JPH11225781A - 淋菌の核酸の増幅および検出による淋菌の検出 - Google Patents
淋菌の核酸の増幅および検出による淋菌の検出Info
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- JPH11225781A JPH11225781A JP10309591A JP30959198A JPH11225781A JP H11225781 A JPH11225781 A JP H11225781A JP 10309591 A JP10309591 A JP 10309591A JP 30959198 A JP30959198 A JP 30959198A JP H11225781 A JPH11225781 A JP H11225781A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 患者の淋菌保菌に関し、Neisseria gonorrho
eaの存在を検出する方法の提供。 【解決手段】 本方法はNeisseria gonorrhoeaゲノムの
一部を増幅し、増幅された核酸の存在を検出することに
基づく。プライマーと検出用配列の様々なセットを開示
する。汚染性微生物の存在下であってもヒトＤＮＡの存
在下であっても、開示されたプライマーおよび検出用配
列を鎖置換増幅アッセイ、熱鎖置換増幅アッセイおよび
均一蛍光リアルタイム熱鎖置換増幅アッセイで使用し
て、Neisseria gonorrhoeaの存在を特異的に検出するこ
とができる。
eaの存在を検出する方法の提供。 【解決手段】 本方法はNeisseria gonorrhoeaゲノムの
一部を増幅し、増幅された核酸の存在を検出することに
基づく。プライマーと検出用配列の様々なセットを開示
する。汚染性微生物の存在下であってもヒトＤＮＡの存
在下であっても、開示されたプライマーおよび検出用配
列を鎖置換増幅アッセイ、熱鎖置換増幅アッセイおよび
均一蛍光リアルタイム熱鎖置換増幅アッセイで使用し
て、Neisseria gonorrhoeaの存在を特異的に検出するこ
とができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、患者に淋菌（ネイ
セリア・ゴノルホア；Neisseria gonorrhoea）が存在す
るか否かを決定する方法に関する。本方法は、好ましく
は鎖置換増幅(Strand Displacement Amplification;Ｓ
ＤＡ）、好熱性鎖置換増幅(thermophilic Strand Displ
acement Amplification;ｔＳＤＡ）または蛍光リアルタ
イムｔＳＤＡ(fluorescent real time tＳＤＡ)の技術
を使用して、淋菌のＤＮＡを特異的に増幅するために核
酸プライマーを使用することを含む。
セリア・ゴノルホア；Neisseria gonorrhoea）が存在す
るか否かを決定する方法に関する。本方法は、好ましく
は鎖置換増幅(Strand Displacement Amplification;Ｓ
ＤＡ）、好熱性鎖置換増幅(thermophilic Strand Displ
acement Amplification;ｔＳＤＡ）または蛍光リアルタ
イムｔＳＤＡ(fluorescent real time tＳＤＡ)の技術
を使用して、淋菌のＤＮＡを特異的に増幅するために核
酸プライマーを使用することを含む。
【０００２】
【従来の技術】Neisseria gonorrhoeaは、性行為感染症
淋病の原因因子である。淋病は、抗生物質治療にも拘わ
らず、ヒトについて報告されている最も流行している性
行為感染症の１つである。この微生物の診断および検出
は、今でも臨床スワブを一晩培養した後の化学的および
／または顕微鏡的同定に依存している。N. gonorrhoea
は、他の近縁関係にあるNeisseria属の種と極めて高度
の相同性を共有する。N.gonorrhoeaに特異的なプライマ
ーをデザインしようとするとき、難しい問題がある。本
発明は、好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）に使用されるN.
gonorrhoeaに特異的なプライマーの開発について記載
する。
淋病の原因因子である。淋病は、抗生物質治療にも拘わ
らず、ヒトについて報告されている最も流行している性
行為感染症の１つである。この微生物の診断および検出
は、今でも臨床スワブを一晩培養した後の化学的および
／または顕微鏡的同定に依存している。N. gonorrhoea
は、他の近縁関係にあるNeisseria属の種と極めて高度
の相同性を共有する。N.gonorrhoeaに特異的なプライマ
ーをデザインしようとするとき、難しい問題がある。本
発明は、好熱性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）に使用されるN.
gonorrhoeaに特異的なプライマーの開発について記載
する。
【０００３】Doneganらは、N. gonorrhoeaのゲノムＤＮ
Ａ由来のＭ１３ライブラリーの「サンドイッチハイブリ
ッド形成」スクリーニングによって、数種のN. gonorrh
oeaに特異的なＤＮＡフラグメントを同定した（Donegan
et al., Mol. Cell. Prob.3:13-26 (1989);米国特許第
４，７５５，４５８号）。米国特許第５，１０８，８９
５号には、このフラグメントの１つがさらにマッピング
され、特徴付されている。
Ａ由来のＭ１３ライブラリーの「サンドイッチハイブリ
ッド形成」スクリーニングによって、数種のN. gonorrh
oeaに特異的なＤＮＡフラグメントを同定した（Donegan
et al., Mol. Cell. Prob.3:13-26 (1989);米国特許第
４，７５５，４５８号）。米国特許第５，１０８，８９
５号には、このフラグメントの１つがさらにマッピング
され、特徴付されている。
【０００４】サザンハイブリダイゼーションやドットブ
ロットなどのオリゴヌクレオチドプローブに基づくアッ
セイは、迅速な結果を（すなわち、１日以内）、細菌感
染の診断に反映することができる。通常、核酸の増幅に
基づくアッセイはさらに敏感であり、さらに迅速に、多
くの場合１時間以内に、結果を提供することが可能であ
る。N. gonorrhoea感染を診断する場合、このような方
法は、この種に特異的なオリゴヌクレオチドプローブま
たはプライマーの開発を必要とする。
ロットなどのオリゴヌクレオチドプローブに基づくアッ
セイは、迅速な結果を（すなわち、１日以内）、細菌感
染の診断に反映することができる。通常、核酸の増幅に
基づくアッセイはさらに敏感であり、さらに迅速に、多
くの場合１時間以内に、結果を提供することが可能であ
る。N. gonorrhoea感染を診断する場合、このような方
法は、この種に特異的なオリゴヌクレオチドプローブま
たはプライマーの開発を必要とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、Neisseria go
norrhoeaの種特異的な検出および同定のための増幅プラ
イマーおよびアッセイプローブとして有用なオリゴヌク
レオチドを提供する。種特異性は、本発明のプライマー
が、他種の近縁関係にある微生物の標的配列をほとんど
または全く検出可能に増幅せずに、Neisseria gonorrho
eaの核酸の標的配列を増幅することを意味する。本発明
のプライマーは、Neisseria gonorrhoeaの標的配列を独
自に増幅するが、他の細菌の標的配列を増幅せず、その
ため、Neisseria gonorrhoeaを敏感に検出および同定す
ることができる。ｔＳＤＡに合うようにプライマーを最
適化すると、短い反応時間で増幅効率を高めることがで
きる。
norrhoeaの種特異的な検出および同定のための増幅プラ
イマーおよびアッセイプローブとして有用なオリゴヌク
レオチドを提供する。種特異性は、本発明のプライマー
が、他種の近縁関係にある微生物の標的配列をほとんど
または全く検出可能に増幅せずに、Neisseria gonorrho
eaの核酸の標的配列を増幅することを意味する。本発明
のプライマーは、Neisseria gonorrhoeaの標的配列を独
自に増幅するが、他の細菌の標的配列を増幅せず、その
ため、Neisseria gonorrhoeaを敏感に検出および同定す
ることができる。ｔＳＤＡに合うようにプライマーを最
適化すると、短い反応時間で増幅効率を高めることがで
きる。
【０００６】本発明のオリゴヌクレオチドは、培養後、
培養された生物の同一性を確認する手段として使用する
ことが可能である。あるいは、このオリゴヌクレオチド
は、既知の増幅方法を使用してNeisseria gonorrhoeaの
核酸を検出および同定するための培養前に、または培養
の代わりに使用することが可能である。いずれの場合に
も、本発明のオリゴヌクレオチドおよびアッセイ方法は
Neisseria gonorrhoeaと他種の微生物とを識別する手段
を提供し、開業医は、慣例上頼みにしている時間のかか
る表現型手法および生化学的手法を実施しなくても、こ
の微生物を迅速に同定することができる。感染に関与す
る特異的な病因がこのように迅速に同定できれば、適切
な治療法の決定に使用することができる情報を短時間の
うちに得ることができる。
培養された生物の同一性を確認する手段として使用する
ことが可能である。あるいは、このオリゴヌクレオチド
は、既知の増幅方法を使用してNeisseria gonorrhoeaの
核酸を検出および同定するための培養前に、または培養
の代わりに使用することが可能である。いずれの場合に
も、本発明のオリゴヌクレオチドおよびアッセイ方法は
Neisseria gonorrhoeaと他種の微生物とを識別する手段
を提供し、開業医は、慣例上頼みにしている時間のかか
る表現型手法および生化学的手法を実施しなくても、こ
の微生物を迅速に同定することができる。感染に関与す
る特異的な病因がこのように迅速に同定できれば、適切
な治療法の決定に使用することができる情報を短時間の
うちに得ることができる。
【０００７】本願明細書では、以下の用語を次のように
定義する。増幅プライマーは、標的配列にハイブリッド
形成後、プライマーの伸長によって標的配列を増幅する
ためのプライマーである。一般に、増幅プライマーは長
さ約１０〜７５ヌクレオチドであり、好ましくは長さ約
１５〜５０ヌクレオチドである。ＳＤＡ用の増幅プライ
マーの全長は、一般に約２５〜５０ヌクレオチドであ
る。ＳＤＡ増幅プライマー（標的結合配列）の３(末端
は、標的配列の５(末端でハイブリッド形成する。標的
結合配列は長さ約１０〜２５ヌクレオチドであり、増幅
プライマーにハイブリッド形成について特異性を与え
る。ＳＤＡ増幅プライマーは、制限エンドヌクレアーゼ
の認識部位５(から標的結合配列までをさらに含む。
定義する。増幅プライマーは、標的配列にハイブリッド
形成後、プライマーの伸長によって標的配列を増幅する
ためのプライマーである。一般に、増幅プライマーは長
さ約１０〜７５ヌクレオチドであり、好ましくは長さ約
１５〜５０ヌクレオチドである。ＳＤＡ用の増幅プライ
マーの全長は、一般に約２５〜５０ヌクレオチドであ
る。ＳＤＡ増幅プライマー（標的結合配列）の３(末端
は、標的配列の５(末端でハイブリッド形成する。標的
結合配列は長さ約１０〜２５ヌクレオチドであり、増幅
プライマーにハイブリッド形成について特異性を与え
る。ＳＤＡ増幅プライマーは、制限エンドヌクレアーゼ
の認識部位５(から標的結合配列までをさらに含む。
【０００８】G. Walkerらが記載している通り（PNAS 8
9: 392-396 (1992)および、Nucl. Acids Res.20: 1691
-1696 (1992)）、認識部位が半修飾されているとき、認
識部位はＤＮＡ二重らせんの鎖１本をニックする制限エ
ンドヌクレアーゼとして用いられる。ＳＤＡ中に増幅プ
ライマーの残りがニックされて置換されるとき、５(か
ら制限エンドヌクレアーゼ認識部位までのヌクレオチド
（「尾部」）は、ポリメラーゼリプライミング部位の役
割をする。尾部ヌクレオチドのリプライミング機能によ
ってＳＤＡ反応が維持され、１つの標的分子から多重ア
ンプリコンを合成することが可能になる。尾部は一般に
長さ約１０〜２５ヌクレオチドである。標的結合配列
は、その標的特異性を決定するプライマーの一部である
ため、標的の末端に専用の配列を必要としない増幅方法
の場合、一般に増幅プライマーは本質的に標的結合配列
のみで構成される。ニック可能な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位およびＳＤＡの尾部以外の標的に追加され
た、専用の配列（たとえば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは
転写ベースの増殖用のＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー）を必要とする増幅方法では、ルーチンのオリゴヌク
レオチド調製方法を使用して、プライマーのハイブリッ
ド形成特異性を変えずに、必要とする専用の配列を標的
結合配列に連結させることが可能である。
9: 392-396 (1992)および、Nucl. Acids Res.20: 1691
-1696 (1992)）、認識部位が半修飾されているとき、認
識部位はＤＮＡ二重らせんの鎖１本をニックする制限エ
ンドヌクレアーゼとして用いられる。ＳＤＡ中に増幅プ
ライマーの残りがニックされて置換されるとき、５(か
ら制限エンドヌクレアーゼ認識部位までのヌクレオチド
（「尾部」）は、ポリメラーゼリプライミング部位の役
割をする。尾部ヌクレオチドのリプライミング機能によ
ってＳＤＡ反応が維持され、１つの標的分子から多重ア
ンプリコンを合成することが可能になる。尾部は一般に
長さ約１０〜２５ヌクレオチドである。標的結合配列
は、その標的特異性を決定するプライマーの一部である
ため、標的の末端に専用の配列を必要としない増幅方法
の場合、一般に増幅プライマーは本質的に標的結合配列
のみで構成される。ニック可能な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位およびＳＤＡの尾部以外の標的に追加され
た、専用の配列（たとえば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは
転写ベースの増殖用のＲＮＡポリメラーゼプロモータ
ー）を必要とする増幅方法では、ルーチンのオリゴヌク
レオチド調製方法を使用して、プライマーのハイブリッ
ド形成特異性を変えずに、必要とする専用の配列を標的
結合配列に連結させることが可能である。
【０００９】バンパープライマーまたは外部プライマー
は、等温増幅反応でプライマー伸長生成物を置換するた
めに使用される。このバンパープライマーは、バンパー
プライマーの伸長が下流の増殖プライマーとその伸長生
成物を置換するという具合に、増幅プライマーの上流の
標的配列にアニーリングする。
は、等温増幅反応でプライマー伸長生成物を置換するた
めに使用される。このバンパープライマーは、バンパー
プライマーの伸長が下流の増殖プライマーとその伸長生
成物を置換するという具合に、増幅プライマーの上流の
標的配列にアニーリングする。
【００１０】標的または標的配列は、増幅すべき核酸配
列を指す。これは、増幅すべき最初の核酸配列、増幅す
べき最初の核酸配列の第２鎖および増幅反応によって産
生された最初の配列のコピーのいずれかの鎖を含む。こ
れらのコピーは、増幅プライマーがハイブリッド形成す
る対象である配列のコピーを含むという理由で、増幅可
能な標的の役割をする。
列を指す。これは、増幅すべき最初の核酸配列、増幅す
べき最初の核酸配列の第２鎖および増幅反応によって産
生された最初の配列のコピーのいずれかの鎖を含む。こ
れらのコピーは、増幅プライマーがハイブリッド形成す
る対象である配列のコピーを含むという理由で、増幅可
能な標的の役割をする。
【００１１】増幅反応中に生じた標的配列のコピーは、
増幅生成物、アンプリマー、またはアンプリコンと呼ば
れる。伸長生成物という用語は、プライマーのハイブリ
ッド形成および標的配列を鋳型として使用するポリメラ
ーゼによるプライマーの伸長によって生じる標的配列の
コピーを指す。
増幅生成物、アンプリマー、またはアンプリコンと呼ば
れる。伸長生成物という用語は、プライマーのハイブリ
ッド形成および標的配列を鋳型として使用するポリメラ
ーゼによるプライマーの伸長によって生じる標的配列の
コピーを指す。
【００１２】種特異性という用語は、同じ属の他種また
は異なる属の種では実質的に検出、増幅またはオリゴヌ
クレオチドハイブリッド形成しないが、ある生物種また
は一群の関連種ついては検出、増幅またはオリゴヌクレ
オチドハイブリッド形成することを指す。アッセイプロ
ーブという用語は、核酸の検出または同定を容易にする
ために使用されるオリゴヌクレオチドを指す。たとえ
ば、本発明では、アッセイプローブはN. gonorrhoea核
酸の検出および同定に使用される。以下に記載の検出プ
ローブ、検出用プライマー、捕捉プライマーおよびシグ
ナルプライマーは、アッセイプローブの例である。添付
の図面と一緒に読むと、以下の詳細な説明から本発明の
様々な目的、長所および斬新な特徴が容易に理解できる
であろう。
は異なる属の種では実質的に検出、増幅またはオリゴヌ
クレオチドハイブリッド形成しないが、ある生物種また
は一群の関連種ついては検出、増幅またはオリゴヌクレ
オチドハイブリッド形成することを指す。アッセイプロ
ーブという用語は、核酸の検出または同定を容易にする
ために使用されるオリゴヌクレオチドを指す。たとえ
ば、本発明では、アッセイプローブはN. gonorrhoea核
酸の検出および同定に使用される。以下に記載の検出プ
ローブ、検出用プライマー、捕捉プライマーおよびシグ
ナルプライマーは、アッセイプローブの例である。添付
の図面と一緒に読むと、以下の詳細な説明から本発明の
様々な目的、長所および斬新な特徴が容易に理解できる
であろう。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明は、核酸増幅反応でNeisse
ria gonorrhoeaについて特異性を示すオリゴヌクレオチ
ド、増幅プライマーおよびアッセイプローブを提供す
る。本発明のオリゴヌクレオチドを使用してNeisseria
gonorrhoeaの核酸を検出および同定する方法も提供す
る。好ましい方法はｔＳＤＡおよび均一リアルタイム蛍
光ｔＳＤＡ反応でオリゴヌクレオチドを使用することで
ある。以上の方法は米国特許第５，５４７，８６１号、
米国特許第５，６４８，２１１号、１９９７年５月３０
日に提出された米国特許出願第０８／８６５，６７５
号、および１９９７年５月１３日に提出された米国特許
出願番号第０８／８５５，０８５号により教示されてお
り、引用することによりこの開示内容は本明細書の一部
をなすものとする。
ria gonorrhoeaについて特異性を示すオリゴヌクレオチ
ド、増幅プライマーおよびアッセイプローブを提供す
る。本発明のオリゴヌクレオチドを使用してNeisseria
gonorrhoeaの核酸を検出および同定する方法も提供す
る。好ましい方法はｔＳＤＡおよび均一リアルタイム蛍
光ｔＳＤＡ反応でオリゴヌクレオチドを使用することで
ある。以上の方法は米国特許第５，５４７，８６１号、
米国特許第５，６４８，２１１号、１９９７年５月３０
日に提出された米国特許出願第０８／８６５，６７５
号、および１９９７年５月１３日に提出された米国特許
出願番号第０８／８５５，０８５号により教示されてお
り、引用することによりこの開示内容は本明細書の一部
をなすものとする。
【００１４】本発明は、Neisseria gonorrhoeaゲノムＤ
ＮＡを特異的に増幅して検出する３種のｔＳＤＡシステ
ム（ＧＣＩＲ５、ＧＣＩＲＳＬおよびＧＣ０２）を提供
する。各システムについて数種プライマーの組み合わせ
をデザインし、統計学的にデザインされた実験で試験し
た。各システムについて最良のプライマーの組み合わせ
で、特異性、感度および交差反応性の実験を行った。
ＮＡを特異的に増幅して検出する３種のｔＳＤＡシステ
ム（ＧＣＩＲ５、ＧＣＩＲＳＬおよびＧＣ０２）を提供
する。各システムについて数種プライマーの組み合わせ
をデザインし、統計学的にデザインされた実験で試験し
た。各システムについて最良のプライマーの組み合わせ
で、特異性、感度および交差反応性の実験を行った。
【００１５】N. gonorrhoeaゲノムＤＮＡの８００塩基
対領域を対象に配列分析を実施した。プライマーGC 1.
3、5'-CTGATATCTGCATGGAGGCAA-3'(配列番号１)およびGC
2.3、5'-GATCGTAATCTCCGCCTTTCTT-3'(配列番号２) を
使用して、８００bp領域を作成し、IR.R.2、5'-CCGCAGC
ATACGCGCAAATCAA-3'(配列番号３)およびIRLI、5'- GGTA
TGGTTTCAAGACGCTTCA-3'(配列番号４)を使用して、その
内部の２００bp領域を作成した。しかし、このフラグメ
ント内に、Neisseria種との交差反応性領域が幾つか同
定された。この情報に基づいて、３種のｔＳＤＡシステ
ムをデザインした。
対領域を対象に配列分析を実施した。プライマーGC 1.
3、5'-CTGATATCTGCATGGAGGCAA-3'(配列番号１)およびGC
2.3、5'-GATCGTAATCTCCGCCTTTCTT-3'(配列番号２) を
使用して、８００bp領域を作成し、IR.R.2、5'-CCGCAGC
ATACGCGCAAATCAA-3'(配列番号３)およびIRLI、5'- GGTA
TGGTTTCAAGACGCTTCA-3'(配列番号４)を使用して、その
内部の２００bp領域を作成した。しかし、このフラグメ
ント内に、Neisseria種との交差反応性領域が幾つか同
定された。この情報に基づいて、３種のｔＳＤＡシステ
ムをデザインした。
【００１６】Neisseria gonorrhoea核酸の８００bpフラ
グメントに基づいて、プライマーをデザインした。最適
条件に合うように、プライマーの組み合わせをスクリー
ニングした。様々な検出用プローブのｔＳＤＡ反応およ
び蛍光リアルタイムｔＳＤＡ反応における特異性および
感度を試験した。
グメントに基づいて、プライマーをデザインした。最適
条件に合うように、プライマーの組み合わせをスクリー
ニングした。様々な検出用プローブのｔＳＤＡ反応およ
び蛍光リアルタイムｔＳＤＡ反応における特異性および
感度を試験した。
【００１７】核酸はハイブリッド形成に完全な相補性を
必要としないため、本願明細書に開示されているプロー
ブ配列およびプライマー配列は、Neisseria gonorrhoea
に特異的なプローブおよびプライマーとしての有用性を
喪失せずに、ある程度修飾できることが理解されるであ
ろう。当該技術において周知の通り、ハイブリッド形成
条件（すなわち、ハイブリッド形成温度または緩衝液の
塩含有量）を調節してストリンジェンシーを増大または
低減することにより、相補的核酸配列および部分的相補
的核酸配列のハイブリッド形成を達成することが可能で
ある。開示された配列のこのような些細な修飾およびNe
isseria gonorrhoeaについての特異性を維持するために
必要なハイブリッド形成条件の調節は、ルーチンの実験
のみを必要とし、且つ当該技術上通常の熟練の範囲内で
ある。
必要としないため、本願明細書に開示されているプロー
ブ配列およびプライマー配列は、Neisseria gonorrhoea
に特異的なプローブおよびプライマーとしての有用性を
喪失せずに、ある程度修飾できることが理解されるであ
ろう。当該技術において周知の通り、ハイブリッド形成
条件（すなわち、ハイブリッド形成温度または緩衝液の
塩含有量）を調節してストリンジェンシーを増大または
低減することにより、相補的核酸配列および部分的相補
的核酸配列のハイブリッド形成を達成することが可能で
ある。開示された配列のこのような些細な修飾およびNe
isseria gonorrhoeaについての特異性を維持するために
必要なハイブリッド形成条件の調節は、ルーチンの実験
のみを必要とし、且つ当該技術上通常の熟練の範囲内で
ある。
【００１８】本発明のプライマーを使用して製作した増
幅生成物は、独特のサイズによってたとえば、臭化エチ
ジウムで染色したポリアクリルアミドゲルまたはアガロ
ースゲル上で、検出することが可能である。あるいは、
検出可能な標識で標識したオリゴヌクレオチドであるア
ッセイプローブを使用して、増幅されたN. gonorrhoea
標的配列を検出することが可能である。１つの実施態様
では、少なくとも１つのアッセイプローブを、ハイブリ
ッド形成（検出用プローブ）、Walker et al.,Nucl. Ac
ids Res.,前出に記載のハイブリッド形成および伸長
（検出用プライマー）、または欧州特許第0 678 582号
に記載のハイブリッド形成、伸長および二本鎖型への変
換（シグナルプライマー）によって増幅された標的配列
の検出に使用することが可能である。好ましくは、アッ
セイプローブは、増幅プライマーの間にある標的の配列
にハイブリッド形成するように選択される、すなわち、
アッセイプローブは内部アッセイプローブでなければな
らない。あるいは、増幅プライマーまたはその標的結合
配列を、アッセイプローブとして使用することが可能で
ある。
幅生成物は、独特のサイズによってたとえば、臭化エチ
ジウムで染色したポリアクリルアミドゲルまたはアガロ
ースゲル上で、検出することが可能である。あるいは、
検出可能な標識で標識したオリゴヌクレオチドであるア
ッセイプローブを使用して、増幅されたN. gonorrhoea
標的配列を検出することが可能である。１つの実施態様
では、少なくとも１つのアッセイプローブを、ハイブリ
ッド形成（検出用プローブ）、Walker et al.,Nucl. Ac
ids Res.,前出に記載のハイブリッド形成および伸長
（検出用プライマー）、または欧州特許第0 678 582号
に記載のハイブリッド形成、伸長および二本鎖型への変
換（シグナルプライマー）によって増幅された標的配列
の検出に使用することが可能である。好ましくは、アッ
セイプローブは、増幅プライマーの間にある標的の配列
にハイブリッド形成するように選択される、すなわち、
アッセイプローブは内部アッセイプローブでなければな
らない。あるいは、増幅プライマーまたはその標的結合
配列を、アッセイプローブとして使用することが可能で
ある。
【００１９】アッセイプローブの検出可能な標識は、標
的核酸が存在する指標として、直接または間接に検出す
ることができる部分である。標識の直接検出の場合、ア
ッセイプローブを放射性同位元素で標識してオートラジ
オグラフィーで検出するか、または蛍光部分で標識して
当該技術上周知の蛍光で検出することが可能である。あ
るいは、アッセイプローブを検出可能にするために別の
試薬を必要とする標識で標識することによって、アッセ
イプローブを間接的に検出することが可能である。間接
的に検出可能な標識としては、たとえば、化学発光剤、
目に見える反応生成物を生じる酵素および標識された特
異的結合パートナー（たとえば、抗体または抗原／ハプ
テン）に結合することによって検出することが可能なリ
ガンド（たとえば、ハプテン、抗体または抗原）などが
ある。リガンドは、検出を容易にするために、リガンド
−標識オリゴヌクレオチドを固相に固定するのにも有用
である（捕捉プローブ）。特に有用な標識としては、ビ
オチン（標識されたアビジンまたはストレプトアビジン
に結合することによって検出できる）および西洋ワサビ
ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素
（酵素基質を加えて有色反応生成物を生ずることによっ
て検出できる）などがある。オリゴヌクレオチドに、こ
のような標識を加えたりこのような標識を含める方法は
当該技術上周知であり、これらの方法のいずれも本発明
について使用するのに適している。
的核酸が存在する指標として、直接または間接に検出す
ることができる部分である。標識の直接検出の場合、ア
ッセイプローブを放射性同位元素で標識してオートラジ
オグラフィーで検出するか、または蛍光部分で標識して
当該技術上周知の蛍光で検出することが可能である。あ
るいは、アッセイプローブを検出可能にするために別の
試薬を必要とする標識で標識することによって、アッセ
イプローブを間接的に検出することが可能である。間接
的に検出可能な標識としては、たとえば、化学発光剤、
目に見える反応生成物を生じる酵素および標識された特
異的結合パートナー（たとえば、抗体または抗原／ハプ
テン）に結合することによって検出することが可能なリ
ガンド（たとえば、ハプテン、抗体または抗原）などが
ある。リガンドは、検出を容易にするために、リガンド
−標識オリゴヌクレオチドを固相に固定するのにも有用
である（捕捉プローブ）。特に有用な標識としては、ビ
オチン（標識されたアビジンまたはストレプトアビジン
に結合することによって検出できる）および西洋ワサビ
ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素
（酵素基質を加えて有色反応生成物を生ずることによっ
て検出できる）などがある。オリゴヌクレオチドに、こ
のような標識を加えたりこのような標識を含める方法は
当該技術上周知であり、これらの方法のいずれも本発明
について使用するのに適している。
【００２０】使用することが可能な特異的検出方法の例
としては、米国特許第５，４７０，７２３号に記載され
ているビオチン化された捕捉プローブおよび酵素複合検
出用プローブを使用して増幅生成物を検出する化学発光
法がある。上記２つのアッセイプローブを、標的配列の
アッセイ領域の異なる部位（２つの増幅プライマーの結
合部位の間）にハイブリッド形成した後、捕捉プローブ
を使用して、この複合体をストレプトアビジンでコート
した微量滴定プレート上に捕捉し、化学発光シグナルを
発生させて照度計で読む。増幅生成物を検出する別の代
わりとして、欧州特許第0 678 582号に記載のシグナル
プライマーがＳＤＡ反応に含まれていてもよい。この実
施態様では、標識された二次増幅生成物が、標的の増幅
に依存的な様式でＳＤＡ中に作られ、これを、関連標識
を使用して標的増幅の目安として検出することができ
る。
としては、米国特許第５，４７０，７２３号に記載され
ているビオチン化された捕捉プローブおよび酵素複合検
出用プローブを使用して増幅生成物を検出する化学発光
法がある。上記２つのアッセイプローブを、標的配列の
アッセイ領域の異なる部位（２つの増幅プライマーの結
合部位の間）にハイブリッド形成した後、捕捉プローブ
を使用して、この複合体をストレプトアビジンでコート
した微量滴定プレート上に捕捉し、化学発光シグナルを
発生させて照度計で読む。増幅生成物を検出する別の代
わりとして、欧州特許第0 678 582号に記載のシグナル
プライマーがＳＤＡ反応に含まれていてもよい。この実
施態様では、標識された二次増幅生成物が、標的の増幅
に依存的な様式でＳＤＡ中に作られ、これを、関連標識
を使用して標的増幅の目安として検出することができ
る。
【００２１】商業的に便利なため、N. gonorrhoea核酸
の特異的検出および同定のための増幅プライマーをキッ
トの形で提供することが可能である。一般に、このよう
なキットは、本発明による増幅プライマーを少なくとも
１対含む。N. gonorrhoeaに特異的な増幅プライマーと
共に、核酸増幅反応を実施するための試薬たとえば、緩
衝液、別のプライマー、ヌクレオチド三リン酸、酵素な
ども含んでもよい。キットの成分は、普通の容器内に一
緒に包装されており、場合に応じて、本発明の方法の個
々の実施態様を実施するための説明書が入っている。他
の任意の成分、たとえば、アッセイプローブとして使用
するのに適した標識で標識されたオリゴヌクレオチド、
および／または標識を検出するための試薬または方法
も、キットに含めることができる。
の特異的検出および同定のための増幅プライマーをキッ
トの形で提供することが可能である。一般に、このよう
なキットは、本発明による増幅プライマーを少なくとも
１対含む。N. gonorrhoeaに特異的な増幅プライマーと
共に、核酸増幅反応を実施するための試薬たとえば、緩
衝液、別のプライマー、ヌクレオチド三リン酸、酵素な
ども含んでもよい。キットの成分は、普通の容器内に一
緒に包装されており、場合に応じて、本発明の方法の個
々の実施態様を実施するための説明書が入っている。他
の任意の成分、たとえば、アッセイプローブとして使用
するのに適した標識で標識されたオリゴヌクレオチド、
および／または標識を検出するための試薬または方法
も、キットに含めることができる。
【００２２】検出用プローブと関連した増幅プライマー
の標的結合配列は、ハイブリッド形成の種特異性をオリ
ゴヌクレオチドに与えることができ、したがって増幅に
基づくアッセイに種特異性を与えることができる。選択
された増幅反応の実施に必要であれば、オリゴヌクレオ
チドの種特異性を変えずに、他の配列を、本願明細書に
開示されている標的結合配列に任意に加えることが可能
である。例として、本発明のN. gonorrhoeaに特異的な
増幅プライマーは、ＳＤＡ反応中にニックされる制限エ
ンドヌクレアーゼBsoB1の認識部位を含んでもよい。欧
州特許第0 648 315号に記載の認識部位を含むがこれに
限定されない、他のニック可能な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位をBsoB1認識部位の代わりに用いてもよいこ
とが当業者には明白であろう。好ましくは、認識部位
は、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）の条件下で増幅反応を実
施することができるように好熱性制限エンドヌクレアー
ゼとして用いられる。同様に、増幅プライマーの尾部配
列（５(から制限エンドヌクレアーゼ認識部位まで）は
一般に重要ではないが、ＳＤＡに使用される制限部位お
よび自身の標的結合配列または他のプライマーのいずれ
かにハイブリッド形成する配列は避けなければならな
い。したがって、本発明によるＳＤＡ用の増幅プライマ
ーは、３(標的結合配列、ニック可能な制限エンドヌク
レアーゼ認識部位５(から標的結合配列まで、および長
さ約１０〜２５ヌクレオチドの尾部配列から制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位までで構成される。ニック可能な
制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびテイル配列は、
ＳＤＡ反応に必要な配列である。他の増幅反応の場合、
本発明による増幅プライマーは、開示されている標的結
合配列のみで構成されてもよく（たとえば、ＰＣＲの場
合）、または標的結合配列と選択された増幅反応に必要
な別の配列（たとえば、上述のＳＤＡに必要な配列また
は３ＳＲ用ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモ
ーター）とで構成されてもよい。
の標的結合配列は、ハイブリッド形成の種特異性をオリ
ゴヌクレオチドに与えることができ、したがって増幅に
基づくアッセイに種特異性を与えることができる。選択
された増幅反応の実施に必要であれば、オリゴヌクレオ
チドの種特異性を変えずに、他の配列を、本願明細書に
開示されている標的結合配列に任意に加えることが可能
である。例として、本発明のN. gonorrhoeaに特異的な
増幅プライマーは、ＳＤＡ反応中にニックされる制限エ
ンドヌクレアーゼBsoB1の認識部位を含んでもよい。欧
州特許第0 648 315号に記載の認識部位を含むがこれに
限定されない、他のニック可能な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位をBsoB1認識部位の代わりに用いてもよいこ
とが当業者には明白であろう。好ましくは、認識部位
は、好熱性ＳＤＡ（ｔＳＤＡ）の条件下で増幅反応を実
施することができるように好熱性制限エンドヌクレアー
ゼとして用いられる。同様に、増幅プライマーの尾部配
列（５(から制限エンドヌクレアーゼ認識部位まで）は
一般に重要ではないが、ＳＤＡに使用される制限部位お
よび自身の標的結合配列または他のプライマーのいずれ
かにハイブリッド形成する配列は避けなければならな
い。したがって、本発明によるＳＤＡ用の増幅プライマ
ーは、３(標的結合配列、ニック可能な制限エンドヌク
レアーゼ認識部位５(から標的結合配列まで、および長
さ約１０〜２５ヌクレオチドの尾部配列から制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位までで構成される。ニック可能な
制限エンドヌクレアーゼ認識部位およびテイル配列は、
ＳＤＡ反応に必要な配列である。他の増幅反応の場合、
本発明による増幅プライマーは、開示されている標的結
合配列のみで構成されてもよく（たとえば、ＰＣＲの場
合）、または標的結合配列と選択された増幅反応に必要
な別の配列（たとえば、上述のＳＤＡに必要な配列また
は３ＳＲ用ＲＮＡポリメラーゼにより認識されるプロモ
ーター）とで構成されてもよい。
【００２３】ＳＤＡでは、バンパープライマーは下流の
種特異的増殖プライマーと置換する作用をするため、バ
ンパープライマーは種特異性に不可欠ではない。バンパ
ープライマーが伸長されるとき、ハンパープライマーが
増幅プライマーとその伸長生成物を置換えるために、バ
ンパープライマーが増幅プライマーから上流の標的にハ
イブリッド形成できることのみが必要である。したがっ
て、バンパープライマーの個々の配列は、一般に重要で
はなく、バンパープライマーが伸長するとすぐに、増幅
プライマー伸長生成物を置換できるほど、増幅プライマ
ーの結合部位に十分に近い任意の上流標的配列から誘導
することが可能である。バンパープライマーが相変わら
ず特定の標的配列にハイブリッド形成できる限り、バン
パープライマー配列における標的と時にミスマッチがあ
ったとしても、または非標的配列との若干の交差ハイブ
リッドを形成しても、一般に、それらのことが増幅効率
に負の影響を及ぼすことはない。しかし、本願明細書に
記載のバンパープライマーはN. gonorrhoeaに特異的で
あり、したがって要望があれば、増幅プライマーの標的
結合配列としても使用することができる。
種特異的増殖プライマーと置換する作用をするため、バ
ンパープライマーは種特異性に不可欠ではない。バンパ
ープライマーが伸長されるとき、ハンパープライマーが
増幅プライマーとその伸長生成物を置換えるために、バ
ンパープライマーが増幅プライマーから上流の標的にハ
イブリッド形成できることのみが必要である。したがっ
て、バンパープライマーの個々の配列は、一般に重要で
はなく、バンパープライマーが伸長するとすぐに、増幅
プライマー伸長生成物を置換できるほど、増幅プライマ
ーの結合部位に十分に近い任意の上流標的配列から誘導
することが可能である。バンパープライマーが相変わら
ず特定の標的配列にハイブリッド形成できる限り、バン
パープライマー配列における標的と時にミスマッチがあ
ったとしても、または非標的配列との若干の交差ハイブ
リッドを形成しても、一般に、それらのことが増幅効率
に負の影響を及ぼすことはない。しかし、本願明細書に
記載のバンパープライマーはN. gonorrhoeaに特異的で
あり、したがって要望があれば、増幅プライマーの標的
結合配列としても使用することができる。
【００２４】本発明のプライマーを使用する増幅反応
は、Walkerら（前出）による教示通り、チミンを含んで
もよく、あるいは、たとえば欧州特許第0 624 643号に
教示されている通りに、ＴＴＰの代わりに2(-デオキシ
ウリジン5(-三リン酸を全体的にまたは部分的に反応に
用いて、次の増幅反応の交差汚染を減少させることが可
能である。ｄＵ（ウリジン）は増幅生成物中に組込まれ
るため、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）処理
によって切り取ることができる。これらの非塩基性部位
は、次の増幅反応で増幅生成物を非増幅可能にさせる。
次の増幅を実施する前に、ウラシルグリコシラーゼイン
ヒビター（Ｕgi）によってＵＤＧを失活させ、新たに形
成された増幅生成物におけるｄUの切除を防止すること
ができる。
は、Walkerら（前出）による教示通り、チミンを含んで
もよく、あるいは、たとえば欧州特許第0 624 643号に
教示されている通りに、ＴＴＰの代わりに2(-デオキシ
ウリジン5(-三リン酸を全体的にまたは部分的に反応に
用いて、次の増幅反応の交差汚染を減少させることが可
能である。ｄＵ（ウリジン）は増幅生成物中に組込まれ
るため、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）処理
によって切り取ることができる。これらの非塩基性部位
は、次の増幅反応で増幅生成物を非増幅可能にさせる。
次の増幅を実施する前に、ウラシルグリコシラーゼイン
ヒビター（Ｕgi）によってＵＤＧを失活させ、新たに形
成された増幅生成物におけるｄUの切除を防止すること
ができる。
【００２５】プライマー、バンパーおよび検出用配列の
異なる組み合わせを使用して、ｔＳＤＡを実施するため
の他のシステムを開発した。しかし、他のシステムは、
特性が十分にないこと、最適条件の範囲が狭いこと、安
定でないことなど様々な理由で好ましくなかった。N. g
onorrhoea核酸配列の均一な核酸増幅およびリアルタイ
ム検出を実施するのに有用であったシステムを、下記の
プライマーおよび検出用配列から開発した。
異なる組み合わせを使用して、ｔＳＤＡを実施するため
の他のシステムを開発した。しかし、他のシステムは、
特性が十分にないこと、最適条件の範囲が狭いこと、安
定でないことなど様々な理由で好ましくなかった。N. g
onorrhoea核酸配列の均一な核酸増幅およびリアルタイ
ム検出を実施するのに有用であったシステムを、下記の
プライマーおよび検出用配列から開発した。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】蛍光リアルタイムｔＳＤＡ技術を使用し
て、Neisseria gonorrhoeaの分析を実施した。ＧＣＩＲ
５およびＧＣＩＲＳＬ用にデザインしたプライマー、バ
ンパーおよび検出用配列を、それぞれ図１および図２に
示す。ＤＮＡ配列の上または下の四角で、増幅プライマ
ーおよび蛍光検出用配列のアニーリング領域を示す。最
適感度を得るために、蛍光ＧＣＩＲ５およびＧＣＩＲＳ
ＬのｔＳＤＡの条件を継続的に修飾した。下記は、ＧＣ
ＩＲ５用のこのような１組の最適条件およびＧＣＩＲＳ
Ｌ用のこのような１組の最適条件である。
て、Neisseria gonorrhoeaの分析を実施した。ＧＣＩＲ
５およびＧＣＩＲＳＬ用にデザインしたプライマー、バ
ンパーおよび検出用配列を、それぞれ図１および図２に
示す。ＤＮＡ配列の上または下の四角で、増幅プライマ
ーおよび蛍光検出用配列のアニーリング領域を示す。最
適感度を得るために、蛍光ＧＣＩＲ５およびＧＣＩＲＳ
ＬのｔＳＤＡの条件を継続的に修飾した。下記は、ＧＣ
ＩＲ５用のこのような１組の最適条件およびＧＣＩＲＳ
Ｌ用のこのような１組の最適条件である。
【００３０】ＧＣＩＲ５ ７％グリセロール ８％ＤＭＳＯ ４５mMリン酸カリウム (0.1mM)dATP、(0.1mM)dGTP、(0.25mM)dUTP、(0.7mM)α
−チオdCTP ５mM酢酸マグネシウム １００μg/mlＢＳＡ １．８２％トレハロース ３６０μM ＤＴＴ ２４００ngヒトＤＮＡ ３２０単位BsoBI制限エンドヌクレアーゼ ２０単位Bstポリメラーゼ １単位ウラシル−N−グリコシラーゼ ５単位ウラシル−N−グリコシラーゼインヒビター ２００nM検出用配列（ＦＤ１０）（配列番号１５） ５００nM増幅プライマー（GCIR-AL5.3（配列番号７）お
よびGCIR-AR5.1（配列番号８）） ５０nMバンパー（GCIR-BL5.1（配列番号１１）およびGC
IR-BR5.1（配列番号１２））
−チオdCTP ５mM酢酸マグネシウム １００μg/mlＢＳＡ １．８２％トレハロース ３６０μM ＤＴＴ ２４００ngヒトＤＮＡ ３２０単位BsoBI制限エンドヌクレアーゼ ２０単位Bstポリメラーゼ １単位ウラシル−N−グリコシラーゼ ５単位ウラシル−N−グリコシラーゼインヒビター ２００nM検出用配列（ＦＤ１０）（配列番号１５） ５００nM増幅プライマー（GCIR-AL5.3（配列番号７）お
よびGCIR-AR5.1（配列番号８）） ５０nMバンパー（GCIR-BL5.1（配列番号１１）およびGC
IR-BR5.1（配列番号１２））
【００３１】反応体積１００μl 除染を４５℃で２０分間実施した 増幅を５２℃で６０分間実施した
【００３２】ＧＣＩＲＳＬ ７％グリセロール ５％ＤＭＳＯ ２５mMリン酸カリウム (0.2mM)dATP、(0.2mM)dGTP、(0.5mM)dUTP、(1.4mM)α−
チオdCTP ６mM酢酸マグネシウム １００μg/mlＢＳＡ １．８２％トレハロース ３６０μM ＤＴＴ ２０００ngヒトＤＮＡ １単位ウラシル−N−グリコシラーゼ ５単位ウラシル−N−グリコシラーゼインヒビター ４８０単位BsoBI ３０単位Bst ２００nM検出用配列（ＧＣＩＲＳＬ．ＦＤ１（配列番号
３１）） ５００nM増幅プライマー（GCIRSL-APL1（配列番号２
２）およびGCIRSL.APR1（配列番号２４）） ５０nMバンパー（GCIRSL.BL（配列番号２７）およびGCI
RSL.BR（配列番号２８））
チオdCTP ６mM酢酸マグネシウム １００μg/mlＢＳＡ １．８２％トレハロース ３６０μM ＤＴＴ ２０００ngヒトＤＮＡ １単位ウラシル−N−グリコシラーゼ ５単位ウラシル−N−グリコシラーゼインヒビター ４８０単位BsoBI ３０単位Bst ２００nM検出用配列（ＧＣＩＲＳＬ．ＦＤ１（配列番号
３１）） ５００nM増幅プライマー（GCIRSL-APL1（配列番号２
２）およびGCIRSL.APR1（配列番号２４）） ５０nMバンパー（GCIRSL.BL（配列番号２７）およびGCI
RSL.BR（配列番号２８））
【００３３】反応体積１００ul 除染を４５℃で２０分間実施した 増幅を５２℃で６０分間実施した
【００３４】例に詳細に説明する通り、検出用配列GCIR
5-FD10（配列番号１５）およびGCIRSL-FD1（配列番号３
１）と、標的ＤＮＡ源としてのプラスミドＧＣ１０とを
使用して、蛍光リアルタイムｔＳＤＡにおけるＧＣＩＲ
５およびＧＣＩＲＳＬの感度を評価した。プラスミドＧ
Ｃ１０は、ｐUC18に挿入されたNeisseria gonorrhoeaゲ
ノムの８００塩基対領域を含む。ＧＣ１０プラスミドの
２５０コピー、５０コピー、２５コピーおよび１２コピ
ーの滴定を使用して、蛍光ｔＳＤＡを実施した。ＦＤ１
０を用いたＧＣＩＲ５は、下は２５コピーのＧＣ１０プ
ラスミドまで検出することができた。リアルタイムｔＳ
ＤＡにおけるＧＣＩＲＳＬの感度は、２５０コピーのＧ
Ｃ１０プラスミドであると決定された。陽性であるとい
う反応の判定は、試料反応のＲＦＵ値とネガティブコン
トロール（標的ＤＮＡを全く加えない）のＲＦＵ値を比
較することによって決定した。ＧＣ１０との反応によっ
て、ネガティブコントロールの平均ＲＦＵ値の２〜３倍
より大きいＲＦＵ値が生じれば、その時は陽性であると
考えた。
5-FD10（配列番号１５）およびGCIRSL-FD1（配列番号３
１）と、標的ＤＮＡ源としてのプラスミドＧＣ１０とを
使用して、蛍光リアルタイムｔＳＤＡにおけるＧＣＩＲ
５およびＧＣＩＲＳＬの感度を評価した。プラスミドＧ
Ｃ１０は、ｐUC18に挿入されたNeisseria gonorrhoeaゲ
ノムの８００塩基対領域を含む。ＧＣ１０プラスミドの
２５０コピー、５０コピー、２５コピーおよび１２コピ
ーの滴定を使用して、蛍光ｔＳＤＡを実施した。ＦＤ１
０を用いたＧＣＩＲ５は、下は２５コピーのＧＣ１０プ
ラスミドまで検出することができた。リアルタイムｔＳ
ＤＡにおけるＧＣＩＲＳＬの感度は、２５０コピーのＧ
Ｃ１０プラスミドであると決定された。陽性であるとい
う反応の判定は、試料反応のＲＦＵ値とネガティブコン
トロール（標的ＤＮＡを全く加えない）のＲＦＵ値を比
較することによって決定した。ＧＣ１０との反応によっ
て、ネガティブコントロールの平均ＲＦＵ値の２〜３倍
より大きいＲＦＵ値が生じれば、その時は陽性であると
考えた。
【００３５】ＧＣＩＲ５の他の検出用配列は、別の実験
で試験されていた。ＦＤ１（配列番号２１）、ＦＤ２
（配列番号２０）、ＦＤ３（配列番号１７）、ＦＤ６
（配列番号１９）、ＦＤ８（配列番号１６）、ＦＤ１１
（配列番号１８）。ＦＤ８、ＦＤ３およびＦＤ１は、２
５０コピーのレベルでＧＣ１０プラスミドを検出するこ
とができたが、ＦＤ１１，ＦＤ６およびＦＤ２などの他
のものは、この同一標的濃度で、ＲＦＵ値が低かった。
このことから、最高の感度を得るためには、複数の検出
用配列／長さを試験することが重要なことがわかり、結
果として、GCIR5-FD10（配列番号１５）をリアルタイム
蛍光ｔＳＤＡで使用する一次検出用として選択した。
で試験されていた。ＦＤ１（配列番号２１）、ＦＤ２
（配列番号２０）、ＦＤ３（配列番号１７）、ＦＤ６
（配列番号１９）、ＦＤ８（配列番号１６）、ＦＤ１１
（配列番号１８）。ＦＤ８、ＦＤ３およびＦＤ１は、２
５０コピーのレベルでＧＣ１０プラスミドを検出するこ
とができたが、ＦＤ１１，ＦＤ６およびＦＤ２などの他
のものは、この同一標的濃度で、ＲＦＵ値が低かった。
このことから、最高の感度を得るためには、複数の検出
用配列／長さを試験することが重要なことがわかり、結
果として、GCIR5-FD10（配列番号１５）をリアルタイム
蛍光ｔＳＤＡで使用する一次検出用として選択した。
【００３６】様々なNeisseria gonorrhoea菌株、他のNe
isseria種、および無関係の細菌およびウイルスを試験
することによって、ＧＣＩＲ５およびＧＣＩＲＳＬの特
異性および交差反応性を決定した。Neisseria gonorrho
eakin１２菌株を１×１０4ゲノムで試験した。全ての交
差反応体ＤＮＡを約１〜１０7ゲノムコピーに希釈し
た。Neisseria gonorrhoea１２菌株を１×１０4ゲノム
で試験した。全ての交差反応物ＤＮＡを約１×１０7ゲ
ノムコピーに希釈した。複数の実験による特異性および
交差反応性を表９にまとめる。
isseria種、および無関係の細菌およびウイルスを試験
することによって、ＧＣＩＲ５およびＧＣＩＲＳＬの特
異性および交差反応性を決定した。Neisseria gonorrho
eakin１２菌株を１×１０4ゲノムで試験した。全ての交
差反応体ＤＮＡを約１〜１０7ゲノムコピーに希釈し
た。Neisseria gonorrhoea１２菌株を１×１０4ゲノム
で試験した。全ての交差反応物ＤＮＡを約１×１０7ゲ
ノムコピーに希釈した。複数の実験による特異性および
交差反応性を表９にまとめる。
【００３７】鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、プライマーの伸
長、半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位のニ
ッキング、１本鎖伸長生成物の置換、プライマーの伸長
生成物（または最初の標的配列）へのアニーリング、お
よび次のプライマーの伸長が反応混合物中で同時に起こ
る等温核酸増幅法である。これは、反応の温度循環特性
の結果として、反応の諸段階が不連続な相またはサイク
ルで起こるポリメラーゼ連鎖反応とは違う。ＳＤＡは、
１）制限エンドヌクレアーゼが、ヘミチオリン酸型の二
本鎖認識／開裂部位の未修飾鎖をニックできること、
２）あるポリメラーゼが、ニックで複製を開始し、下流
の非鋳型鎖を置換できることに基づいている。プライマ
ーアニーリング用の二本鎖標的配列を変性させるため、
高温（約９５℃）で初回インキュベーション後、その後
の重合および新たに合成された鎖の置換は一定の温度で
行われる。標的配列の各新しいコピーの生産は、５つの
段階で構成される。１）増幅プライマーを、最初の標的
配列または予め重合させて置換した一本鎖伸長生成物に
結合させること、２）α−チオデオキシヌクレオシド三
リン酸（α−チオｄＮＴＰ）を組み込む５(−３(エキソ
ヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによるプライマーの伸
長、３）半修飾二本鎖制限部位のニッキング、４）ニッ
ク部位からの制限酵素の分離、および５）５(−３(エキ
ソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによる、ニックの３
(末端からの伸長と、下流の新たに合成された鎖の置
換。ニックからの伸長によって別のニック可能な制限部
位が発生するため、ニッキング、重合および置換は一定
の温度で同時に且つ連続的に起こる。一対の増幅プライ
マーを使用し、その各々が二本鎖標的配列の２本の鎖の
うちの１本にハイブリッド形成するとき、増幅は指数関
数的である。これは、センス鎖およびアンチセンス鎖
が、次の回の増幅で反対側のプライマーの鋳型の役割を
果たすためである。増幅プライマーを１個使用すると
き、鎖１本のみがプライマー伸長の鋳型の役割をするた
め、増幅は直線的である。α−チオｄＮＴＰが組み込ま
れるとき、二本鎖認識／開裂部位をニックする制限エン
ドヌクレアーゼの例は、HincII、HindII、AvaI、NciIお
よびFnu4HIである。以上の制限エンドヌクレアーゼ全て
と、必要なニッキング活性を示す他の制限エンドヌクレ
アーゼは、従来のＳＤＡで使用するのに適している。し
かし、これらは比較的に熱に不安定であり、約４０℃を
超えると活性を失う傾向がある。
長、半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位のニ
ッキング、１本鎖伸長生成物の置換、プライマーの伸長
生成物（または最初の標的配列）へのアニーリング、お
よび次のプライマーの伸長が反応混合物中で同時に起こ
る等温核酸増幅法である。これは、反応の温度循環特性
の結果として、反応の諸段階が不連続な相またはサイク
ルで起こるポリメラーゼ連鎖反応とは違う。ＳＤＡは、
１）制限エンドヌクレアーゼが、ヘミチオリン酸型の二
本鎖認識／開裂部位の未修飾鎖をニックできること、
２）あるポリメラーゼが、ニックで複製を開始し、下流
の非鋳型鎖を置換できることに基づいている。プライマ
ーアニーリング用の二本鎖標的配列を変性させるため、
高温（約９５℃）で初回インキュベーション後、その後
の重合および新たに合成された鎖の置換は一定の温度で
行われる。標的配列の各新しいコピーの生産は、５つの
段階で構成される。１）増幅プライマーを、最初の標的
配列または予め重合させて置換した一本鎖伸長生成物に
結合させること、２）α−チオデオキシヌクレオシド三
リン酸（α−チオｄＮＴＰ）を組み込む５(−３(エキソ
ヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによるプライマーの伸
長、３）半修飾二本鎖制限部位のニッキング、４）ニッ
ク部位からの制限酵素の分離、および５）５(−３(エキ
ソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼによる、ニックの３
(末端からの伸長と、下流の新たに合成された鎖の置
換。ニックからの伸長によって別のニック可能な制限部
位が発生するため、ニッキング、重合および置換は一定
の温度で同時に且つ連続的に起こる。一対の増幅プライ
マーを使用し、その各々が二本鎖標的配列の２本の鎖の
うちの１本にハイブリッド形成するとき、増幅は指数関
数的である。これは、センス鎖およびアンチセンス鎖
が、次の回の増幅で反対側のプライマーの鋳型の役割を
果たすためである。増幅プライマーを１個使用すると
き、鎖１本のみがプライマー伸長の鋳型の役割をするた
め、増幅は直線的である。α−チオｄＮＴＰが組み込ま
れるとき、二本鎖認識／開裂部位をニックする制限エン
ドヌクレアーゼの例は、HincII、HindII、AvaI、NciIお
よびFnu4HIである。以上の制限エンドヌクレアーゼ全て
と、必要なニッキング活性を示す他の制限エンドヌクレ
アーゼは、従来のＳＤＡで使用するのに適している。し
かし、これらは比較的に熱に不安定であり、約４０℃を
超えると活性を失う傾向がある。
【００３８】標的配列を切断しないエンドヌクレアーゼ
で制限することによって、より大きい核酸を分割するこ
とによって、ＳＤＡによる増幅の標的を調製することが
可能である。しかし、Walkerら（Nuc. Acids Res. (199
2)前出）および米国特許第５，２７０，１８４号（引用
することにより本明細書の一部をなすものとする）に記
載の通りに、ＳＤＡ反応におけるニッキング用に選択さ
れた制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を有する標
的核酸を調製することが一般に好ましい。簡単に説明す
ると、標的配列が二本鎖の場合、４種のプライマーが標
的配列にハイブリッド形成する。そのプライマーのうち
２種（Ｓ1およびＳ2）はＳＤＡ増幅プライマーであり、
２種（Ｂ1およびＢ2）は外部プライマーまたはバンパー
プライマーである。Ｓ1とＳ2は、標的配列に隣接する二
本鎖核酸の反対の鎖に結合する。Ｂ1とＢ2は、それぞれ
Ｓ1およびＳ2の標的配列５(（すなわち、上流）に結合
する。３種のデオキシヌクレオシド三リン酸および少な
くとも１種の修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸
（たとえば、２(−デオキシアデノシン５(−O−(１−チ
オ三リン酸)、「ｄＡＴＰαＳ」）が存在する条件下
で、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを使用して４
種のプライマー全てを同時に伸長させる。置換された、
増幅プライマーの一本鎖伸長生成物は、反対の増幅プラ
イマーおよびバンパープライマーを結合する標的の役割
をする（たとえば、Ｓ1の伸長生成物はＳ2およびＢ2を
結合する）。次の伸長および置換のサイクルで、各末端
に半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を有す
る２つの二本鎖核酸フラグメントが生じる。これらは、
ＳＤＡによる増幅に適した基質である。ＳＤＡの場合と
同様、標的生成反応の個々の段階は同時に且つ連続的に
起こり、ＳＤＡでの制限酵素によるニッキングに必要な
末端に認識／開裂部位を有する標的配列が生じる。ＳＤ
Ａ反応の成分の全てが既に標的生成反応に存在するた
め、自動的且つ連続的に発生した標的配列はＳＤＡサイ
クルに入って増幅される。
で制限することによって、より大きい核酸を分割するこ
とによって、ＳＤＡによる増幅の標的を調製することが
可能である。しかし、Walkerら（Nuc. Acids Res. (199
2)前出）および米国特許第５，２７０，１８４号（引用
することにより本明細書の一部をなすものとする）に記
載の通りに、ＳＤＡ反応におけるニッキング用に選択さ
れた制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を有する標
的核酸を調製することが一般に好ましい。簡単に説明す
ると、標的配列が二本鎖の場合、４種のプライマーが標
的配列にハイブリッド形成する。そのプライマーのうち
２種（Ｓ1およびＳ2）はＳＤＡ増幅プライマーであり、
２種（Ｂ1およびＢ2）は外部プライマーまたはバンパー
プライマーである。Ｓ1とＳ2は、標的配列に隣接する二
本鎖核酸の反対の鎖に結合する。Ｂ1とＢ2は、それぞれ
Ｓ1およびＳ2の標的配列５(（すなわち、上流）に結合
する。３種のデオキシヌクレオシド三リン酸および少な
くとも１種の修飾されたデオキシヌクレオシド三リン酸
（たとえば、２(−デオキシアデノシン５(−O−(１−チ
オ三リン酸)、「ｄＡＴＰαＳ」）が存在する条件下
で、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼを使用して４
種のプライマー全てを同時に伸長させる。置換された、
増幅プライマーの一本鎖伸長生成物は、反対の増幅プラ
イマーおよびバンパープライマーを結合する標的の役割
をする（たとえば、Ｓ1の伸長生成物はＳ2およびＢ2を
結合する）。次の伸長および置換のサイクルで、各末端
に半修飾制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位を有す
る２つの二本鎖核酸フラグメントが生じる。これらは、
ＳＤＡによる増幅に適した基質である。ＳＤＡの場合と
同様、標的生成反応の個々の段階は同時に且つ連続的に
起こり、ＳＤＡでの制限酵素によるニッキングに必要な
末端に認識／開裂部位を有する標的配列が生じる。ＳＤ
Ａ反応の成分の全てが既に標的生成反応に存在するた
め、自動的且つ連続的に発生した標的配列はＳＤＡサイ
クルに入って増幅される。
【００３９】１つのＳＤＡ反応が別の増幅生成物によっ
て交差汚染されるのを防止するために、増幅反応を阻害
せずに、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡ増幅ＤＮ
Ａに組み込むことが可能である。ウラシルＤＮＡグリコ
シラーゼ（ＵＤＧ）で処理することによって、ウラシル
修飾核酸を特異的に認識させ失活させることが可能であ
る。したがって、先行反応でＳＤＡ増幅ＤＮＡにｄＵＴ
Ｐが組み込まれる場合、二本鎖標的を増幅する前に、後
続のあらゆるＳＤＡ反応をＵＤＧで処理し、以前の増幅
反応由来のｄＵ含有ＤＮＡを増幅不可能にさせることが
できる。その後の反応で増幅すべき標的ＤＮＡはｄＵを
含まず、ＵＤＧ処理による影響を受けない。次に、標的
を増幅する前にUgiで処理することにより、ＵＤＧを阻
害することが可能である。あるいは、UDGを熱失活させ
てもよい。好熱性ＳＤＡでは、より高い反応温度そのも
の（≧５０℃）を使用してＵＤＧ失活と標的の増幅を同
時に行うことができる。
て交差汚染されるのを防止するために、増幅反応を阻害
せずに、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰをＳＤＡ増幅ＤＮ
Ａに組み込むことが可能である。ウラシルＤＮＡグリコ
シラーゼ（ＵＤＧ）で処理することによって、ウラシル
修飾核酸を特異的に認識させ失活させることが可能であ
る。したがって、先行反応でＳＤＡ増幅ＤＮＡにｄＵＴ
Ｐが組み込まれる場合、二本鎖標的を増幅する前に、後
続のあらゆるＳＤＡ反応をＵＤＧで処理し、以前の増幅
反応由来のｄＵ含有ＤＮＡを増幅不可能にさせることが
できる。その後の反応で増幅すべき標的ＤＮＡはｄＵを
含まず、ＵＤＧ処理による影響を受けない。次に、標的
を増幅する前にUgiで処理することにより、ＵＤＧを阻
害することが可能である。あるいは、UDGを熱失活させ
てもよい。好熱性ＳＤＡでは、より高い反応温度そのも
の（≧５０℃）を使用してＵＤＧ失活と標的の増幅を同
時に行うことができる。
【００４０】ＳＤＡには、５(−３(エキソヌクレアーゼ
活性がなく、二本鎖核酸の一本鎖ニックで重合を開始
し、ニックの下流で鎖を置換すると同時に、非ニック鎖
を鋳型として使用して新しい相補鎖を生成するポリメラ
ーゼが必要である。非結合３(−ＯＨにヌクレオチドを
加えることによって、このポリメラーゼを伸長させなけ
ればならい。ＳＤＡ反応を最適化させるためには、ポリ
メラーゼが極めて前進的であり、増幅することが可能な
標的配列の長さを最大にすることが望ましい。極めて前
進的なポリメラーゼは、伸長生成物の分離および合成停
止前に、かなりの長さの新しい鎖を重合することができ
る。置換活性は、コピーのさらなる合成に標的を利用で
きるようにし、指数関数的な増幅反応で第二の増幅プラ
イマーをハイブリッド形成することが可能な対象である
一本鎖伸長生成物を生成するため、増幅反応に置換活性
は不可欠である。反応を永続させ、次回の標的増幅を開
始させるのはニッキングであるため、ニッキング活性も
非常に重要である。
活性がなく、二本鎖核酸の一本鎖ニックで重合を開始
し、ニックの下流で鎖を置換すると同時に、非ニック鎖
を鋳型として使用して新しい相補鎖を生成するポリメラ
ーゼが必要である。非結合３(−ＯＨにヌクレオチドを
加えることによって、このポリメラーゼを伸長させなけ
ればならい。ＳＤＡ反応を最適化させるためには、ポリ
メラーゼが極めて前進的であり、増幅することが可能な
標的配列の長さを最大にすることが望ましい。極めて前
進的なポリメラーゼは、伸長生成物の分離および合成停
止前に、かなりの長さの新しい鎖を重合することができ
る。置換活性は、コピーのさらなる合成に標的を利用で
きるようにし、指数関数的な増幅反応で第二の増幅プラ
イマーをハイブリッド形成することが可能な対象である
一本鎖伸長生成物を生成するため、増幅反応に置換活性
は不可欠である。反応を永続させ、次回の標的増幅を開
始させるのはニッキングであるため、ニッキング活性も
非常に重要である。
【００４１】好熱性ＳＤＡは、望ましい熱安定なポリメ
ラーゼおよび熱安定な制限エンドヌクレアーゼを置き換
えて、Walkerら（PNASおよびNuc. Acids Res. (1992)前
出）に記載の従来のＳＤＡと本質的に同様に実施され
る。もちろん、置換された酵素に適したより高い温度に
反応温度を調節し、HincII制限エンドヌクレアーゼ認識
／開裂部位を、選択された熱安定なエンドヌクレアーゼ
の適当な制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位と置換
する。また、Walkerらとは違って、酵素が変性温度で十
分に安定であれば、初回変性ステップの前に、臨床医は
反応混合物に酵素を含めることが可能である。好熱性Ｓ
ＤＡで使用するのに好ましい制限エンドヌクレアーゼは
BsrI、BstNI、BsmAIおよびBsoB1（New England BioLab
s）、およびBstOI（Promega）である。好ましい好熱性ポ
リメラーゼはBca (Panvera)およびBst（New England Bi
oLabs）である。
ラーゼおよび熱安定な制限エンドヌクレアーゼを置き換
えて、Walkerら（PNASおよびNuc. Acids Res. (1992)前
出）に記載の従来のＳＤＡと本質的に同様に実施され
る。もちろん、置換された酵素に適したより高い温度に
反応温度を調節し、HincII制限エンドヌクレアーゼ認識
／開裂部位を、選択された熱安定なエンドヌクレアーゼ
の適当な制限エンドヌクレアーゼ認識／開裂部位と置換
する。また、Walkerらとは違って、酵素が変性温度で十
分に安定であれば、初回変性ステップの前に、臨床医は
反応混合物に酵素を含めることが可能である。好熱性Ｓ
ＤＡで使用するのに好ましい制限エンドヌクレアーゼは
BsrI、BstNI、BsmAIおよびBsoB1（New England BioLab
s）、およびBstOI（Promega）である。好ましい好熱性ポ
リメラーゼはBca (Panvera)およびBst（New England Bi
oLabs）である。
【００４２】均一リアルタイム蛍光ｔＳＤＡはｔＳＤＡ
の改良型である。この方法は検出用オリゴヌクレオチド
を使用して、蛍光消光を標的依存性様式で減少させる。
検出用オリゴヌクレオチドは、標的の非存在下で蛍光消
光が起こるように結合されたドナー／アクセプター色素
対を含む。標的の存在下で検出用オリゴヌクレオチドの
分子内塩基対二次構造が開いて線状化する(linearize)
と、色素間の距離が増大し、蛍光消光が減少する。一般
に、塩基対二次構造の展開は、二次構造が少なくとも部
分的に崩壊されるような、二次構造の配列と相補鎖との
間の分子内塩基対形成を含む。塩基対二次構造は、十分
な長さの相補鎖の存在下で完全に線状化すると考えられ
る。好ましい実施態様で、制限エンドヌクレアーゼ認識
部位（Restriction endonuclease recognition site;Ｒ
ＥＲＳ）は２つの色素の間に存在し、二次構造と相補鎖
との間の分子内塩基対はＲＥＲＳも二本鎖にして、制限
エンドヌクレアーゼで開裂可能にする。制限エンドヌク
レアーゼによる開裂またはニッキングは、ドナー色素と
アクセプター色素を別個の核酸フラグメント上に分け、
さらに消光を減少させる一因となる。いずれの実施態様
でも、関連する蛍光パラメータの変化（たとえば、ドナ
ー蛍光強度の増加、アクセプター蛍光強度の低減または
展開前後の蛍光の比率）を標的配列の存在の指標として
モニタリングする。一般にドナー蛍光強度の変化はアク
セプター蛍光強度の変化よりも大きいため、ドナー蛍光
強度の変化をモニタリングすることが好ましい。蛍光寿
命の変化など、他の蛍光パラメータをモニタリングして
もよい。
の改良型である。この方法は検出用オリゴヌクレオチド
を使用して、蛍光消光を標的依存性様式で減少させる。
検出用オリゴヌクレオチドは、標的の非存在下で蛍光消
光が起こるように結合されたドナー／アクセプター色素
対を含む。標的の存在下で検出用オリゴヌクレオチドの
分子内塩基対二次構造が開いて線状化する(linearize)
と、色素間の距離が増大し、蛍光消光が減少する。一般
に、塩基対二次構造の展開は、二次構造が少なくとも部
分的に崩壊されるような、二次構造の配列と相補鎖との
間の分子内塩基対形成を含む。塩基対二次構造は、十分
な長さの相補鎖の存在下で完全に線状化すると考えられ
る。好ましい実施態様で、制限エンドヌクレアーゼ認識
部位（Restriction endonuclease recognition site;Ｒ
ＥＲＳ）は２つの色素の間に存在し、二次構造と相補鎖
との間の分子内塩基対はＲＥＲＳも二本鎖にして、制限
エンドヌクレアーゼで開裂可能にする。制限エンドヌク
レアーゼによる開裂またはニッキングは、ドナー色素と
アクセプター色素を別個の核酸フラグメント上に分け、
さらに消光を減少させる一因となる。いずれの実施態様
でも、関連する蛍光パラメータの変化（たとえば、ドナ
ー蛍光強度の増加、アクセプター蛍光強度の低減または
展開前後の蛍光の比率）を標的配列の存在の指標として
モニタリングする。一般にドナー蛍光強度の変化はアク
セプター蛍光強度の変化よりも大きいため、ドナー蛍光
強度の変化をモニタリングすることが好ましい。蛍光寿
命の変化など、他の蛍光パラメータをモニタリングして
もよい。
【００４３】均一リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の検出用
オリゴヌクレオチドは、標的配列（標的結合配列）にハ
イブリッド形成する一本鎖５(セクションまたは３(セク
ションを含むオリゴヌクレオチドであり、標的結合配列
に隣接する分子内塩基対二次構造である。本発明のオリ
ゴヌクレオチドは、二次構造が分子内塩基対形成すると
き蛍光が消え、二次構造が開いて線状化すると蛍光消光
が減少するという具合に、検出用オリゴヌクレオチドに
結合したドナー／アクセプター色素対をさらに含む。オ
リゴヌクレオチドの開裂は、ＤＮＡ二重らせんの両鎖の
ホスホジエステル結合の破壊または一本鎖ＤＮＡのホス
ホジエステル結合の破壊を指す。これは、ＤＮＡ二重ら
せんの鎖２本のうちの１本のみのホスホジエステル結合
の破壊を指すニッキングとは違う。
オリゴヌクレオチドは、標的配列（標的結合配列）にハ
イブリッド形成する一本鎖５(セクションまたは３(セク
ションを含むオリゴヌクレオチドであり、標的結合配列
に隣接する分子内塩基対二次構造である。本発明のオリ
ゴヌクレオチドは、二次構造が分子内塩基対形成すると
き蛍光が消え、二次構造が開いて線状化すると蛍光消光
が減少するという具合に、検出用オリゴヌクレオチドに
結合したドナー／アクセプター色素対をさらに含む。オ
リゴヌクレオチドの開裂は、ＤＮＡ二重らせんの両鎖の
ホスホジエステル結合の破壊または一本鎖ＤＮＡのホス
ホジエステル結合の破壊を指す。これは、ＤＮＡ二重ら
せんの鎖２本のうちの１本のみのホスホジエステル結合
の破壊を指すニッキングとは違う。
【００４４】均一リアルタイム蛍光ｔＳＤＡ用の発明の
検出用オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長またはハ
イブリッド形成のために選択された反応条件で分子内塩
基対二次構造を形成する配列を含む。この二次構造は、
標的結合配列の少なくとも一部が一本鎖３(テイルまた
は５(テイルを形成するように、検出オリゴヌクレオチ
ドの標的結合配列に隣接して位置する。本願明細書で使
用されるとき、用語「標的結合配列に隣接した」は標的
結合配列の全部または一部が、標的へのハイブリッド形
成に利用できる５(尾部または３(尾部中に一本鎖のまま
残されることを意味する。すなわち、二次構造は標的結
合配列全体を含まない。標的結合配列の一部が二次構造
の分子内塩基対形成に含まれてもよく、二次構造の分子
内塩基対形成に含まれる第１の配列の全部または一部を
含んでもよいが、その相補的配列内に伸長しないことが
好ましい。たとえば、二次構造がステム・ループ構造
（たとえば、「ヘアピン」）であり、検出用オリゴヌク
レオチドの標的結合配列が一本鎖３(尾部として存在す
る場合、標的結合配列もステムの第１アームの全部また
は一部、および場合に応じて、ループの全部または一部
に伸長してもよい。しかし、標的結合配列は、ステム分
子内塩基対形成に関与する配列の第２アーム内に伸長し
ないことが好ましい。すなわち、標的にハイブリッド形
成することができる二次構造の分子内塩基対形成に関与
する両配列を具有しないことが望ましい。検出用オリゴ
ヌクレオチド二次構造の分子内塩基対部分が不適当な組
み合わせの場合、標的の存在下で蛍光の変化の大きさが
低減するが、アッセイの感度が問題でなければ、容認で
きる。一本鎖尾部の標的結合配列の不適当な組み合わせ
も容認できるが、同様にアッセイの感度および／または
特異性が低減する可能性がある。しかし、二次構造と標
的結合配列の両者における完全な塩基対形成が反応を犠
牲にしないことが本発明の特徴である。ハイブリッド形
成に関与する配列が完全に適合すると、反応速度論に負
の影響を及ぼすことなく、分析の特異性が向上する。
検出用オリゴヌクレオチドは、プライマー伸長またはハ
イブリッド形成のために選択された反応条件で分子内塩
基対二次構造を形成する配列を含む。この二次構造は、
標的結合配列の少なくとも一部が一本鎖３(テイルまた
は５(テイルを形成するように、検出オリゴヌクレオチ
ドの標的結合配列に隣接して位置する。本願明細書で使
用されるとき、用語「標的結合配列に隣接した」は標的
結合配列の全部または一部が、標的へのハイブリッド形
成に利用できる５(尾部または３(尾部中に一本鎖のまま
残されることを意味する。すなわち、二次構造は標的結
合配列全体を含まない。標的結合配列の一部が二次構造
の分子内塩基対形成に含まれてもよく、二次構造の分子
内塩基対形成に含まれる第１の配列の全部または一部を
含んでもよいが、その相補的配列内に伸長しないことが
好ましい。たとえば、二次構造がステム・ループ構造
（たとえば、「ヘアピン」）であり、検出用オリゴヌク
レオチドの標的結合配列が一本鎖３(尾部として存在す
る場合、標的結合配列もステムの第１アームの全部また
は一部、および場合に応じて、ループの全部または一部
に伸長してもよい。しかし、標的結合配列は、ステム分
子内塩基対形成に関与する配列の第２アーム内に伸長し
ないことが好ましい。すなわち、標的にハイブリッド形
成することができる二次構造の分子内塩基対形成に関与
する両配列を具有しないことが望ましい。検出用オリゴ
ヌクレオチド二次構造の分子内塩基対部分が不適当な組
み合わせの場合、標的の存在下で蛍光の変化の大きさが
低減するが、アッセイの感度が問題でなければ、容認で
きる。一本鎖尾部の標的結合配列の不適当な組み合わせ
も容認できるが、同様にアッセイの感度および／または
特異性が低減する可能性がある。しかし、二次構造と標
的結合配列の両者における完全な塩基対形成が反応を犠
牲にしないことが本発明の特徴である。ハイブリッド形
成に関与する配列が完全に適合すると、反応速度論に負
の影響を及ぼすことなく、分析の特異性が向上する。
【００４５】本発明の検出用オリゴヌクレオチドシグナ
ルプライマーを増幅反応に加えると、増幅プライマーの
ハイブリッド形成および伸長によって二本鎖型に変換さ
れる。ポリメラーゼによる鎖置換も二次構造を開いたり
線状化したりし、相補鎖の合成によってこれを二本鎖型
に変換する。ＲＥＲＳは、存在すれば、二本鎖で且つ制
限エンドヌクレアーゼで開裂可能またはニック可能にな
る。ポリメラーゼの鎖置換活性によって二次構造が展開
されたり線状化されたりすると、ドナー色素とアクセプ
ター色素との間の距離が増大し、その結果ドナー蛍光の
消光が低減する。関連した、ドナー色素またはアクセプ
ター色素のいずれかの蛍光の変化を、標的配列の増幅の
指標としてモニタリングしたり検出したりすることが可
能である。一般に、ＲＥＲＳが開裂またはニックする
と、二本鎖二次増幅生成物の別々のフラグメントが２個
生じ、各々に２種の色素のうちの１種が結合しているた
め、蛍光の変化の大きさがさらに増大する。このフラグ
メントは反応溶液中で自由に拡散でき、ドナー／アクセ
プター対の色素間の距離がさらに増大する。ドナー蛍光
強度の増大またはアクセプター蛍光強度の低減は、標的
増幅が起こっているまたは起こった指標として、検出お
よび／またはモニタリングすることができるが、ドナー
／アクセプター色素対の近接によって影響を受ける他の
蛍光パラメータもモニタリングすることが可能である。
ドナーまたはアクセプターの蛍光強度の変化も、ドナー
および／またはアクセプター蛍光強度の比率の変化とし
て検出することが可能である。たとえば、ａ）二次構造
を線状化または展開した後のドナー発蛍光団蛍光と、線
状化または展開する前の検出用オリゴヌクレオチドにお
けるドナー発蛍光団蛍光との比率の増加、またはｂ）線
状化(linearization)または展開した後のアクセプター
色素蛍光と、線状化または展開する前の検出用オリゴヌ
クレオチドにおけるアクセプター色素蛍光との比率の低
減として、蛍光強度の変化を検出することが可能であ
る。
ルプライマーを増幅反応に加えると、増幅プライマーの
ハイブリッド形成および伸長によって二本鎖型に変換さ
れる。ポリメラーゼによる鎖置換も二次構造を開いたり
線状化したりし、相補鎖の合成によってこれを二本鎖型
に変換する。ＲＥＲＳは、存在すれば、二本鎖で且つ制
限エンドヌクレアーゼで開裂可能またはニック可能にな
る。ポリメラーゼの鎖置換活性によって二次構造が展開
されたり線状化されたりすると、ドナー色素とアクセプ
ター色素との間の距離が増大し、その結果ドナー蛍光の
消光が低減する。関連した、ドナー色素またはアクセプ
ター色素のいずれかの蛍光の変化を、標的配列の増幅の
指標としてモニタリングしたり検出したりすることが可
能である。一般に、ＲＥＲＳが開裂またはニックする
と、二本鎖二次増幅生成物の別々のフラグメントが２個
生じ、各々に２種の色素のうちの１種が結合しているた
め、蛍光の変化の大きさがさらに増大する。このフラグ
メントは反応溶液中で自由に拡散でき、ドナー／アクセ
プター対の色素間の距離がさらに増大する。ドナー蛍光
強度の増大またはアクセプター蛍光強度の低減は、標的
増幅が起こっているまたは起こった指標として、検出お
よび／またはモニタリングすることができるが、ドナー
／アクセプター色素対の近接によって影響を受ける他の
蛍光パラメータもモニタリングすることが可能である。
ドナーまたはアクセプターの蛍光強度の変化も、ドナー
および／またはアクセプター蛍光強度の比率の変化とし
て検出することが可能である。たとえば、ａ）二次構造
を線状化または展開した後のドナー発蛍光団蛍光と、線
状化または展開する前の検出用オリゴヌクレオチドにお
けるドナー発蛍光団蛍光との比率の増加、またはｂ）線
状化(linearization)または展開した後のアクセプター
色素蛍光と、線状化または展開する前の検出用オリゴヌ
クレオチドにおけるアクセプター色素蛍光との比率の低
減として、蛍光強度の変化を検出することが可能であ
る。
【００４６】ＳＤＡのほかにも、本発明の検出用オリゴ
ヌクレオチドは、他のプライマー伸長増幅方法（たとえ
ば、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＴＭＡまたはＮＡＳＢＡ）におけ
るシグナルプライマー用に改変することが可能である。
たとえば、ＰＣＲ増幅プライマーおよび５(→３(エキソ
ヌクレアーゼ活性のない鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ（た
とえば、PrimegaのSequencing Grade TaqまたはNew Eng
land BioLabsのexo-Ventまたはexo-Deep VentをＰＣＲ
で使用することによって、この方法をＰＣＲ用に改変す
ることが可能である。検出用オリゴヌクレオチドシグナ
ルプライマーは、ＰＣＲ増幅プライマーから下流の標的
にハイブリッド形成し、置換されて、本質的にＳＤＡに
関する記載と同様に二本鎖になる。一般に、ＲＥＲＳの
開裂よりむしろニッキングを誘導すると考えられる修飾
されたデオキシヌクレオシド三リン酸が全く存在しない
ため、ＰＣＲでは、場合に応じて検出用オリゴヌクレオ
チド用ＲＥＲＳを選択することが可能である。温度周期
はＰＣＲによる増幅の特徴であるため、制限エンドヌク
レアーゼは、最終周期のプライマーアニーリングおよび
増幅のエンドポイント検出のための伸長の後に低温で加
えることが好ましい。しかし、ＰＣＲ反応の高温相を通
して活性のままである好熱性制限エンドヌクレアーゼ
は、増幅中ずっと存在することができ、即時アッセイを
実施することが可能である。ＳＤＡシステムの場合と同
様、二次構造の線状化および色素対の分離によって蛍光
消光が低減し、強度などの蛍光パラメータの変化は標的
増幅の指標の役割をする。
ヌクレオチドは、他のプライマー伸長増幅方法（たとえ
ば、ＰＣＲ、３ＳＲ、ＴＭＡまたはＮＡＳＢＡ）におけ
るシグナルプライマー用に改変することが可能である。
たとえば、ＰＣＲ増幅プライマーおよび５(→３(エキソ
ヌクレアーゼ活性のない鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ（た
とえば、PrimegaのSequencing Grade TaqまたはNew Eng
land BioLabsのexo-Ventまたはexo-Deep VentをＰＣＲ
で使用することによって、この方法をＰＣＲ用に改変す
ることが可能である。検出用オリゴヌクレオチドシグナ
ルプライマーは、ＰＣＲ増幅プライマーから下流の標的
にハイブリッド形成し、置換されて、本質的にＳＤＡに
関する記載と同様に二本鎖になる。一般に、ＲＥＲＳの
開裂よりむしろニッキングを誘導すると考えられる修飾
されたデオキシヌクレオシド三リン酸が全く存在しない
ため、ＰＣＲでは、場合に応じて検出用オリゴヌクレオ
チド用ＲＥＲＳを選択することが可能である。温度周期
はＰＣＲによる増幅の特徴であるため、制限エンドヌク
レアーゼは、最終周期のプライマーアニーリングおよび
増幅のエンドポイント検出のための伸長の後に低温で加
えることが好ましい。しかし、ＰＣＲ反応の高温相を通
して活性のままである好熱性制限エンドヌクレアーゼ
は、増幅中ずっと存在することができ、即時アッセイを
実施することが可能である。ＳＤＡシステムの場合と同
様、二次構造の線状化および色素対の分離によって蛍光
消光が低減し、強度などの蛍光パラメータの変化は標的
増幅の指標の役割をする。
【００４７】検出用オリゴヌクレオチドの展開または線
状化に起因する蛍光の変化は、選択された反応のエンド
ポイントで検出することが可能である。しかし、線状化
された二次構造はハイブリッド形成およびプライマー伸
長と同時に生じるため、反応が起こるにつれて、すなわ
ち「リアルタイム」に、蛍光の変化もモニタリングする
ことが可能である。この均一リアルタイムアッセイフォ
ーマットを使用して、存在する標的の初期量に関する半
定量的または定量的情報を提供することができる。たと
えば、（標的増幅の一部として、または非増幅検出方法
で）展開反応中または直線反応中に蛍光強度が変化する
速度は、初期標的レベルの指標である。結果として、存
在する標的配列の初期コピーが多いほど、ドナー蛍光は
選択された閾値に速やかに（すなわち、短時間で確実
に）達する。同様に、アクセプター蛍光の減少は短時間
で確実に達し、選択された最小値に達するのに要する時
間として検出される。さらに、反応経過中の蛍光パラメ
ータの変化の速度は、初期標的含有量が少ない試料より
も初期標的含有量が多い試料で迅速である（すなわち、
上昇勾配の蛍光曲線）。当該技術上周知の通り、これら
の測定または他の測定を、標的が存在する指標として、
あるいは標的増幅の指標として行うことができる。一般
に、標的の初期量は、実験結果と既知量の標的の結果と
を比較することによって決定される。
状化に起因する蛍光の変化は、選択された反応のエンド
ポイントで検出することが可能である。しかし、線状化
された二次構造はハイブリッド形成およびプライマー伸
長と同時に生じるため、反応が起こるにつれて、すなわ
ち「リアルタイム」に、蛍光の変化もモニタリングする
ことが可能である。この均一リアルタイムアッセイフォ
ーマットを使用して、存在する標的の初期量に関する半
定量的または定量的情報を提供することができる。たと
えば、（標的増幅の一部として、または非増幅検出方法
で）展開反応中または直線反応中に蛍光強度が変化する
速度は、初期標的レベルの指標である。結果として、存
在する標的配列の初期コピーが多いほど、ドナー蛍光は
選択された閾値に速やかに（すなわち、短時間で確実
に）達する。同様に、アクセプター蛍光の減少は短時間
で確実に達し、選択された最小値に達するのに要する時
間として検出される。さらに、反応経過中の蛍光パラメ
ータの変化の速度は、初期標的含有量が少ない試料より
も初期標的含有量が多い試料で迅速である（すなわち、
上昇勾配の蛍光曲線）。当該技術上周知の通り、これら
の測定または他の測定を、標的が存在する指標として、
あるいは標的増幅の指標として行うことができる。一般
に、標的の初期量は、実験結果と既知量の標的の結果と
を比較することによって決定される。
【００４８】本発明の方法による選択された標的配列の
存在のアッセイは、溶液または固相で実施することがで
きる。検出用オリゴヌクレオチドがプライマーの役割を
するリアルタイムまたはエンドポイント均一アッセイは
一般に溶液で行われる。本発明の検出用オリゴヌクレオ
チドを使用するハイブリッド形成アッセイは溶液でも実
施することが可能である（たとえば、均一リアルタイム
アッセイとして）が、標的のリアルタイム検出またはエ
ンドポイント検出のための固相アッセイに特に適してい
る。固相アッセイでは、当該技術上周知の方法を使用し
た内部標識または末端標識によって検出用オリゴヌクレ
オチドを固相（たとえば、ビーズ、膜または反応容器）
に固定することが可能である。たとえば、ビオチン標識
検出用オリゴヌクレオチドをアビジン修飾固相に固定す
ることが可能であり、この場合、適切なハイブリッド形
成条件で標的に曝露したとき蛍光を変化させる。この様
式で標識を捕捉すると、試料から標的を分離することが
容易になり、シグナルの検出またはアッセイの他の局面
を妨害する可能性がある試料注の物質を除去することが
できる。
存在のアッセイは、溶液または固相で実施することがで
きる。検出用オリゴヌクレオチドがプライマーの役割を
するリアルタイムまたはエンドポイント均一アッセイは
一般に溶液で行われる。本発明の検出用オリゴヌクレオ
チドを使用するハイブリッド形成アッセイは溶液でも実
施することが可能である（たとえば、均一リアルタイム
アッセイとして）が、標的のリアルタイム検出またはエ
ンドポイント検出のための固相アッセイに特に適してい
る。固相アッセイでは、当該技術上周知の方法を使用し
た内部標識または末端標識によって検出用オリゴヌクレ
オチドを固相（たとえば、ビーズ、膜または反応容器）
に固定することが可能である。たとえば、ビオチン標識
検出用オリゴヌクレオチドをアビジン修飾固相に固定す
ることが可能であり、この場合、適切なハイブリッド形
成条件で標的に曝露したとき蛍光を変化させる。この様
式で標識を捕捉すると、試料から標的を分離することが
容易になり、シグナルの検出またはアッセイの他の局面
を妨害する可能性がある試料注の物質を除去することが
できる。
【００４９】以下の実施例は本願明細書に記載の本発明
の詳細な実施例を示す。当業者には明白であろうが、様
々な変化および修正が可能であり、様々な変化および修
正は記載されている本発明の範囲内であると考えられ
る。
の詳細な実施例を示す。当業者には明白であろうが、様
々な変化および修正が可能であり、様々な変化および修
正は記載されている本発明の範囲内であると考えられ
る。
【００５０】
【実施例】例１ｔＳＤＡプライマーセットのデザイン ｔＳＤＡプライマーセットのデザインに関して、同定さ
れた８００bpのN. gonorrhoea配列を試験した。ＧＣ伸
長またはＡＴ伸長、および／またはプライマー間の強力
な相互作用を引起こす小さい反復が存在するため、ゲノ
ムのある領域を避けた。ΔＧ値が高いプライマー／プラ
イマー相互作用のため、潜在的に問題がある可能性のあ
るｔＳＤＡセットを、ソフトウエアプログラムOligoTM
（National Biosciences, Inc., Plymouth, Minnesot
a）を使用して選別除去した。様々なプライマーセット
を領域内にデザインした。数セットは直ちに退けられ、
幾つかは本格的な相互作用が欠如していた。試験した全
セットの中から、さらなる研究用に１つ−ＧＣＩＲ５を
選択した。左増幅プライマーと右増幅プライマーの両者
の３種の変異体を含むＧＣＩＲ５を設計した（図１）。
これによって、様々な組み合わせのプライマーを試験す
ることが可能になり、その各々は異なるTmを有してい
た。ＧＣＩＲ５システムを包含する全てのプライマーお
よびその位置を図１の線図に示す。
れた８００bpのN. gonorrhoea配列を試験した。ＧＣ伸
長またはＡＴ伸長、および／またはプライマー間の強力
な相互作用を引起こす小さい反復が存在するため、ゲノ
ムのある領域を避けた。ΔＧ値が高いプライマー／プラ
イマー相互作用のため、潜在的に問題がある可能性のあ
るｔＳＤＡセットを、ソフトウエアプログラムOligoTM
（National Biosciences, Inc., Plymouth, Minnesot
a）を使用して選別除去した。様々なプライマーセット
を領域内にデザインした。数セットは直ちに退けられ、
幾つかは本格的な相互作用が欠如していた。試験した全
セットの中から、さらなる研究用に１つ−ＧＣＩＲ５を
選択した。左増幅プライマーと右増幅プライマーの両者
の３種の変異体を含むＧＣＩＲ５を設計した（図１）。
これによって、様々な組み合わせのプライマーを試験す
ることが可能になり、その各々は異なるTmを有してい
た。ＧＣＩＲ５システムを包含する全てのプライマーお
よびその位置を図１の線図に示す。
【００５１】例２ＧＣＩＲ５ｔＳＤＡ反応条件のデザイン 異なる濃度の補助溶剤の存在下および異なる温度で、６
種のＧＣＩＲ５プライマーの組み合わせを試験するため
に、統計学的にデザインされた実験を実施した。この実
験を使用して、広い条件スペクトル全域にわたって、ど
のプライマー対が最も優れた増幅惹起能力を有するかを
決定した。次の変数を試験した：リン酸カリウム（２５
mMおよび３５mM）、ＤＭＳＯ（３％および８％）、グリ
セロール（３．５％および７％）、ヒトＤＮＡ（６５0n
gおよび１０５０ng）、増幅温度（５２℃および５４
℃）。結果から、次のｔＳＤＡ条件で最大の増幅が得ら
れることがわかる。
種のＧＣＩＲ５プライマーの組み合わせを試験するため
に、統計学的にデザインされた実験を実施した。この実
験を使用して、広い条件スペクトル全域にわたって、ど
のプライマー対が最も優れた増幅惹起能力を有するかを
決定した。次の変数を試験した：リン酸カリウム（２５
mMおよび３５mM）、ＤＭＳＯ（３％および８％）、グリ
セロール（３．５％および７％）、ヒトＤＮＡ（６５0n
gおよび１０５０ng）、増幅温度（５２℃および５４
℃）。結果から、次のｔＳＤＡ条件で最大の増幅が得ら
れることがわかる。
【００５２】
【表４】
【００５３】試験した増幅プライマー全部が有効であっ
たため、ＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配列番号５）など、他
のプライマーも有効であると考えられる。さらに、ＤＩ
Ｌの代わりにＧＣＩＲ−Ｄ２Ｌ（配列番号１４）を32P
検出用プローブとして使用することが可能である。ＧＣ
ＩＲ−ＡＬ５．３とＧＣＩＲ−ＡＲ５．１の組み合わせ
が最適プライマーセットであった。試験したプライマー
セットは全て１×１０6ゲノムでN. gonorrhoea BDMS 29
00を増幅することができたが、ある条件下では、他より
有効なものも数セットあった。これらのプライマーセッ
トを用いて、戦略的デザインに基づいてさらに実験した
結果、ＤＭＳＯおよびグリセロールの濃度をＤＭＳＯ
５．５％、グリセロール５．２％に変えることにより、
上記反応条件が最適化された。他の全ての補助溶剤濃度
および酵素濃度は上記の通りであった。
たため、ＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配列番号５）など、他
のプライマーも有効であると考えられる。さらに、ＤＩ
Ｌの代わりにＧＣＩＲ−Ｄ２Ｌ（配列番号１４）を32P
検出用プローブとして使用することが可能である。ＧＣ
ＩＲ−ＡＬ５．３とＧＣＩＲ−ＡＲ５．１の組み合わせ
が最適プライマーセットであった。試験したプライマー
セットは全て１×１０6ゲノムでN. gonorrhoea BDMS 29
00を増幅することができたが、ある条件下では、他より
有効なものも数セットあった。これらのプライマーセッ
トを用いて、戦略的デザインに基づいてさらに実験した
結果、ＤＭＳＯおよびグリセロールの濃度をＤＭＳＯ
５．５％、グリセロール５．２％に変えることにより、
上記反応条件が最適化された。他の全ての補助溶剤濃度
および酵素濃度は上記の通りであった。
【００５４】例３ＧＣＩＲ５ｔＳＤＡ感度のアッセイ 例２に記載の最適ｔＳＤＡ条件を使用して、検出実験の
限界を設定した。１×１０6ゲノム／反応から下は１ゲ
ノム／反応まで、N. gonorrhoea菌株BDM2900の滴定を実
施した。滴定パネルを試験した。６５０ng／反応および
１２５０ng／反応のヒトＤＮＡの存在下、ＧＣＩＲ５ｔ
ＳＤＡシステムを用いて滴定パネルを試験した。１×１
０6、１×１０5および１×１０4ゲノム／反応の試料を
１検体試験し、１×１０3ゲノム／反応を二重に試験
し、１００、１０および１ゲノムを三重に試験した。陰
性コントロールも実験に含めた。１つの試料における増
幅の欠如がシステムの感度を示すと考えないことを確実
にするために、コピー数が少ないN. gonorrhoeaゲノム
を複数の反応で試験する方法を実施した。感度実験の結
果は、ＧＣＩＲ５は下は１０ゲノム／反応を３回中３回
検出でき、１ゲノム／反応を３回中１回検出できたとい
うことであった。
限界を設定した。１×１０6ゲノム／反応から下は１ゲ
ノム／反応まで、N. gonorrhoea菌株BDM2900の滴定を実
施した。滴定パネルを試験した。６５０ng／反応および
１２５０ng／反応のヒトＤＮＡの存在下、ＧＣＩＲ５ｔ
ＳＤＡシステムを用いて滴定パネルを試験した。１×１
０6、１×１０5および１×１０4ゲノム／反応の試料を
１検体試験し、１×１０3ゲノム／反応を二重に試験
し、１００、１０および１ゲノムを三重に試験した。陰
性コントロールも実験に含めた。１つの試料における増
幅の欠如がシステムの感度を示すと考えないことを確実
にするために、コピー数が少ないN. gonorrhoeaゲノム
を複数の反応で試験する方法を実施した。感度実験の結
果は、ＧＣＩＲ５は下は１０ゲノム／反応を３回中３回
検出でき、１ゲノム／反応を３回中１回検出できたとい
うことであった。
【００５５】例４N. gonorrhoea ｔＳＤＡ特異性および交差反応性のアッ
セイ ＧＣＩＲ５ｔＳＤＡシステムの特異性および交差反応性
を試験するために、実験を計画した。例２に記載の最適
プライマーセットをこの実験で使用した。Neisseria go
norrhoea数菌株を１×１０6ゲノム／反応で試験した。
ＧＣＩＲ５は、表２に記載の被験種をことごとく増幅す
ることができた。このｔＳＤＡシステムの特異性は申し
分なかった。次に、他のNeisseria種または非Neisseria
細菌と交差反応性があるかどうかを決定した。これを実
施するために、全ての非交差反応物細菌を１×１０7ゲ
ノム／反応のレベルで試験した。増幅生成物が検出され
た反応は皆無であった（表６〜７）。
セイ ＧＣＩＲ５ｔＳＤＡシステムの特異性および交差反応性
を試験するために、実験を計画した。例２に記載の最適
プライマーセットをこの実験で使用した。Neisseria go
norrhoea数菌株を１×１０6ゲノム／反応で試験した。
ＧＣＩＲ５は、表２に記載の被験種をことごとく増幅す
ることができた。このｔＳＤＡシステムの特異性は申し
分なかった。次に、他のNeisseria種または非Neisseria
細菌と交差反応性があるかどうかを決定した。これを実
施するために、全ての非交差反応物細菌を１×１０7ゲ
ノム／反応のレベルで試験した。増幅生成物が検出され
た反応は皆無であった（表６〜７）。
【００５６】
【表５】
【００５７】
【表６】
【００５８】
【表７】
【００５９】例５蛍光リアルタイムｔＳＤＡにおけるGCIR5プライマー 蛍光リアルタイムｔＳＤＡを使用して、Neisseria gono
rrhoeaのアッセイを実施した。このためにデザインした
プライマー、バンパーおよび検出用配列を図１に示す。
検出用ＦＤ１（配列番号２１）を用いたＧＣＩＲ５の感
度および交差反応性を分析した（表８）。ｐＵＣ１８に
挿入されたNeisseria gonorrhoeaゲノムの８００塩基対
領域を含むプラスミド（ＧＣ１０）を標的として使用し
た。１０００〜２５コピーのプラスミドを用いて試験を
実施した。ｔＳＤＡの条件は次の通りであった。
rrhoeaのアッセイを実施した。このためにデザインした
プライマー、バンパーおよび検出用配列を図１に示す。
検出用ＦＤ１（配列番号２１）を用いたＧＣＩＲ５の感
度および交差反応性を分析した（表８）。ｐＵＣ１８に
挿入されたNeisseria gonorrhoeaゲノムの８００塩基対
領域を含むプラスミド（ＧＣ１０）を標的として使用し
た。１０００〜２５コピーのプラスミドを用いて試験を
実施した。ｔＳＤＡの条件は次の通りであった。
【００６０】５．２％グリセロール ５．５％ＤＭＳＯ ３５mMリン酸カリウム ２０００ngヒトＤＮＡ ３２０単位BsoB1 ２０単位Bst ２００nM検出用配列（ＦＤ１） ５００nM増幅プライマー（AL5.3（配列番号７）およびA
R5.1（配列番号８）） ５０nMバンパー（BL5.1（配列番号１１）およびBR5.1
（配列番号１２）） 除染を４５℃で２０分間実施した 増幅を５２℃で６０分間実施した
R5.1（配列番号８）） ５０nMバンパー（BL5.1（配列番号１１）およびBR5.1
（配列番号１２）） 除染を４５℃で２０分間実施した 増幅を５２℃で６０分間実施した
【００６１】PerSeptive Biosystem CytoFluor Series
400 Multiwellプレート読取り装置（「PerSeptive Inst
rument」）を使用した。１００μLの反応をLab Systems
Microtiter Stripに移した。ＧＣ１０の場合、ＦＤ１
を用いたＧＣＩＲ５の感度は、クローン化Neisseria go
norrhoeaＤＮＡ５０コピーの範囲内である。表４に、GC
IR5-FD1を用いて試験した交差反応物を全て記載する。
これらの各反応物は、５×１０7ゲノムで試験した（表
８）。あるN. meningitidis菌株およびN. lactamica菌
株は、時間が経過すると蛍光を生じた。以上の結果か
ら、交差反応性に関連する問題が明らかになり、このた
め、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１の組み合わせが、蛍光リアルタ
イムｔＳＤＡを使用する有用なアッセイシステムの候補
になる公算は低い
400 Multiwellプレート読取り装置（「PerSeptive Inst
rument」）を使用した。１００μLの反応をLab Systems
Microtiter Stripに移した。ＧＣ１０の場合、ＦＤ１
を用いたＧＣＩＲ５の感度は、クローン化Neisseria go
norrhoeaＤＮＡ５０コピーの範囲内である。表４に、GC
IR5-FD1を用いて試験した交差反応物を全て記載する。
これらの各反応物は、５×１０7ゲノムで試験した（表
８）。あるN. meningitidis菌株およびN. lactamica菌
株は、時間が経過すると蛍光を生じた。以上の結果か
ら、交差反応性に関連する問題が明らかになり、このた
め、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１の組み合わせが、蛍光リアルタ
イムｔＳＤＡを使用する有用なアッセイシステムの候補
になる公算は低い
【００６２】
【表８】
【００６３】例６検出用ＦＤ８およびＦＤ１０を用いたＧＣＩＲ５の蛍光
リアルタイムｔＳＤＡアッセイにおける感度 検出用プローブＦＤ８（配列番号１６）およびFD10（配
列番号１５）を使用して、蛍光リアルタイムｔＳＤＡに
おけるＧＣＩＲ５の感度を評価した。上記２種のプロー
ブを図１に示す。プラスミドＧＣ１０を標的として使用
した。ｔＳＤＡ反応の条件は次の通りであった。
リアルタイムｔＳＤＡアッセイにおける感度 検出用プローブＦＤ８（配列番号１６）およびFD10（配
列番号１５）を使用して、蛍光リアルタイムｔＳＤＡに
おけるＧＣＩＲ５の感度を評価した。上記２種のプロー
ブを図１に示す。プラスミドＧＣ１０を標的として使用
した。ｔＳＤＡ反応の条件は次の通りであった。
【００６４】５．２％グリセロール ５．５％ＤＭＳＯ ３５mMリン酸カリウム ２０００ngヒトＤＮＡ ３２０単位BsoB1 ２０単位Bst ２００nM検出用ＦＤ８またはＦＤ１０ ５００nM増幅プライマーAL5.3（配列番号７）およびAR
5.1（配列番号８） ５０nMバンパーBL5.1（配列番号１１）およびBR5.1（配
列番号１２） 除染は４５℃で２０分間であった 増幅は５２℃で６０分間であった
5.1（配列番号８） ５０nMバンパーBL5.1（配列番号１１）およびBR5.1（配
列番号１２） 除染は４５℃で２０分間であった 増幅は５２℃で６０分間であった
【００６５】PerSeptive Instrumentを上記アッセイに
使用した。Lab Systems MicrotiterPlate StripをPerSe
ptive Instrumentと一緒に使用した。反応の体積は１０
０μLであった。ＧＣＩＲ５−ＦＤ８の組み合わせもＧ
ＣＩＲ５−ＦＤ１０の組み合わせも下は１２コピーのＧ
Ｃ１０プラスミドを検出することができた。このデータ
を表９に示す。上記バックグラウンドの２〜３倍のＲＦ
Ｕ値を陽性と考えた。
使用した。Lab Systems MicrotiterPlate StripをPerSe
ptive Instrumentと一緒に使用した。反応の体積は１０
０μLであった。ＧＣＩＲ５−ＦＤ８の組み合わせもＧ
ＣＩＲ５−ＦＤ１０の組み合わせも下は１２コピーのＧ
Ｃ１０プラスミドを検出することができた。このデータ
を表９に示す。上記バックグラウンドの２〜３倍のＲＦ
Ｕ値を陽性と考えた。
【００６６】
【表９】
【００６７】例７リアルタイム蛍光ｔＳＤＡにおける検出用FD3、FD8また
はFD10を用いたGCIRの交差反応性の分析 検出用ＦＤ３（配列番号１７）、ＦＤ８（配列番号１
６）またはＦＤ１０（配列番号１５）のいずれか１つと
組合せたＧＣＩＲ５の交差反応性をリアルタイム蛍光ｔ
ＳＤＡで分析した。上記３種のプローブを図１に示す。
例５で、ＦＤ１（配列番号２１）と組合せたＧＣＩＲ５
は特定のN. meningitidis菌株およびLactamica菌株と交
差反応性を示さなかった。標的プラスミドＧＣ１０を使
用してｔＳＤＡを実施した。２５０コピーの陽性コント
ロールを、全ての蛍光検出用について試験した。陰性コ
ントロールも試験した。Neisseria meningitidis ATCC
13090、Neisseria lactamica ATCC 23971、23972および
49142は全て１×１０7ゲノムコピーで試験した。試験し
たｔＳＤＡ条件は次の通りであった。
はFD10を用いたGCIRの交差反応性の分析 検出用ＦＤ３（配列番号１７）、ＦＤ８（配列番号１
６）またはＦＤ１０（配列番号１５）のいずれか１つと
組合せたＧＣＩＲ５の交差反応性をリアルタイム蛍光ｔ
ＳＤＡで分析した。上記３種のプローブを図１に示す。
例５で、ＦＤ１（配列番号２１）と組合せたＧＣＩＲ５
は特定のN. meningitidis菌株およびLactamica菌株と交
差反応性を示さなかった。標的プラスミドＧＣ１０を使
用してｔＳＤＡを実施した。２５０コピーの陽性コント
ロールを、全ての蛍光検出用について試験した。陰性コ
ントロールも試験した。Neisseria meningitidis ATCC
13090、Neisseria lactamica ATCC 23971、23972および
49142は全て１×１０7ゲノムコピーで試験した。試験し
たｔＳＤＡ条件は次の通りであった。
【００６８】５．２％グリセロール ５．５％ＤＭＳＯ ３５mMリン酸カリウム ２５００ngヒトＤＮＡ ３２０単位BsoB1 ２０単位Bst １６７nM検出用配列（ＦＤ３、ＦＤ８またはＦＤ１０の
いずれか） ５００nM増幅プライマー（AL5.3（配列番号７）およびA
R5.1（配列番号８）） ５０nMバンパー（BL5.1（配列番号１１）およびBR5.1
（配列番号１２）） 除染は４５℃で２０分間であった 増幅は５２℃で６０分間であった
いずれか） ５００nM増幅プライマー（AL5.3（配列番号７）およびA
R5.1（配列番号８）） ５０nMバンパー（BL5.1（配列番号１１）およびBR5.1
（配列番号１２）） 除染は４５℃で２０分間であった 増幅は５２℃で６０分間であった
【００６９】PerSeptive Instrumentを上記アッセイに
使用した。１００μLの反応をLab Systems Microtiter
Stripに移した。ＦＤ３、ＦＤ８またはＦＤ１０を使用
するアッセイの中で、試験した菌株と有意な交差反応性
を示すものは皆無であった。上記検出用配列は全て、２
５０コピーのＧＣ１０で陽性の結果を示した。反対に、
検出用ＦＤ１１（配列番号１８）およびＦＤ６（配列番
号１９）では、使用したプライマーとバンパーを組合せ
た場合、有用な結果を与えないことを示す結果が得られ
た。ＦＤ１１は若干の交差反応性を示したが、ＦＤ６は
コントロール標的を用いても、陽性の結果を示すことが
できなかった。以上の結果を表６に示す。ＦＤ３検出用
プローブアッセイを二重に実施した。
使用した。１００μLの反応をLab Systems Microtiter
Stripに移した。ＦＤ３、ＦＤ８またはＦＤ１０を使用
するアッセイの中で、試験した菌株と有意な交差反応性
を示すものは皆無であった。上記検出用配列は全て、２
５０コピーのＧＣ１０で陽性の結果を示した。反対に、
検出用ＦＤ１１（配列番号１８）およびＦＤ６（配列番
号１９）では、使用したプライマーとバンパーを組合せ
た場合、有用な結果を与えないことを示す結果が得られ
た。ＦＤ１１は若干の交差反応性を示したが、ＦＤ６は
コントロール標的を用いても、陽性の結果を示すことが
できなかった。以上の結果を表６に示す。ＦＤ３検出用
プローブアッセイを二重に実施した。
【００７０】
【表１０】
【００７１】例８リアルタイム蛍光ｔＳＤＡアッセイにおけるＦＤ８また
はＦＤ１０を用いたＧＣＩＲ５の感度 リアルタイム蛍光ｔＳＤＡアッセイにおけるＧＣＩＲ５
−ＦＤ８（配列番号１６）およびＧＣＩＲ５−ＦＤ１０
（配列番号１５）システムの感度を分析するために、２
５０〜６．２５コピーのＧＣ１０プラスミドの滴定を実
施した。感度を確実にするために、各滴定濃度を三重に
試験した。使用したｔＳＤＡ条件は例７と同じであっ
た。PerSeptive Instrumentを上記アッセイに使用し
た。１００μLの反応をLab Systems Microtiter Strip
に移した。結果を表１１に示す。ＦＤ８およびＦＤ１０
を用いたＧＣＩＲ５の感度は、クローン化Neisseria go
norrhoeaＤＮＡが１２〜２５コピーの範囲内であった。
２５０コピーのＧＣ１０のＲＦＵ値は全て、陰性コント
ロールでみられるバックグラウンド値より十分に高かっ
た。若干の試料で反応は陽性と思われたが、他はバック
グラウンドレベルの蛍光のままであった。
はＦＤ１０を用いたＧＣＩＲ５の感度 リアルタイム蛍光ｔＳＤＡアッセイにおけるＧＣＩＲ５
−ＦＤ８（配列番号１６）およびＧＣＩＲ５−ＦＤ１０
（配列番号１５）システムの感度を分析するために、２
５０〜６．２５コピーのＧＣ１０プラスミドの滴定を実
施した。感度を確実にするために、各滴定濃度を三重に
試験した。使用したｔＳＤＡ条件は例７と同じであっ
た。PerSeptive Instrumentを上記アッセイに使用し
た。１００μLの反応をLab Systems Microtiter Strip
に移した。結果を表１１に示す。ＦＤ８およびＦＤ１０
を用いたＧＣＩＲ５の感度は、クローン化Neisseria go
norrhoeaＤＮＡが１２〜２５コピーの範囲内であった。
２５０コピーのＧＣ１０のＲＦＵ値は全て、陰性コント
ロールでみられるバックグラウンド値より十分に高かっ
た。若干の試料で反応は陽性と思われたが、他はバック
グラウンドレベルの蛍光のままであった。
【００７２】
【表１１】
【００７３】例９ＧＣＩＲＳＬｔＳＤＡ用のプライマーのスクリーニング 例２〜５は、ＧＣＩＲ５を用いて実施する実験向けであ
ったが、この例ならびに次の例（６〜８）は、ＧＣＩＲ
ＳＬを使用して得られる結果に向けたものである。異な
るプライマーの組み合わせ全部（図２）から、ＧＣＩＲ
ＳＬに最も適したプライマー対を評価するために統計学
的にデザインした実験を実施した。このデザインは、リ
ン酸カリウム（２５mMおよび３５mM）、ｈＤＮＡ（５０
0ngおよび１２００ng）、温度（５２℃および５４
℃）、グリセロール（３％および７％）およびＤＭＳＯ
（３％および７％）について各々２種のレベルを試験し
た。プライマーの組み合わせは全て、反応当たり１０6
ゲノムのNeisseria gonorrhoea菌株BDMS 2900を増幅し
た。広範囲の条件にわたって最高の増幅を示したプライ
マーの組み合わせは、ＧＣＩＲＳＬ．ＡＰＬ１（配列番
号２２）／ＧＣＩＲＳＬＡＰＲ３（配列番号２６）であ
った。感度実験、特異性実験および交差反応性実験で最
大の増幅を示した条件を選択し、これを以下に示す。
ったが、この例ならびに次の例（６〜８）は、ＧＣＩＲ
ＳＬを使用して得られる結果に向けたものである。異な
るプライマーの組み合わせ全部（図２）から、ＧＣＩＲ
ＳＬに最も適したプライマー対を評価するために統計学
的にデザインした実験を実施した。このデザインは、リ
ン酸カリウム（２５mMおよび３５mM）、ｈＤＮＡ（５０
0ngおよび１２００ng）、温度（５２℃および５４
℃）、グリセロール（３％および７％）およびＤＭＳＯ
（３％および７％）について各々２種のレベルを試験し
た。プライマーの組み合わせは全て、反応当たり１０6
ゲノムのNeisseria gonorrhoea菌株BDMS 2900を増幅し
た。広範囲の条件にわたって最高の増幅を示したプライ
マーの組み合わせは、ＧＣＩＲＳＬ．ＡＰＬ１（配列番
号２２）／ＧＣＩＲＳＬＡＰＲ３（配列番号２６）であ
った。感度実験、特異性実験および交差反応性実験で最
大の増幅を示した条件を選択し、これを以下に示す。
【００７４】ＧＣＩＲＳＬのｔＳＤＡ反応条件（５０u
L） ２５mMリン酸カリウムｐH７．６ ７％グリセロール ３％ＤＭＳＯ ６mM酢酸マグネシウム ５００ngｈＤＮＡ １００μg／mL アセチル化ＢＳＡ ３６０μM ＤＴＴ ０．５mMｄＵＴＰ ０．２mMｄＡＴＰ ０．２mMｄＧＴＰ ０．２mMα−チオ−ｄＣＴＰ ０．５μM ｔＳＤＡプライマー ０．０５μM ｔＳＤＡバンパー BsoB1１６０単位 Bstポリメラーゼ９単位 ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ１単位 ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼインヒビター５単位 １．８２％トレハロース ４５℃で３０分間除染 ５４℃で６０分間増幅
L） ２５mMリン酸カリウムｐH７．６ ７％グリセロール ３％ＤＭＳＯ ６mM酢酸マグネシウム ５００ngｈＤＮＡ １００μg／mL アセチル化ＢＳＡ ３６０μM ＤＴＴ ０．５mMｄＵＴＰ ０．２mMｄＡＴＰ ０．２mMｄＧＴＰ ０．２mMα−チオ−ｄＣＴＰ ０．５μM ｔＳＤＡプライマー ０．０５μM ｔＳＤＡバンパー BsoB1１６０単位 Bstポリメラーゼ９単位 ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ１単位 ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼインヒビター５単位 １．８２％トレハロース ４５℃で３０分間除染 ５４℃で６０分間増幅
【００７５】例１０ＧＣＩＲＳＬｔＳＤＡ感度のアッセイ ｔＳＤＡで増幅し検出することが可能な最小数のゲノム
を決定するために、N.gonorrhoea菌株BDMS 2990に対し
てゲノム滴定を実施した。Neisseria gonorrhoeaＤＮＡ
を単離し、１０ng／μLヒト胎盤ＤＮＡで希釈した。１
０5、１０4、１０3、１０2、１０、１および０ゲノム／
反応を使用して、ｔＳＤＡ反応を実施した。ＧＣＩＲＳ
Ｌの検出限界は１０ゲノム／反応であった。
を決定するために、N.gonorrhoea菌株BDMS 2990に対し
てゲノム滴定を実施した。Neisseria gonorrhoeaＤＮＡ
を単離し、１０ng／μLヒト胎盤ＤＮＡで希釈した。１
０5、１０4、１０3、１０2、１０、１および０ゲノム／
反応を使用して、ｔＳＤＡ反応を実施した。ＧＣＩＲＳ
Ｌの検出限界は１０ゲノム／反応であった。
【００７６】例１１ＧＣＩＲＳＬｔＳＤＡの特異性のアッセイ Neisseria gonorrhoea１２菌株を１０6ゲノム／反応で
使用して、ＧＣＩＲＳＬシステムの特異性を試験した。
Neisseria gonorrhoea１２菌株全てが検出された。結果
を上記の表５に記載する。
使用して、ＧＣＩＲＳＬシステムの特異性を試験した。
Neisseria gonorrhoea１２菌株全てが検出された。結果
を上記の表５に記載する。
【００７７】例１２ＧＣＩＲＳＬｔＳＤＡ交差反応性のアッセイ ４３のNeisseria種および非Neisseria種の交差反応性実
験を１０7ゲノム／反応で実施した。試験した４３の交
差反応体のいずれでも、交差反応性は全くみられなかっ
た。結果を上記の表６〜７にまとめる。
験を１０7ゲノム／反応で実施した。試験した４３の交
差反応体のいずれでも、交差反応性は全くみられなかっ
た。結果を上記の表６〜７にまとめる。
【００７８】例１３蛍光リアルタイムｔＳＤＡにおけるＧＣＩＲＳＬプライ
マー 蛍光リアルタイムｔＳＤＡを使用して、Neisseria gono
rrhoeaを分析した。このためにデザインしたプライマ
ー、バンパーおよび検出用配列を図２に示す。検出用Ｆ
Ｄ１（配列番号３１）を用いたＧＣＩＲＳＬの感度を分
析した。ＧＣ１０を標的として使用し、５００〜２５０
コピーのプラスミドを試験した。ｔＳＤＡの条件は次の
通りであった。
マー 蛍光リアルタイムｔＳＤＡを使用して、Neisseria gono
rrhoeaを分析した。このためにデザインしたプライマ
ー、バンパーおよび検出用配列を図２に示す。検出用Ｆ
Ｄ１（配列番号３１）を用いたＧＣＩＲＳＬの感度を分
析した。ＧＣ１０を標的として使用し、５００〜２５０
コピーのプラスミドを試験した。ｔＳＤＡの条件は次の
通りであった。
【００７９】３５mMリン酸カリウムｐH７．６ ７％グリセロール ７％ＤＭＳＯ ６mM MgAc １４５０ngλＤＮＡ １００μg／ml アセチル化ＢＳＡ ３６０mMＤＴＴ ０．５mMｄＵＴＰ、０．２mMｄＡＴＰ、０．２mMｄＧＴ
Ｐおよび１．４mMα−チオ−ｄＣＴＰ ０．５μMおよび０．０５μMのｔＳＤＡプライマー（Ａ
ＰＬ１（配列番号２２）およびＡＰＲ３（配列番号２
６）およびバンパー（ＢＬ（配列番号２７）およびＢＲ
（配列番号２８）） １００nM検出用配列（ＦＤ１） BsoB1 ４８０単位 Bst ３０単位 除染を４５℃で２０分間実施した。 増幅を５２℃で６０分間実施した。
Ｐおよび１．４mMα−チオ−ｄＣＴＰ ０．５μMおよび０．０５μMのｔＳＤＡプライマー（Ａ
ＰＬ１（配列番号２２）およびＡＰＲ３（配列番号２
６）およびバンパー（ＢＬ（配列番号２７）およびＢＲ
（配列番号２８）） １００nM検出用配列（ＦＤ１） BsoB1 ４８０単位 Bst ３０単位 除染を４５℃で２０分間実施した。 増幅を５２℃で６０分間実施した。
【００８０】「PerSeptive Instrument」を使用した。
体積１００μLの反応をLab SystemsMicrotiter Stripに
移した。結果を表８に示す。ＦＤ１を用いたＧＣＩＲＳ
Ｌの感度は、クローン化Neisseria gonorrhoeaプラスミ
ドＧＣ１０１００コピーの範囲内であった。
体積１００μLの反応をLab SystemsMicrotiter Stripに
移した。結果を表８に示す。ＦＤ１を用いたＧＣＩＲＳ
Ｌの感度は、クローン化Neisseria gonorrhoeaプラスミ
ドＧＣ１０１００コピーの範囲内であった。
【００８１】
【表１２】
【００８２】例１４ＧＣ０２のｔＳＤＡプライマー評価 ＧＣＩＲ５セットおよびＧＣＩＲＳＬセットのプライマ
ーのほかに、三番目のプライマーセットも試験した。２
種の左端プライマーと２種の右端プライマーとの可能な
プライマーの組み合わせを全て試験するために、戦略的
にデザインした実験を実施した。次の変数も使用した。
リン酸カリウム（２５mMおよび３５mM）、グリセロール
（３．１％および８％）、ＤＭＳＯ（３％および８％）
および温度（５２℃および５４℃）。全てのプライマー
セットが１０6ゲノムのＧＣ３５２０１を増幅した。更
なる実験ののために選択された最も強健なプライマーの
組み合わせは、Ｏ２ＡＬ４２．１（配列番号３３）およ
びＯ２ＡＲ４２．１（配列番号３５）であった。最も高
感度の検出用プローブはＯ２ＤＬ４２．１（配列番号３
８）であり、これをさらなる実験に使用した。感度、特
異性および交差反応性を試験するために選択した条件を
以下に列挙する。
ーのほかに、三番目のプライマーセットも試験した。２
種の左端プライマーと２種の右端プライマーとの可能な
プライマーの組み合わせを全て試験するために、戦略的
にデザインした実験を実施した。次の変数も使用した。
リン酸カリウム（２５mMおよび３５mM）、グリセロール
（３．１％および８％）、ＤＭＳＯ（３％および８％）
および温度（５２℃および５４℃）。全てのプライマー
セットが１０6ゲノムのＧＣ３５２０１を増幅した。更
なる実験ののために選択された最も強健なプライマーの
組み合わせは、Ｏ２ＡＬ４２．１（配列番号３３）およ
びＯ２ＡＲ４２．１（配列番号３５）であった。最も高
感度の検出用プローブはＯ２ＤＬ４２．１（配列番号３
８）であり、これをさらなる実験に使用した。感度、特
異性および交差反応性を試験するために選択した条件を
以下に列挙する。
【００８３】ｔＳＤＡ反応混合物 ３５mMリン酸カリウムｐH７．６ ８％グリセロール ３％ＤＭＳＯ ６mM酢酸マグネシウム ６５０ngヒト胎盤ＤＮＡ １．４mMα−チオ−ｄＣＴＰ ０．５mMｄＵＴＰ ０．２mMｄＡＴＰ ０．２mMｄＧＴＰ Bst ポリメラーゼ９単位 BsoB1制限酵素１６単位 ウラシル−N−グリコシラーゼ１単位 ウラシル−N−グリコシラーゼインヒビター２単位 ０．５μM ｔＳＤＡプライマー ０．５μM ｔＳＤＡバンパー０２ＢＬ４２．１（配列番
号３６）および０２ＢＲ４２．１（配列番号３７） １．８２％トレハロース ０．３６mMジチオトレイトール １００μg／ml アセチル化ウシ血清アルブミン ０．０１５％消泡剤 除染は４５℃で３０分間であった 増幅は５２℃で６０分間であった
号３６）および０２ＢＲ４２．１（配列番号３７） １．８２％トレハロース ０．３６mMジチオトレイトール １００μg／ml アセチル化ウシ血清アルブミン ０．０１５％消泡剤 除染は４５℃で３０分間であった 増幅は５２℃で６０分間であった
【００８４】例１５ＧＣ０２ｔＳＤＡ感度の分析 ＧＣ０２ｔＳＤＡシステムで増幅され、検出されるＧＣ
菌株ＢＤＭＳ２９００の最小ゲノムコピー数を決定する
ために、ゲノム滴定を実施した。ＧＣゲノムＤＮＡを単
離し、ヒト胎盤ＤＮＡで希釈した。ｔＳＤＡ反応を実施
した。１０4、１０3、１０2、１０、１および０ゲノム
コピー／反応を使用して、ｔＳＤＡ反応を実施した。Ｇ
Ｃ０２システムで、１００ゲノムコピーの感度が得られ
た。
菌株ＢＤＭＳ２９００の最小ゲノムコピー数を決定する
ために、ゲノム滴定を実施した。ＧＣゲノムＤＮＡを単
離し、ヒト胎盤ＤＮＡで希釈した。ｔＳＤＡ反応を実施
した。１０4、１０3、１０2、１０、１および０ゲノム
コピー／反応を使用して、ｔＳＤＡ反応を実施した。Ｇ
Ｃ０２システムで、１００ゲノムコピーの感度が得られ
た。
【００８５】例１６ＧＣ０２ｔＳＤＡ特異性の分析 Neisseria gonorrhoea１１菌株を１０6ゲノム／反応で
使用して、ＧＣ０２システムの特異性を試験した。上記
の表５に示す通り、１１菌株全てが検出された。
使用して、ＧＣ０２システムの特異性を試験した。上記
の表５に示す通り、１１菌株全てが検出された。
【００８６】例１７ＧＣ０２ｔＳＤＡ交差反応性の分析 ４４の関連細菌菌株を１０7ゲノム／反応で使用して、
ＧＣ０２システムの特異性を試験した。上記の表６〜７
に示す通り、交差反応物種は全く検出されなかった。
ＧＣ０２システムの特異性を試験した。上記の表６〜７
に示す通り、交差反応物種は全く検出されなかった。
【００８７】本発明をかなり具体的に説明してきたが、
本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明白な修
正を行うことが可能である。本発明の様々な特徴を特許
請求の範囲に記載する。
本発明の範囲から逸脱することなく、当業者に明白な修
正を行うことが可能である。本発明の様々な特徴を特許
請求の範囲に記載する。
【００８８】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Becton Dickinson and Company <120> Detection of Neisseria Gonorrhoeae by Amplification and Detection of Its Nucleic Acid <130> P98786 <140> JP 1998-309591 <141> 1998-10-30 <150> US 08/963946 <151> 1997-11-04 <160> 39 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> primer <400> CTGATATCTG CATGGAGGCA A 21 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> primer <400> GATCGTAATC TCCGCCTTTC TT 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> primer <400> CCGCAGCATA CGCGCAAATC AA 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> primer <400> GGTATGGTTT CAAGACGCTT CA 22 <210> 5 <211> 41 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> primer <400> CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGGAACAG CTTGAAGTTT T 41 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> primer <400> CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGGAACAG CTTGAAGTTT 40 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> amplification primer <400> CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGAACAGC TTGAAGTTTT 40 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> amplification primer <400> ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTCCTTG CAGTTAGGC 39 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> amplification primer <400> ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGCCTTGC AGTTAGGC 38 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> amplification primer <400> ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTCCTTG CAGTTAGG 38 <210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> bumper <400> CGCAAATCAT CAAAG 15 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> bumper <400> TCAAGACGCT TCACG 15 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> AAAGGAGAAG ATAAAAG 17 <210> 14 <211> 14 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> AGCAGACGGA GAAG 14 <210> 15 <211> 41 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> TAGCACCCGA GTGCTTTCTC CGTCTGCTCT TTTATCTTCT C 41 <210> 16 <211> 39 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> TAGCACCCGA GTGCTTTCTC CGTCTGCTCT TTTATCTTC 39 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> TAGCACCCGA GTGCTTTCTC CGTCTGCTCT 30 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> TAGCACCCGA GTGCTTAAAG GAGAAGATAA AAGAGCAG 38 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> TAGACCCGAG TGCTTAAAGG AGAAGATAAA AGAGC 35 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> TAGCACCCGA GTGCTTAAAG GAGAAGATAA AAG 33 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> TAGCACCCGA GTGCTTAAAG GAGAAGATAA AAGAGCAGAC GGAGA 45 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> amplification primer <400> CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGGAGAAG CCTAACTG 38 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> amplification primer <400> CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGAGAAGC CTAACTGCA 39 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> amplification primer <400> ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGCTGCCT ATTGCCGGT 39 <210> 25 <211> 39 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> amplification primer <400> ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTGCCTA TTGCCGGTA 39 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> amplification primer <400> ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTGCCTA TTGCCGGT 38 <210> 27 <211> 15 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> bumper <400> GAGAAGATAA AAGAG 15 <210> 28 <211> 14 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> bumper <400> ACAATACGGC TGCG 14 <210> 29 <211> 15 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> CAAGGAAGGC GTGAA 15 <210> 30 <211> 15 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> GCGTCTTGAA ACCAT 15 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> TAGCACCCGA GTGCTGGAAG GCGTGAAGCG TCTTGAAACC AT 42 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> primer <400> CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGAGGCTG GAAGAAAAG 39 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> primer <400> CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGGGCTGG AAGAAAAG 38 <210> 34 <211> 40 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> primer <400> ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGCGAGTT TACGCATCAA 40 <210> 35 <211> 39 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> primer <400> ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGAGTTT ACGCATCAA 3 9 <210> 36 <211> 14 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> bumper <400> TTTCCCCGAC TTCA 14 <210> 37 <211> 15 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> bumper <400> GTGATACGCA ATAAC 15 <210> 38 <211> 16 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> AAGAAGCCTA AAAAAG 16 <210> 39 <211> 14 <212> DNA <213> Artifical Sequence <220> <223> detector <400> TCATCATCGC AGCA 14
【図１】図１は、１０３塩基対領域全域の、システムＧ
ＣＩＲ５プライマー、バンパーおよび検出用配列の相対
的な位置を示す図である。
ＣＩＲ５プライマー、バンパーおよび検出用配列の相対
的な位置を示す図である。
【図２】図２は、１００塩基対領域全域の、システムＧ
ＣＩＲＳＬプライマー、バンパーおよび検出用配列の相
対的な位置を示す図である。
ＣＩＲＳＬプライマー、バンパーおよび検出用配列の相
対的な位置を示す図である。
【図３】図３は、９８塩基対領域全域のＧＣ０２プライ
マー、バンパーおよび検出用配列の相対的な位置を示す
図である。
マー、バンパーおよび検出用配列の相対的な位置を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:36） (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:36） (71)出願人 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲＡ ＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥ ＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡ (72)発明者 ジェイムズ・エム・ハリス アメリカ合衆国メリーランド州21044，コ ロンビア，ミルバンク・ロウ 10942 (72)発明者 カレン・ディリー・ヤンソン アメリカ合衆国メリーランド州21286，タ ウソン，エイグバース・ロード 422
Claims (22)
- 【請求項１】 ＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配列番号５）、
ＧＣＩＲ−ＡＬ５．２（配列番号６）およびＧＣＩＲ−
ＡＬ５．３（配列番号７）から成る群から選択される核
酸。 - 【請求項２】 ＧＣＩＲ−ＡＲ５．１（配列番号８）、
ＧＣＩＲ−ＡＲ５．２（配列番号９）およびＧＣＩＲ−
ＡＲ５．３（配列番号１０）から成る群から選択される
核酸。 - 【請求項３】 ＧＣＩＲ−ＢＬ５．１（配列番号１１）
およびＧＣＩＲ−ＢＲ５．１（配列番号１２）から成る
群から選択される核酸。 - 【請求項４】 ＧＣＩＲ−Ｄ１Ｌ（配列番号１３）、配
列番号１３に相補的な核酸、ＧＣＩＲ−Ｄ２Ｌ（配列番
号１４）および配列番号１４に相補的な核酸から成る群
から選択される核酸。 - 【請求項５】 ＧＣＩＲ５−ＦＤ３（配列番号１７）、
配列番号１７に相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ８（配
列番号１６）、配列番号１６に相補的な核酸、ＧＣＩＲ
５−ＦＤ１０（配列番号１５）、配列番号１５に相補的
な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１１（配列番号１８）、配列
番号１８に相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ６（配列番
号１９）、配列番号１９に相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−
ＦＤ２（配列番号２０）、配列番号２０に相補的な核
酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１（配列番号２１）および配列番
号２１に相補的な核酸から成る群から選択される核酸。 - 【請求項６】 ＧＣＩＲＳＬ．ＡＰＬ１（配列番号２
２）およびＧＣＩＲＳＬ．ＡＰＬ２（配列番号２３）か
ら成る群から選択される核酸。 - 【請求項７】 ＧＣＩＲＳＬ−ＡＰＲ１（配列番号２
４）、ＧＣＩＲＳＬ−ＡＰＲ２（配列番号２５）および
ＧＣＩＲＳＬ−ＡＰＲ３（配列番号２６）から成る群か
ら選択される核酸。 - 【請求項８】 ＧＣＩＲＳＬ−ＢＬ（配列番号２７）お
よびＧＣＩＲＳＬ−ＢＲ（配列番号２８）から成る群か
ら選択される核酸。 - 【請求項９】 ＧＣＩＲＳＬ−ＤＬ１（配列番号２
９）、配列番号２９に相補的な核酸、ＧＣＩＲＳＬ−Ｄ
Ｌ２（配列番号３０）および配列番号３０に相補的な核
酸から成る群から選択される核酸。 - 【請求項１０】 ＧＣＩＲＳＬ．ＦＤ１（配列番号３
１）および配列番号３１に相補的な核酸から成る群から
選択される核酸。 - 【請求項１１】 Ｏ２ＡＬ４４．１（配列番号３２）お
よびＯ２ＡＬ４２．１（配列番号３３）から成る群から
選択される核酸。 - 【請求項１２】 Ｏ２ＡＲ４６．１（配列番号３４）お
よびＯ２ＡＲ４２．１（配列番号３５）から成る群から
選択される核酸。 - 【請求項１３】 Ｏ２ＢＬ４２．１（配列番号３６）お
よびＯ２ＢＲ４２．１（配列番号３７）から成る群から
選択される核酸。 - 【請求項１４】 Ｏ２ＤＬ４２．１（配列番号３８）、
配列番号３８に相補的な核酸、Ｏ２ＤＲ４２．１（配列
番号３９）および配列番号３９に相補的な核酸から成る
群から選択される核酸。 - 【請求項１５】 ＧＣ１．３（配列番号１）、ＧＣ２．
３（配列番号２）、ＩＲ．Ｒ２（配列番号３）およびＩ
ＲＬ１（配列番号４）から成る群から選択される核酸。 - 【請求項１６】 ａ）ＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配列番号
５）、ＧＣＩＲ−ＡＬ５．２（配列番号６）およびＧＣ
ＩＲ−ＡＬ５．３（配列番号７）から成る群から選択さ
れる１種以上のプライマーと、 ｂ）ＧＣＩＲ−ＡＲ５．１（配列番号８）、ＧＣＩＲ−
ＡＲ５．２（配列番号９）およびＧＣＩＲ−ＡＲ５．３
（配列番号１０）から成る群から選択される１種以上の
プライマーと、 ｃ）バンパーであるＧＣＩＲ−ＢＬ５．１（配列番号１
１）およびＧＣＩＲ−ＢＲ５．１（配列番号１２）と、 ｄ）ＧＣＩＲ−Ｄ１Ｌ（配列番号１３）、配列番号１３
に相補的な核酸、ＧＣＩＲ−Ｄ２Ｌ（配列番号１４）、
配列番号１４に相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ３（配
列番号１７）、配列番号１７に相補的な核酸、ＧＣＩＲ
５−ＦＤ８（配列番号１６）、配列番号１６に相補的な
核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１０（配列番号１５）、配列番
号１５に相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１１（配列番
号１８）、配列番号１８に相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−
ＦＤ６（配列番号１９）、配列番号１９に相補的な核
酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ２（配列番号２０）、配列番号２
０に相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１（配列番号２
１）および配列番号２１に相補的な核酸から成る群から
選択される１種以上の検出用配列とを含んでなるキッ
ト。 - 【請求項１７】 ａ）ＧＣＩＲＳＬ−ＡＰＬ１（配列番
号２２）およびＧＣＩＲＳＬ−ＡＰＬ２（配列番号２
３）から成る群から選択される１種以上のプライマー
と、 ｂ）ＧＣＩＲＳＬ−ＡＰＲ１（配列番号２４）、ＧＣＩ
ＲＳＬ−ＡＰＲ２（配列番号２５）およびＧＣＩＲＳＬ
−ＡＰＲ３（配列番号２６）から成る群から選択される
１種以上のプライマーと、 ｃ）バンパーであるＧＣＩＲＳＬ−ＢＬ（配列番号２
７）およびＧＣＩＲＳＬ−ＢＲ（配列番号２８）と、 ｄ）ＧＣＩＲＳＬ−ＤＬ１（配列番号２９）、配列番号
２９に相補的な核酸、ＧＣＩＲＳＬ−ＤＬ２（配列番号
３０）、配列番号３０に相補的な核酸、ＧＣＩＲＳＬ．
ＦＤ１（配列番号３１）および配列番号３１に相補的な
核酸から成る群から選択される１種以上の検出用配列と
を含んでなるキット。 - 【請求項１８】 ａ）Ｏ２ＡＬ４４．１（配列番号３
２）およびＯ２ＡＬ４２．１（配列番号３３）から成る
群から選択される１種以上のプライマーと、 ｂ）Ｏ２ＡＲ４６．１（配列番号３４）およびＯ２ＡＲ
４２．１（配列番号３５）から成る群から選択される１
種以上のプライマーと、 ｃ）バンパーであるＯ２ＢＬ４２．１（配列番号３６）
およびＯ２ＢＲ４２．１（配列番号３７）と、 ｄ）Ｏ２ＤＬ４２．１（配列番号３８）、配列番号３８
に相補的な核酸、Ｏ２ＤＲ４２．１（配列番号３９）お
よび配列番号３９に相補的な核酸から成る群から選択さ
れる１種以上の検出用配列とを含んでなるキット。 - 【請求項１９】 ａ）プライマーであるＧＣＩＲ−ＡＬ
５．３（配列番号７）およびＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配
列番号８）と、 ｂ）バンパーであるＧＣＩＲ−ＢＬ５．１（配列番号１
１）およびＧＣＩＲ−ＢＲ５．１（配列番号１２）と、 ｃ）ＧＣＩＲ５−ＦＤ１０（配列番号１５）および配列
番号１５に相補的な核酸から成る群から選択される１種
以上の検出用配列とを含むキット。 - 【請求項２０】 試料中の淋菌(ネイセリア・ゴノルホ
ア；Neisseria gonorrhoea)の有無を検出する方法であ
って、 ａ）ＧＣＩＲ−ＡＬ５．１（配列番号５）、ＧＣＩＲ−
ＡＬ５．２（配列番号６）およびＧＣＩＲ−ＡＬ５．３
（配列番号７）から成る群から選択される第１のプライ
マーと、ＧＣＩＲ−ＡＲ５．１（配列番号８）、ＧＣＩ
Ｒ−ＡＲ５．２（配列番号９）およびＧＣＩＲ−ＡＲ
５．３（配列番号１０）から成る群から選択される第２
のプライマーとからなる一対の核酸プライマーを核酸増
幅反応で使用して前記試料を処理するステップと、 ｂ）増幅生成物の検出が淋菌の存在を示すあらゆる増幅
核酸生成物を検出するステップとを含む方法。 - 【請求項２１】 前記ＳＤＡ反応がＧＣＩＲ−ＢＬ５．
１（配列番号１１）およびＧＣＩＲ−ＢＲ５．１（配列
番号１２）をバンパーとして使用する請求項２０に記載
の方法。 - 【請求項２２】 前記増幅核酸生成物の検出が、ＧＣＩ
Ｒ−Ｄ１Ｌ（配列番号１３）、配列番号１３に相補的な
核酸、ＧＣＩＲ−Ｄ２Ｌ（配列番号１４）、配列番号１
４に相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ３（配列番号１
７）、配列番号１７に相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ
８（配列番号１６）、配列番号１６に相補的な核酸、Ｇ
ＣＩＲ５−ＦＤ１０（配列番号１５）、配列番号１５に
相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１１（配列番号１
８）、配列番号１８に相補的な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ
６（配列番号１９）、配列番号１９に相補的な核酸、Ｇ
ＣＩＲ５−ＦＤ２（配列番号２０）、配列番号２０に相
補的な核酸、ＧＣＩＲ５−ＦＤ１（配列番号２１）およ
び配列番号２１に相補的な核酸から成る群から選択され
る検出用配列と、前記増幅核酸生成物とのハイブリッド
形成によって実行されることを特徴とする請求項２０に
記載の方法。
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| US08/963,946 US5962273A (en) | 1997-11-04 | 1997-11-04 | Detection of Neisseria gonorrhoeae by amplification and detection of its nucleic acid |
| US08/963946 | 1997-11-04 |
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| JP4209977B2 JP4209977B2 (ja) | 2009-01-14 |
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