JPH11225788A - 脂肪酸代謝と微生物的アセチル化反応との融合方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 微生物による一級アルコールの効果的なアセ
チル化方法を提供すること。 【解決手段】 親水性固定化担体に、脂肪酸からのアセ
チルコエンザイムＡ生産能及びアルコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ生産能を有する微生物を付着させ、該微
生物の栄養源及びアセチルコエンザイムＡの原料である
短鎖脂肪酸塩を含有する水性媒体の存在下に、水に不溶
性もしくは難溶性の一級アルコールを含有する疎水性有
機溶媒相を該担体上の該微生物に接触させ、それにより
接触界面において、微生物の作用による該短鎖脂肪酸塩
のβ−酸化から生じるアセチルコエンザイムＡと該疎水
性有機溶媒中の水に不溶性もしくは難溶性の一級アルコ
ールとを該微生物が生産するアルコールアセチルトラン
スフェラーゼの酵素作用によってアセチル化反応せしめ
ることを特徴とする脂肪酸代謝と微生物的アセチル化反
応との融合方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、親水性固定化担体
表面で増殖する微生物の作用による短鎖脂肪酸塩のβ−
酸化から生じるアセチルコエンザイムＡ（以下、「アセ
チル−CoA」と略す場合がある）と疎水性有機溶媒相中
の水不溶性もしくは難溶性の一級アルコールとを、アル
コールアセチルトランスフェラーゼ（以下、「AATFas
e」と略す場合がある）の酵素作用によって、アセチル
ドナーの未添加条件下でアセチル化反応させることを特
徴とする脂肪酸代謝と微生物的アセチル化反応との融合
方法に関する。

【０００２】

【従来技術およびその課題】近年、地球環境問題、省資
源・資エネルギー問題の高揚、あるいは光学活性体の需
要拡大などを背景として、有機合成化学に生体触媒を利
用するバイオコンバージョンの研究・開発が世界中で活
発化してきている。該バイオコンバージョンの応用例の
１つとして、リパーゼやエステラーゼのような加水分解
酵素の逆反応によって有用エステルを合成する方法が、
特に光学分割を目的として数多く提案されている［Suga
i, T. and Ohta, H., Agric. Biol. Chem., ５４，３３
３７（１９９０）；Wang, Y. F., et al., Tetrahedron
Lett., ３０，１９１７（１９８９）］。このような酵
素的エステル合成又はエステル交換反応を効率的に行わ
せるためには、反応系に存在する水分量を減少させるこ
とが必要であり、そのために該エステル化又はエステル
交換反応は一般に有機溶媒中で行われる。

【０００３】一方、他のエステル化酵素として、イソア
ミルアルコールとアセチル−CoA から酢酸イソアミルを
生成させる AATFase の存在も知られている［Yoshioka,
K.and Hashimoto, N., Agric. Biol. Chem., ４５，２
１８３（１９８１）；栗山一秀、醗酵工学、６７、１０
５（１９８９）］。該アセチル化酵素 AATFase は清
酒、ビール、ワイン酵母以外に Hansenula, Pichia 属
の酵母にも高活性で存在しており、種々の一級アルコー
ルをアセチル化することが可能である［Oda, S., et a
l., Appl. Environ. Microbiol., ６２，２２１６（１
９９６）；Oda, S. and Ohta, H., J. Ferment. Bioen
g., ８３，４２３（１９９７）］が、特に、界面バイオ
リアクター［Oda, S. and Ohta, H., ５６，２０４１
（１９９２）；Oda, S., et al., J. Ferment. Bioen
g., ７８，１４９（１９９４）；特許第２５４２７６６
号］を用いることによって高濃度の酢酸エステルが生産
可能となる。

【０００４】本発明者は、この AATFase の存在下に、
微生物の糖質代謝によって生産されるアセチル−CoA と
有機溶媒相中の一級アルコールとをアセチル化反応する
システムを代謝−微生物変換融合システム（以下、「カ
ップリングシステム」と略す場合がある）と命名し、種
々の一級酢酸エステルの調製に有用であることを報告し
た［Oda, S. and Ohta, H., J. Ferment. Bioeng., ８
３，４２３（１９９７）］。しかしながら、グルコース
などの糖質を出発原料として解糖系経由でアセチル−Co
A を生産する場合には、１０段以上の酵素反応を経るた
めに生産速度が遅く、また、微生物が界面バイオリアク
ターの有機溶媒相中に添加した一級アルコールの代謝阻
害を受けやすいという難点があった。

【０００５】

【問題を解決するための手段】そこで本発明者は、上記
のようなカップリングシステムの難点を克服すべく鋭意
検討を重ねた結果、今回、糖質の解糖系経由でのみアセ
チル−CoA を供給する従来の方法に替えて又はそれと複
合させる形で、脂肪酸のβ−酸化系によってアセチル−
CoA を供給するようにすると、該カップリング速度なら
びに一級アルコールの阻害作用回避の効果を大きく向上
させ得ることを見出し、本発明を完成させるに至った。

【０００６】かくして本発明に従えば、クレーム１が提
供される。

【０００７】本発明によれば、例えば、界面バイオリア
クターにおいて、先ず、親水性固定化担体中に、炭素源
として脂肪酸塩を単独で又は糖質と共存する形で包含さ
せ、該固定化担体表面に代謝−微生物変換融合活性、す
なわち、アセチル−CoA 生産能と AATFase 生産能とを
兼ね備えた微生物を付着、増殖させて微生物膜を成長さ
せる。ここで「代謝」とは、糖質の解糖系及び脂肪酸の
β−酸化系によってアセチル−CoA に至る経路を指す
が、両代謝系はほとんど全ての酵母が有しているもので
ある。次いで、該微生物膜に対して、疎水性有機溶媒中
に添加した一級アルコールを作用させ、それにより、脂
肪酸塩のβ−酸化によってあるいはそれにさらに複合さ
れた形の糖質の解糖系によって生じるアセチル−CoA と
該一級アルコールとを、AATFase の存在下に、微生物的
にアセチル化させることができる。しかして、本発明の
最も大きな特徴は、脂肪酸塩のβ−酸化系をアセチル−
CoA 生産に活用するため、従来の糖質の解糖系を利用す
る場合に比べてより高い速度で、しかもより効率的にア
セチル−CoA を生成せしめることができる点にある。

【０００８】本発明で利用する微生物菌体のβ−酸化系
は、固定化担体中に添加した脂肪酸塩を原料とするアシ
ル−CoA シンセターゼによる CoA 化を出発とし、不飽
和化および水酸化を経由してアセチル−CoA の生産に至
る経路であり、解糖系と比較してより効率的にアセチル
−CoA を生産することができる。しかし、オクタン酸塩
やデカン酸塩などの中鎖アルカン酸塩を添加した場合に
は、それら中鎖アルカン酸塩の強烈な毒性発現によって
固定化担体表面の微生物の代謝系は強い阻害を受けてし
まう。界面バイオリアクターは疎水性有機溶媒相中に添
加した疎水性アルカン酸の毒性を著しく緩和することが
できる［Oda, S., et al., J. Ferment,Bioeng., ７
８，１４９（１９９４）］が、これらアルカン酸を塩の
形で担体中に添加した場合には、それらの毒性を回避す
ることは不可能である。したがって、本発明においてア
セチル−CoA を供給するためにβ−酸化系を利用するに
は、短鎖の脂肪酸塩、例えば酢酸、プロピオン酸、酪酸
のような短鎖のアルカン酸のナトリウム塩、カリウム
塩、アンモニウム塩などを固定化担体の液相中に添加す
ることが必要である。また、中鎖あるいは長鎖脂肪酸を
遊離の形で界面バイオリアクターの有機溶媒相に添加し
た場合にもやはり、β−酸化系に対する強い阻害作用が
認められ適用困難である。

【０００９】固定化担体中に添加される短鎖脂肪酸塩
は、それ自体栄養源として使用できるが、主としてアセ
チル−CoA の供給源として使用される。特に酢酸塩は非
常に安価であり、栄養源として大量に消費させることが
可能であるが、酢酸塩のような脂肪酸塩を唯一の炭素源
として使用する場合、界面バイオリアクターの有機溶媒
相中に添加する一級アルコールが固定化微生物菌体のア
ルコールデヒトロゲナーゼの作用によってアルデヒドあ
るいはカルボン酸に酸化される場合があるので注意が必
要である。糖質の解糖系を経てアセチル−CoA を生産す
る従来のカップリングシステムでは、高濃度で担体中に
存在するグルコース等の糖質によって一級アルコールの
酸化が抑止される［Oda, S., et al., Appl. Environ.
Microbiol., ６２，２２１６（１９９６）］。この現象
は、高濃度グルコースによってアルコールデヒトロゲナ
ーゼの生成が抑止されることに起因する［Yadav, B.
S., etal., J. Ferment. Technol., ５７，２４４（１
９７９）；Schimpfessel, L.,Biochim. Biophys. Acta,
１５１，３１７（１９６８）］。したがって、本発明
においてアセチル−CoA の原料として供給される短鎖脂
肪酸塩は単独で用いるよりもグルコース等の糖質と共存
する形で使用することが好ましい。

【００１０】本発明者らは、上記のカップリングシステ
ムの鍵酵素である AATFase の基質特異性について先に
報告した［Oda, S. and Ohta, H., J. Ferment. Bioen
g.,８３，４２３（１９９７）］が、この酵素は一級ア
ルコールに対する基質特異性が広く、種々の脂肪族アル
コール、芳香族アルコール、テルペンアルコールなどの
１級アルコールをアセチル化することが可能であるのみ
ならず、脂環式アルコール、複素環式アルコールなどの
一級アルコールをアセチル化することも可能である。し
かしながら、二級および三級アルコールのアセチル化に
対しては全く触媒作用を示さない。上記した一級アルコ
ールは、界面バイオリアクターにおける毒性緩和現象
［Oda, S. and Ohta, H., Biosci. Biotech. Biochem.,
５６，１５１５（１９９２）］に基づいて、非常に高
い濃度で疎水性有機溶媒相に添加可能であるが、脂肪酸
塩からアセチル−CoA に至るβ−酸化系が添加したアル
コール類によって阻害を受ける場合には、これら一級ア
ルコール類を流加（逐次添加）することにより、容易に
その阻害作用を回避することができる。また、生成する
酢酸エステル類は水に対する溶解度が低く、界面バイオ
リアクターの有機溶媒相に自動的に移行するため、その
毒性は回避され、結果的に該酢酸エステル類は非常に高
い濃度で有機溶媒相中に蓄積させることができる。

【００１１】本発明に供し得る微生物としては、ピシア
（Pichia）属又はハンゼヌラ（Hansenula）属に属する
酵母を挙げることができる。より具体的には、例えば、
ピシア・クエルキューム（Pichia quercuum）、ピシア
・サルゲンテンシス（P. sargentensis）、ピシア・グ
イリエルモンディ（P. guilliermondii）、ピシア・ク
ルイベリ（P. kluyveri）、ピシア・ヒーディ（P. heed
ii）、ハンゼヌラ・サチュールナス（Hansenula saturn
us）等が挙げられる。一方、AATFase 生産性酵母として
知られているサッカロマイセス（Saccharomyces）属に
属する酵母については、生産される AATFase が、その
活性中心を細胞質側に向けているため、一般的に本発明
には不適当である。

【００１２】さらに、ラセミ体一級アルコールのエナン
チオ選択的カップリング能を有する酵母、例えば、ピシ
ア（Pichia kluyveri）を本発明のシステムに用いた場
合には、従来のカップリングシステムに比較してより速
い速度で、かつより高いエナンチオ選択性で、ラセミ体
一級アルコールの光学分割を実施することが可能であ
る。

【００１３】本発明のカップリングシステムで使用し得
る界面バイオリアクターは、それ自体既知のものである
ことができ、使用される親水性固定化担体の素材、大き
さおよび形態、使用可能な疎水性有機溶媒については、
例えば、特許第２５４２７６６号公報に記載されたもの
を使用することができる。

【００１４】親水性固定化担体としては、例えば、アル
ギン酸、カラギーナン、デンプンマトリクス、寒天、濾
過板のようなセルロース材などの天然高分子；ポリビニ
ルアルコール、ウレタンポリマー、ポリアクリルアミ
ド、ポリアクリル酸などの合成高分子；泡ガラス板のよ
うな無機多孔質材料の板状化物等を挙げることができ
る。担体を繰り返し再生使用する場合には、ゲル状合成
高分子や無機多孔質材料の板状化物などを用いる方が好
ましく、また、それらに強度を付与するために、強固な
濾過板や泡ガラス板のような多孔質板、あるいはステン
レスフレーム製の棒状もしくは板状フレームを担体の骨
格として用いることが好ましい。

【００１５】上記の親水性固定化担体には、通常、前記
微生物の栄養源及びアセチル−CoAの原料である前述の
如き短鎖脂肪酸塩を含有する水性媒体が導入又は含浸せ
しめられる。該栄養源としては、例えば、炭素源として
は短鎖脂肪酸塩及び／又はグルコースを、窒素源として
はペプトンを、微量栄養源としては酵母エキスを、そし
て微量金属塩としては硫酸マグネシウムをそれぞれ挙げ
ることができる。

【００１６】該親水性固定化担体表面への微生物菌体の
付着（植菌）法としては、例えば、菌体懸濁液を塗布す
る方法；該懸濁液中へ担体をディッピングする方法等が
挙げられる。

【００１７】このようにして植菌された微生物菌体は、
該担体中の栄養源を利用して分裂、増殖し、担体表面に
膜（微生物膜）を形成する。

【００１８】また、反応溶媒である疎水性有機溶媒とし
ては、固定化された微生物菌体に対して実質的に毒性を
示さないものが好ましく、具体的には例えば、ヘキサ
ン、ヘプタン、オクタン、デカン等の炭素数６〜２０の
ノルマルパラフィン類；イソオクタン等のイソパラフィ
ン類；ペンチルベンゼン、ヘキシルベンゼン等の脂肪鎖
長５〜１５のノルマルアルキルベンゼン類；キュメン等
のイソアルキルベンゼン類；シクロヘキサン等の脂環式
炭化水素類；ヘキシルエーテル等の脂肪族エーテル類；
ジブチルフタレート等の芳香族エステル類；デカン酸エ
チル等の脂肪族エステル類；ポリジメチルシロキサン等
のシリコンオイル等を例示することができる。

【００１９】さらに、使用する反応溶媒は１種類に限定
されるものではなく、原料及び生成物の溶解性、溶媒同
士の相溶性、微生物に対する毒性等を考慮して２種又は
それ以上の混合溶媒系であってもよい。

【００２０】これらの有機溶媒に添加しうる基質として
の水に不溶性もしくは難溶性の一級アルコールは、反応
に供する微生物菌体に対して著るしい毒性を示さないも
のであれば特に制限はなく、脂肪族一級アルコール、芳
香族一級アルコール、脂環式一級アルコール、複素環式
一級アルコール及びテルペンアルコール類から選ばれる
各種の一級アルコールを使用することができる。より具
体的には、例えば、１−オクタノール、１−デカノール
等の脂肪族一級アルコール；ベンジルアルコール、フェ
ネチルアルコール等の芳香族一級アルコール；２−シク
ロヘキシルプロパノール等の脂環式一級アルコール；シ
トロネロール、ゲラニオール等の一級テルペンアルコー
ルを例示することができる。

【００２１】本発明の方法を実施するための界面バイオ
リアクターの具体例としては、例えば、反応溶媒として
パラフィン類を用い、そして固定化担体としてステンレ
スフレームを骨格として内部に包含するポリビニルアル
コール−グルタルアルデヒド−アルギン酸複合架橋系ゲ
ル板を使用し、これらを反応溶媒中に縦方向に配列充填
したものを用いることができる。

【００２２】一方、微生物菌体の懸濁液の上層に一級ア
ルコールを溶解せしめた疎水性有機溶媒相を重層した水
−有機溶媒二相系反応法［Hocknull, M. D. and Lilly,
M.D., Appl. Microbiol. Biotechnol., ３３，１４８
（１９９０）］によっても、本発明における脂肪酸代謝
と微生物的アセチル化とを融合させることが可能である
が、その際には、有機溶媒やアセチル化に供する水不溶
性もしくは難溶性アルコール類、あるいは生成する酢酸
エステル類の毒性発現が生じるため、さらには、二相系
反応法では、水−有機溶媒界面や水相中での基質又は生
成物の透過拡散が律速となるため、界面バイオリアクタ
ーで得られる成績を凌駕することは一般に困難である。

【００２３】本発明における脂肪酸代謝と微生物的アセ
チル化との融合システムにおいて、β−酸化によってア
セチル−CoA を生産するためには酸素を効率的に供給す
る必要があるが、界面バイオリアクターの反応溶媒であ
る疎水性有機溶媒は一般に水の１０倍程度の酸素溶解性
を有しているため、非常に効率的にアセチル−CoA が生
産され、アセチル化反応に供される。

【００２４】かくして、本発明の方法によれば、前述し
た如き一級アルコールの酢酸エステルを何らアセチルド
ナーを添加する必要なく、非常に効率的かつ高濃度で合
成することが可能である。

【００２５】合成される酢酸エステル類、例えば酢酸デ
シル、酢酸ベンジル、酢酸ゲラニル等は香料原料として
有用である。さらに、本発明の方法において微生物菌体
としてピシア・クルイベリ（Pichia kluyveri）を用い
た場合には、シトロネロールのような反応点と不斉点と
が離れた一級アルコールの光学分割が可能となるが、こ
れは従来の技術では達成困難なことである。

【００２６】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。

【００２７】実施例１ 直径２１ｃｍのガラスシャーレに、ペプトン５ｇ、酵母
エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、硫酸マグネシウム１ｇ、
グルコース５０ｇ、酢酸ナトリウム５０ｇ、寒天２０ｇ
および蒸留水１ｌよりなる寒天平板培地（ｐＨ７.０）
を５００ｍｌ分注し、これにハンゼヌラ・サチュールナ
ス（Hansenula saturnus）ＩＦＯ ０８０９の懸濁液３
ｍｌを植菌して１日間前培養した。この前培養によって
成長した微生物膜上に５％ゲラニオール／デカン溶液５
０ｍｌを重層し、３０℃で静置培養した。デカン層のガ
スクロマトグラフィーによる分析の結果、ガップリング
産物である酢酸ゲラニルの蓄積が培養開始１日目から認
められ、４日間の培養で５２.３ｍｇ／ｍｌの蓄積濃度
に達した。

【００２８】比較例１ 実施例１の培地組成のうち酢酸ナトリウムを欠く寒天平
板培地を用いて実施例１と同様のカップリング試験を実
施した。その結果、酢酸ゲラニルの生成速度は実施例１
と比較して約１／５に低下し、４日間の培養では酢酸ゲ
ラニルの蓄積濃度は９.７ｍｇ／ｍｌにとどまった。

【００２９】実施例２ ピシア・クルイベリ（Pichia kluyveri）ＩＦＯ １１６
５を植菌、１日間前培養した寒天被覆濾過板８枚を縦配
列にて充填した板状担体充填型界面バイオリアクター
（内容積３.０ｌ）を組み立てた。該担体内部の水相は
同量の実施例１の培地の２倍濃度の液体培地にて３日間
平衡化させることによって栄養源を取り込ませた。４％
シトロネロール／デカン溶液６００ｍｌを分注し、３０
℃、撹拌速度５００ｒｐｍ、通気量３００ｍｌ／ｍｉｎ
にて実働試験に入った。デカン相をガスクロマトグラフ
ィーにて分析した結果、カップリング産物である酢酸シ
トロネリルの蓄積が試験開始１日目より認められ、７日
間で酢酸シトロネリル、残余シトロネロールの濃度は各
々２４.９ｇ／ｌ、２０.９ｇ／ｌとなった。反応終了
後、デカン層をシリカゲル４５０ｇを充填したカラムク
ロマトグラフィーにかけた。ヘキサンにてデカンを流去
した後、ヘキサン−酢酸エチル（９：１）、ヘキサン−
酢酸エチル（５：５）で順次、酢酸シトロネリルとシト
ロネロールを溶出させた。溶媒を除去した後、酢酸シト
ロネリルはアルカリ加水分解、ジョーンズ酸化した後、
酸クロライドに誘導して（Ｒ）−１−（１−ナフチルエ
チル）アミンでアミド化し、液体クロマトグラフィーに
てその絶対配置とエナンチオ過剰率を測定した。その結
果、生成したカップリング産物の酢酸シトロネリルの絶
対配置は（Ｓ）であり、そのエナンチオ過剰率は９２％
ｅ.ｅ. であった。一方、残余シトロネロールを同様に
してアミド化して分析した結果、その絶対配置、エナン
チオ過剰率はそれぞれ（Ｒ）、９１％ｅ.ｅ. であっ
た。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 親水性固定化担体に、脂肪酸からのアセ
   チルコエンザイムＡ生産能及びアルコールアセチルトラ
   ンスフェラーゼ生産能を有する微生物を付着させ、該微
   生物の栄養源及びアセチルコエンザイムＡの原料である
   短鎖脂肪酸塩を含有する水性媒体の存在下に、水に不溶
   性もしくは難溶性の一級アルコールを含有する疎水性有
   機溶媒相を該担体上の該微生物に接触させ、それにより
   接触界面において、微生物の作用による該短鎖脂肪酸塩
   のβ−酸化から生じるアセチルコエンザイムＡと該疎水
   性有機溶媒中の水に不溶性もしくは難溶性の一級アルコ
   ールとを該微生物が生産するアルコールアセチルトラン
   スフェラーゼの酵素作用によってアセチル化反応せしめ
   ることを特徴とする脂肪酸代謝と微生物的アセチル化反
   応との融合方法。
2. 【請求項２】 使用する微生物がピシア（Pichia）属又
   はハンゼヌラ（Hansenula）属に属し、かつ短鎖脂肪酸
   塩のβ−酸化能ならびにアルコールアセチルトランスフ
   ェラーゼ生産能を有する酵母である請求項１記載の融合
   方法。
3. 【請求項３】 短鎖脂肪酸塩が酢酸、プロピオン酸及び
   酪酸から選ばれる短鎖アルカン酸のナトリウム塩、カリ
   ウム塩又はアンモニウム塩である短鎖アルカン酸塩であ
   る請求項１記載の融合方法。
4. 【請求項４】 有機溶媒相中の水に不溶性もしくは難溶
   性の一級アルコールが脂肪族アルコール、芳香族アルコ
   ール、脂環式アルコール、複素環式アルコールおよびテ
   ルペンアルコール類から選ばれる一級アルコールである
   請求項１記載の融合方法。