JPH11225770A

JPH11225770A - アスヒブヤ・ゴシピのゲノムｄｎａ配列及びその使用

Info

Publication number: JPH11225770A
Application number: JP10076818A
Authority: JP
Inventors: Peter Philippsen; フィリップセンペーター; Rainer Poehlmann; ペールマンライナー; Sabine Steiner; シュタイナーザビネ; Christine Mohr; モーアクリスティネ; Juergen Wendland; ベンドラントユルゲン; Philipp Knechtle; クネッヒトルフィリップ; Corrine Rebischung; レビシュンコリーヌ
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1996-12-31
Filing date: 1998-01-05
Publication date: 1999-08-24
Also published as: AU6291698A; EP0953044A2; US6239264B1; CA2276110A1; JP2001509012A; AU5764398A; EP0866129A2; WO1998029538A3; CA2276093A1; EP0951538A2; JP2001508289A; WO1998029539A2; WO1998029539A3; US6489147B1; WO1998029538A2

Abstract

(57)【要約】【課題】これまでほとんど特徴づけられていない糸状
菌アスヒブヤゴシピ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉ
ｉ）の比較遺伝子及びゲノム分析によりそれを特徴づけ
ることである。【解決手段】アスヒブヤゴシピのランダムゲノム
フラグメントの末端配列決定から得られるゲノムＤＮ
Ａ配列を提供することである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、糸状菌アスヒブヤ・ゴシピ（Ａ
ｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）のランダムゲノム
フラグメントの末端配列決定から得られるゲノムＤＮＡ
配列及びその使用に関する。植物病原性菌類アスヒブヤ
・ゴシピは、熱帯及び亜熱帯地域において植物病原体と
して最初に単離された糸状的に増殖する子ノウ菌であ
る。それは、綿植物の子房壁を感染せしめ（Ａｓｈｂｙ
Ｓ．Ｆ．ａｎｄＮｏｗｅｌｌＷ．（１９２６）Ａ
ｎｎ．Ｂｏｔａｎｙ４０：６９−８４）、そしてま
た、トマト及びカンキツ類の果実からも単離されている
（ＰｈａｆｆＨ．Ｊ．ａｎｄＳｔａｒｍｅｒＷ．
ｔ．（１９８７）“ＴｈｅＹｅａｓｔｓ”，Ｖｏｌ．
１ＲｏｓｅＡ．Ｈ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．
（ｅｄｓ．），ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄ
ｏｎ，１２３；ＤａｍｍｅｒＫ．Ｈ．ａｎｄＲａｖ
ｅｌｏＨ．Ｇ．（１９９０），Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｔｏ
ｐａｔｈｏｌ．Ｐｆｌａｎｚｅｎｓｃｈｕｔｚ，Ｂｅｒ
ｌｉｎ２６：７１−７８ＤａｍｍｅｒａｎｄＲａ
ｖｅｌｏ，１９９０）。子房壁の感染は、刺性−吸引性
昆虫によるＡ．ゴシピ菌糸体断片又は胞子の伝達により
引き起こされ、そして小紅斑性真菌症（ｓｔｉｇｍａｔ
ｏｍｙｃｏｓｉｓ）と呼ばれる疾病を引き起こす。

【０００２】Ａ．ゴシピの核型を特徴づける研究はこれ
まで行なわれて来た（Ｗｒｉｇｈｔ，１９９０；Ｗｅｎ
ｄｌａｎｄ，１９９３；Ｇａｕｄｅｎｚ，１９９４，
“Ｔｈｅｓｍａｌｌｇｅｎｏｍｅｏｆｔｈｅ
ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｆｕｎｇｕｓＡｓｈｂｙａ
ｇｏｓｓｙｐｉｉＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔ
ｈｅＫａｒｙｏｔｙｐｅ”，ＤｉｐｌｏｍａＴｈｅ
ｓｉｓ，ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｐｐｌｉｅｄ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｅｎｔｅｒ，Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢａｓｅｌ）。Ａ．ゴシピのゲノ
ムが８．８５Ｍｂの完全な核ゲノムサイズを有すること
が、サイズマーカーとしてこれまで知られている長さの
酵母染色体を用いて見出された。

【０００３】Ａ．ゴシピは、スペルモフトラセアエ（Ｓ
ｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ）の科に属するエン
ドミケス目（ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）に系統的に
分類される（ＬｏｄｄｅｒＪ．（１９７０）Ｇｅｎｅ
ｒａｌＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ
ｙｅａｓｔｓ，“ＴｈｅＹｅａｓｔｓ”，Ｌｏｄｄ
ｅｒＪ．（ｅｄｔ．），ＮｏｒｔｈＨｏｌｌａｎｄ
ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ−Ｌｏｎｄｏｎ，１ｆｆＬｏｄｄｅｒ，１
９７０）。この分類は、胞子ノウと呼ばれる分節菌体に
おいて増殖する胞子が、減数分裂の最終生成物として定
義される子ノウ胞子のように見える観察に基づかれてい
る（ＭｕｌｌｅｒＥ．ｕｎｄＬｏｆｆｌｅｒＷ．
（１９７１）Ｍｙｋｏｌｏｇｉｅ，ＧｒｕｎｄｒｉＢ
ｄｅｒＰｉｌｚｋｕｎｄｅ，ＤＴＶ−Ｔｈｉｅｍｅ，
Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，３７ｆｆ）。

【０００４】しかしながら、いくつかの観点において、
Ａ．ゴシピは、他の糸状菌よりも出芽酵母サッカロミセ
スセレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）により密接に類似する。たとえば、
相同組換えが、形質転換ＤＮＡの組込みの主要モードで
あることが見出されており（ＳｔｅｉｎｅｒＳ．（１
９９１），Ｄｉｐｌｏｍａｒｂｅｉｔ，Ｉｎｓｔｉｔｕ
ｔｆｕｒＭｉｋｒｏ−ｕｎｄＭｏｌｅｋｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｉｅｄｅｒＪｕｓｔｕｓＬｉｅｂｉ
ｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔＧｉｅＢｅｎＳｔｅｉｎ
ｅｒなど．，１９９５）、これは多くの他の糸状菌にお
いて見出され来た発見と対照をなしている（Ｆｉｎｃｈ
ａｍＪ．Ｒ．Ｓ．（１９８９）Ｔｒｏｎｓｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎｉｎｆｕｎｇｉ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅ
ｖ．５３（１）：１４８−１７０）。

【０００５】さらに、Ａ．ゴシピのＴＥＦ，ＬＥＵ２及
びＴＨＲ４遺伝子（Ａｌｔｍａｎｎ−Ｊｏｈｌａｎｄ
Ｐｈｉｌｉｐｐｓｅｎ，１９９６；Ｍｏｈｒ，Ｍａｙ
１９９７；ＳｔｅｉｎｅｒａｎｄＰｈｉｌｉｐｐ
ｓｅｎ，１９９４）の配列分析は、Ｓ．セレビシアエに
おけるそれらの機能的相同体に対して高い配列の相同性
を同定している。さらに、後者の遺伝子に関しては、隣
接する相同ＯＲＦのシンテニー（位置的に保存された）
配置が見出された。完全に配列決定された対照のゲノ
ム、たとえばＳ．セレビシアエの増殖数は、遺伝子技法
の適用と同時に、又はその適用の前でさえ、これまでほ
とんど特性決定されていない生物、たとえばＡ．ゴシピ
の急速な比較遺伝子及びゲノム分析のための新しい見込
みを提供する。

【０００６】上記の観点から、本発明は、アスヒブヤ
ゴシピのランダムゲノムフラグメントの末端配列決
定から得られるゲノムＤＮＡ配列を提供する。特に、本
発明は、表１〜表１０１に列挙される一連のクローンか
ら得られ、そして添付する配列表に示されるＡ．ゴシピ
のゲノムＤＮＡ配列に関する。それらのＡ．ゴシピ配列
のいくつかは、Ｓ．セレビシアエ配列に対して、及び他
の糸状菌、たとえば糸状菌における増殖のために特異的
に必要とされるＯＲＦからの配列に対して相同である。
それらのＡ．ゴシピ配列の他のもの、たとえば表１０２
〜表１０４に示されるものは、いづれか他の菌類からの
既知の配列に対して相同性を有さない配列を含めて、
Ｓ．セレビシアエ配列に対して相同性を有さない。本発
明の配列は、法医学的な同定、染色体マッピング、染色
体同定、及び既知で且つ有用な機能の遺伝子の標識化に
おいて特に使用される。それらの方法は、当業者により
容易に実施され得る。本発明はまた、本発明の配列を含
んで成るキメラ遺伝子、そのようなキメラ遺伝子を含ん
で成る組換えベクター（ここで、前記ベクターは宿主を
安定して形質転換することができる）、及びそのような
ベクターにより安定して形質転換された宿主にも関す
る。好ましい宿主は、菌類、たとえばＡ．ゴシピ、及び
細菌である。

【０００７】さらに、本発明は、Ａ．ゴシピ及びＳ．セ
レビシアエにおける一次構造の高い相同性及びそれによ
り得られる配列に基づいてのＡ．ゴシピのＯＲＦの同定
及び特性決定に関する。本発明はまた、ゲノム間比較に
よるこの子ノウ菌の遺伝子及び遺伝子機構を特性決定
し、選択マーカーとして使用され得る生合成遺伝子を同
定し、相同及び非相同情況への適用のためのプロモータ
ー及びターミネーターを単離し、推定上のセントロメア
含有クローン、すなわちゲノム機構についての一般的な
情報を見出し、そしてさらに、Ａ．ゴシピ特異的遺伝子
の同定を可能にする、Ｓ．セレビシアエ又はいづれか他
の生物に対して相同性を有さないＯＲＦ含有の単一読取
り配列（ＳＲＳ）を同定するために、配列表に提供され
るＡ．ゴシピ配列の使用にも関する。

【０００８】関連する対のゲノム配列を得るためにラン
ダムに取られたＡ．ゴシピショットガンクローンの末端
を配列決定するための方法が、本発明に包含される。前
記関連する対のゲノム配列は、Ｓ．セレビシアエ、他の
菌類又は他の生物からの機能的に特徴づけられているか
又は特徴づけられていない遺伝子に対する相同性を示す
か又は相同性を欠いているオープンリーディングフレー
ム（ＯＲＦ）の同定のために使用され得る。添付する配
列表において提供される配列情報は、本明細書に記載さ
れるようなＰＣＲに基づく遺伝子標的化方法によりアス
ヒブヤにおける遺伝子欠失を生ぜしめるために十分であ
る。

【０００９】そのような分析における成功のための主な
必要条件の１つは、比較的コンパクトな組織化されたゲ
ノムである。これは、限定された長さの単一の読取り配
列（ＳＲＳ）分析からの最大の情報を得るために必要と
される。Ａ．ゴシピは、そのようなコンパクトゲノムを
表わす。短い遺伝子間領域のアスヒブヤゲノム内での
存在及びイントロンのまれな存在は、大部分のＳＲＳに
おける読取り枠（ＯＲＦ）への適合性の発見の確率を高
める。従って、本発明の１つの態様は、Ａ．ゴシピＯＲ
Ｆについての完全な配列情報を必要としないで、それら
のＳ．セレビシアエ相同物の配列比較によりＡ．ゴシピ
ＯＲＦを同定し、そして特徴づけるための方法である。
そのノックアウトが非増殖表現型を導びく、アスヒブヤ
遺伝子の特性決定のための方法もまた、本発明により包
含される。

【００１０】本発明の特定の態様においては、（ａ）添付する配列表において提供されるゲノムｐＡＧ
クローンのアスヒブヤ配列中に、選択マーカー、及び適
切なクローニングベクターからの隣接する複数のクロー
ニング領域を含んで成るキメラ遺伝子構造体を挿入し；（ｂ）適切な宿主系における前記選択マーカー遺伝子に
より分裂されたアスヒブヤ配列を担持するクローンを選
択し；（ｃ）（ａ）の分裂カセットによりアスヒブヤを形質転
換し；（ｄ）前記選択マーカーモジュールの組込みの部位のま
わりのＤＮＡ配列分析により前記分裂されたオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を示し、そして前記選択
マーカーモジュールの配向を決定し；そして（ｅ）前記分裂部位での欠失／挿入がいづれかの表現型
の変更をもたらすかどうかを決定する；ことを含んで成る、アスヒブヤ遺伝子の特性決定及び確
認のための方法が提供される。

【００１１】本発明のさらなる態様は、（ａ）選択マーカーモジュールを包含する末端ショート
フランキングホモロジー領域（ＳｈｏｒｔＦｌａｎｋ
ｉｎｇＨｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎｓ）を含んで
成る遺伝子標的化のためのカセットを設計し；（ｂ）Ａ．ゴシピ中に（ａ）の遺伝子標的化カセットを
トランスフェクトし、そして形質転換体を選択し；（ｃ）適切な試験法を適用することによって正しい遺伝
子標的化を確かめ；そして（ｅ）前記分裂部位での欠失／挿入がいづれかの表現型
の変更をもたらすかどうかを決定する；ことを含んで成る、アスヒブヤ遺伝子の特性決定及び確
認のための方法に関する。

【００１２】さらに、三重選択マーカーモジュールを包
含するアスヒブヤ遺伝子の特性決定及び確認のための方
法が本発明により包含され、ここで前記方法は、（ａ）
アスヒブヤゲノム内の興味あるもの（プロモーター交
換変異体）のコード配列の開始コドンの前に、レポータ
ー、選択マーカー、及び好ましくは調節可能プロモータ
ーである強力プロモーターを挿入し；（ｂ）前記（ａ）
のプロモーター交換変異体及び野生型株のそれぞれに増
殖のための可能性ある抗真菌剤を適用し；そして（ｃ）
前記強力プロモーター変換変異体の増殖又は非増殖表現
型を同定する；ことを含んで成る。

【００１３】形質転換後にＡ．ゴシピに対する耐性表現
型を付与することができ、又は形質転換体が形質転換さ
れていないクローン、たとえばＳｃＬＥＵ２，ＫａｎＭ
Ｘ，ＫａｎＳＣ又はＧＥＮ３から分離され得るいづれか
他の利点を付与することができる選択マーカーをコード
するいづれかのＤＮＡが、本発明の新規方法内に使用さ
れ得る。三重選択マーカーモジュールの部分として適切
に使用され得るプロモーターは、アスヒブヤ及び異種
系、たとえばＳ．セレビシアエ又はＫ．ラクチス（Ｋ．
ｌａｃｔｉｓ）において機能することができるものであ
る。

【００１４】アスヒブヤ系内で強いプロモーターとして
資格を与えられているのみならず、またアスヒブヤにお
いても十分に調節可能である、Ｓ．セレビシアエ又は
Ｋ．ラクチスからの異種プロモーターは、本発明内で好
ましいものである。三重選択マーカー内で適切に使用さ
れ得るレポーターは、容易に検出できるもの、たとえば
緑色螢光タンパク質である。遺伝子生成物の活性又は発
現が１又は複数の剤により阻害される場合、増殖につい
ての阻害効果は遺伝子生成物を過剰発現する株において
は克服するであろう。野生型プロモーターにより制御さ
れるレポーター発現が変更されない場合、前記剤は遺伝
子生成物を不活性化し、そして遺伝子生成物の発現のた
めの転写因子又はシグナル因子を不活性化しないことが
結論づけられ得る。レポーター発現がより低い場合、前
記剤は遺伝子生成物の発現に対して最とも影響を与え、
そして遺伝子生成物自体に対しては影響を与えない。

【００１５】本発明は、さらに、添付する配列表から選
択されたＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ配列に関し、こ
こで前記分子は、本明細書に記載されるような遺伝子分
裂方法への前記分子の使用に基づいて殺虫剤スクリーン
における可能性ある標的物として確認される。

【００１６】さらに、抗真菌活性を有する物質を同定す
るためへの添付された配列表から選択された配列の使
用；殺虫活性を有する物質を同定するためへの添付され
た配列表から選択された配列の使用；選択マーカーとし
て使用され得る生合成遺伝子を同定するためへの添付さ
れた配列表から選択された配列の使用；それぞれ、下流
の非翻訳領域及び上流の非翻訳領域を包含するプロモー
ター及びターミネーター領域を同定するためへの添付さ
れた配列表から選択された配列の使用；Ｓ．セレビシア
エに対する相同性を有さないＳＲＳ配列を含むＯＲＦを
同定するためへの添付された配列表から選択された配列
の使用；Ａ．ゴシピ特異的遺伝子の同定を可能にする、
いづれか他の生物に対する相同性を有さないＳＲＳ配列
を含むＯＲＦを同定するためへの添付された配列表から
選択された配列の使用；ゲノム間比較によりこの菌子体
の遺伝子及び遺伝子機構を特徴づけるためへの添付され
た配列表から選択された配列の使用；及びアスヒブヤ
ゴシピのゲノム機構を同定し、そして特徴づけるためへ
の添付された配列表から選択された配列の使用が本発明
により包含される。

【００１７】特に、本発明は、それぞれ、下流の非翻訳
領域及び上流の非翻訳領域を包含する、アスヒブヤ・ゴ
シピプロモーター及びターミネーター領域を同定する
ためへの配列表から選択されたＤＮＡ配列の使用を包含
する。本発明はさらに、推定上のプロモーター領域が配
列の整合により同定され、そして開始コドン及びターミ
ネーターと共に遺伝子選択マーカーのＯＲＦが前記推定
上のプロモーター領域の下流に配置されている、配列表
から選択されたＤＮＡ配列の使用にも関する。さらに、
植物における広範囲の疾病耐性を誘発することができる
化合物を同定するためのスクリーニング方法への配列表
から選択されたＤＮＡ配列及びその変異体の使用が包含
される。

【００１８】そのようなスクリーニングアッセイにおい
て使用されるＤＮＡ配列の適合性は、アスヒブヤゲノ
ムにおける遺伝子分裂において決定される。このために
は、選択マーカー、及び適切なクローニングベクターか
らの隣接する複数のクローニング領域を含んで成る分裂
カセットが使用され得る。本発明のさらなる態様におい
ては、配列表から選択されたＤＮＡ配列又はその一部
が、選択マーカーを内在化するＤＮＡ分子の両端に付加
される短い標的配列相同体を包含する遺伝子標的化方法
内に使用される。本発明のさらなる態様においては、配
列表から選択されたＤＮＡ配列はまた、植物病原体菌類
の異なった種間を区別するために、及び他の病原体、た
とえば細菌と真菌性病原体とを区別するためにも使用さ
れ得る。

【００１９】それぞれ、下流の非翻訳領域及び上流の非
翻訳領域を包含する、プロモーター及びターミネーター
領域を同定するために添付された配列表から選択された
配列を使用することは、本発明の１つの態様である。多
くの場合、添付された配列表は、最初の単一の読取りか
ら又は追加の配列決定の後、読取り枠とプロモーター又
はターミネーター領域との間の正確な境界の位置決定を
可能にする。そのようにして得られたプロモーター及び
ターミネーター領域はまた、本発明の一部である。

【００２０】特に、配列の整合は、読取り枠の５’端及
びそれらの推定上のプロモーター領域の隣接する配列を
表わすことができる。この推定上のプロモーター配列の
下流に遺伝子選択マーカーのＯＲＦ及び開始コドン及び
ターミネーターを配置することによって、アスヒブヤ・
ゴシピプロモーターを同定し、そして使用することが
できる。そのようにして得られたプロモーター及びター
ミネーター領域はまた、本発明の一部である。本出願に
より提供されるＤＮＡ配列は、アスヒブヤゲノムにお
ける遺伝子分裂において使用されるために特に適切であ
る。これは、たとえば遺伝子分裂カセットを包含する従
来の方法を用いて実施され得る。

【００２１】前記遺伝子分裂カセットは、選択マーカ
ー、及び適切なクローニングベクターからの隣接する複
数のクローニング領域から実質的に成る。選択マーカー
遺伝子の発現に基づくこの形質転換選択モジュールは、
好ましくは、酵母及び糸状菌、並びにまた細菌、たとえ
ばＥ．コリにおいて耐性を導びく。このモジュールは、
添付された配列表において提供されるようなゲノムｐＡ
Ｇクローンのアスヒブヤ配列中に挿入される。このため
には、選択マーカーは、適切な制限酵素、たとえばＢａ
ｍＨＩ，ＳａｌＩ又はＸｈｏＩによる切断によりクロー
ニングベクターから開放される。

【００２２】それは、対応する制限酵素、すなわち、そ
れぞれＢｇｌＩＩ，ＸｈｏＩ（部分的）又はＳａｌＩ
（部分的）により切断された、クローン化されたアスヒ
ブヤＤＮＡ中に連結される。選択マーカー遺伝子により
分裂されたアスヒブヤ配列を担持するクローンは、適切
な宿主系、たとえばＥ．コリにおいて選択される。選択
マーカーモジュールの組込みのみ部位のまわりのＤＮＡ
配列分析（付随するアスヒブヤデータベースにおける
ｉ１及びｉ２の配列）は、分裂された読取り枠を示し、
そして選択マーカーモジュールの配向を決定する。

【００２３】本発明の範囲内で使用されるよう特別に適
合される選択マーカーは、酵母及び糸状菌においてＧ４
１８耐性及びＥ．コリにおいてカナマイシン耐性を発現
するＫａｎＭＸＯである（国際特許出願番号ＰＣＴ／Ｅ
Ｐ９１／０１１１６；Ｓｔｅｉｎｅｒなど、１９９
５）。本明細書に提供される新規のＰＣＲに基づくアス
ヒブヤ遺伝子標的化方法は、本発明の範囲内において特
に好ましい。アスヒブヤにおける遺伝子標的化は、この
菌類における相同組換えに依存する（Ｓｔｅｉｎｅｒな
ど．，（１９９５）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ｉｎｐｒｅｓ
ｓ１９９５））。

【００２４】選択マーカーを内在化するＤＮＡ分子の両
端に付加される短い標的配列相同体は、アスヒブヤにお
ける配列特異的遺伝子標的化を仲介するために十分であ
る。標的配列相同体の長さは好ましくは、約２０〜８０
ｎｔ、より好ましくは３５〜６０ｎｔ、及び最とも好ま
しくは約４５ｎｔである。形質転換に基づいて、Ａ．ゴ
シピに対して表現型耐性を付与することができる選択マ
ーカー又は形質転換体が非形質転換クローンから分離さ
れ得るいづれか他の利点をコードするいづれかのは、本
発明の新規方法内において使用され得る。

【００２５】従って、遺伝子標的化のために企画された
フラグメントは、選択マーカーモジュールを包含する末
端のショートフランキングホモロジー領域（ｔｅｒｍｉ
ｎａｌＳｈｏｒｔＦｌａｎｋｉｎｇＨｏｍｏｌｏ
ｇｙｒｅｇｉｏｎｓ）を担持する。それらのフラグメ
ントは、適切な方法、たとえばエレクトロポレーション
によりＡ．ゴシピ中にトランスフェクトされ、そして形
質転換体が選択される。正しい遺伝子標的化の確認は、
適切な試験方法、たとえば特定の確認プライマーを用い
て標的ＤＮＡと組込まれたマーカーとの間の新しい連結
部の存在を試験するＰＣＲにより達成される。遺伝子標
的化の確認はまた、ＤＮＡ−ハイブリダイゼーション実
験により実施され得る。

【００２６】確認プライマーを用いる場合、特定のプラ
イマー対の組合せを用いることが好都合であることがわ
かった。たとえば、１対の確認プライマーは、選択マー
カー遺伝子の読取り枠から誘導され得る。ところが、第
２対のプライマー配列は、単一の読取り配列から誘導さ
れ得、そして標的化方法のために使用される相同領域の
それぞれ上流及び下流の領域に対応する。このＰＣＲに
基づく標的化アプローチを用いれば、長さ約１５０ｎｔ
である配列が操作され得る。基準は、付随するアスヒブ
ヤデータベースのすべての単一の読取り配列により適
合される。これは、周囲の標的配列相同体のかなり大き
な側部内に選択マーカーを組込むために労力を要し、そ
してクローニング段階を必要とする、遺伝子分裂の従来
の方法を考慮する場合、主な利点である。

【００２７】クローン純化（胞子単離）の後、標的化さ
れた遺伝子座での欠失／挿入がいづれかの表現型変更、
たとえば菌類増殖の低下又は廃止、生存性の低下又は欠
損、等をもたらすかどうかが容易に決定され得る。その
ような表現型変更がアスヒブヤ分裂又はノックアウト変
異体の１つのために確立されると、前記変異体が殺虫剤
スクリーン、好ましくは殺カビ剤スクリーンに使用され
るべき標的物として適切であるかどうかがさらに試験さ
れる。

【００２８】新規で且つ強力な遺伝子分裂方法の本発明
の範囲内への提供のおかげで、本明細書において提供さ
れるＡ．ゴシピＤＮＡ配列の１つを含んで成るか又は他
方では、その配列の１つを両端に有する遺伝子によりコ
ードされるタンパク質生成物の正確な生物学的機能を知
る必要性がもはや存在しない。Ｓ．セレビシアエに対し
ても又はいづれか他の生物に対しても相同性を有さず、
そして従って、Ａ．ゴシピ特異的であるそれらの配列
は、それらが殺虫及び好ましくは殺カビ活性を有する
が、しかし他の生物、特に哺乳類に対して非毒性である
物質を同定するために殺虫剤スクリーンに使用されるべ
き有望な候補であるので、特に有用である。

【００２９】前記ＤＮＡ配列を含んで成るか又は前記Ｄ
ＮＡ配列を両端に有する遺伝子の正確な生物学的機能に
ついては何ら知られてはいないが、それにもかかわら
ず、それらは菌類病原体に対してユニークであるために
特に価値ある。従って、１又は複数のそれらの配列を包
含する殺虫剤スクリーンにおいて同定されるいづれか殺
虫的に活性的な物質は、Ａ．ゴシピ及び（まだ同定され
ていない）相同配列を有する他の病原性菌類に対して単
に影響を及ぼすが、しかし他の生物、たとえば哺乳類に
おいてはいづれの生存機能をも妨害しない生物学的活性
を示す高い可能性を有する。

【００３０】従って、３又は“ナシ”として分類される
酵母遺伝子に対して２０％以下の相同性を示す１００及
びそれ以上のコドンを有するＯＲＦに対応する配列表に
同定されるそれらのアスヒブヤ配列を用いることによっ
て、殺虫的に活性的な化合物、特に殺カビ的に活性的な
化合物の作用のための可能性ある標的物である、Ａ．ゴ
シピゲノム内の遺伝子を同定することが、本発明のさ
らなる態様である。

【００３１】略語ＬＩＰＳ：連結された対の配列ＭＣＳ：複数のクローニング部位ＯＲＦ：読取り枠ＳＲＳ：単一の読取り配列ＲＰ：逆方向プライマーＵＰ：ユニバーサルプライマー

【００３２】表１及び配列表の説明配列表における配列は、表１におけるＰＡＧ名称に対応
する。従って、表１は、６つの縦列、すなわち“ＰＡＧ
名称”、“酵母名称”、“遺伝子名称”、“簡単な説
明”、“相同クラス”、及び“追加の解説”（それらの
詳細は下記に示される）において、配列表における個々
の配列を説明する。

【００３３】ＰＡＧ名称：アスヒブヤ・ゴシピプラス
ミドクローン（たとえばＰＡＧ１００１）の番号、続く
ＲＰ（逆方向プライマーを用いて得られた配列）又はＵ
Ｐ（ユニバーサルプライマーを用いて得られた配列）、
又は１１又は１２（ＢｇｌＩ，ＸｈｏＩ又はＢａｍＨＩ
部位でアスヒブヤＤＮＡにおけるｋａｎＭＸＯの挿入後
に得られ、そしてｋａｎＭＸＯの５’及び３’領域に結
合する配列決定プライマーを用いてそれらの部位から両
方向に配列決定された内部配列）。ＣＲＰ及びＣＵＰ
は、まれなキメラ性ゲノムクローンを示し、その末端
は異なったゲノム領域を位置づける。

【００３４】少数のクローンに関しては、ＲＰ又はＵＰ
配列のみが列挙される。プラスミドクローンの５％は、
Ｓ．セレビシアエのリボソームＤＮＡに対するそれらの
ＲＰ及びＵＰ配列の高い配列相同性から結論づけられる
ように、リボソームＤＮＡ配列を担持する。８．２ｋｂ
のアスヒブヤリボソームＤＮＡ反復体のランデムコピ
ーを示すそれらのオーバーラップするクローンは、アス
ヒブヤゲノムデータベースに列挙されていない。Ｐ
ＡＧ名称は、配列表においてそれぞれ個々の配列上に詳
しく述べられている。

【００３５】酵母名称：調査アルゴリズムにより決定さ
れるような、アスヒブヤ配列に対して最高の相同性を有
するＳ．セレビシアエ遺伝子の組織的名称。いくつかの
アスヒブヤ配列に関しては、２つの組織的名称が、それ
らがＳ．セレビシアエ遺伝子に対しての相同性を有する
２種のアスヒブヤＯＲＦからの情報を担持するので、列
挙される。高い（有意な）相同性の配列は、低い（有意
でない）相同性の配列から、縦列５（相同クラス）にお
ける分類により区別される。組織的遺伝子名称が列挙さ
れない場合、アスヒブヤ配列は、Ｓ．セレビシアエゲ
ノムＤＮＡに対する相同性を示さないが、又はそれはミ
トコンドリアＤＮＡである（約８０％のＡＴ塩基対、及
びミトコンドリアゲノムによりコードされる遺伝子に対
する相同性）。

【００３６】遺伝子名称：文献に使用されるＳ．セレビ
シアエ遺伝子名称。簡単な説明：アスヒブヤ配列に対する最高の相同性を示
すＳ．セレビシアエ遺伝子の簡単な説明。相同クラス（ＨＣ）：Ｓ．セレビシアエ遺伝子に対する
有意な相同性は、１として分類される。中間の相同性
（アミノ酸レベルでの約１／４〜１／３の同一性）は、
２として分類される。酵母遺伝子に対して２０％以下の
相同性を示す１００及びそれ以上のコドンのＯＲＦは、
３として分類される。１００及びそれ以上のコドンのＯ
ＲＦを欠き、そしてＳ．セレビシアエに対して２０％以
下の相同性を示すアスヒブヤ配列は、４として分類され
る。

【００３７】追加の解説：（ａ）ＯＲＦ及び隣接するＤ
ＮＡの５’端（Ｎ−末端）及び／又は３’端（Ｃ−末
端）の存在により判断されるようなプロモーター又はタ
ーミネーター配列の存在、（ｂ）フレーム＋１〜＋３又
は−１〜−３における唯一のＯＲＦとして及び酵母及び
菌類に対する有意な相同性を欠いている新規のアスヒブ
ヤＯＲＦ（ヌクレオチド（ｎｔ）の最小サイズ）の同定
（ｃ）シンテニー、（ｄ）ＯＲＦ分類の変更についての
理由、（ｅ）ｔＲＮＡ遺伝子に対する適合性、（ｆ）高
レベルのタンパク質相同性の領域の中断から判断され、
そしてさらに、Ｓ．セレビシアエイントロン−認識規則
の適用により確かめられる、イントロンの存在、及び
（ｇ）十分に発現された遺伝子を示し、そして強いプロ
モーターを有する高いＣＡＩ（コドン適合指数）に関す
る有用な解説。追加の略語は、ＭＩＰＳ酵母データベー
スに説明される。

【００３８】

【実施例】例１：ゲノムライブラリーの構成Ａ）部分的に消化されたＤＮＡの調製Ａ．ゴシピ（菌株ＡＴＣＣ１０８９５）のゲノムＤＮＡ
をＳａｕ３Ａにより部分的に消化し、そして低溶融アガ
ロースゲル上で分離した。次の２種の領域を前記ゲルか
ら切り出した：長さ３．５〜６ｋｂの範囲のＤＮＡフラ
グメントを含む第１のゲル断片及び長さ５〜８ｋｂの範
囲のＤＮＡフラグメントを含む第２のゲル断片。

【００３９】Ｂ）連結及びクローニング（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋなど．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒ
ｅｓｓ，１９８９に記載されるような標準の方法及び培
地）。ゲノムＤＮＡの部分消化に由来する異なったサイズのＳ
ａｕ３Ａフラグメントを、酵母シャトルベクターｐＲＳ
４１６（ＳｉｋｏｒｓｋｉａｎｄＨｉｅｔｅｒ，１
９８９，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２：１９−２７）中にク
ローン化した。このためには、ｐＲＳ４１６をＢａｍＨ
Ｉにより切断した。線状化されたベクター（４．８ｋ
ｂ）の５’−リン酸基をウシ腸ホスファターゼにより除
去し、連結の間の再環状化を最少にした。２種のサイズ
の画分、すなわち３．５〜６ｋｂの範囲のフラグメント
及び５〜８ｋｂの範囲のフラグメントのＤＮＡを、ベク
ター中に別々にクローン化した。

【００４０】連結サンプルを用いて、Ｅ．コリ株ＸＬ１
−ブルーを別々に形質転換し、５５プレート上に約２
１，５００のコロニーを一緒に得た。コロニーの８０％
（１７，０００）は、Ａ．ゴシピＤＮＡの挿入を示す白
色であった。２種のサイズの画分に由来する２１，５０
０のコロニーを、２ｍｌの完全な培地（２^＊ＹＴ）によ
り個々のプレートを洗浄することによって組合した。約
１２０ｍｌの細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液１００
ｍｌを用いて、プラスミドＤＮＡの単離のために１１の
培養物を１度接種した。

【００４１】残りの２０ｍｌの細胞懸濁液を５ｍｌのグ
リセロールと共に混合し、そして２種のアリコートに分
け−７０℃で貯蔵した。白色コロニー：青色コロニーの
割合は、完全な選択培地ＯＮにおける増殖の後、安定し
ていた。単離されたプラスミドＤＮＡを、塩化セシウム
密度グラジエント上で精製し、そしてアガロースゲル上
で分離した。１１の培養物から単離されたプラスミドＤ
ＮＡの全収量は約５ｍｇであった。ゲノムライブラリー
のすべてのプラスミドは、プラスミドｐＲＳ４１６に基
づいて共通する構造体を有した。平均の挿入体の長さ
は、約４ｋｂであった。従って、挿入体を担持する１
７，０００の組換えコロニーを有するゲノムライブラリ
ーは９．７ＭｂのＡ．ゴシピゲノムの８倍に及ぶ（Ｇ
ａｕｄｅｎｚ，１９９４）。

【００４２】例２：配列決定Ａ）両端での部分Ｓａｕ３Ａフラグメントの配列決定約３５０〜４５０ｎｇのプラスミドＤＮＡを、製造業者
のプロトコールを用いて、サイクル配列決定（Ｔ３及び
ＫＳプライマー又は同様に結合するプライマー）のため
のＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＡｍｐｌｉＴａｑＦ
ＳＰＲＩＳＭ^ＴＭＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ
ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒＣｙｃｌｅＳｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇキット（配列決定反応への１％ＤＭＳＯ
の添加、９５℃の変性温度）、及び電気泳動及びフラグ
メント検出のための３７３Ａ自動配列決定システム（Ｐ
ｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）のために採取した。ＳＲＳ
を、プラスミド名称により命名し、そして接尾のＵＰ又
はＲＰを挿入体の側を示すために付加し、ここで前記配
列は、複数のクローニング部位のこの側で存在するプラ
イマーが実際に使用されたにもかかわらず、その挿入体
に由来した。

【００４３】Ｂ）配列プロセッシングｐＡＧ１００１〜ｐＡＧ１１００及び１２０１〜１７０
０シリーズのクローンに関して、それらの配列のベクタ
ー部分を除去し、明白な塩基誤差を編集し、そして配列
の性質に依存して、個々の終点を決定した。ｐＡＧ１０
０１〜ｐＡＧ１１００及び１２０１〜１７００シリーズ
のＳＲＳをさらに編集し、そして提供されるようにして
採取した。すべての配列をＶＡＸシステム上にトランス
ファーし、そしてＧＣＧフォーマット中に置いた。短い
配列を、すべての６個の読取り枠において翻訳し、そし
てｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｐｓ．ｂｉｏｃｈｅｍ．
ｍｐｇ．ｄｅ／ｍｉｐｓ／ｙｅａｓｔ／でのＭＩＰＳデ
ータベースに対してＢＬＡＳＴ調査（Ａｌｔｓｃｈｕｌ
など．，１９９０）にゆだねた。

【００４４】ミトコンドリア又はｒＤＮＡクローンから
の配列の整合体を、ＭａｃｉｎｔｏｓｈＰｏｗｅｒ
ＰＣに基づいて、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッ
ケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ
Ｋ）のＳａｑＭａｎモジュールにより実行した。

【００４５】例３：ＢＬＡＳＴ調査結果の分類ＢＬＡＳＴ結果の評価においては、相同クラス（ＨＣ）
の４種の異なったカテゴリーを使用した。ＨＣ１及び２
は、Ｓ．セレビシアエＯＲＦに対する有意なヒットを示
すＳＲＳを表わす。カテゴリー１と２との間の境界は、
整合されたタンパク質配列において約４０％の同一性で
創造された。納得のゆく相同性を示さないが（約２０％
の同一性及びそれ以下）、しかし少なくとも３００ｎｔ
の長さの可能な読取り枠（ＡＴＧを有するか又は有さな
い）を有するＳＲＳを、ＨＣ３として割り当てた。

【００４６】有意な相同性及び少なくとも３００ｎｔの
可能な読取り枠を有さないすべてのＳＲＳを、ＨＣ４と
して割り当てた。しかしながら、分類のための記載され
る値は、厳密な規則として適用されなかった。因子、た
とえば相同ブロックの長さ、いくつかのブロックの場
合、全体の相同性、可能な読取り枠に対する得点ヒット
の関係、Ｓ．セレビシアエタンパク質配列（たとえば、
最Ｎ−又はＣ−末端）内での相同ブロックの位置、偏向
された配列、等が、分類のために考慮された。

【００４７】付随する配列表に列挙されるクローンのほ
とんど３０％が、Ｓ．セレビシアエとのシンテニーを示
す。従って、殺カビスクリーニングアッセイのための興
味あるアスヒブヤ遺伝子（たとえば、必須の菌類又は酵
母遺伝子の相同体）は、ＲＰ及び／又はＵＰ配列が隣接
するＳ．セレビシアエ相同体に適合する場合、位置保存
（シンテニー）により見出され得る。古くからのシンテ
ニーの規則を適用する場合、そのような予測の頻度は、
２倍又はそれ以上、上昇する。

【００４８】ＲＰ及びＵＰ配列の５％以上が、データベ
ースにおける配列に対する明らかな相同性を伴わない
で、１００及びそれ以上のコドンの読取り枠を同定し
た。表１においては、それらはクラス３又は４として示
されている。従って、それらの配列は、新規の先導標的
遺伝子のための候補体である。それらの遺伝子を担持す
る菌類病原体（たとえば、カンジダアルヒカンス（Ｃ
ａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）又は植物病原性菌
類）は、アスヒブヤ先導標的物を用いてのアッセイに基
づいて開発された化合物により処理され得る。

【００４９】例４：アスヒブヤゴシピプロモーター
の単離のためへのアスヒブヤゴシピ配列の使用配列の整合は、読取り枠の５’端、及びそれらのプロモ
ーター領域の隣接する配列を示すことができる。このプ
ロモーター配列の下流に開始コドン及びターミネーター
と共に遺伝子選択マーカーのＯＲＦを配置することによ
って、新規のアスヒブヤ・ゴシピプロモーターを同定
し、そして用いることができる。たとえば、６７個のア
ミノ酸のＯＲＦは、ｐＡＧ１２４５ｒｐのＳＲＳ上で同
定された。このＯＲＦは、ＢＬＡＳＴ調査において、
Ｓ．セレビシアエのリボソームタンパク質Ｓ２８．ｅ．
１２に対して９８％の相同性を示す（Ａｌｔｓｃｈｕｌ
など．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：
４０３−４１０）。推定上のＡ．ゴシピリボソームタ
ンパク質のためのＯＲＦ（ＡｇＲＰＳ３３Ｂ）は、プロ
モーターのために３００ｂｐを残して、７００ｂｐのＳ
ＲＳ上の１９５〜３９５に位置する。この発見に基づけ
ば、プラスミドｐＡＧ１２４５は、Ｓ．セレビシアエに
おけるＰＣＲ−標的化遺伝子交換においてＡｇＬＥＵ２
マーカーを用いての新規のプロモーターの単離のために
使用され得る。

【００５０】Ａ）ＡｇＬＥＵ２マーカーを担持するＤＮ
ＡフラグメントのＰＣＲ合成２種のプライマー、すなわちＲＰ５及びＲＰ３がＡｇＬ
ＥＵ２遺伝子の増幅のために選択される。両プライマー
は、ｐＡＧ１２４５に対しての４０ｂｐの相同性の他
に、ＡｇＬＥＵ２に対してさらに２０ｂｐの相同性を示
す６０マーである。プライマーＲＰ５：５’ＴＴＴＴ
ＡＣＴＡＧＡＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴＣＣＡＡ
ＧＡＡＧＣＡＡＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡＴ
ＧＧＣＴＧＣＧＧＴＡＡＡＧＡＧＡＡＴ
３’。ＲＰ５の５’端での４０ｂｐは、ＡｇＲＰＳ３３
ＢのＡＴＧ開始コドンの前の４０個のヌクレオチドに対
して相同である。ＲＰ５の３’端での２０ｂｐは、ＡＴ
Ｇ開始コドンを包含する、ＡｇＬＥＵ２ＯＲＦの最初
の２０個のヌクレオチドに対して相同である。

【００５１】プライマーＲＰ３：５’ＣＴＧＧＡＧ
ＣＴＣＣＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧ
ＣＴＣＴＡＧＡＡＣＴＡＧＴＧＣＧＣＣＡ
ＡＣＧＴＴＧＣＧＡＧＡＴＡＴＡ３’。ＲＰ
３の５’端での４０ｂｐは、ＳａｃＩ，ＳａｃＩＩ，Ｎ
ｏｔＩ，ＥａｇＩ，ＸｂａＩ及びＳｐｅＩ制限部位を包
含するｐＡＧ１２４５のｐＢＩＩＳｋ＋複数クローニン
グ部位（Ａｌｔｉｎｇ−ＭｅｓｓＭ．Ａ．ａｎｄＳ
ｈｏｒｔＪ．Ｍ．（１９８９）Ｎｕｃ．ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．１７（２２）：９４９４）における４０個のヌ
クレオチドに対して相同である。ＲＰ３の３’端での２
０ｂｐは、ＡｇＬＥＵ２ターミネーター領域における２
０個のヌクレオチド（１２６１〜１２８１）に対して相
同である。ＡｇＬＥＵ２コード領域及びＡｇＬＥＵ２タ
ーミネーター配列を担持する配列（ＡｇＬＥＵ２のＡＴ
Ｇ開始コドンは太字で書かれており、そして停止コドン
（１１１７〜１１１９）は下線が引かれている）：

【００５２】

【表１】

【００５３】ＰＣＲ反応は、ＡｒｍｓＢｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙからのＴｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにおいて
行なわれる。鋳型として、ＡｇＬＥＵ２遺伝子を担持す
るプラスミドｐＡＧ１５０（ＭｏｈｒＣｈ．（１９９
７）Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏ
ｆＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢａｓｅｌ）からの単離され
た３．１ｋｂのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩフラグメントを用
いる。１００ｎｇの鋳型を、５μｌの１０^＊Ｔｈｅｒｍ
ｏＰｏｌ（緩衝液（Ｂｉｏｌａｂｓ）中、０．２ｍＭ
のｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰにより補
充された５０μｌの反応体積のために添加する。

【００５４】その反応におけるプライマーＲＰ５及びプ
ライマーＲＰ３の濃度は、１μＭである。高温開始の
後、１μｌの酵素混合物（５：１のＴａｑポリメラーゼ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）：Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｂｉ
ｏｌａｂｓ））を添加する。ＰＣＲを次の条件下で実行
する：９４℃での高温開始、９４℃での３０秒、５５℃
での３０秒、及び７２℃での２分並びに最終的に、７２
℃での４分（３０サイクル）。１％アガロースゲル上で
ＰＣＲ反応の分析は、Ｓ．セレビシアエを形質転換する
ために使用され得る、１．３６ｋｂのＰＣＲ生成物のた
めに１００ｎｇ／μｌの濃度を示す。

【００５５】Ｂ）Ｓ．セレビシアエの形質転換相同組換によるＡｇＬＥＵ２マーカーとＳ．セレビシア
エにおけるプラスミドｐＡＧ１２４５上のＡｇＲＰＳ３
３ＢのＯＲＦとの直接的な交換のためには、同時形質転
換が行なわれる。受容体積として、表現型９，ｕｒａ３
−５２，ｌｙｓ２−８０１^{ａｍｂｅｒ}，ａｄｅ２−１０
１^{ｏｃｈｒｏ}，ｔｒｐ１−Δ１，ｌｅｕ２−Δ１（Ｓｉ
ｋｏｒｓｋｉＲ．Ｓ．ａｎｄＨｉｅｔｅｒＰ．
（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２：１９−２７）
が使用される。形質転換は、Ｇｌｅｔｚなど．（１９９
２）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄＲｅｓ．２０（６）：１４２５
に従って実施される。

【００５６】ｐＡＧ１２４５のプラスミドＤＮＡ２μｇ
及びＰＣＲ生成物２μｇを用いて、ＹＰ９８株を同時形
質転換する。プラスミドｐＡＧ１２４５は、ＣＥＮ６／
ＡＲＳＨ４カセット、及びＹＰ．９８における複製及び
選択を提供するＵＲＡ３遺伝子を担持する。ｐＡＧ１２
４５ｒｐＳＲＳの一部に対して相同である、ＰＣＲ生
成物の末端での４０ｂｐ間での組換えは、ＡｇＲＰＳ３
３Ｂ読取り枠の切除及びＡｇＬＥＵ２マーカー遺伝子の
組込みを導びく。形質転換体は、リシン、アデニン、ト
リプトファンにより補充され、そしてウラシル及びロイ
シンを欠いているＳＤ−最少培地（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ
Ｒ．Ｓ．ａｎｄＨｉｅｔｅｒＰ．（１９８９）Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ１２２：１９−２７）上で、ＵＲＡ＋及
びＬＥＵ＋について２重選択される。

【００５７】正の対照として、ｐＲＳ４１５及びｐＲＳ
４１６（ＳｉｋｏｒｓｋｉＲ．Ｓ．ａｎｄＨｉｅｔ
ｅｒＰ．（１９８９）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２２：１９
−２７）のプラスミドＤＮＡ２μｇを同時形質転換し
た。プラスミドｐＲＳ４１６は、ＣＥＮ６／ＡＲＳＨ４
カセット及びＵＲＡ３遺伝子を担持し、そしてｐＲＳ４
１５は、ＣＥＮ６／ＡＲＳＨ４カセット、及び複製及び
選択のためのＬＥＵ２遺伝子を担持する。形質転換体は
また、リシン、アデニン、トリプトファンにより補充さ
れ、そしてウラシル及びロイシンを欠いているＳＤ−最
少培地上で選択される。負の対照として、２μｇのＰＣ
Ｒ生成物が形質転換され、ＡｇＬＥＵ２マーカー遺伝子
のゲノム組込みの可能性が排除される。

【００５８】負の対照についての選択は、リシン、アデ
ニン、トリプトファン、ウラシルにより補充され、そし
てロイシンを欠いているＳＤ−最少培地プレート上で行
なわれる。２〜３日間のインキュベーションの後、最初
の形質転換体が現われ、そして５日後、形質転換効率が
計算される。負の対照、すなわち形質転換されたＰＣＲ
生成物は、形質転換体を有さない。正の対照、すなわち
ｐＲＳ４１５及びｐＲＳ４１６は、３００の形質転換体
／μｇＤＮＡの形質転換効率を有する。ｐＡＧ１２４
５及びＰＣＲ生成物の同時形質転換は、１０の形質転換
体／μｇＤＮＡの形質転換効率を示す。ｐＡＧ１２４
５中へのＡｇＬＥＵ２マーカー遺伝子の組込みの確認の
ためには、ｐＡＧ１２４５−１として命名される新規プ
ラスミドが、その形質転換体から単離され、そしてさら
に調査される。

【００５９】Ｃ）ｐＡＧ１２４５中へのＡｇＬＥＵ２の
組込みの確認新しく生成されたプラスミドｐＡＧ１２４５を有するい
くつかの独立したＳ．セレビシアエ形質転換体からのゲ
ノムＤＮＡを、ＰｈｉｌｉｐｐｓｅｎＰ．など．，
（１９９１）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ１９４：１６９−１８２，ＧｕｉｄｅｔｏＹ
ｅａｓｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌ
ａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ
に従って単離する。

【００６０】ゲノムＤＮＡを用いて、ＤｏｗｅｒＪ．
Ｗ．，（１９８８）Ｎａｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１
６：６１２７−６１４５により記載されるプロトコール
に従って、Ｅ．コリ株ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｂｕｌｌｏｃ
ｋＷ．Ｏ．など．，（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎ
ｉｑｕｅｓ５（４）：３７６−３７８）を形質転換す
る。ｐＡＧ１２４５−１のプラスミドＤＮＡを単離し、
そしてＡｇＬＥＵ２マーカー遺伝子の組込みを、分析Ｐ
ＣＲを通して確認する。複数のクローニング部位に位置
する１つのプライマー及びＡｇＲＰＳ３３Ｂのプロモー
ター領域における１つのプライマーを有するプライマー
対は、ＡｇＲＰＳ３３ＢのＯＲＦの切除及びＡｇＬＥＵ
２マーカー遺伝子の組込みを示す。

【００６１】このためには、２種のプライマーＲＰ１及
びＲＰ２が選択される。ＲＰ１（５’ＣＡＴＧＡＴ
ＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＧＣＧＣ３’）は、ｐ
ＢＩＩＳｋ、及び逆方向プライマー結合部位に隣接する
ｐＡＧ１２４５における複数のクローニング部位（Ａｌ
ｔｉｎｇ−ＭｅｓｓＭ．Ａ．ａｎｄＳｈｏｒｔＪ．
Ｍ．（１９８９）Ｎｕｃ．ａｃｉｄｓＲｅｓ．１７
（２２）：９４９４）における２０個のヌクレオチドに
対して相同である。ＲＰ２（５’ＣＣＡＡＧＣＡＣ
ＡＴＴＴＣＡＣＣＴＧＣＧ３’）は、５２１〜
５４０からのｐＡＧ１２４５ＳＲＳにおける２０個の
ヌクレオチドに対して相同である。このプライマーの組
合せにより、予測されるＰＣＲ生成物は、ｐＡＧ１２４
５のために０．６ｋｂであり、そしてｐＡＧ１２４５−
１のために１．５ｋｂである。

【００６２】ＰＣＲ反応を、鋳型として２種の独立した
Ｓ．セレビシアエ形質転換体に起因する、ｐＡＧ１２４
５及びｐＡＧ１２４５−１からのプラスミドＤＮＡを用
いて実施した。１００ｎｇの鋳型を、５μｌの１０^＊Ｔ
ｈｅｒｍｏＰｏｌ緩衝液（Ｂｉｏｌａｂｓ）中、０．
２ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰに
より補充された５０μｌの反応体積のために添加する。
前記反応におけるプライマーＲＰ１及びプライマーＲＰ
２の濃度は、１μＭである。高温開始の後、１μｌの酵
素混合物（５：１のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）：Ｖｅｎｔポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ））
を添加する。

【００６３】ＰＣＲを次の条件下で実行する：９４℃で
２分間の高温開始、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒及
び７２℃で２分間、並びに最終的に７２℃で４分間（３
０サイクル）。１％アガロースゲル上でのＰＣＲ反応の
分析は、ｐＡＧ１２４５に関して０．６ｋｂで及びｐＡ
Ｇ１２４５−１に関して１．５ｋｂでバンドを示す。こ
の結果は、ｐＡＧ１２４５におけるＡｇＬＥＵ２マーカ
ー遺伝子の正しい組込みを示す。

【００６４】例５：連結された配列対のシンテニーに基
づいての新規菌類ＤＮＡ要素の単離プラスミドＰＡＧ１４８９（ＰＡＧ１４８９ＲＰ及びＰ
ＡＧ１４８９ＵＰ）のＤＮＡ挿入体の初期＝末端ＳＲＳ
により、シンテニーがＳ．セレビシアエＣＥＮ２のセン
トロメア領域に発見される。このシンテニーは、酵母遺
伝子ＹＢＬ００３ｃ及びＹＢＲ００１ｃに対する相同性
を示す。完全な二本鎖挿入体配列は、酵母ゲノムデータ
ベース（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳｔｅｐｈｅｎＦ．，Ｇ
ｉｓｈ，Ｗａｒｒｅｎ，Ｍｉｌｌｅｒ，Ｗｅｂｂ，Ｍｙ
ｅｒｓ，ＥｕｇｅｎｅＷ．，ａｎｄＤａｖｉｄ
Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９０）．Ｂａｓｉｃｌｏｃａ
ｌａｌｉｇｎｍｅｎｔｓｅａｒｃｈｔｏｏｌ，Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）によるＢ
ＬＡＳＴ研究により決定される場合、酵母遺伝子ＹＢＬ
００３ｃ（９７％の同一性）、ＹＢＬ００２ｗ（９４％
の同一性）、ＹＢＬ００１ｃ（６９％の同一性）及びＹ
ＢＲ００１ｃ（７３％の同一性）に対するシンテニーを
示す。

【００６５】酵母において、染色体ＩＩのセントロメア
を、ＹＢＬ００１ｃとＹＢＲ００１ｃとの間に配置す
る。酵母セントロメアＩＩに対する相同配列が、位置２
９００〜３２００間でＰＡＧ１４８９のＡ．ゴシピＤＮ
Ａ配列において見出される。この相同体は、必須のセン
トロメアＤＮＡ要素ＣＤＥＩ，ＣＤＥＩＩ、及びＣＤＥ
ＩＩＩを含んで成る。対照のゲノムに対する単一のｐＡ
ＧプラスミドのＲＰ及びＵＰ配列のシンテニーを用いる
場合、可能性ある殺カビ薬物標的物の検出が、ＰＡＧ１
４８９上のセントロメアと同じ手段で推定され得る。さ
らに、対照ゲノムとしてアスヒブヤゴシピを用いる場
合、他の病原性菌類の可能性ある殺カビ薬物標的物が単
離され得る。ＰＡＧ１４８９挿入体ＤＮＡの配列：

【００６６】

【表２】

【００６７】

【表３】

【００６８】

【表４】

【００６９】

【表５】

【００７０】例６：付随するアスヒブヤ・ゴシピデー
タベースに示される殺カビ薬物標的物の同定Ａ）アスヒブヤ・ゴシピのショートフランキングホ
モロジー（ＳＦＨ）−ＰＣＲ仲介の形質転換を用いての
遺伝子分裂の原理配列表に提供される配列により示されるアスヒブヤゲ
ノムにおける遺伝子分裂を、新規のＰＣＲに基づくアス
ヒブヤ遺伝子標的化方法を用いて行なう。アスヒブヤに
おける遺伝子標的化は、この菌類における相同組換えに
依存する（Ｓｔｅｉｎｅｒなど．，１９９５）。選択マ
ーカー（たとえばＧＥＮ３）の両端にＰＣＲにより付加
される短い（約４５ｂｐ）標的配列相同体はアスヒブヤ
における配列特異的遺伝子標的化を仲介するために十分
であることが見出された。従って、遺伝子標的化のため
のＰＣＲフラグメントは、選択マーカーモジュールを包
含する末端ショートフランキングホモロジー領域を担持
する。

【００７１】それらのＰＣＲフラグメントはＡ．ゴシピ
中にトランスフェクトされ（たとえばエレクトロポレー
ションにより）、そして形質転換体がＧ４１８耐性に対
して選択される。正しい遺伝子標的化の確認は、Ｗａｃ
ｈなど．（１９９７）Ｐ．Ｙｅａｓｔ１３：１０６５
−１０７５により記載されるように、確認プライマー対
Ｇ１−Ｇ２及びＧ３−Ｇ４を用いて、標的ＤＮＡと組込
まれたマーカーとの間の新規連結部の存在をＰＣＲ試験
することによって達成される。また、遺伝子標的化の確
認は、ＤＮＡ−ハイブリダイゼーション実験により実施
され得る。確認プライマーＧ２：５’ＧＴＴＴＡＧＴＣ
ＴＧＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＧ３’及びＧ３：５’
ＴＣＧＣＡＧＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＧＧＡＴＣ３’
は、選択マーカー遺伝子ＧＥＮ３の読取り枠に由来す
る。

【００７２】Ｇ１及びＧ４プライマー配列は、単一の読
取り配列に由来し、そしてＰＣＲに基づく標的化のため
に使用される相同領域のそれぞれの上流及び下流の領域
に対応する。このＰＣＲに基づく標的化アプローチを用
いて、長さ約１５０ｎｔである配列が操作され得る（基
準は付随するアスヒブヤデータベースのすべての単一
の読取り配列により適合される）。これは、取り囲む標
的配列相同体のかなり大きな側部内に選択マーカーを組
込むために労力を要し、そしてクローニング段階を必要
とする、遺伝子分裂の従来の方法を考慮する場合、主な
利点である。クローン純化（胞子単離）の後、標的化さ
れた遺伝子座での欠失／挿入が殺カビ薬物のための可能
性ある標的物を同定するいづれかの表現型変更（たとえ
ば生存性の低下又は損失）をもたらすかどうかが決定さ
れる。

【００７３】Ｂ）アスヒブヤ・ゴシピのショートフラ
ンキングホモロジー（ＳＦＨ）−ＰＣＲ仲介の形質転
換のためのプロトコール１）Ｓ１及びＳ２プライマーの選択が、ｐＧＥＮ３に対
して相同の２０ｎｔに標的遺伝子座配列に対して特異的
な約４５ｎｔを連結するために行なわれ、選択マーカー
ＧＥＮ３の増幅が可能にされる。ＧＥＮ３の５’側上の
標準の配列は、配列番号９に対応し、これはＰＣＲフラ
グメントに対するまれな切断エンドヌクレアーゼ１−Ｓ
ＣＥ１の認識部位を包含する。

【００７４】この制限部位はＡ．ゴシピの核ゲノムには
見出されず、そして染色体位置に対するＡ．ゴシピ挿入
体ＤＮＡの位置を物理的にマッピングするために使用さ
れ得る。ＧＥＮ３の３’側上の配列は、配列番号１０に
対応する。Ｓ１及びＳ２プライマーは合計的６５ｎｔを
含んで成る。Ｓ１及びＳ２プライマー配列と部分的にも
オーバーラップしない確認プライマーＧ１及びＧ４の選
択は、標的遺伝子座配列に依存する。

【００７５】２）ＳＦＨ−ＰＣＲフラグメントの生成
は、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ
（Ｂｉｏｌａｂｓ）により切断される約１０ｍｇの多く
の線状化されたＰＧＥＮ３にＧＥＮ３を増幅するために
Ｓ１及びＳ２プライマーを用いることにより達成され
る。ＰＣＲ−生成物の適合性を高めるためには、Ｔａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びＶｅ
ｎｔＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の混合物
が１０：１〜２単位の比で使用される。標準ＰＣＲ条件
は次の通りである：

【００７６】段階１：初期変性：９６℃で２分間。段階２：変性：９６℃で３０秒。段階３：プライマーアニーリング：５０℃で３０秒。段階４：拡張期間：７２℃で２．５分。（段階２〜４は
２５〜３５回、反復される。）段階５：末端拡張期間：７２℃で５分間。段階６：４℃での貯蔵（任意）。

【００７７】３）Ａ．ゴシピ中へのＳＦＨ−ＰＣＲ生成
物のトランスフェクションは、エレクトロポレーション
により行なわれる（Ｓｔｅｉｎｅｒなど．，１９９５、
改良を伴う）：１）約１０^７個の胞子の胞子懸濁液による１００〜２０
０ｍｌのＹＰＤ又はＡＦＭ（ＹＰＤ：２％カゼインペ
プトン、２％グルコース、１％酵母抽出物；ＡＦＭ：１
％カゼインペプトン、２％グルコース、１％酵母抽出
物、０．１％ｍｙｏ−イノシトール）の接種。２）２００ｒｐｍの回転下で、３０℃で約１８時間のイ
ンキュベーション。３）濾過による菌糸体の収集及び無菌Ｈ_２Ｏによる１度
の洗浄。

【００７８】４）２５ｍＭのＤＴＴを含む５０ｍＭのリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）４０ｍｌ中への１ｇ
の湿量の菌糸体の再懸濁、及び軽く振盪しながら３０℃
で３０分間のインキュベーション。５）濾過による菌糸体の収集及び５０ｍｌの冷ＳＴＭ緩
衝液（ＳＴＭ：２７５ｍＭのスクロース、１０ｍＭのト
リス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，２ｍＭのＭｇＣｌ_２）によ
る１度の洗浄。６）ＳＴＭ緩衝液における菌糸体の密にパックされた混
合物への再懸濁。７）Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管における１５０ｍｌの菌糸体
及び最大５０ｍｌのＳＦＨ−ＰＣＲ生成物の混合及びそ
の混合物のエレクトロポレーションキュベット（Ｂｉ
ｏＲａｄ４ｍｍ）中への移行。

【００７９】８）約２．３ｍｓのパルスの長さをもたら
すであろう、１．５ｋＶ，１００１／２，２５ｍＦの電
場パルスの適用。１ｍｌのＹＰＤ又はＡＦＭの添加及び
３つの前もって乾燥されたＡＦＭプレート上への等量の
流布。９）３０℃で最少４時間のインキュベーション。１０）２００ｍｇ／ｍｌの最終濃度でＧｅｎｅｔｉｃｉ
ｎ／Ｇ４１８を含む上部層への０．５％アガロース８ｍ
ｌのオーバーレイ。１１）３０℃で最大４日間のインキュベーション。

【００８０】Ｃ）ショートフランキングホモロジー
（ＳＦＨ）−ＰＣＲを用いての可能性ある殺カビ薬物標
的物を現す遺伝子分裂の例１）ＰＡＧ１０２５ＲＰの分裂ＲＨＯ３遺伝子のアミノ末端部分は、ＰＡＧ１０２５Ｒ
Ｐ上に位置する。ＳＦＨ−ＰＣＲ形質転換体を構成し、
そして確認するために必要な４種のプライマー（Ｓ１，
Ｓ２，Ｇ１及びＧ４）の標的遺伝子座に対する相同領域
の位置は、下記セクションＥ）に示される。ｐＧＥＮ
３、すなわち選択マーカー遺伝子ＧＥＮ３を担持するプ
ラスミド（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限エンドヌクレ
アーゼ〔Ｂｉｏｌａｂｓ〕による切断により線状化され
ている）と共に、Ｓ１及びＳ２プライマー（Ａ）におい
て示されるように標的遺伝子座に対して相同領域の３’
端でｐＧＥＮ３に対して相同の２０ｎｔを包含する）を
用いて、選択マーカーモジュールを包含する末端シー
トフランキングホモロジー領域を担持するＰＣＲフ
ラグメントを生成する。

【００８１】形質転換された核及び形質転換されていな
い核に関してヘテロカリオン性である一次形質転換体
は、マイクロマニプレーターを用いて胞子単離によりク
ローン的に精製される。選択培地上でのＲＨＯ３に対し
て欠失された胞子の発芽は、浸透安定剤、たとえば１Ｍ
のソルビトールを添加することによって得られる。前記
対の欠失の確認は、標的遺伝子座に対してユニークであ
り、そして初期形質転換出来事に使用されない確認プラ
イマーＧ１及びＧ４、及び選択マーカーに対して特異的
であるプライマーＧ２及びＧ３を用いて、ＰＣＲにより
実施される。相同遺伝子標的化出来事を示すＰＣＲ生成
物は、組合せＧ１−Ｇ４（ＧＥＮ３の組込みが標的化さ
れている完全な遺伝子座を増幅する）、Ｇ１−Ｇ２（Ｇ
ＥＮ３の挿入により創造される５’側の新規連結部を増
幅する）、及びＧ３−Ｇ４（ＧＥＮ３の挿入により創造
される３’側の新規連結部を増幅する）での確認プライ
マーを用いることによって得られる。

【００８２】２）ＰＡＧ１６３４ＲＰの分裂ＢＡＬ１遺伝子のアミノ末端部分は、ＰＡＧ１６３４Ｒ
Ｐ上に位置する。ＳＦＨ−ＰＣＲ形質転換体を構成し、
そして確認するために必要な４種のプライマー（Ｓ１，
Ｓ２，Ｇ１及びＧ４）の標的遺伝子座に対する相同領域
の位置は、下記セクションＥ）に示される。ｐＧＥＮ
３、すなわち選択マーカー遺伝子ＧＥＮ３を担持するプ
ラスミド（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限エンドヌクレ
アーゼ〔Ｂｉｏｌａｂｓ〕による切断により線状化され
ている）と共に、Ｓ１及びＳ２プライマー（Ａ）におい
て示されるように標的遺伝子座に対して相同領域の３’
端でｐＧＥＮ３に対して相同の２０ｎｔを包含する）を
用いて、選択マーカーモジュールを包含する末端シー
トフランキングホモロジー領域を担持するＰＣＲフ
ラグメントを生成する。

【００８３】形質転換された核及び形質転換されていな
い核に関してヘテロカリオン性である一次形質転換体
は、マイクロマニプレーターを用いて胞子単離によりク
ローン的に精製される。選択培地上でのＢＡＬ１に対し
て欠失された胞子の発芽は、浸透安定剤、たとえば１Ｍ
のソルビトールを添加することによって得られる。遺伝
子標的化出来事の確認は、Ｃ．１）に記載されるように
して行なわれる。

【００８４】３）ＰＡＧ１４８６ＲＰの分裂ＢＵＢ１読取り枠のアミノ末端部分は、ＰＡＧ１４８６
ＲＰ上に位置する。ＳＦＨ−ＰＣＲ形質転換体を構成
し、そして確認するために必要な４種のプライマー（Ｓ
１，Ｓ２，Ｇ１及びＧ４）の標的遺伝子座に対する相同
領域の位置は、下記セクションＥ）に示される。ｐＧＥ
Ｎ３、すなわち選択マーカー遺伝子ＧＥＮ３を担持する
プラスミド（ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限エンドヌク
レアーゼ〔Ｂｉｏｌａｂｓ〕による切断により線状化さ
れている）と共に、Ｓ１及びＳ２プライマー（Ａ）にお
いて示されるように標的遺伝子座に対して相同領域の
３’端でｐＧＥＮ３に対して相同の２０ｎｔを包含す
る）を用いて、選択マーカーモジュールを包含する末
端シートフランキングホモロジー領域を担持するＰ
ＣＲフラグメントを生成する。

【００８５】形質転換された核及び形質転換されていな
い核に関してヘテロカリオン性である一次形質転換体
は、マイクロマニプレーターを用いて胞子単離によりク
ローン的に精製される。ＢＵＢ１に対して欠失された胞
子の発芽は得られず、これは、この遺伝子がＡ．ゴシピ
において必須であることを示す。遺伝子標的出来事の確
認は、Ｃ．１）に記載されるようにして行なわれる。

【００８６】Ａ．ゴシピＤＮＡ中へのＳＦＨ−ＰＣＲ仲
介のマーカー組込みは、付随するデータベースのすべて
のＲＰ及び／又はＵＰ配列に適用され得る。Ａ．ゴシピ
におけるＳＦＨ−ＰＣＲ仲介の遺伝子標的化のさらなる
適用は次の通りである：１）アンチセンス転写体の生成。２）ｍＲＮＡの過剰生成及びたぶん、タンパク質の過剰
発現。３）標的配列（たとえばＧＦＰ，ｌａｃＺ）へのレポー
ター遺伝子の付加。４）ＲＰ及びＵＰ配列を用いてのより長い欠失の導入。

【００８７】Ｄ）従来の方法による、可能性ある殺カビ
薬物標的物を現わす遺伝子分裂の例１）分裂カセットの構成選択マーカーとして、ｋａｎＭＸＯを使用する。これ
は、酵母及び糸状菌においてＧ４１８耐性及びＥ．コリ
においてカナマイシン耐性を発現する形質転換選択モジ
ュールである（国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９１／０
１１１６）。このモジュールを、ゲノムｐＡＧクローン
のアスヒブヤ配列中に挿入する。前記モジュールは、キ
メラ性カナマイシン遺伝子、及びクローニングベクター
ｐＡＧ−２３１（Ｓｔｅｉｎｅｒ，Ｗｅｎｄｌａｎｄ，
Ｗｒｉｇｈｔ，ａｎｄＰｈｉｌｉｐｐｓｅｎ，Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ１９９５：１４０，９７３−９８７）から
の隣接する複数のクローニング領域を有する。

【００８８】このためには、選択マーカーが、クローニ
ングベクターｐＡＧ−２３１から開放される（ＢａｍＨ
Ｉ，ＳａｌＩ又はＸｈｏＩのいづれかによる切断によ
り）。それを、それぞれＢｇｌＩＩ，ＸｈｏＩ（部分
的）又はＳａｌＩ（部分的）のいづれかにより切断され
た、クローン化されたアスヒブヤＤＮＡ中に連結する。
ｋａｎＭＸＯにより分裂されたアスヒブヤ配列を担持す
るクローンを、カナマイシン耐性によりＥ．コリにおい
て選択する。ｋａｎＭＸＯモジュールの組込みの部位の
まわり（付随するアスヒブヤデータベースにおけるｉ
１及びｉ２配列）のＤＮＡ配列分析は、分裂された読取
り枠を示し、そしてｋａｎＭＸＯモジュールの配向を決
定する。

【００８９】２）ＰＡＧ１０１０ｉ１／ｉ２，ＰＡＧ１
０１７ｉ１／ｉ２，ＰＡＧ１０２１ｉ１／ｉ２及びＰＡ
Ｇ１０４４ｉ１／ｉ２の分裂分裂カセットを、ｋａｎＭＸＯを両端に有する数百の塩
基対のアスヒブヤＤＮＡを残して、プラスミドから開放
する（たとえば、複数のクローニング領域におけるＮｏ
ｔＩ及びＫｐｎＩによる切断により）。分裂カセットに
よるアスヒブヤの形質転換は、標的遺伝子座中への相同
組換えを誘発する（Ｓｔｅｉｎｅｒなど．，１９９
５）。一次形質転換体を、Ｇ４１８を含むプレート上で
選択し、そしてＤＮＡハイブリダイゼーション実験又は
ＰＣＲ、続いてクローン精製（胞子単離）により分析す
る。標的遺伝子座の染色体、マッピングは、パルスされ
た電場のゲル電気泳動により分離された染色体ＤＮＡの
１−ＳｃｅＩエンドヌクレアーゼマッピングにより達成
する。

【００９０】野生型対立遺伝子を有する核及び分裂され
た対立遺伝子を有する核を担持する一次形質転換体は、
ヘテロカリオン性である。単一の半数性核を有する胞子
が、より古い菌糸体において増殖し、そして形質転換体
のクローン精製を可能にする（たとえば、マイクロマニ
プレーターによる単一の胞子単離により、Ｓｔｅｉｎｅ
ｒなど．，１９９５）。胞子単離に続いて、増殖アッセ
イを行なう。たとえば、配列ＰＡＧ１０１０ｉ１／ｉ
２，ＰＡＧ１０１７ｉ１／ｉ２，ＰＡＧ１０２１ｉ１／
ｉ２及びＰＡＧ１０４４ｉ１／ｉ２において同定された
アスヒブヤＯＲＦの分裂体は、Ｇ４１８培地上で胞子の
増殖を現わさないでは増殖せず、従って増殖のために必
須なものとしてそれらのＯＲＦの生成物を分類する（新
規の殺カビ標的物）。

【００９１】新規薬物標的物同定のためにアスヒブヤ、
すなわち小さなゲノム及び明らかにひじょうに少数の遺
伝子分裂を有する菌類を用いる１つの利点は、ＰＡＧ１
０１７ｉ１／ｉ２により表わされるＯＲＦはアスヒブヤ
において必須であるが、しかしＳ．セレビシアエの高い
相同性のＯＲＦＹｅｒＯ８２ｃは必須ではない事実に
より示される（Ｓｍｉｔｈ，Ｃｈｏｕ，Ｌａｓｈｋａｒ
ｉ，ＢｏｔｓｔｅｉｎａｎｄＢｒｏｗｎ，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ１９９６：２７４，２０６９−２０７４）。いく
つかの他のＯＲＦのクローン的に精製された分裂体はＧ
４１８培地上で増殖し、時々、遅い増殖表現型を示す変
異体（たとえば、ＡｇＤＨＣ１の分裂体）を同定する。

【００９２】Ｅ）ｐＧＥＮ３の構成ＧＥＮ３選択モジュールを、所望する標的遺伝子座に対
するＤＮＡ配列相同性の短い側端を用いてアスヒブヤ
ゴシピにおける相同組換えを可能にするために、特別に
企画する。ＧＥＮ３は、Ｓ．セレビシアエＴＥＦ２プ
ロモーター及びターミネーターの転写制御下にあるｋａ
ｎ^Ｒ−遺伝子の読取り枠から成る。抗生物質薬物ゲネチ
シンに対する耐性を付与するＧＥＮ３は、Ａ．ゴシピ
ゲノムに対する配列相同性を担持しない。

【００９３】ｐＧＥＮ３を構成するために、ｋａｎ−遺
伝子のＯＲＦを、ｐＦＡ−ｋａｎＭＸ４（Ｗａｃｈ，
Ａ．，Ｂｒａｃｈａｔ，Ａ．，Ｐｏｅｈｌｍａｎｎ，
Ｒ．，ａｎｄＰｈｉｌｉｐｐｓｅｎ，Ｐ．（１９９
４），Ｎｅｗｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｍｏｄｕｌ
ｅｓｆｏｒｃｌａｓｓｉｃａｌｏｒＰＣＲ−ｂ
ａｓｅｄｇｅｎｅｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓｉｎ
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｙ
ｅａｓｔ１０：１７９３−１８０８）から、Ｓ．セレ
ビシアエＴＥＦ２遺伝子に対する相同性の追加の４０
ｂｐの短い側端を含むプライマーＰＴＥＦ２−ｋａｎ及
びＴＴＥＦ２−ｋａｎ（表１）を用いて増幅する。二倍
体酵母株ＦＹ１６７９を、このＳＦＨ−ＰＣＲ生成物に
より形質転換する（Ｗａｃｈなど．，１９９４）。

【００９４】Ｇ４１８に対する耐性の形質転換体のゲノ
ムＤＮＡを、プライマーＴＥＦ２−１５０ＲＰＧ及びＴ
ＥＦ２−ＢｇｌＩＩを用いて、分析ＰＣＲによりＴＥＦ
２遺伝子座でのＰＣＲ生成物の組込みについて調べる。
二倍体バックグラウンドのために、野生型バンド２．２
６ｋｂ及び置換バンド１．７ｋｂが生成される。この
１．７ｋｂのフラグメントは、６０９ｂｐのＴＥＦ２−
プロモーター領域及び２７４ｂｐのＴＥＦ２−ターミネ
ーターを両端に有するｋａｎ−ＯＲＦを含む。この遺伝
子をＧＥＮ３と命名する。

【００９５】前記フラグメントを、アガロースゲルから
抽出し、そしてＢｇｌＩＩ−フラグメントとしてｐＡＦ
１００のＢｇｌＩＩ部位中に連結し（Ｔｈｉｅｒｒｙ
Ａ．，Ｆａｉｒｈｅａｄ，Ｃ．，ａｎｄＤａｊｏｎ，
Ｂ．（１９９０），Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｓｅｑｕ
ｅｎｃｅｏｆｔｈｅ８．２ｋｂｓｅｇｍｅｎｔ
ｌｅｆｔｏｆＭＡＴｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍ
ｅＩＩＩｒｅｖｅａｌｓｆｉｖｅＯＲＦ’ｓ，
ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｇｅｎｅｆｏｒａｙ
ｅａｓｔｒｉｂｏｋｉｎａｓｅ，Ｙｅａｓｔ６：５
２１−５３４）、ｐＧＥＮ３を生成する。Ａ．ゴシピに
おけるマーカー遺伝子としてのＧＥＮ３の有用性は、
Ａ．ゴシピにおける形質転換に基づいて自由な複製を可
能にするＡＲＳ含有ベクター（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ，Ｒ．
Ｓ．ａｎｄＨｉｅｔｅｒ，Ｐ．（１９８９），Ａｓ
ｙｓｔｅｍｏｆｓｈｕｔｔｌｅｖｅｃｔｏｒｓ
ａｎｄｙｅａｓｔｈｏｓｔｓｔｒａｉｎｓｄｅ
ｓｉｇｎｅｄｆｏｒｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍａｎｉ
ｐｕｌａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｉｎＳａｃｃｈａ
ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ，Ｇｅｎｅｔｉ
ｃｓ１２２：１９−２７）における遺伝子の再クロー
ニングにより確認される。

【００９６】オリゴヌクレオチドプライマー^１）ＰＴＥＦ２−ｋａｎ→ＧＴＴＴＴＴＡＧＡＡＴＡＴＡＣ
ＧＧＴＣＡＡＣＧＡＡＣＴＡＴＡＡＴＴＡＡＣＴＡＡＡ
ＣａｔｇｇｇｔａａｇｇａａａａｇａｃｔｃａＴＴＥＦ２−ｋａｎ→ＧＧＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＴ
ＴＡＴＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＣ
ｔｔａｇａａａａａｃｔｃａｔｃｇａｇｃａＴＥＦ２−１５０ＲＰＧ→ｇｃｇａｇａｔｃｔＧＧＴＧ
ＴＡＴＴＴＡＣＣＡＡＴＡＡＴＴＥＦ２−ＢｇｌＩＩ→
ｇｃｇａｇａｔｃｔＧＡＴＧＡＧＧＣＣＧＴＣＴＴＴＴ
ＧＴＴＧ１）：大文字は、相同領域として使用される
Ｓ．セレビシアエＤＮＡに対応する。小文字は、ｐＧＥ
Ｎ３，ｐＦＡ−ｋａｎＭＸ４（二重下線）に対する相同
性に対応し、又はｐＧＥＮ３のクローニングに使用され
る制限部位ＢｇｌＩＩ（太字）を含む追加のヌクレオチ
ドを表わす。

【００９７】例７：ＰＣＲに基づく診断技法を用いての
法的な同定本発明のＤＮＡ配列はまた、植物病原性菌類の異なった
種間を区別するために、及び菌類病原体と他の病原体、
たとえば細菌とを区別するためにも有用である。特に、
本発明のＤＮＡ配列は、菌類同定のためのＰＣＲに基づ
く分析において、プライマーとして、及びそれらのＤＮ
Ａ配列に由来するプライマーとして使用され得る。異な
った病原体間で異なるＤＮＡ配列は、それらの特定の病
原体間を同定し、そして区別するために使用され得る。

【００９８】たとえば、感染された小麦におけるガウマ
ンノミセスグラミニス（Ｇａｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ
ｇｒａｍｉｎｉｓ）の存在は、病原体ミトコンドリア
ゲノムに対して特異的な配列のＰＣＲを用いて検出され
ており（Ｓｃｈｌｅｓｓｅｒなど．，１９９１；Ａｐｐ
ｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．５７：５５３−５５６）、そしてランダムに増幅さ
れた多型性ＤＮＡ（すなわちＲＡＰＤ）マーカーは、球
果植物における腐敗病の原因物質であるグレメニアラ
アビエチナ（Ｇｒｅｍｍｅｎｉｅｌｌａａｂｉｅｔｉ
ｎａ）の多くの種類を区別することができた。アメリカ
特許第５，５８５，２３８号は、セプトリア（Ｓｅｐｔ
ｏｒｉａ）、プソイドセルコスポレラ（Ｐｓｅｕｄｏｃ
ｅｒｃｏｓｐｏｒｅｌｌａ）及びマイコスファエレラ
（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ）の菌株のリボソーム
ＲＮＡ遺伝子のＩＴＳ配列に由来するプライマー、及び
ＰＣＲに基づく技法を用いてのそれらの菌類単離物の同
定へのそれらの使用を記載する。

【００９９】ＰＣＲ分析へのＤＮＡ配列の使用方法は、
当業界において良く知られている。たとえばアメリカ特
許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２
号、並びにＳｃｈｌｅｓｓｅｒなど．，（１９９１）Ａ
ｐｐｌｉｅｄａｎｄＥｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌ．５７：５５３−５５６を参照のこと。また、ベ
ルチシリウム・アルボーアトラム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌ
ｉｕｍａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ）及びベルチシラム・ダ
ヒリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍｄａｈｌｉａｅ）
のＩＴＳ領域における差異を活用し、そして従って、２
つの種間を区別するためにＰＣＲ増幅を使用した、Ｎａ
ｚａｒなど．，（１９９１：Ｐｈｙｓｉｏｌ．ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ．３９：１−１
１）、及びバナナ病原体マイコスファエレラ・フィジエ
ンシス（Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｆｉｊｉｅｎ
ｓｉｓ）及びマイコスファエレラムシコラ（Ｍｙｃｏ
ｓｐｈａｒｅｌｌａｍｕｓｉｃｏｌａ）を区別するた
めに類似する技法を使用したＪｅｇｅｒ（１９９３：Ｍ
ｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．９７：６７０−６７４）を参照のこ
と。同様に、配列の列挙に示される本発明の配列は、そ
のようなＰＣＲ分析への使用のために適合され得る。

【０１００】

【表６】

【０１０１】

【表７】

【０１０２】

【表８】

【０１０３】

【表９】

【０１０４】

【表１０】

【０１０５】

【表１１】

【０１０６】

【表１２】

【０１０７】

【表１３】

【０１０８】

【表１４】

【０１０９】

【表１５】

【０１１０】

【表１６】

【０１１１】

【表１７】

【０１１２】

【表１８】

【０１１３】

【表１９】

【０１１４】

【表２０】

【０１１５】

【表２１】

【０１１６】

【表２２】

【０１１７】

【表２３】

【０１１８】

【表２４】

【０１１９】

【表２５】

【０１２０】

【表２６】

【０１２１】

【表２７】

【０１２２】

【表２８】

【０１２３】

【表２９】

【０１２４】

【表３０】

【０１２５】

【表３１】

【０１２６】

【表３２】

【０１２７】

【表３３】

【０１２８】

【表３４】

【０１２９】

【表３５】

【０１３０】

【表３６】

【０１３１】

【表３７】

【０１３２】

【表３８】

【０１３３】

【表３９】

【０１３４】

【表４０】

【０１３５】

【表４１】

【０１３６】

【表４２】

【０１３７】

【表４３】

【０１３８】

【表４４】

【０１３９】

【表４５】

【０１４０】

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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者ザビネシュタイナードイツ連邦共和国，53225 ボン，アグネスシュトラーセ６ (72)発明者クリスティネモーアスイス国，4123 アルシュビル，バーゼルマットベーク 163 (72)発明者ユルゲンベンドラントドイツ連邦共和国，79540 レラッハ，ノイエハイマットベーク８アー (72)発明者フィリップクネッヒトルスイス国，4104 オーベルビル，フォルデルベルグシュトラーセ 63 (72)発明者コリーヌレビシュンフランス国，68300 サン−ルイ，リュドゥリン４

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表から選択された配列を含んで成る
単離されたＤＮＡ分子。
【請求項２】関連した対のゲノム配列を得るために、
ランダムに取られたアスヒブヤ・ゴシピ（Ａｓｈｂｙａ
ｇｏｓｓｙｐｉｉ）ショットガンクローンの末端を配
列決定するための方法。
【請求項３】アスヒブヤ遺伝子の特性決定及び確認の
ための方法であって、（ａ）添付された配列表において提供されるゲノムｐＡ
Ｇクローンのアスヒブヤ配列中に、選択マーカー、及び
適切なクローニングベクターからの隣接する複数のクロ
ーニング領域を含んで成るキメラ遺伝子構造体を挿入
し；（ｂ）適切な宿主系において前記選択マーカー遺伝子に
より分裂されるアスヒブヤ配列を担持するクローンを選
択し；（ｃ）（ａ）の分裂カセットによりアスヒブヤを形質転
換し；（ｄ）前記選択マーカーモジュールの組込みの部位のま
わりのＤＮＡ配列分析により前記分裂されたオープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）を示し、そして前記選択
マーカーモジュールの配向を決定し；そして（ｅ）前記分裂部位での欠失／挿入がなんらかの表現型
の変更をもたらすかどうかを決定する；ことを含んで成る方法。
【請求項４】アスヒブヤ遺伝子の特性決定及び確認の
ための方法であって、（ａ）選択マーカーモジュールを含有する末端ショート
フランキングホモロジー領域（ＳｈｏｒｔＦｌａｎｋ
ｉｎｇＨｏｍｏｌｏｇｙｒｅｇｉｏｎｓ）を含んで
成る遺伝子標的化のためのカセットを設計し；（ｂ）Ａ．ゴシピ中に（ａ）の遺伝子標的化カセットを
トランスフェクトし、そして形質転換体を選択し；（ｃ）適切な試験法を適用することによって正しい遺伝
子標的化を確かめ；そして（ｅ）前記分裂部位での欠失／挿入がいづれかの表現型
の変更をもたらすかどうかを決定する；ことを含んで成る方法。
【請求項５】三重選択マーカーモジュールを含むアス
ヒブヤ遺伝子の特性決定及び確認のための方法であっ
て、（ａ）アスヒブヤゲノム内の興味あるもの（プロモー
ター交換変異体）のコード配列の開始コドンの前に、レ
ポーター、選択マーカー、及び好ましくは調節可能プロ
モーターである強力プロモーターを挿入し；（ｂ）前記（ａ）のプロモーター交換変異体及び野生型
株のそれぞれに、増殖のための可能性ある抗真菌剤を適
用し；そして（ｃ）前記強力プロモーター変換変異体の増殖又は非増
殖表現型を同定する；ことを含んで成る方法。
【請求項６】アスヒブヤ・ゴシピのプロモーター及び
ターミネーターを同定するためへの請求項１記載のＤＮ
Ａ分子の使用。
【請求項７】推定上のプロモーター領域が配列の整列
により同定され、そして開始コドン及びターミネーター
と共に、遺伝子選択マーカーのＯＲＦが前記推定上のプ
ロモーター領域の下流に配置される請求項６記載の使
用。
【請求項８】植物における広範囲の疾病耐性を誘発す
ることができる化合物を同定するためのスクリーニング
方法への請求項１記載の単離されたＤＮＡ分子及びその
変異体の使用。
【請求項９】スクリーニングアッセイにおいて使用さ
れるべきＤＮＡ配列の適合性が、アスヒブヤゲノムに
おける遺伝子分裂において決定される請求項８記載の使
用。
【請求項１０】選択マーカー、及び適切なクローニン
グベクターからの隣接する複数のクローニング領域を含
んで成る分裂カセットが使用される請求項９記載の使
用。
【請求項１１】選択マーカーを内在化するＤＮＡ分子
の両端に付加される短い標的配列相同体を包含する遺伝
子標的化方法に基づく請求項９記載の使用。
【請求項１２】植物病原性菌類の異なった種間を区別
し、そして菌類病原体と他の病原体、たとえば細菌とを
区別するためへの請求項１記載のＤＮＡ配列の使用。
【請求項１３】配列表から選択されたＤＮＡ配列を含
んで成るＤＮＡ分子であって、請求項３〜５のいづれか
１項記載の遺伝子分裂方法への前記分子の使用に基づく
殺虫剤スクリーンにおける可能性ある標的物として確認
される分子。