JPH11225768A - 超耐熱性β−グリコシダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 超耐熱性β−グリコシダーゼを提供するこ
と。 【解決手段】 超好熱性始原菌KOD-1株から超耐熱性β
−グリコシダーゼをコードするDNAを単離し、このDNAを
用いて超耐熱性β−グリコシダーゼ生産宿主細胞を得、
そしてこの宿主細胞を培養する工程を包含する方法によ
り、超耐熱性β−グリコシダーゼを生産する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、超耐熱性β−グリ
コシダーゼおよびそれをコードするDNAに関する。

【０００２】

【従来の技術】β−グリコシダーゼは、β−グリコシド
結合を加水分解する酵素群の総称である。β−グリコシ
ダーゼには例えば、β−グルコシダーゼ、β−ガラクト
シダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−フルクトシダーゼ
などが含まれる。

【０００３】β−グリコシダーゼの一種であるβ−ガラ
クトシダーゼは、β-D-ガラクトシドを加水分解してD-
ガラクトースを生成する酵素である。β−ガラクトシダ
ーゼのラクトース（グルコース-β-D-ガラクトシド）を
グルコースとガラクトースとに分解する能力は、牛乳中
のラクトースを処理して低ラクトース乳を生産するため
に利用されている。この目的のためには、酵素を牛乳中
に添加する方法に加えて、固定化酵素の利用も検討され
ている。一般に、固定化酵素として利用される酵素は、
使用される反応条件（pH、温度など）において高い活性
を示し、そして構造的に安定性であることが好ましい。

【０００４】β−ガラクトシダーゼは、動物、植物およ
び微生物を含む、多様な生物中に広範に存在する。代表
的なβ−ガラクトシダーゼとしては、Escherichia coli
由来のβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。E. coliの
β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子はlacZと称
し、このlacZ遺伝子を含むラクトースオペロンの発現制
御機構は古くから解析されている。その遺伝子産物の検
出が容易であることなどから、lacZ遺伝子はまた、遺伝
子の発現制御機構を研究するための指標となるレポータ
ー遺伝子として、そしてクローニングベクターにフラグ
メントが挿入されたか否かを示すためのマーカー遺伝子
として利用されている。

【０００５】しかし、E. coliは常温で生育する微生物
であるので、E. coli由来のβ−ガラクトシダーゼは、
超好熱始原菌のような高温で生育する生物中では失活し
てしまう。従って、高温で生育する生物における利用の
ためには、より耐熱性の酵素をコードする遺伝子の利用
が好ましい。

【０００６】超好熱始原菌は、高温で生存するので、こ
の微生物が生産するタンパク質（例えば、酵素）は、一
般に高度に耐熱性である（すなわち、構造的に安定であ
る）。さらに、超好熱始原菌が属する始原菌は従来から
知られていた原核生物および真核生物とは異なる生物で
あると提唱されていることからも明らかなように、進化
的にもこれらの生物とは異なる。従って、たとえ原核生
物および真核生物に由来する公知の酵素などと類似の機
能を有していても、超好熱始原菌由来の酵素は、構造的
にも酵素学的にも従来の酵素とは異なる場合が多い。例
えば、超好熱始原菌KOD-1株（Morikawa, M.ら、Appl. E
nviron. Microbiol. 60(12), 4559-4566(1994)）から単
離されたシャペロニンは、Escherichia coli由来のGroE
Lと同様の機能を有している。しかし、GroELがこれ自体
が14量体を形成し、さらに７量体を形成しているGroES
とともに複合体を形成して機能するのに対し、KOD-1株
由来のシャペロニンは単独で機能する（Yan, Zら、App
l. Environ. Microbiol. 63:785-789）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、超耐熱性β
−グリコシダーゼおよびそれをコードするDNAを提供す
ること、このDNAを含むベクターおよびこのベクターを
含む宿主細胞を提供すること、ならびにこの宿主細胞を
培養する工程を包含する超耐熱性β−グリコシダーゼの
生産方法を提供することをその目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明によれば、配列番
号２のアミノ酸配列を含む超耐熱性β−グリコシダー
ゼ、または配列番号２のアミノ酸配列において１もしく
は数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミ
ノ酸を含みかつβ−グリコシダーゼ活性を有するその改
変体が提供される。

【０００９】１つの実施態様において、前記超耐熱性β
−グリコシダーゼまたはその改変体は、超好熱始原菌KO
D-1株に由来する。

【００１０】本発明によれば、前記超耐熱性β−グリコ
シダーゼまたはその改変体をコードするDNAが提供され
る。

【００１１】１つの実施態様において、前記DNAは、配
列番号１の325位〜1773位のヌクレオチド配列を含む。

【００１２】１つの実施態様において、前記DNAは、超
好熱始原菌KOD-1株に由来する。

【００１３】本発明によれば、前記のDNAを含むベクタ
ーが提供される。

【００１４】本発明によれば、前記のベクターを含む組
換え宿主細胞が提供される。

【００１５】本発明によれば、前記の宿主細胞を培養す
る工程を包含する、超耐熱性β−グリコシダーゼまたは
その改変体の生産方法が提供される。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明は、超好熱始原菌が産生す
る超耐熱性β−グリコシダーゼを、本来この酵素を生産
する超好熱始原菌を培養することにより、またはこの酵
素をコードするDNAを単離し、このDNAを含むベクターを
構築し、このベクターを含む宿主細胞を作製し、そして
この宿主細胞培養することによって超耐熱性β−グリコ
シダーゼを産生する方法に関する。

【００１７】β−グリコシダーゼは、β−グリコシド結
合を加水分解する酵素群の総称である。β−グリコシダ
ーゼには例えば、β−グルコシダーゼ、β−ガラクトシ
ダーゼ、β−マンノシダーゼ、β−フルクトシダーゼな
どが含まれる。

【００１８】β−ガラクトシダーゼは、β-D-ガラクト
シドを加水分解してD-ガラクトースを生成する酵素であ
り、系統名β-D-ガラクトシドガラクトヒドロラーゼを
有する。本発明のβ−グリコシダーゼは、β−ガラクト
シダーゼ活性に加えて、β−グルコシダーゼ、β−マン
ノシダーゼおよび／またはβ−キシロシダーゼ活性を有
し得る。本発明のβ−グリコシダーゼは、オリゴ糖を加
水分解する活性に加えて転移活性を有し得る。

【００１９】本発明のβ−グリコシダーゼの至適温度は
好ましくは約75℃〜125℃であり、より好ましくは約90
℃〜約110℃であり、最も好ましくは約100℃である。本
発明のβ−グリコシダーゼの100℃における半減期は、
好ましくは約15分より長く、より好ましくは約30分より
長く、最も好ましくは約１時間である。本発明のβ−グ
リコシダーゼの至適pHは好ましくは約5.0〜約8.0であ
り、より好ましくは約6.0〜約7.0であり、最も好ましく
は約6.5である。

【００２０】本発明において使用される超好熱始原菌
は、90℃以上で生育する微生物であると定義される。好
ましくは超好熱始原菌は、超耐熱β−グリコシダーゼを
産生する、本発明者らが単離した耐熱性チオールプロテ
アーゼ産生菌KOD-1株（Appl. Environ. Microbiol. 60
(12), 4559-4566(1994)）である。KOD-1株は工業技術院
生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託番
号はFERM P-15007号である。なお、このKOD-1株は、上
記文献に記載されているように、分離された当初Pyroco
ccus属に分類されていた。しかし、DNASIS（日立ソフト
ウェアーエンジニアリング社製）に入力されているGenB
ank R91.0 October, 1995＋Daily Updateの登録データ
を用いた16S rRNAの配列の比較を実施したところ、KOD-
1株はPyrococcus属よりはむしろThermococcus属に近縁
であることが示唆されている。

【００２１】本来の本発明の超耐熱性β−グリコシダー
ゼを生産する超好熱始原菌の培養は、例えばAppl. Envi
ron. Microbiol. 60(12), 4559-4566(1994)（前出）に
記載の培養条件下で実施し得る。培養は、静置培養また
は窒素ガスによる通気撹拌培養のいずれかであり得、そ
して連続的または回分的のいずれかであり得る。

【００２２】組換え宿主細胞を培養する条件は、使用さ
れる宿主細胞の種類に依存して適切に選択される。宿主
細胞としては、組換えDNA技術において使用可能な任意
の宿主細胞が使用され得る。これらは例えば、細菌細
胞、酵母細胞、動物細胞、植物細胞および昆虫細胞など
を包含する。好ましい宿主細胞は細菌細胞である。

【００２３】培養後、得られる培養物から当該分野に公
知の方法により本発明の超耐熱性β−グリコシダーゼを
精製し得る。発現産物が細胞外に分泌される場合は、例
えば培養物を遠心分離またはろ過することによって上清
を得、これを直接精製するかあるいは沈澱法または限外
ろ過などにより濃縮してから精製する。発現産物が細胞
中に蓄積される場合は、細胞を、細胞壁溶解酵素、浸透
圧の変化、ガラスビーズ、ホモジナイザーまたは超音波
処理などを用いて破壊して細胞抽出物を得、これを精製
する。精製は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ
過、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動など
の当該分野で公知の方法を組み合わせて実施され得る。

【００２４】超耐熱性β−グリコシダーゼをコードする
DNAは、例えば、超好熱始原菌から染色体DNAを単離し、
この染色体DNAを含むライブラリーを作製し、このライ
ブラリーをスクリーニングすることにより取得され得
る。

【００２５】超好熱始原菌の染色体DNAは、培養された
細菌細胞を、界面活性剤（例えば、N-ラウリルサルコシ
ン）などを用いて溶解し、得られた溶解物を塩化セシウ
ムエチジウムブロミド平衡密度勾配超遠心分離法などに
より分画して得ることができる（例えば、Imanakaら、
J. Bacteriol. 147:776-786 (1981)を参照のこと）。ラ
イブラリーは、得られた染色体DNAを各種制限酵素で切
断した後、同一の制限酵素または共通の切断末端を与え
る制限酵素で切断したベクター（ファージまたはプラス
ミドなどのような）にT4 DNAリガーゼなどを用いて連結
することにより得ることができる。

【００２６】ライブラリーのスクリーニングは、このラ
イブラリーから目的の超耐熱性β−グリコシダーゼをコ
ードするDNAを含むベクターを選択することにより行う
い得る。選択は、例えば、予め決定された超耐熱性β−
グリコシダーゼの部分アミノ酸配列に基づいて設計され
たオリゴヌクレオチド、目的のDNAと相同性を有すると
推測されるクローン化DNAなどをプローブとして用いて
実施され得る。あるいは、選択は、目的の酵素を発現さ
せることにより実施され得る。例えば、発現の検出は、
目的の酵素の活性が容易に検出され得る場合は、プレー
トに加えられた基質に対する発現産物の活性を検出する
ことにより、または目的の酵素に対する抗体が利用可能
である場合は、発現産物と抗体との反応性を利用して実
施され得る。

【００２７】得られたクローン化DNAの解析は、例えば
選択されたDNAを単離し、この制限地図を作製するこ
と、およびヌクレオチド配列を決定することなどにより
実施され得る。クローン化DNAの調製、制限酵素処理、
サブクローニング、ヌクレオチド配列の決定などの技術
は当該分野において周知であり、例えば、「Molecular
Cloning: A Laboratory Manual第２版」（Sambrook, Fr
itschおよびManiatis編, Cold Spring Laboratory Harb
or Press, 1989）に記載されている。

【００２８】次いで、得られたクローン化DNAを、使用
される宿主細胞に適合性の発現ベクター中に作動可能に
挿入し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、形
質転換された宿主細胞を培養することにより、超耐熱性
β−グリコシダーゼを発現させ得る。

【００２９】本明細書中以下で、本発明を実施例により
詳細に説明する。しかし、本発明はこれらの実施例によ
り限定されない。

【００３０】

【実施例】（実施例１：超耐熱性β−グリコシダーゼを
コードするDNAの単離） 1.1. PCR 1.1.1. KOD-1株の染色体DNAの調製 KOD-1株を、Appl. Environ. Microbiol. 60(12), 4559-
4566(1994)に記載の0.5×2216マリンブロース培地（221
6マリンブロース：18.7g/L、PIPES 3.48g/L、CaCl₂・H₂O
0.725g/L、0.4 mL 0.2%レザズリン、475mL人工海水（N
aCl 28.16 g/L、KCl 0.7 g/L、MgCl₂・6H₂O 5.5 g/L、Mg
SO₄・7H₂O 6.9 g/L）、蒸留水500 mL、pH7.0）1,000mlに
接種して、２リットルの発酵槽を用いて培養した。培養
に際しては、発酵槽内を窒素ガスで置換し、同ガスで内
圧を0.1Kg/cm²に維持した。培養は、温度85±１℃にて1
4時間実施した。なお、培養は静置培養で実施し、培養
中窒素ガスの通気および撹拌は行わなかった。培養終了
後、培養液（約1,000ml）を10,000rpmで10分間遠心分離
することにより菌体を回収した。

【００３１】得られた菌体１gを10mlのＡ溶液（50mM Tr
is-HCl、50mM EDTA、pH8.0）に懸濁し、遠心分離（8,00
0rpm、５分間、４℃）により集菌後、３mlの15％ショ糖
を含むＡ溶液に懸濁し、37℃にて30分間保温後、１％Ｎ
-ラウリルサルコシンを含むＡ溶液３mlを添加した。こ
の液にさらに5.4gの塩化セシウムおよび10mg/mlの臭化
エチジウム溶液300μlを添加し、55,000rpm、16時間、1
8℃にて超遠心分離を行い、染色体DNAを分画した。得ら
れた染色体DNA画分からｎ-ブタノール抽出により臭化エ
チジウムを除去後、TE溶液（10mM Tris-HCl（pH8.0）、
0.1mM EDTA）に対して一夜透析し、染色体DNAを得た。

【００３２】1.1.2. PCR 糖加水分解ファミリー１に属する種々の酵素のアミノ酸
配列間で高度に保存された２つの領域のアミノ酸配列を
選択した（Voorhorst,W.G.B.ら、J.Bacteriol., 117, 7
105-7111 (1995)；およびMoracci,M.ら、Protein Engin
eering, 9, 1191-1195 (1996)を参照のこと）。

【００３３】選択したアミノ酸に基づいて２つのプライ
マーを設計し、そして合成した。

【００３４】PCRは、上記で調製した染色体DNA１μg、
各プライマー20 pmolおよびKODポリメラーゼ（東洋紡績
株式会社）を含む100μlの反応液中で、98℃で15秒、55
℃で15秒および74℃で60秒を１サイクルならびに98℃で
60秒、55℃で30秒および74℃で60秒を29サイクルの反応
条件で実施した。

【００３５】生じた約１kbのPCR産物をサブクローニン
グし、そのヌクレオチド配列を決定したところ、このDN
Aが上記の公知の糖加水分解ファミリー１に属する種々
の酵素のアミノ酸配列に相同なアミノ酸を有するポリペ
プチドをコードすることが見出された（データは示さ
ず）。このPCR産物のフラグメントを以下の実験におい
てプローブとして使用した。

【００３６】1.2. 染色体ライブラリーのスクリーニン
グ 上記1.1において調製した染色体DNAを制限酵素EcoRIで
部分消化し、次いでT4DNAリガーゼを用いてファージベ
クターλEMBL4（Stratagene）と連結した。この連結混
合物をMax Plax^TM Packaging Extract（EPICENTRE TEC
HNOLOGIES）を用いてパッケージングした。

【００３７】このファージライブラリーの1.1×10⁹ pfu
をEscherichia coli XL1-Blue MRA(P2)株に感染させ、
出現したプラークを上記PCRフラグメントをプローブと
して使用して常法によりスクリーニングした（「Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual第２版」Sambrook,
FritschおよびManiatis編, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, 1989）。ポジティブクローン中の約15 kb
のEcoRIフラグメントを、各種制限酵素での消化および
上記プローブを用いるサザンブロッティングによって解
析することにより、β−グリコシダーゼ遺伝子の位置を
限定した。

【００３８】1.3. 配列の解析 上記1.2で限定された８kb EcoRIフラグメントのヌクレ
オチド配列を決定したとろ、上記PCRクローンの配列を
含む1452 bpのオープンリーディングフレームが見出さ
れた。この配列を配列番号１に示す。

【００３９】このオープンリーディングフレームは483
アミノ酸（配列番号２）からなるポリペプチドをコード
しており、その遺伝子産物の分子量は56.2 kDaであると
推定された。

【００４０】オープンリーディングフレームの上流には
転写開始に関与すると考えられるTATAボックス様配列
（配列番号１の122〜128位）および翻訳開始に関与する
と考えられるリボソーム結合部位（配列番号１の315〜3
18位）が見出された。

【００４１】次いで、この推定アミノ酸配列をBLASTプ
ログラムを使用してSwiss PlotおよびPIRデータベース
に登録されている公知のタンパク質のアミノ酸配列と比
較した。この結果、各種の糖加水分解酵素のアミノ酸配
列との相同性が示された。図１は、本発明のβ−グリコ
シダーゼのアミノ酸配列と各種酵素のアミノ酸配列との
アラインメントおよび相同性から推定されたそれらの酵
素の進化的関係を示す系統樹である。ここで、図中＊で
示すアミノ酸残基は、これらの酵素において保存されて
いる活性部位のGluを示す（配列番号２の398位に相当す
る）。また、β-gal/KOD1、β-mann/Pfu、β-glu/Pfu、
β-gal/Sso1、β-glu/Thema、pβ-gal/Llac、pβgal/Ba
csu、pβgal/Ecol、およびtβgal/Branaはそれぞれ、KO
D1株由来のβ−グリコシダーゼ、Pyrococcus furiosus
由来のβ−マンノシダーゼ、Pyrococcus furiosus由来
のβ−グルコシダーゼ、Sulfolobus solfataricus由来
のβ−ガラクトシダーゼ、Thermotoga maritina由来の
β−グルコシダーゼ、Lactococcus lactis由来の６−ホ
スホ−β−ガラクトシダーゼ、Bacillus subtilis由来
の６−ホスホ−β−ガラクトシダーゼ、Escherichia co
li由来の６−ホスホ−β−ガラクトシダーゼ、およびBr
assica napus由来のチオグルコシダーゼを示す。この結
果、本発明のβ−グリコシダーゼは超好熱始原菌由来の
４種類の酵素との相同性が特に高いことが示された。

【００４２】（実施例２：β−グリコシダーゼ遺伝子の
発現および酵素化学的性質の検討）実施例１で得られた
β−グリコシダーゼをEscherichia coli内で発現させる
ために、β−グリコシダーゼ遺伝子のオープンリーディ
ングフレーム全体を含むNdeI−EcoRI 1.4kbフラグメン
ト（鋳型としてKOD-1株染色体DNAを使用し、NdeI部位を
含むセンスプライマーおよびEcoRI部位を含むアンチセ
ンスプライマーを使用するPCRにより得た）をプラスミ
ドpET21a(+)（Novagen）に挿入してpET21a/β-galを構
築した（図２）。このプラスミドを用いてEscherichia
coli BL21(DE3)株を形質転換した。

【００４３】出現したアンピシリン耐性形質転換体をア
ンピシリン（50μg/ml）を含有するNZCYM培地（１％NZ
アミン、0.5％ NaCl、0.5％イーストエキス、0.1％カザ
ミノ酸、0.2％MgSO₄・7H₂O（pH7））に接種し、37℃でO
D₆₆₀が0.5になるまで培養し、次いでイソプロピル-β-D
-チオガラクトピラノシド（IPTG、0.1 mM）を添加し、
さらに37℃で培養を継続した。培養終了後、細胞を遠心
分離により回収し、超音波処理により破砕し、これを再
度遠心分離することにより可溶性画分を回収し、次いで
85℃30分間熱処理した。熱安定性可溶性画分を遠心分離
することにより得られた試料を濃縮した後、これをドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
（SDS-PAGE）に供したところ、予想された約56 kDaのバ
ンドが検出され、このバンドはIPTGの誘導後の時間とと
もに増加した（図３）。

【００４４】上記の熱処理した試料を使用して本発明の
β−グリコシダーゼの酵素化学的性質を検討した。酵素
活性の測定方法については、Pisani,F.M.ら、Eur. J. B
iochem., 187, 321-328 (1990)を参照のこと。１分間当
たり１μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素活
性を１Ｕとした。

【００４５】本発明のβ−グリコシダーゼの至適pHを調
べた。反応は、酵素1.5μg/mlを含む各種緩衝液中で2.8
mM pNp-β-グルコピラノシドを基質として75℃で実施
した。使用した緩衝液はリン酸ナトリウム緩衝液（pH６
〜８）、クエン酸緩衝液（pH４〜６）、ホウ酸緩衝液
（pH８〜９）、グリシン緩衝液（pH 8.5〜10）であっ
た。結果を図４に示す。この結果は、本発明のβ−グリ
コシダーゼが約6.5に至適pHを有することを示す。

【００４６】本発明のβ−グリコシダーゼの至適温度を
調べた。反応は、酵素1.5μg/mlを含む50 mMリン酸ナト
リウム緩衝液（pH 6.5）中で2.8 mM pNp-β-グルコピラ
ノシドを基質として各種温度で実施した。結果を図５に
示す。この結果は、本発明のβ−グリコシダーゼが約10
0℃に至適温度を有することを示す。また、この結果を
用いて、アレニウスプロットを実施した（図６）。この
図は、75℃（1/T^*10^-3＝2.87）の付近で直線の傾きが変
化していることを示す。式ｋ＝Ａｅ^-E/RT（ここで、ｋ
は反応速度定数、Ｅは活性化エネルギー、Ｒは気体定
数、Ｔは絶対温度、Ａは頻度因子である）にこの結果を
当てはめると、25〜75℃の範囲ではＥ＝53.4 kJ/molで
あり、そして75〜100℃の範囲ではＥ＝17.7 kJ/molであ
ると算出された。

【００４７】本発明のβ−グリコシダーゼの熱安定性を
調べた。上記試料を90℃または100℃で各種時間インキ
ュベートした後、酵素活性を、酵素1.5μg/mlを含む50
mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）中で2.8 mM pNp-
β-グルコピラノシドを基質として80℃で測定した。結
果を図７に示す。この結果は、本発明のβ−グリコシダ
ーゼが、90℃および100℃において、それぞれ約18時間
および約１時間を有することを示す。同様の実験を110
℃において実施したところ、この酵素は約15分間で失活
した。

【００４８】本発明のβ−グリコシダーゼの基質特異性
を調べた。2.8 mMの各種基質に対する活性を、酵素1.5
μg/mlを含む50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.5）
中で80℃で測定した。結果を表１に示す。

【００４９】

【表１】

【００５０】この結果は、本発明のβ−グリコシダーゼ
が、高いβ-グルコシダーゼ活性を有し、そしてβ-マン
ノシダーゼ、β−グルコシダーゼおよびβ-キシロシダ
ーゼ活性も有することを示す。これら４つの酵素として
の反応速度定数を、3.0μg/mlの酵素の、0.28 mM〜5.6
mMの濃度の基質に対する活性を測定して得た。結果を表
２に示す。

【００５１】

【表２】

【００５２】基質としての各々２mMのオリゴ糖（β−ラ
クトース（レーン１）、セロビオース（レーン２）、セ
ロトリオース（レーン３）、セロテトラオース（レーン
４）およびセロペンタオース（レーン５））ならびに酵
素1.5μg/mlを含む50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH
6.5）を、80℃で７時間インキュベートした。次いでこ
の反応液を薄層クロマトグラフィー（TLC）にかけた。
結果を図８に示す。β−ラクトース（レーン１）以外の
レーンには、グルコースのスポットが観察された（Ｇ
１）。４糖であるセロテトラオースは３糖および１糖に
（レーン４）そして５糖であるセロペンタオースは４糖
および１糖に（レーン５）それぞれ分解された。この結
果は本発明のβ−グリコシダーゼがエキソ型の加水分解
活性を有することを示す。

【００５３】各々５mMのセロビオース（レーン１）、セ
ロトリオース（レーン２）、セロテトラオース（レーン
３）およびセロペンタオース（レーン４）ならびに酵素
３μg/mlを含む50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH 6.
5）を、80℃で４時間インキュベートした。また同様の
反応系においてセロテトラオースを０、１、２、４およ
び７時間（それぞれ、レーン５、６、７、８および９）
インキュベートした。次いでこの反応液を薄層クロマト
グラフィー（TLC）にかけた。結果を図９に示す。セロ
ビオース（レーン１）、セロトリオース（レーン２）、
セロテトラオース（レーン３および５〜９）ならびにセ
ロペンタオース（レーン４）はそれぞれ２糖、３糖、４
糖および５糖であるが（図中それぞれＧ２、Ｇ３、Ｇ４
およびＧ５に相当する）、基質としてのこれらの糖より
大きなスポットが反応後に観察された（例えば、レーン
２のＧ４の位置のスポットならびにレーン３および５〜
９のＧ５の位置のスポットを参照のこと）。この結果
は、本発明のβ−グリコシダーゼがエキソ型の糖分解活
性に加えて糖転移活性も有することを示す（ただし、こ
の反応条件においては、反応時間とともにグルコース
（Ｇ１）およびセロビオース（Ｇ２）が増加し（レーン
５〜９）、このことは、この条件下では転移反応よりも
加水分解が経時的に進行したことを示す）。すなわち、
本発明のβ−グリコシダーゼは、セロビオースがマンノ
ースにβ−結合したオリゴ糖など、任意の組み合わせの
β−結合を有するオリゴ糖の合成に応用され得る。

【００５４】

【発明の効果】本発明により、超耐熱性β−グリコシダ
ーゼおよびそれをコードするDNAが提供される。また、
本発明により、このDNAを含むベクターおよびこのベク
ターを含む宿主細胞が提供される。さらに、本発明によ
り、この宿主細胞を培養する工程を包含する超耐熱性β
−グリコシダーゼの生産方法が提供される。

【００５５】

【配列表】

【００５６】

【配列番号１】 配列の長さ：1828 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 株名：KOD-1（受託番号FERM P-15007） 配列 CGGCAGGCTC TCTGCGGCCA GACCGTACCC AGCCTCGAAG AGGCCGAGAA TGAAAATCGC 60 CACAAGGGCA ACCGCGGTAG CTTTCTTCAT GGACACCACC ACTTATAAGG TTGGTCAATT 120 TTATATTTTT GGACATCTAT ATAAACTTAT CTATTTTTGG GCATCTTAGC AATTATGTGG 180 ACAAAGCGCC AAGAAGTGGA GGGACGCCCA CTATGAGCAT TGCAATACTG ATCCGTCCAG 240 AAATACCAAG AGCTGTCAGA TCCTACATAT TGCGGTTACG AAAATTATAA AAGATGCCAT 300 GATTATAACC ATTCAGGTGG AAGT ATG AGG GAG TTT GCA TGG GGC GTT GTC 351 Met Arg Glu Phe Ala Trp Gly Val Val 1 5 CAG TCG GCG TTT CAG TTT GAG ATG GGA GAT CCA TTG AGG AGG TTT ATA 399 Gln Ser Ala Phe Gln Phe Glu Met Gly Asp Pro Leu Arg Arg Phe Ile 10 15 20 25 GAC ACT CGG ACG GAC TGG TGG CAC TGG GTC CGC GAT CCG CTC AAC ATA 447 Asp Thr Arg Thr Asp Trp Trp His Trp Val Arg Asp Pro Leu Asn Ile 30 35 40 AAG AAC GAC CTC GTG AGC GGG CAC CTG CCC GAG GAC GGC ATA AAC AAC 495 Lys Asn Asp Leu Val Ser Gly His Leu Pro Glu Asp Gly Ile Asn Asn 45 50 55 TAC GGC CTC TAT GAG ATA GAC CAT CAG CTT GCA AAG GAT ATG GGA CTG 543 Tyr Gly Leu Tyr Glu Ile Asp His Gln Leu Ala Lys Asp Met Gly Leu 60 65 70 AAC GCC TAT CAG ATA ACG GTT GAG TGG AGC AGA ATC TTT CCG TGT CCG 591 Asn Ala Tyr Gln Ile Thr Val Glu Trp Ser Arg Ile Phe Pro Cys Pro 75 80 85 ACT TAT GGA GTT GAA GTG GAC TTC GAG AGG GAC TCA TAC GGA CTC ATA 639 Thr Tyr Gly Val Glu Val Asp Phe Glu Arg Asp Ser Tyr Gly Leu Ile 90 95 100 105 AAA AGA GTG AAG ATC ACA AAG GAA ACC CTC CAC GAG CTT GAG GAA ATC 687 Lys Arg Val Lys Ile Thr Lys Glu Thr Leu His Glu Leu Glu Glu Ile 110 115 120 GCG AAC GCA AAG GAA GTC GAG CAC TAC AGA GAG GTT CTC AAA AAC CTA 735 Ala Asn Ala Lys Glu Val Glu His Tyr Arg Glu Val Leu Lys Asn Leu 125 130 135 AAG GAA CTC GGC TTT TCA ACT TTC GTA ACC CTA AAC CAC CAG ACG CAG 783 Lys Glu Leu Gly Phe Ser Thr Phe Val Thr Leu Asn His Gln Thr Gln 140 145 150 CCG ATA TGG CTC CAC GAT CCA ATC CAT GTG AGG GAA AAC TTT GAA AAA 831 Pro Ile Trp Leu His Asp Pro Ile His Val Arg Glu Asn Phe Glu Lys 155 160 165 GCA AGG GCT AAG GGG TGG GTC GAC GAG AGG GCC ATC CTT GAG TTC GCC 879 Ala Arg Ala Lys Gly Trp Val Asp Glu Arg Ala Ile Leu Glu Phe Ala 170 175 180 185 AAG TTC GCC GCT TTT GTT GCC TGG AAG CGT TGG GAT CTA GTC GAC TAC 927 Lys Phe Ala Ala Phe Val Ala Trp Lys Arg Trp Asp Leu Val Asp Tyr 190 195 200 TGG GCA ACC TTC GAC GAG CCA ATG GTT ACC GTT GAG CTT GGC TAC CTC 975 Trp Ala Thr Phe Asp Glu Pro Met Val Thr Val Glu Leu Gly Tyr Leu 205 210 215 GCT CCC TAC GTC GGA TGG CCG CCG GGG ATA CTT AAC CCG AAG GCA GCT 1023 Ala Pro Tyr Val Gly Trp Pro Pro Gly Ile Leu Asn Pro Lys Ala Ala 220 225 230 AAA GCA GTT ATC ATC AAC CAG CTC GTT GGA CAC GCA AGG GCC TAC GAG 1071 Lys Ala Val Ile Ile Asn Gln Leu Val Gly His Ala Arg Ala Tyr Glu 235 240 245 GCA GTT AAA ACC TTC TCA GAC AAG CCC GTC GGA ATA ATA CTC AAC ATA 1119 Ala Val Lys Thr Phe Ser Asp Lys Pro Val Gly Ile Ile Leu Asn Ile 250 255 260 265 ATC CCC GCT TAC CCC CGC GAC CCC AAC GAC CCT AAG GAC GTT AAG GCA 1167 Ile Pro Ala Tyr Pro Arg Asp Pro Asn Asp Pro Lys Asp Val Lys Ala 270 275 280 ACG GAG AAC TAC GAT CTC TTC CAC AAC AGG ATA TTC CTC GAT GGA GTC 1215 Thr Glu Asn Tyr Asp Leu Phe His Asn Arg Ile Phe Leu Asp Gly Val 285 290 295 AAC GAA GGG AAG GTT GAT CTT GAT TTC GAT GGG AAC TAT GTC AAA ATC 1263 Asn Glu Gly Lys Val Asp Leu Asp Phe Asp Gly Asn Tyr Val Lys Ile 300 305 310 GAT CAC TTG AAG AGA AAC GAC TGG ATC GGC AAC AAC TAC TAC ACC AGG 1311 Asp His Leu Lys Arg Asn Asp Trp Ile Gly Asn Asn Tyr Tyr Thr Arg 315 320 325 GAG GTC ATT AGT ACA CGG AAC CCA AAT ACG AGG AGC TCG GAT AAT AAA 1359 Glu Val Ile Ser Thr Arg Asn Pro Asn Thr Arg Ser Ser Asp Asn Lys 330 335 340 345 CTT CGT GGG GAC GAA GGG TAC GGT TAC TCC TCG GAG CCT AAC AGC GTC 1407 Leu Arg Gly Asp Glu Gly Tyr Gly Tyr Ser Ser Glu Pro Asn Ser Val 350 355 360 TCG AAG GAC AAC AAC CCC ACG AGC GAC TTT GGC TGG GAG TGC TTC CCG 1455 Ser Lys Asp Asn Asn Pro Thr Ser Asp Phe Gly Trp Glu Cys Phe Pro 365 370 375 CAA GGA ATG TAC GAT TCG ATA ATG ATA GGA AAC GAA TAC AGG AAG CCG 1503 Gln Gly Met Tyr Asp Ser Ile Met Ile Gly Asn Glu Tyr Arg Lys Pro 380 385 390 ATA TAC ATA ACG GAG AAC GGC ATA GCC GAT TCG AGA GAT CTC CTA AGG 1551 Ile Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Ile Ala Asp Ser Arg Asp Leu Leu Arg 395 400 405 CCG AGA TAT ATA AAG GAG CAT GTG GAG AAG ATG TTC GAA GCA ATT CAG 1599 Pro Arg Tyr Ile Lys Glu His Val Glu Lys Met Phe Glu Ala Ile Gln 410 415 420 GCT GGG GCC GAT GTG AGG GGA TAC TTC CAC TGG GCC CTG ACC GAC AAC 1647 Ala Gly Ala Asp Val Arg Gly Tyr Phe His Trp Ala Leu Thr Asp Asn 430 435 440 TAC GAG TGG GCA ATG GGT TTT AAA ATC AAG TTC GGC CTC TAT GAG GTT 1695 Tyr Glu Trp Ala Met Gly Phe Lys Ile Lys Phe Gly Leu Tyr Glu Val 445 450 455 GAT CCA ATA AGC AAG CAG AGA ATA CCC CGC CCC AGA AGC GTG GAA ACA 1743 Asp Pro Ile Ser Lys Gln Arg Ile Pro Arg Pro Arg Ser Val Glu Thr 460 465 470 TAC AAA AAG ATA GTG CGG GAG GGA TTA CCT TGAAGACCAT CGCCGTTGAC 1793 Tyr Lys Lys Ile Val Arg Glu Gly Leu Pro 475 480 GAGAACACCT GGAAGAAGAT AAAGCTCCTG AAGGA 1828

【００５７】

【配列番号２】 配列の長さ：483 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ｍｅｔ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ １ ５
１０ １５ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｉｌｅ
Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｔｒｐ Ｔｒｐ ２０ ２５
３０ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｇｌｙ ３５ ４０
４５ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ａｓｎ
Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ ５０ ５５
６０ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｖａｌ ６５ ７０
７５ ８０ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ
Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｐ ８５
９０ ９５ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｉｌｅ
Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｌｙｓ １００ １０５
１１０ Ｇｌｕ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｉｌｅ
Ａｌａ Ａｓｎ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ １１５ １２０
１２５ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ｌｅｕ
Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ １３０ １３５
１４０ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ
Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ １４５ １５０
１５５ １６０ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｖａｌ １６５
１７０ １７５ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｖａｌ Ａｌａ １８０ １８５
１９０ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｔｙｒ
Ｔｒｐ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｐｒｏ １９５ ２００
２０５ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｌｅｕ
Ａｌａ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｐｒｏ ２１０ ２１５
２２０ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ａｌａ
Ｌｙｓ Ａｌａ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｇｌｎ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｇｌｕ
Ａｌａ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ ２４５
２５０ ２５５ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｉｌｅ
Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ａｓｐ ２６０ ２６５
２７０ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ａｌａ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｐｈｅ ２７５ ２８０
２８５ Ｈｉｓ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｖａｌ
Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｌｅｕ ２９０ ２９５
３００ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｉｌｅ
Ａｓｐ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｌｙｓ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｓｐ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ Ｔｒｐ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｔｙｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ
Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ ３２５
３３０ ３３５ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｓｎ Ｌｙｓ
Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｔｙｒ ３４０ ３４５
３５０ Ｇｌｙ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｔｈｒ ３５５ ３６０
３６５ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ
Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｍｅｔ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ｉｌｅ ３７０ ３７５
３８０ Ｍｅｔ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ ３８５ ３９０
３９５ ４００ Ｉｌｅ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｇｌｕ Ｈｉｓ ４０５
４１０ ４１５ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｎ
Ａｌａ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｙ ４２０ ４２５
４３０ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ａｓｎ
Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｌａ Ｍｅｔ Ｇｌｙ Ｐｈｅ ４３５ ４４０
４４５ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｕ Ｖａｌ
Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｇｌｎ Ａｒｇ ４５０ ４５５
４６０ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｔｈｒ
Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ａｒｇ Ｇｌｕ ４６５ ４７０
４７５ ４８０ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のβ−グリコシダーゼのアミノ酸配列と
各種酵素のアミノ酸配列とのアラインメントおよび相同
性から推定されたそれらの酵素の進化的関係を示す系統
樹である。

【図２】発現ベクターｐＥＴ２１ａ／β-galの構築を示
す図である。

【図３】E. coliにおける本発明のβ−グリコシダーゼ
の発現を示す図である。

【図４】本発明のβ−グリコシダーゼの至適pHを示す図
である。

【図５】本発明のβ−グリコシダーゼの至適温度を示す
図である。

【図６】本発明のβ−グリコシダーゼのアレニウスプロ
ットである。

【図７】本発明のβ−グリコシダーゼの熱安定性を示す
図である。

【図８】本発明のβ−グリコシダーゼのオリゴ糖に対す
る分解活性を示す図である。

【図９】本発明のβ−グリコシダーゼのオリゴ糖に対す
る転移活性を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 藤原 伸介 兵庫県西宮市田近野町３ 仁川合同宿舎６ −302 (72)発明者 高木 昌宏 大阪府吹田市青山台１−３ Ｃ58−207 (72)発明者 跡見 晴幸 京都府京都市上京区上御霊横道寺町西入上 御霊馬場町362−１ 上御霊アーバンライ フ502号

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列を含む超耐熱
   性β−グリコシダーゼ、または配列番号２のアミノ酸配
   列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もし
   くは付加されたアミノ酸を含みかつβ−グリコシダーゼ
   活性を有するその改変体。
2. 【請求項２】 超好熱始原菌KOD-1株に由来する、請求
   項１に記載の超耐熱性β−グリコシダーゼまたはその改
   変体。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の超耐熱性β−グリコシ
   ダーゼまたはその改変体をコードするDNA。
4. 【請求項４】 配列番号１の325位〜1773位のヌクレオ
   チド配列を含む、請求項３に記載のDNA。
5. 【請求項５】 超好熱始原菌KOD-1株に由来する、請求
   項３または４に記載のDNA。
6. 【請求項６】 請求項３〜５のいずれかに記載のDNAを
   含むベクター。
7. 【請求項７】 請求項６に記載のベクターを含む組換え
   宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の宿主細胞を培養する工
   程を包含する、超耐熱性β−グリコシダーゼまたはその
   改変体の生産方法。