造方法。
38. 【請求項３８】 不溶性セルロースが、非結晶性セルロ
    ースである請求項３８記載の融合タンパク質製造方法。
39. 【請求項３９】 糖類がセロビオース、マルトース、グ
    ルコースまたはキシロースである請求項２９記載の融合
    タンパク質製造方法。
40. 【請求項４０】 糖類がセロビオースである請求項２９
    記載の融合タンパク質製造方法。
41. 【請求項４１】 セロビオースの濃度が、１〜１０％の
    範囲で使用される請求項２９記載の融合タンパク質製造
    方法。
42. 【請求項４２】 融合タンパク質が、（ａ）製造しよう
    とするタンパク質、（ｂ）配列番号３に示したアミノ酸
    配列からなるリンカー、さらに（ｃ）セルロース分解酵
    素のセルロース結合ドメインを含み、さらに（ｄ）特異
    的プロテアーゼにより該リンカー部分において切断され
    る部位を含む請求項２９記載の融合タンパク質製造方
    法。
43. 【請求項４３】 請求項４２記載の溶出した融合タンパ
    ク質を、さらに、特異的プロテアーゼで処理することに
    より、該融合タンパク質からセルロース結合ドメインを
    含むポリペプチド鎖を分離して、タンパク質のみを回収
    することを特徴とするタンパク質製造方法。
44. 【請求項４４】 特異的プロテアーゼが、トリプシンで
    ある請求項４３記載のタンパク質製造方法。