JPH11228517A - ジアゾニウムイオンアッセイ試薬およびその使用方法 - Google Patents
ジアゾニウムイオンアッセイ試薬およびその使用方法Info
- Publication number
- JPH11228517A JPH11228517A JP10331434A JP33143498A JPH11228517A JP H11228517 A JPH11228517 A JP H11228517A JP 10331434 A JP10331434 A JP 10331434A JP 33143498 A JP33143498 A JP 33143498A JP H11228517 A JPH11228517 A JP H11228517A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bilirubin
- compound
- methyl
- diazonium
- ion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C245/00—Compounds containing chains of at least two nitrogen atoms with at least one nitrogen-to-nitrogen multiple bond
- C07C245/20—Diazonium compounds
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/103332—Bilirubin or uric acid standard or control
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
- Y10T436/145555—Hetero-N
- Y10T436/146666—Bile pigment
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 体液サンプル中に含まれるビリルビンを検出
するためのアッセイ試薬として使用できるジアゾニウム
イオン化合物を提供する。 【解決手段】 式Ｉのジアゾニウムイオン化合物： 【化１】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5のうちの少なく
とも１つはＨ、アルキル、スルホネートまたはニトロで
ある）であって、サンプル中に含まれるビリルビンと反
応して検出可能な生成物を生成し得る前記ジアゾニウム
イオン化合物。
するためのアッセイ試薬として使用できるジアゾニウム
イオン化合物を提供する。 【解決手段】 式Ｉのジアゾニウムイオン化合物： 【化１】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5のうちの少なく
とも１つはＨ、アルキル、スルホネートまたはニトロで
ある）であって、サンプル中に含まれるビリルビンと反
応して検出可能な生成物を生成し得る前記ジアゾニウム
イオン化合物。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、安定なジアゾニウ
ムイオン化合物、並びに血漿、血液または他のサンプル
中に含まれるビリルビンの検出および定量的分析のため
のアッセイを行う際の該化合物の使用方法に関する。
ムイオン化合物、並びに血漿、血液または他のサンプル
中に含まれるビリルビンの検出および定量的分析のため
のアッセイを行う際の該化合物の使用方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ビリルビンは体液中に含まれる胆汁色素
の主な成分である。血清中に存在するビリルビンは、赤
血球細胞のヘモグロビンに由来するヘムの分解産物であ
る。血清中には非抱合型ビリルビンと抱合型ビリルビン
の２つのビリルビン画分が存在する。抱合型ビリルビン
は、肝臓でグルクロン酸と抱合して水溶性となるビリル
ビンである。抱合型ビリルビンは「直接型」ビリルビン
とも呼ばれ、グルクロン酸と抱合しないビリルビンは
「間接型」ビリルビンまたは非抱合型ビリルビンと呼ば
れる。通常は、少量のビリルビンが血液中に見られるだ
けであり、正常な濃度は、直接型ビリルビンの場合には
約0.25mg/100ml血清まで（4.3μmol/L以下）であり、間
接型ビリルビンの場合には約0.75mg/100ml血清まで（1
2.7μmol/L以下）である。血液中のビリルビン含量は、
ヘモグロビンの分解が増加し、肝機能が低下すると高く
なる。
の主な成分である。血清中に存在するビリルビンは、赤
血球細胞のヘモグロビンに由来するヘムの分解産物であ
る。血清中には非抱合型ビリルビンと抱合型ビリルビン
の２つのビリルビン画分が存在する。抱合型ビリルビン
は、肝臓でグルクロン酸と抱合して水溶性となるビリル
ビンである。抱合型ビリルビンは「直接型」ビリルビン
とも呼ばれ、グルクロン酸と抱合しないビリルビンは
「間接型」ビリルビンまたは非抱合型ビリルビンと呼ば
れる。通常は、少量のビリルビンが血液中に見られるだ
けであり、正常な濃度は、直接型ビリルビンの場合には
約0.25mg/100ml血清まで（4.3μmol/L以下）であり、間
接型ビリルビンの場合には約0.75mg/100ml血清まで（1
2.7μmol/L以下）である。血液中のビリルビン含量は、
ヘモグロビンの分解が増加し、肝機能が低下すると高く
なる。
【０００３】医学的な診断では両方のビリルビン画分を
測定することが重要である。通常、ビリルビンは胆汁と
ともに胆嚢から腸へ排出される。しかしながら、このメ
カニズムは様々な疾患状態において妨害される。例え
ば、ヘモグロビンの破壊が増加している場合には、ビリ
ルビン抱合系がオーバーロード(overload)となる可能性
があり、その結果直接型／間接型ビリルビンの比率が変
化する。肝細胞の損傷、毛細胆管内の流出量の乱れまた
は胆管閉塞の場合には、胆嚢から腸へのビリルビンの排
出が減少するかまたは完全に遮断される。これにより血
中のビリルビン濃度が上昇する。その結果、ビリルビン
の絶対濃度および直接型／間接型ビリルビンの比率が影
響を受ける可能性がある。従って、両方の値の測定か
ら、肝臓、胆嚢、および腸管の特定の疾患の性質および
局在性について重要な診断結果が得られる。一般には、
全ビリルビンを通常最初に測定し、次いで直接型ビリル
ビンの含量を測定する。間接型ビリルビンの割合は、こ
の２つの値の差から得られる。血清ビリルビンを測定す
る方法は、DoumasおよびWu, Critical Reviews in Clin
ical Laboratory Sciences, 28:415-445 (1991);並びに
LottおよびDoumas, ClinChem., 39:641-647 (1993)に概
説されており、これらの開示内容は本明細書に含まれる
ものとする。
測定することが重要である。通常、ビリルビンは胆汁と
ともに胆嚢から腸へ排出される。しかしながら、このメ
カニズムは様々な疾患状態において妨害される。例え
ば、ヘモグロビンの破壊が増加している場合には、ビリ
ルビン抱合系がオーバーロード(overload)となる可能性
があり、その結果直接型／間接型ビリルビンの比率が変
化する。肝細胞の損傷、毛細胆管内の流出量の乱れまた
は胆管閉塞の場合には、胆嚢から腸へのビリルビンの排
出が減少するかまたは完全に遮断される。これにより血
中のビリルビン濃度が上昇する。その結果、ビリルビン
の絶対濃度および直接型／間接型ビリルビンの比率が影
響を受ける可能性がある。従って、両方の値の測定か
ら、肝臓、胆嚢、および腸管の特定の疾患の性質および
局在性について重要な診断結果が得られる。一般には、
全ビリルビンを通常最初に測定し、次いで直接型ビリル
ビンの含量を測定する。間接型ビリルビンの割合は、こ
の２つの値の差から得られる。血清ビリルビンを測定す
る方法は、DoumasおよびWu, Critical Reviews in Clin
ical Laboratory Sciences, 28:415-445 (1991);並びに
LottおよびDoumas, ClinChem., 39:641-647 (1993)に概
説されており、これらの開示内容は本明細書に含まれる
ものとする。
【０００４】ビリルビンの定量的な分析を可能にする分
析試験は、臨床上非常に有用である。最も広く利用され
ているビリルビンアッセイは、いわゆるジアゾ法であ
る。ジアゾ法では、ビリルビンを含むと予想されるサン
プルを、ジアゾニウム塩を含む試薬組成物と接触させ
る。ジアゾニウム塩はビリルビンと反応して２つのアゾ
ビリルビン断片を生成する。アゾビリルビンは、ビリル
ビンそのものよりも高い吸光係数を有し、検出が容易で
ある。
析試験は、臨床上非常に有用である。最も広く利用され
ているビリルビンアッセイは、いわゆるジアゾ法であ
る。ジアゾ法では、ビリルビンを含むと予想されるサン
プルを、ジアゾニウム塩を含む試薬組成物と接触させ
る。ジアゾニウム塩はビリルビンと反応して２つのアゾ
ビリルビン断片を生成する。アゾビリルビンは、ビリル
ビンそのものよりも高い吸光係数を有し、検出が容易で
ある。
【０００５】ビリルビンを測定するためのジアゾ法では
多くのジアゾニウム塩が使用されている。例えば、ジア
ゾ化スルファニル酸はビリルビンと結合して黄色のジア
ゾビリルビン色素を生成する。ビリルビンの定量分析を
行うジアゾ法の詳細は、Doumasら, Clin Chem., 31:177
9-1789 (1985); M. Michaelsson, Scand, J, Clin. La
b. Invest., 13 (Suppl.), 1-80 (1961); H. Malloy,
J. Biol, Chem., 119, 481 (1939);およびZ. K. Shihab
iら, American Journal of Medical Technology,43 (1
0), 1004-1007 (1977)に記載されており、これらの開示
内容は本明細書中に含まれるものとする。2,4-および2,
5-ジクロロフェニルジアゾニウム塩等のその他のジアゾ
ニウム塩は、血清および尿中に含まれるビリルビンの検
出に利用されている。しかしながら、これらのジアゾニ
ウム塩を使用する方法は比較的感度が低いことが知られ
ており、これらのジアゾニウム塩には、乾燥させた際に
急激に不安定になる、即ち、衝撃によって分解が引き起
こされるものもある。Babbらの米国特許第4,468,467号
参照。ビリルビンの測定に用いられている別のジアゾニ
ウム化合物はジアゾ化スルファニルアミドである。Chin
-ChungChenら, Clin Chem., 26:990 (1980)参照。Syner
med(商標)(Synermed, Inc., Quebec, Canada）全ビリル
ビン試薬は市販されており、この試薬は、3,5-ジクロロ
アニリン、3,5-ジクロロフェニルジアゾニウムテトラフ
ルオロ硼酸の安定化させたジアゾニウム塩を含み、ビリ
ルビンと反応して540nmにて最大吸収を示すアゾビリル
ビンを生成する。生成した赤色のアゾビリルビンは、ア
ルカリの添加により600nmにて吸収を示す青色へシフト
させることができる。カフェインおよび界面活性剤を反
応促進剤として使用する。
多くのジアゾニウム塩が使用されている。例えば、ジア
ゾ化スルファニル酸はビリルビンと結合して黄色のジア
ゾビリルビン色素を生成する。ビリルビンの定量分析を
行うジアゾ法の詳細は、Doumasら, Clin Chem., 31:177
9-1789 (1985); M. Michaelsson, Scand, J, Clin. La
b. Invest., 13 (Suppl.), 1-80 (1961); H. Malloy,
J. Biol, Chem., 119, 481 (1939);およびZ. K. Shihab
iら, American Journal of Medical Technology,43 (1
0), 1004-1007 (1977)に記載されており、これらの開示
内容は本明細書中に含まれるものとする。2,4-および2,
5-ジクロロフェニルジアゾニウム塩等のその他のジアゾ
ニウム塩は、血清および尿中に含まれるビリルビンの検
出に利用されている。しかしながら、これらのジアゾニ
ウム塩を使用する方法は比較的感度が低いことが知られ
ており、これらのジアゾニウム塩には、乾燥させた際に
急激に不安定になる、即ち、衝撃によって分解が引き起
こされるものもある。Babbらの米国特許第4,468,467号
参照。ビリルビンの測定に用いられている別のジアゾニ
ウム化合物はジアゾ化スルファニルアミドである。Chin
-ChungChenら, Clin Chem., 26:990 (1980)参照。Syner
med(商標)(Synermed, Inc., Quebec, Canada）全ビリル
ビン試薬は市販されており、この試薬は、3,5-ジクロロ
アニリン、3,5-ジクロロフェニルジアゾニウムテトラフ
ルオロ硼酸の安定化させたジアゾニウム塩を含み、ビリ
ルビンと反応して540nmにて最大吸収を示すアゾビリル
ビンを生成する。生成した赤色のアゾビリルビンは、ア
ルカリの添加により600nmにて吸収を示す青色へシフト
させることができる。カフェインおよび界面活性剤を反
応促進剤として使用する。
【０００６】Babbらの米国特許第4,468,467号には、ビ
リルビンアッセイ用の特定の置換スルファニルアミドジ
アゾニウム塩と置換カーボンアミド(carbonamide)ジア
ゾニウム塩が記載されている。Katsuyamaらの米国特許
第4,902,477号には、ジアゾ法によってビリルビンを定
量的に分析するための分析エレメントが開示されてい
る。この分析エレメントには、アリール基にアルコキシ
カルボニル基、アルキルアミノスルホニル基またはアル
キルアミノカルボニル基である置換基を有する特定のア
リールジアゾニウム塩が含まれる。Weissらの米国特許
第4,892,833号には、アリールジアゾニウム塩が開示さ
れており、該アリール基は、ビリルビンの測定に使用す
るためハロゲン基および低級アルコキシ基で置換されて
いる。
リルビンアッセイ用の特定の置換スルファニルアミドジ
アゾニウム塩と置換カーボンアミド(carbonamide)ジア
ゾニウム塩が記載されている。Katsuyamaらの米国特許
第4,902,477号には、ジアゾ法によってビリルビンを定
量的に分析するための分析エレメントが開示されてい
る。この分析エレメントには、アリール基にアルコキシ
カルボニル基、アルキルアミノスルホニル基またはアル
キルアミノカルボニル基である置換基を有する特定のア
リールジアゾニウム塩が含まれる。Weissらの米国特許
第4,892,833号には、アリールジアゾニウム塩が開示さ
れており、該アリール基は、ビリルビンの測定に使用す
るためハロゲン基および低級アルコキシ基で置換されて
いる。
【０００７】現在のアッセイにおいて使用される多くの
アッセイ試薬は、その使用に問題がある。例えば、市販
のジクロロアニリンジアゾニウムテトラフルオロ硼酸塩
を使用する自動ビリルビンアッセイの場合には、クロロ
アニリン誘導体のジアゾニウム体がインジカン（腎透析
患者の血清中に見られる化合物）と強く相互作用するこ
とが知られている（このため、該ジアゾニウム体はこの
サンプルタイプとしては適さなくなる）。溶血サンプル
も、ヘモグロビンによる著しい妨害のため多くのアッセ
イで使用することができない。該試薬には水系での溶解
度が比較的低いものもあり、水系での有用性を低下させ
ている。さらに、該試薬の多くが液体状態では不安定で
あり、容易に輸送することができず、有用な貯蔵寿命を
有していない。
アッセイ試薬は、その使用に問題がある。例えば、市販
のジクロロアニリンジアゾニウムテトラフルオロ硼酸塩
を使用する自動ビリルビンアッセイの場合には、クロロ
アニリン誘導体のジアゾニウム体がインジカン（腎透析
患者の血清中に見られる化合物）と強く相互作用するこ
とが知られている（このため、該ジアゾニウム体はこの
サンプルタイプとしては適さなくなる）。溶血サンプル
も、ヘモグロビンによる著しい妨害のため多くのアッセ
イで使用することができない。該試薬には水系での溶解
度が比較的低いものもあり、水系での有用性を低下させ
ている。さらに、該試薬の多くが液体状態では不安定で
あり、容易に輸送することができず、有用な貯蔵寿命を
有していない。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、体液
サンプル中に含まれるビリルビンを検出するためのアッ
セイ試薬として使用できるジアゾニウムイオン化合物を
提供することである。本発明の別の目的は、長距離輸送
をさらに可能にする熱的に安定なジアゾニウムイオン化
合物を提供することである。本発明のさらに別の目的
は、熱的に安定で長期間の貯蔵寿命を有し、かつ活性を
保持した状態で例えば１年以上保存が可能なジアゾニウ
ムイオン化合物を提供することである。
サンプル中に含まれるビリルビンを検出するためのアッ
セイ試薬として使用できるジアゾニウムイオン化合物を
提供することである。本発明の別の目的は、長距離輸送
をさらに可能にする熱的に安定なジアゾニウムイオン化
合物を提供することである。本発明のさらに別の目的
は、熱的に安定で長期間の貯蔵寿命を有し、かつ活性を
保持した状態で例えば１年以上保存が可能なジアゾニウ
ムイオン化合物を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】体液サンプル等のサンプ
ル中に含まれるビリルビン含量のアッセイ用試薬として
有用なジアゾニウムイオンを提供する。また、サンプル
に含まれるビリルビンを検出または定量するためのアッ
セイ方法も提供する。該方法は、ビリルビンを含むと予
想されるサンプルを本明細書中に開示するジアゾニウム
イオン化合物と接触させ、次いでジアゾニウムイオンと
ビリルビンの反応生成物を例えば分光測光法にて検出す
るものである。
ル中に含まれるビリルビン含量のアッセイ用試薬として
有用なジアゾニウムイオンを提供する。また、サンプル
に含まれるビリルビンを検出または定量するためのアッ
セイ方法も提供する。該方法は、ビリルビンを含むと予
想されるサンプルを本明細書中に開示するジアゾニウム
イオン化合物と接触させ、次いでジアゾニウムイオンと
ビリルビンの反応生成物を例えば分光測光法にて検出す
るものである。
【００１０】一態様では、式Ｉのジアゾニウムイオン化
合物：
合物：
【００１１】
【化５】
【００１２】（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5の
うちの少なくとも１つはＨ、アルキル、スルホネートま
たはニトロである）であって、サンプル中に含まれるビ
リルビンと反応して検出可能な生成物を生成し得る前記
ジアゾニウムイオン化合物を提供する。Ｒ1、Ｒ2、
Ｒ3、Ｒ4またはＲ5のうちの１つがＣ１〜Ｃ３アルキ
ル、好ましくはメチルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4また
はＲ5のうちの１つがスルホネートまたはニトロ、好ま
しくはニトロであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5の
うちの残りがＨである式Ｉの化合物が好適である。
うちの少なくとも１つはＨ、アルキル、スルホネートま
たはニトロである）であって、サンプル中に含まれるビ
リルビンと反応して検出可能な生成物を生成し得る前記
ジアゾニウムイオン化合物を提供する。Ｒ1、Ｒ2、
Ｒ3、Ｒ4またはＲ5のうちの１つがＣ１〜Ｃ３アルキ
ル、好ましくはメチルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4また
はＲ5のうちの１つがスルホネートまたはニトロ、好ま
しくはニトロであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5の
うちの残りがＨである式Ｉの化合物が好適である。
【００１３】好適な一態様では、ジアゾニウムイオンは
2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオン（2-メ
チル-3-ニトロ-1-ベンゼンジアゾニウムイオン）であ
り、以下の構造を有する。
2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオン（2-メ
チル-3-ニトロ-1-ベンゼンジアゾニウムイオン）であ
り、以下の構造を有する。
【００１４】
【化６】
【００１５】他の好適な化合物としては、4-アミノトル
エン-3-スルホン酸ジアゾニウムイオンが挙げられる。
好適な化合物は、アミン群等の前駆化合物から形成され
るジアゾニウムイオン化合物であり、該前駆体アミン化
合物は、酸性水溶液（例えばpHが約1.0の100mMHCl）に
対して少なくとも約0.038mg/mlの溶解度を有する。
エン-3-スルホン酸ジアゾニウムイオンが挙げられる。
好適な化合物は、アミン群等の前駆化合物から形成され
るジアゾニウムイオン化合物であり、該前駆体アミン化
合物は、酸性水溶液（例えばpHが約1.0の100mMHCl）に
対して少なくとも約0.038mg/mlの溶解度を有する。
【００１６】また、ジアゾニウムイオンを含む試薬組成
物も提供する。該試薬組成物は液状または固体状であ
り、さらに他の成分（例えば、緩衝液、担体および／ま
たは可溶化剤）を含んでいてもよい。ジアゾニウムイオ
ンおよび対アニオンを含む塩も提供する。好適な塩とし
ては、テトラフルオロ硼酸塩、ヘキサフルオロリン酸
塩、および亜鉛複塩化物等の金属複塩が挙げられる。
物も提供する。該試薬組成物は液状または固体状であ
り、さらに他の成分（例えば、緩衝液、担体および／ま
たは可溶化剤）を含んでいてもよい。ジアゾニウムイオ
ンおよび対アニオンを含む塩も提供する。好適な塩とし
ては、テトラフルオロ硼酸塩、ヘキサフルオロリン酸
塩、および亜鉛複塩化物等の金属複塩が挙げられる。
【００１７】本明細書中に開示するアッセイ法を使用し
て、サンプル中に含まれるビリルビンの総量を定量する
ことが可能である。別の態様では、サンプル中に直接型
および間接型ビリルビンが含まれ、該方法は、該サンプ
ル中に含まれる直接型および間接型ビリルビンの濃度を
検出する工程をさらに含んでいてもよい。従って、サン
プル中に含まれる直接型、間接型および全ビリルビンの
レベルを測定して、例えば肝臓、胆嚢または腸の疾患ま
たは障害の有無と相関させることが可能である。
て、サンプル中に含まれるビリルビンの総量を定量する
ことが可能である。別の態様では、サンプル中に直接型
および間接型ビリルビンが含まれ、該方法は、該サンプ
ル中に含まれる直接型および間接型ビリルビンの濃度を
検出する工程をさらに含んでいてもよい。従って、サン
プル中に含まれる直接型、間接型および全ビリルビンの
レベルを測定して、例えば肝臓、胆嚢または腸の疾患ま
たは障害の有無と相関させることが可能である。
【００１８】
【発明の実施の形態】アッセイ試薬として有用なジアゾ
ニウム化合物を提供する。特に、ジアゾニウム化合物
は、体液サンプル中に含まれるビリルビンを検出または
定量するためのアッセイにおいて有用である。一態様で
は、下記の一般式Ｉのジアゾニウム化合物：
ニウム化合物を提供する。特に、ジアゾニウム化合物
は、体液サンプル中に含まれるビリルビンを検出または
定量するためのアッセイにおいて有用である。一態様で
は、下記の一般式Ｉのジアゾニウム化合物：
【００１９】
【化７】
【００２０】（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5の
うちの少なくとも１つはＨ、アルキル、スルホネートま
たはニトロである）であって、サンプル中に含まれるビ
リルビンと反応して検出可能な生成物を生成し得る前記
ジアゾニウムイオン化合物を提供する。好ましいアルキ
ル基としてはＣ１〜Ｃ３アルキル基、例えばメチル、エ
チルおよびプロピルが挙げられる。特に好適なアルキル
基はメチルである。
うちの少なくとも１つはＨ、アルキル、スルホネートま
たはニトロである）であって、サンプル中に含まれるビ
リルビンと反応して検出可能な生成物を生成し得る前記
ジアゾニウムイオン化合物を提供する。好ましいアルキ
ル基としてはＣ１〜Ｃ３アルキル基、例えばメチル、エ
チルおよびプロピルが挙げられる。特に好適なアルキル
基はメチルである。
【００２１】好適な態様では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4また
はＲ5のうちの１つがＣ１〜Ｃ３アルキル、好ましくは
メチルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5のうちの
１つがスルホネートまたはニトロ、好ましくはニトロで
あり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5のうちの残りがＨ
である。具体的な化合物としては、4-アミノトルエン-3
-スルホン酸ジアゾニウムイオンが挙げられる。他の具
体的な化合物としては、2-メチル-4-ニトロアニリン、2
-メチル-5-ニトロアニリン、2-メチル-5-ニトロアニリ
ン水和物、2-メチル-6-ニトロアニリン、および5-メチ
ル-2-ニトロアニリンのジアゾニウムイオンが挙げられ
る。
はＲ5のうちの１つがＣ１〜Ｃ３アルキル、好ましくは
メチルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5のうちの
１つがスルホネートまたはニトロ、好ましくはニトロで
あり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5のうちの残りがＨ
である。具体的な化合物としては、4-アミノトルエン-3
-スルホン酸ジアゾニウムイオンが挙げられる。他の具
体的な化合物としては、2-メチル-4-ニトロアニリン、2
-メチル-5-ニトロアニリン、2-メチル-5-ニトロアニリ
ン水和物、2-メチル-6-ニトロアニリン、および5-メチ
ル-2-ニトロアニリンのジアゾニウムイオンが挙げられ
る。
【００２２】好適な一態様では、該化合物は、以下に示
す2-メチル-3-ニトロアニリンのジアゾニウムイオンで
ある。
す2-メチル-3-ニトロアニリンのジアゾニウムイオンで
ある。
【００２３】
【化８】
【００２４】化合物は有利には、血清サンプル等の体液
サンプル中に含まれるビリルビンを検出および定量する
アッセイに使用することができる。式Ｉの好適な化合物
は、熱的に安定で貯蔵寿命の長いものである。この化合
物を使用して、肝臓、胆嚢または腸管の機能損傷等の疾
患状態を同定することが可能である。好適な化合物は、
アミン群等の前駆化合物から形成されるジアゾニウムイ
オン化合物であり、該前駆化合物は、酸性水溶液（例え
ばpHが約1.0の100mMHCl）に対して少なくとも約0.038mg
/ml、または場合によっては少なくとも約0.5mg/ml、ま
たは好ましくは少なくとも約2.0mg/mlの溶解度を有す
る。例えば、2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウム
イオンの前駆体である2-メチル-3-ニトロアニリンは、p
Hが約1.0の100mMHClに対して約2.3mg/mlの溶解度を有す
る。
サンプル中に含まれるビリルビンを検出および定量する
アッセイに使用することができる。式Ｉの好適な化合物
は、熱的に安定で貯蔵寿命の長いものである。この化合
物を使用して、肝臓、胆嚢または腸管の機能損傷等の疾
患状態を同定することが可能である。好適な化合物は、
アミン群等の前駆化合物から形成されるジアゾニウムイ
オン化合物であり、該前駆化合物は、酸性水溶液（例え
ばpHが約1.0の100mMHCl）に対して少なくとも約0.038mg
/ml、または場合によっては少なくとも約0.5mg/ml、ま
たは好ましくは少なくとも約2.0mg/mlの溶解度を有す
る。例えば、2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウム
イオンの前駆体である2-メチル-3-ニトロアニリンは、p
Hが約1.0の100mMHClに対して約2.3mg/mlの溶解度を有す
る。
【００２５】ジアゾニウム化合物の合成 ジアゾニウム化合物は、当業界で公知のジアゾニウムカ
チオンを生成する方法を用いて合成することが可能であ
る。Heinrich Zollinger, "Diazo Chemistry I, Aromat
ic and Heteroaromatic Compounds", VCH Publishers,
New York, NY,1994, 第２章参照。一般には、ジアゾニ
ウムイオンは、亜硝酸ナトリウムおよび酸（例えば、塩
酸）を用いて遊離のアリールアミンをジアゾ化し、所望
のジアゾニウム塩を生成させることによって調製が可能
である。ジアゾ化反応混合物にアニオンの塩を含ませる
ことで、ジアゾニウム塩の望ましいアニオンを提供する
ことができる。例えば、ヘキサフルオロリン酸ナトリウ
ムを反応混合物へ含ませた場合、ヘキサフルオロリン酸
ジアゾニウム塩が得られる。あるいは、テトラフルオロ
硼酸塩を得ることも可能である。他の塩としては、金属
複塩、特に亜鉛複塩化物（ZnCl4 2-）が挙げられる。従
って、本発明の範囲内にある組成物にはジアゾニウムカ
チオンの塩が含まれる。
チオンを生成する方法を用いて合成することが可能であ
る。Heinrich Zollinger, "Diazo Chemistry I, Aromat
ic and Heteroaromatic Compounds", VCH Publishers,
New York, NY,1994, 第２章参照。一般には、ジアゾニ
ウムイオンは、亜硝酸ナトリウムおよび酸（例えば、塩
酸）を用いて遊離のアリールアミンをジアゾ化し、所望
のジアゾニウム塩を生成させることによって調製が可能
である。ジアゾ化反応混合物にアニオンの塩を含ませる
ことで、ジアゾニウム塩の望ましいアニオンを提供する
ことができる。例えば、ヘキサフルオロリン酸ナトリウ
ムを反応混合物へ含ませた場合、ヘキサフルオロリン酸
ジアゾニウム塩が得られる。あるいは、テトラフルオロ
硼酸塩を得ることも可能である。他の塩としては、金属
複塩、特に亜鉛複塩化物（ZnCl4 2-）が挙げられる。従
って、本発明の範囲内にある組成物にはジアゾニウムカ
チオンの塩が含まれる。
【００２６】具体的な合成は、2-メチル-3-ニトロアニ
リンジアゾニウムイオン（２）の合成である。この態様
では、2-メチル-3-ニトロアニリン（１）を、酸性水系
媒体中での亜硝酸ナトリウムとの反応によってジアゾニ
ウムイオン（２）へ変換する。反応を下記のスキームＩ
に示す。2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオ
ン（２）はビリルビンと反応して検出可能な生成物を形
成することが可能であり、従ってサンプル中に含まれる
ビリルビンを検出および定量するアッセイにおいて有用
である。2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオ
ン前駆体である2-メチル-3-ニトロアニリンも、有利な
ことに水系において良好な溶解度を有する。2-メチル-3
-ニトロアニリンは、pHが約1.0の100mMHClに対して少な
くとも約2.3mg/mlの溶解度を有する。
リンジアゾニウムイオン（２）の合成である。この態様
では、2-メチル-3-ニトロアニリン（１）を、酸性水系
媒体中での亜硝酸ナトリウムとの反応によってジアゾニ
ウムイオン（２）へ変換する。反応を下記のスキームＩ
に示す。2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオ
ン（２）はビリルビンと反応して検出可能な生成物を形
成することが可能であり、従ってサンプル中に含まれる
ビリルビンを検出および定量するアッセイにおいて有用
である。2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオ
ン前駆体である2-メチル-3-ニトロアニリンも、有利な
ことに水系において良好な溶解度を有する。2-メチル-3
-ニトロアニリンは、pHが約1.0の100mMHClに対して少な
くとも約2.3mg/mlの溶解度を有する。
【００２７】
【化９】
【００２８】試薬組成物 アッセイに使用するためのジアゾニウムイオン化合物を
含む試薬組成物は、溶液状または固体状等の様々な状態
で提供することができる。一態様では、試薬組成物は安
定な液状の試薬溶液の形態である。好適な態様では、酸
性水溶液中、好ましくは約0.25mM〜15mMの濃度、約７未
満のpH、好ましくは約pH0.5〜２にてジアゾニウムイオ
ン化合物を提供する。固体または液体試薬組成物は、任
意に緩衝液または可溶化剤等の他の添加物質をさらに含
んでいてもよい。
含む試薬組成物は、溶液状または固体状等の様々な状態
で提供することができる。一態様では、試薬組成物は安
定な液状の試薬溶液の形態である。好適な態様では、酸
性水溶液中、好ましくは約0.25mM〜15mMの濃度、約７未
満のpH、好ましくは約pH0.5〜２にてジアゾニウムイオ
ン化合物を提供する。固体または液体試薬組成物は、任
意に緩衝液または可溶化剤等の他の添加物質をさらに含
んでいてもよい。
【００２９】使用可能な緩衝系としては、クエン酸／ト
リス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、クエン酸／水
酸化ナトリウム水溶液、酢酸／水酸化ナトリウム水溶
液、酢酸／酢酸ナトリウム、フタル酸水素カリウム／水
酸化ナトリウム水溶液またはリン酸緩衝液が挙げられ
る。好適な緩衝系としては酢酸塩である酢酸ナトリウム
／酢酸系が挙げられる。
リス-(ヒドロキシメチル)-アミノメタン、クエン酸／水
酸化ナトリウム水溶液、酢酸／水酸化ナトリウム水溶
液、酢酸／酢酸ナトリウム、フタル酸水素カリウム／水
酸化ナトリウム水溶液またはリン酸緩衝液が挙げられ
る。好適な緩衝系としては酢酸塩である酢酸ナトリウム
／酢酸系が挙げられる。
【００３０】ビリルビンアッセイに使用する溶液には、
可溶化剤および界面活性剤が含まれ得る。具体的な可溶
化剤としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キシド、テトラヒドロフラン、ジオキサンおよびポリエ
チレングリコール等の各種グリコールが挙げられる。他
の具体的な可溶化剤としては、ポリオキシエチレン化オ
クチルフェノール（例えば、Triton(登録商標)Ｘ100, R
ohm& Haas, Philadelphia, PA）等の非イオン性界面活
性剤が挙げられ、例えば約0.1〜1.0％(w/v)の濃度にて
添加することができる。さらに、使用可能な非イオン性
界面活性剤の例としては、モノラウリン酸ポリオキシエ
チレンソルビタン（例えば、Tween(登録商標)20, ICI,
Wilmington, DE）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレ
ンソルビタン（Tween(登録商標)40, ICI, Wilmington,
DE）、およびTergitol(登録商標)15-S-30（Union Carbi
de Corp., Houston, TX）等のポリグリコールエーテル
界面活性剤が挙げられる。アルキルベタイン（Empigen
BB, Albright and Wilson, Ashland, VA）等のイオン性
界面活性剤も使用可能である。一態様では、可溶化剤を
含む水系試験溶液を提供する。該溶液は、約１〜13％(w
/v)の可溶化剤を含み、pHは７未満、好ましくは約pH0.5
〜７である。
可溶化剤および界面活性剤が含まれ得る。具体的な可溶
化剤としては、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホ
キシド、テトラヒドロフラン、ジオキサンおよびポリエ
チレングリコール等の各種グリコールが挙げられる。他
の具体的な可溶化剤としては、ポリオキシエチレン化オ
クチルフェノール（例えば、Triton(登録商標)Ｘ100, R
ohm& Haas, Philadelphia, PA）等の非イオン性界面活
性剤が挙げられ、例えば約0.1〜1.0％(w/v)の濃度にて
添加することができる。さらに、使用可能な非イオン性
界面活性剤の例としては、モノラウリン酸ポリオキシエ
チレンソルビタン（例えば、Tween(登録商標)20, ICI,
Wilmington, DE）、モノパルミチン酸ポリオキシエチレ
ンソルビタン（Tween(登録商標)40, ICI, Wilmington,
DE）、およびTergitol(登録商標)15-S-30（Union Carbi
de Corp., Houston, TX）等のポリグリコールエーテル
界面活性剤が挙げられる。アルキルベタイン（Empigen
BB, Albright and Wilson, Ashland, VA）等のイオン性
界面活性剤も使用可能である。一態様では、可溶化剤を
含む水系試験溶液を提供する。該溶液は、約１〜13％(w
/v)の可溶化剤を含み、pHは７未満、好ましくは約pH0.5
〜７である。
【００３１】ジアゾニウムイオン化合物は、担体、緩衝
液および／または可溶化剤等の任意の様々な物質と組み
合わせて製剤として提供することが可能である。適切な
担体としては、水、好ましくは酸性水溶液が挙げられ
る。ジアゾニウムイオン化合物と対アニオンを含む塩も
提供する。好適な塩としては、テトラフルオロ硼酸塩、
ヘキサフルオロリン酸塩および亜鉛複塩化物等の金属複
塩が挙げられる。
液および／または可溶化剤等の任意の様々な物質と組み
合わせて製剤として提供することが可能である。適切な
担体としては、水、好ましくは酸性水溶液が挙げられ
る。ジアゾニウムイオン化合物と対アニオンを含む塩も
提供する。好適な塩としては、テトラフルオロ硼酸塩、
ヘキサフルオロリン酸塩および亜鉛複塩化物等の金属複
塩が挙げられる。
【００３２】試薬組成物は、ジアゾニウムイオン化合物
またはその塩および酸を含んでいてもよい。このジアゾ
ニウムイオン化合物またはその塩は、酸性pHで貯蔵が可
能である。試薬組成物が水溶液の状態の場合には、有用
な酸としては塩酸および硫酸等の鉱酸が挙げられる。乾
燥試薬組成物の場合には、リンゴ酸、スルホサリチル
酸、酒石酸、コハク酸、シクロヘキサンスルファミン
酸、p-トルエンスルホン酸およびクエン酸等の、無水物
の状態では固体である酸を使用することができる。試薬
組成物が担体を含む場合には、担体マトリックスを分解
しない酸が含まれていてもよい。あるいは、水と接触し
た際にその場(insitu)で酸を生成することのできる物質
の組み合わせ（例えば、フリーデル-クラフツ塩および
有機ルイス塩基と米国特許第3,814,586号に記載されて
いるような有機酸等の弱酸との固体アダクト）を含ませ
てもよい。酸が存在することにより、ジアゾニウムイオ
ン塩とビリルビンとの結合が促進される。試薬に含まれ
る酸の量は変えることができる。例えば、酸を有効量に
てジアゾニウムイオン化合物の水溶液へ添加し、pHが約
７未満、好ましくは約pH0.5〜２の試薬溶液を提供する
ことが可能である。酸は、アッセイに使用する乾燥分析
エレメントに含まれていてもよい。
またはその塩および酸を含んでいてもよい。このジアゾ
ニウムイオン化合物またはその塩は、酸性pHで貯蔵が可
能である。試薬組成物が水溶液の状態の場合には、有用
な酸としては塩酸および硫酸等の鉱酸が挙げられる。乾
燥試薬組成物の場合には、リンゴ酸、スルホサリチル
酸、酒石酸、コハク酸、シクロヘキサンスルファミン
酸、p-トルエンスルホン酸およびクエン酸等の、無水物
の状態では固体である酸を使用することができる。試薬
組成物が担体を含む場合には、担体マトリックスを分解
しない酸が含まれていてもよい。あるいは、水と接触し
た際にその場(insitu)で酸を生成することのできる物質
の組み合わせ（例えば、フリーデル-クラフツ塩および
有機ルイス塩基と米国特許第3,814,586号に記載されて
いるような有機酸等の弱酸との固体アダクト）を含ませ
てもよい。酸が存在することにより、ジアゾニウムイオ
ン塩とビリルビンとの結合が促進される。試薬に含まれ
る酸の量は変えることができる。例えば、酸を有効量に
てジアゾニウムイオン化合物の水溶液へ添加し、pHが約
７未満、好ましくは約pH0.5〜２の試薬溶液を提供する
ことが可能である。酸は、アッセイに使用する乾燥分析
エレメントに含まれていてもよい。
【００３３】ジアゾニウムイオン化合物を含む試薬組成
物は、様々な固体形態または様々な形態の組み合わせで
調製が可能である。試薬組成物は、水または適切な希釈
剤を加えて試薬溶液に戻せる粉剤または錠剤として調製
してもよい。試薬組成物並びに充填剤および結合剤等の
物質を固体形態にする当業界で公知の技術を利用するこ
とができる。
物は、様々な固体形態または様々な形態の組み合わせで
調製が可能である。試薬組成物は、水または適切な希釈
剤を加えて試薬溶液に戻せる粉剤または錠剤として調製
してもよい。試薬組成物並びに充填剤および結合剤等の
物質を固体形態にする当業界で公知の技術を利用するこ
とができる。
【００３４】適切な支持体上に試薬組成物を含む乾燥分
析エレメントを使用してもよい。支持体とサンプルを接
触させて試薬組成物を溶解させることができ、次いでサ
ンプル中に含まれるビリルビンを検出する。乾燥分析エ
レメントは、試薬組成物を担体マトリックスへ含漬させ
て製剤化することも可能である。有用な担体物質は、水
または血清もしくは尿等の生理学的液体に曝した際に不
溶性であり、構造を完全に保つものである。具体的なマ
トリックスとしては、紙、セルロース、木材、ガラス繊
維、並びに織布および不織布が挙げられる。例えば、試
薬組成物を含有する溶液をマトリックスへ塗布し、乾燥
させることにより乾燥分析エレメントを得ることができ
る。
析エレメントを使用してもよい。支持体とサンプルを接
触させて試薬組成物を溶解させることができ、次いでサ
ンプル中に含まれるビリルビンを検出する。乾燥分析エ
レメントは、試薬組成物を担体マトリックスへ含漬させ
て製剤化することも可能である。有用な担体物質は、水
または血清もしくは尿等の生理学的液体に曝した際に不
溶性であり、構造を完全に保つものである。具体的なマ
トリックスとしては、紙、セルロース、木材、ガラス繊
維、並びに織布および不織布が挙げられる。例えば、試
薬組成物を含有する溶液をマトリックスへ塗布し、乾燥
させることにより乾燥分析エレメントを得ることができ
る。
【００３５】アッセイ 一態様では、安定なジアゾニウムイオン化合物を含む試
薬組成物を、体液サンプル中に含まれるビリルビンを検
出または定量するアッセイに使用することが可能な溶液
として提供する。サンプル中に含まれるビリルビンはジ
アゾニウムイオン化合物と反応して酸性溶液中でアゾビ
リルビンを生成する。このアゾビリルビンは約540nmで
最大吸収を示す。アルカリ媒体中では、発色団は例えば
約600nmへシフトする。反応生成物は、分光光度計また
は所望の波長での吸光度の測定が可能な他の分析機器を
用いて検出することができる。例えば、Hitachi系列の
分析機器を使用することが可能である（Boehringer Man
nheim Diagnostics, Inc., Indianapolis, IN）。従っ
て、ジアゾニウム化合物を用いることにより、血液、血
漿または血清サンプル中のビリルビンレベルを正確に測
定することができる。
薬組成物を、体液サンプル中に含まれるビリルビンを検
出または定量するアッセイに使用することが可能な溶液
として提供する。サンプル中に含まれるビリルビンはジ
アゾニウムイオン化合物と反応して酸性溶液中でアゾビ
リルビンを生成する。このアゾビリルビンは約540nmで
最大吸収を示す。アルカリ媒体中では、発色団は例えば
約600nmへシフトする。反応生成物は、分光光度計また
は所望の波長での吸光度の測定が可能な他の分析機器を
用いて検出することができる。例えば、Hitachi系列の
分析機器を使用することが可能である（Boehringer Man
nheim Diagnostics, Inc., Indianapolis, IN）。従っ
て、ジアゾニウム化合物を用いることにより、血液、血
漿または血清サンプル中のビリルビンレベルを正確に測
定することができる。
【００３６】多くの診断用途では、全ビリルビンの他に
直接型ビリルビンを定量することが重要である。ジアゾ
試薬を用いて直接型、間接型および全ビリルビンを定量
する方法は、当業界で開発されている。例えば、Lottお
よびDoumas, Clin. Chem. 39:641-647 (1993);並びにDo
umasおよびWu, Critical Reviews in Clinical Laborat
ory Sciences, 28:415-445 (1991)を参照。
直接型ビリルビンを定量することが重要である。ジアゾ
試薬を用いて直接型、間接型および全ビリルビンを定量
する方法は、当業界で開発されている。例えば、Lottお
よびDoumas, Clin. Chem. 39:641-647 (1993);並びにDo
umasおよびWu, Critical Reviews in Clinical Laborat
ory Sciences, 28:415-445 (1991)を参照。
【００３７】全ビリルビンを定量するためには、カフェ
イン等の促進剤の存在下にて、ジアゾニウム化合物をビ
リルビンを含むと予想されるサンプルと反応させる。反
応が完了した後（約10分後）、アゾビリルビン生成物を
分光測光法にて約540nmでの吸光度により検出する。あ
るいは、例えばアルカリ性酒石酸塩試薬を添加すること
により溶液をアルカリ性に変え、約598nmでの吸光度を
測定してもよい。ジアゾビリルビンの形成を促進する使
用可能な他の促進試薬（またはプロモーター）として
は、ダイフィリン、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウ
ムおよびアラビアゴムが挙げられる。吸光度は、アッセ
イ成分を含むがビリルビンサンプルを含まないサンプル
ブランクを用いて検出する。NationalInstitute for St
andards and Technology (NIST)製のビリルビン(SRM 91
6a)を、ビリルビンアッセイを検量するための標準溶液
の調製に用いることが可能である。
イン等の促進剤の存在下にて、ジアゾニウム化合物をビ
リルビンを含むと予想されるサンプルと反応させる。反
応が完了した後（約10分後）、アゾビリルビン生成物を
分光測光法にて約540nmでの吸光度により検出する。あ
るいは、例えばアルカリ性酒石酸塩試薬を添加すること
により溶液をアルカリ性に変え、約598nmでの吸光度を
測定してもよい。ジアゾビリルビンの形成を促進する使
用可能な他の促進試薬（またはプロモーター）として
は、ダイフィリン、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウ
ムおよびアラビアゴムが挙げられる。吸光度は、アッセ
イ成分を含むがビリルビンサンプルを含まないサンプル
ブランクを用いて検出する。NationalInstitute for St
andards and Technology (NIST)製のビリルビン(SRM 91
6a)を、ビリルビンアッセイを検量するための標準溶液
の調製に用いることが可能である。
【００３８】診断用途によっては、ジアゾニウム化合物
を非抱合型ビリルビンと反応させずに直接型ビリルビン
を検出できることが重要である。一般的には、直接反応
型ビリルビン（ビリルビンモノおよびジグルクロニド並
びにデルタビリルビン）を促進剤の不在下にてジアゾニ
ウムイオンと反応させる。このアッセイでは、ジアゾニ
ウムイオン化合物を血清サンプル等のビリルビンサンプ
ルと組み合わせる。アッセイ溶液の他の成分としては、
水、緩衝液、安定化剤およびHClが含まれていてもよ
い。結合の終了時に（約10分）、アゾ色素の吸光度を54
0nm付近で測定するか、あるいはアルカリ性酒石酸塩等
の塩基を添加した後、598nm付近で測定する。pHは好ま
しくは非抱合型ビリルビンの反応を防げるくらいに低く
する。非抱合型ビリルビンを反応から保護するために
は、血清サンプルをHCl（例えば100mmol/L）で希釈し、
ジアゾ試薬を添加する前に少なくとも約５分間インキュ
ベートすればよい。
を非抱合型ビリルビンと反応させずに直接型ビリルビン
を検出できることが重要である。一般的には、直接反応
型ビリルビン（ビリルビンモノおよびジグルクロニド並
びにデルタビリルビン）を促進剤の不在下にてジアゾニ
ウムイオンと反応させる。このアッセイでは、ジアゾニ
ウムイオン化合物を血清サンプル等のビリルビンサンプ
ルと組み合わせる。アッセイ溶液の他の成分としては、
水、緩衝液、安定化剤およびHClが含まれていてもよ
い。結合の終了時に（約10分）、アゾ色素の吸光度を54
0nm付近で測定するか、あるいはアルカリ性酒石酸塩等
の塩基を添加した後、598nm付近で測定する。pHは好ま
しくは非抱合型ビリルビンの反応を防げるくらいに低く
する。非抱合型ビリルビンを反応から保護するために
は、血清サンプルをHCl（例えば100mmol/L）で希釈し、
ジアゾ試薬を添加する前に少なくとも約５分間インキュ
ベートすればよい。
【００３９】好ましくは、このアッセイを水系で行う。
血漿または血清サンプル等のサンプル中に含まれる全ビ
リルビンのための具体的なアッセイでは、２つのアッセ
イ製剤を用意する。即ち、酸性可溶化剤製剤（以下、
「全ビリルビンR1製剤」という）とジアゾニウムイオン
化合物を含む試薬製剤（以下、「全ビリルビンR2製剤」
という）である（表１および２参照）。ここに記載する
アッセイは、例えば、R1およびR2製剤の成分、インキュ
ベーション時間または温度を変えることによって改変す
ることが可能である。以下のアッセイ条件および製剤を
例として挙げる。
血漿または血清サンプル等のサンプル中に含まれる全ビ
リルビンのための具体的なアッセイでは、２つのアッセ
イ製剤を用意する。即ち、酸性可溶化剤製剤（以下、
「全ビリルビンR1製剤」という）とジアゾニウムイオン
化合物を含む試薬製剤（以下、「全ビリルビンR2製剤」
という）である（表１および２参照）。ここに記載する
アッセイは、例えば、R1およびR2製剤の成分、インキュ
ベーション時間または温度を変えることによって改変す
ることが可能である。以下のアッセイ条件および製剤を
例として挙げる。
【００４０】このアッセイでは、４〜６μlのサンプル
を250μlの全ビリルビンR1製剤に添加し、混合する（サ
ンプル：R1製剤の比は約1:62〜約1:42である）。サンプ
ル中のビリルビン濃度が35mg/dLよりも高いことが判明
した場合には、サンプルを生理食塩水にて１＋１に希釈
し、再度アッセイすることができる。混合物を例えば25
℃、30℃または37℃にて約３〜５分間インキュベートす
る。各患者のサンプル、標準およびコントロールに対し
てサンプルブランクを入れる。約５分後に65μlの酸性
全ビリルビンR2製剤を添加する（R1製剤の容量の約13/5
0に等しい容量）。溶液を混合し、好ましくはインキュ
ベーション反応が終了してから約10分経過しないうちに
分光光度計を用いて約540nmにて吸光度を検出する。吸
光度を既知の全ビリルビン濃度の標準と比較し、サンプ
ルの濃度を求める。
を250μlの全ビリルビンR1製剤に添加し、混合する（サ
ンプル：R1製剤の比は約1:62〜約1:42である）。サンプ
ル中のビリルビン濃度が35mg/dLよりも高いことが判明
した場合には、サンプルを生理食塩水にて１＋１に希釈
し、再度アッセイすることができる。混合物を例えば25
℃、30℃または37℃にて約３〜５分間インキュベートす
る。各患者のサンプル、標準およびコントロールに対し
てサンプルブランクを入れる。約５分後に65μlの酸性
全ビリルビンR2製剤を添加する（R1製剤の容量の約13/5
0に等しい容量）。溶液を混合し、好ましくはインキュ
ベーション反応が終了してから約10分経過しないうちに
分光光度計を用いて約540nmにて吸光度を検出する。吸
光度を既知の全ビリルビン濃度の標準と比較し、サンプ
ルの濃度を求める。
【００４１】全ビリルビンアッセイ用の製剤の例を以下
の表１および２に示すが、これらに限定されるものでは
ない。
の表１および２に示すが、これらに限定されるものでは
ない。
【００４２】
【表１】 表１：全ビリルビンR1製剤成分 濃度 アルキルベタイン(EmpigenBB) 4〜13％(w/v)、例えば11％(w/v) ヨウ化カリウム 0〜12.5mM、例えば12.5mM 消泡FG-10エマルション 1500ppm 酢酸ナトリウム・3H2O 50〜150mM、例えば85mM スルファミン酸 50〜200mM、例えば110mM
【００４３】
【表２】 表２：全ビリルビンR2製剤成分 濃度 ＨＣｌ 50 〜500mM、例えば100mM 2-メチル-3-ニトロアニリン 1 〜15mM、例えば３mM 亜硝酸ナトリウム 1 〜20mM、例えば８mM スルファミン酸 1 〜25mM、例えば５mM
【００４４】全ビリルビンR1およびR2製剤の成分は市販
のものでもよい。例えば、アルキルベタイン（Ｃ12〜Ｃ
14アルキルベタイン、EmpigenBB）はAlbright & Wilso
n, (Ashland, VA)から入手でき；ヨウ化カリウム、スル
ファミン酸、およびHClはJ.T.Baker(Phillipsburgh, N
J)から市販されており；消泡FG-10エマルション（ポリ
ジメチルシロキサンを含むエマルション）はDow Cornin
g (Midland, MI)から市販されており；酢酸ナトリウム
・3H2OはFisher Scientific (Itaska, IL)から市販され
ており；2-メチル-3-ニトロアニリンはAldrich Chemica
l Co., St. Louis, MOから市販されており；亜硝酸ナト
リウムはSigma Chemical Company, St. Louis, MOから
市販されている。
のものでもよい。例えば、アルキルベタイン（Ｃ12〜Ｃ
14アルキルベタイン、EmpigenBB）はAlbright & Wilso
n, (Ashland, VA)から入手でき；ヨウ化カリウム、スル
ファミン酸、およびHClはJ.T.Baker(Phillipsburgh, N
J)から市販されており；消泡FG-10エマルション（ポリ
ジメチルシロキサンを含むエマルション）はDow Cornin
g (Midland, MI)から市販されており；酢酸ナトリウム
・3H2OはFisher Scientific (Itaska, IL)から市販され
ており；2-メチル-3-ニトロアニリンはAldrich Chemica
l Co., St. Louis, MOから市販されており；亜硝酸ナト
リウムはSigma Chemical Company, St. Louis, MOから
市販されている。
【００４５】上記の製剤は全て水中で調製する。成分を
組み合わせてR2製剤を調製すると、亜硝酸塩が酸と反応
して亜硝酸が生成し、次いでこの亜硝酸が2-メチル-3-
ニトロアニリンと反応して2-メチル-3-ニトロアニリン
ジアゾニウムイオンが生成する。従って、反応後には、
亜硝酸塩と2-メチル-3-ニトロアニリンはR2製剤中には
もはや実質的に存在しない。
組み合わせてR2製剤を調製すると、亜硝酸塩が酸と反応
して亜硝酸が生成し、次いでこの亜硝酸が2-メチル-3-
ニトロアニリンと反応して2-メチル-3-ニトロアニリン
ジアゾニウムイオンが生成する。従って、反応後には、
亜硝酸塩と2-メチル-3-ニトロアニリンはR2製剤中には
もはや実質的に存在しない。
【００４６】直接型ビリルビンもサンプル中で定量する
ことができる。血漿または血清サンプル等のサンプル中
に含まれる直接型ビリルビンの具体的なアッセイでは、
再び２つの製剤を用意する。即ち、酸性製剤（以下、
「直接型ビリルビンR1製剤」という）とジアゾニウムイ
オン化合物を含む試薬製剤（以下、「直接型ビリルビン
R2製剤」という）である（下記の表３および４参照）。
当業界で開発されたビリルビンアッセイの知見を利用し
てR1およびR2製剤の成分並びにインキュベーション時間
を設定および最適化することができるが、以下のアッセ
イ条件と製剤を例として挙げる。
ことができる。血漿または血清サンプル等のサンプル中
に含まれる直接型ビリルビンの具体的なアッセイでは、
再び２つの製剤を用意する。即ち、酸性製剤（以下、
「直接型ビリルビンR1製剤」という）とジアゾニウムイ
オン化合物を含む試薬製剤（以下、「直接型ビリルビン
R2製剤」という）である（下記の表３および４参照）。
当業界で開発されたビリルビンアッセイの知見を利用し
てR1およびR2製剤の成分並びにインキュベーション時間
を設定および最適化することができるが、以下のアッセ
イ条件と製剤を例として挙げる。
【００４７】血清サンプル中の直接型ビリルビン濃度の
ための具体的なアッセイでは、６μlのサンプルを250μ
lの直接型ビリルビンR1製剤へ添加し、混合する（サン
プル：R1製剤の比は約1:42である）。サンプル中のビリ
ルビン濃度が20mg/dLよりも高い場合には、サンプルを
生理食塩水にて１＋１に希釈し、再度アッセイすること
ができる。混合物を25℃、30℃または37℃にて約30秒〜
５分間インキュベートする。各患者のサンプル、標準お
よびコントロールに対してサンプルブランクを入れる。
５分後に65μlの直接型ビリルビンR2製剤を添加する
（直接型ビリルビンR1製剤の容量の約13/50に等しい容
量）。溶液を混合し、好ましくはインキュベーション反
応が終了してから約10分経過しないうちに分光光度計を
用いて約540nmにて吸光度を検出する。吸光度を、既知
のビリルビン濃度のサンプルを使用して作成した標準曲
線と相関させる。これにより、サンプル中に含まれる直
接型ビリルビンの濃度の測定が可能となる。
ための具体的なアッセイでは、６μlのサンプルを250μ
lの直接型ビリルビンR1製剤へ添加し、混合する（サン
プル：R1製剤の比は約1:42である）。サンプル中のビリ
ルビン濃度が20mg/dLよりも高い場合には、サンプルを
生理食塩水にて１＋１に希釈し、再度アッセイすること
ができる。混合物を25℃、30℃または37℃にて約30秒〜
５分間インキュベートする。各患者のサンプル、標準お
よびコントロールに対してサンプルブランクを入れる。
５分後に65μlの直接型ビリルビンR2製剤を添加する
（直接型ビリルビンR1製剤の容量の約13/50に等しい容
量）。溶液を混合し、好ましくはインキュベーション反
応が終了してから約10分経過しないうちに分光光度計を
用いて約540nmにて吸光度を検出する。吸光度を、既知
のビリルビン濃度のサンプルを使用して作成した標準曲
線と相関させる。これにより、サンプル中に含まれる直
接型ビリルビンの濃度の測定が可能となる。
【００４８】直接型ビリルビンアッセイ用の製剤の例を
以下の表３および４に示すが、これらに限定されるもの
ではない。
以下の表３および４に示すが、これらに限定されるもの
ではない。
【００４９】
【表３】 表３：直接型ビリルビンR1製剤成分 濃度 ベタイン一水和物 1 〜８％(w/v)、例えば２％(w/v) Thesit(登録商標) 0.05〜0.3％(w/v)、例えば0.2％(w/v) ヨウ化カリウム 0.1 〜12mM、例えば２mM 酢酸ナトリウム・3H2O 50 〜150mM、例えば85mM スルファミン酸 50 〜300mM、例えば200mM
【００５０】
【表４】 表４：直接型ビリルビンR2製剤成分 濃度 ＨＣｌ 100mM 2-メチル-3-ニトロアニリン 0.25〜12mM、例えば３mM 亜硝酸ナトリウム 8 〜11mM、例えば８mM スルファミン酸 5 mM
【００５１】直接型ビリルビン製剤の成分は市販のもの
でもよい。例えば、ベタイン一水和物および亜硝酸ナト
リウムはSigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から入手
できる。Thesit(登録商標)（ドデシルポリ(エチレング
リコールエーテル)n）は、Boehringer Mannheim Corpor
ation (Indianapolis, IN)から入手でき；ヨウ化カリウ
ム、スルファミン酸およびHClはJ.T. Baker(Phillipsbu
rgh, NJ)から入手でき；酢酸ナトリウム・3H2OはFisher
Scientific (Itaska, IL)から市販されており；2-メチ
ル-3-ニトロアニリンはAldrich Chemical Co. (St. Lou
is, MO)から市販されている。
でもよい。例えば、ベタイン一水和物および亜硝酸ナト
リウムはSigma Chemical Co. (St. Louis, MO)から入手
できる。Thesit(登録商標)（ドデシルポリ(エチレング
リコールエーテル)n）は、Boehringer Mannheim Corpor
ation (Indianapolis, IN)から入手でき；ヨウ化カリウ
ム、スルファミン酸およびHClはJ.T. Baker(Phillipsbu
rgh, NJ)から入手でき；酢酸ナトリウム・3H2OはFisher
Scientific (Itaska, IL)から市販されており；2-メチ
ル-3-ニトロアニリンはAldrich Chemical Co. (St. Lou
is, MO)から市販されている。
【００５２】上記の製剤は全て水中で調製する。上述し
たように、R2製剤の成分を混合すると、亜硝酸塩が酸と
反応して亜硝酸が生成し、次いでこの亜硝酸が2-メチル
-3-ニトロアニリンと反応して2-メチル-3-ニトロアニリ
ンジアゾニウムイオンが生成する。従って、反応後に
は、亜硝酸塩と2-メチル-3-ニトロアニリンは製剤中に
はもはや実質的に存在しない。
たように、R2製剤の成分を混合すると、亜硝酸塩が酸と
反応して亜硝酸が生成し、次いでこの亜硝酸が2-メチル
-3-ニトロアニリンと反応して2-メチル-3-ニトロアニリ
ンジアゾニウムイオンが生成する。従って、反応後に
は、亜硝酸塩と2-メチル-3-ニトロアニリンは製剤中に
はもはや実質的に存在しない。
【００５３】ジアゾニウムイオンの利点と特性 本発明の範囲内の好適なジアゾニウムイオン化合物は、
ビリルビンと反応して、例えば分光測光法にて検出可能
な生成物を形成し得る化合物である。ビリルビンとの反
応性が高い化合物が特に好適である。
ビリルビンと反応して、例えば分光測光法にて検出可能
な生成物を形成し得る化合物である。ビリルビンとの反
応性が高い化合物が特に好適である。
【００５４】また、本明細書中で定義したような熱的に
安定なジアゾニウムイオン化合物も好適である。本明細
書中で用いる「熱的に安定な」とは、約42℃の温度に少
なくとも１日おいた後でも化合物の約60％が分解せずに
残存し、かつ活性を保持している化合物および／または
該化合物を含む試薬製剤のことをいう。該ジアゾニウム
化合物は、好ましくは海外輸送の熱的要件を満たすのに
充分安定なものである。また、試薬に熱的ストレスをか
けても、４℃で少なくとも12ヶ月の貯蔵寿命を得るのに
充分なレベル（少なくとも元の約60％程度のレベル）の
活性成分を有するのが好ましい。
安定なジアゾニウムイオン化合物も好適である。本明細
書中で用いる「熱的に安定な」とは、約42℃の温度に少
なくとも１日おいた後でも化合物の約60％が分解せずに
残存し、かつ活性を保持している化合物および／または
該化合物を含む試薬製剤のことをいう。該ジアゾニウム
化合物は、好ましくは海外輸送の熱的要件を満たすのに
充分安定なものである。また、試薬に熱的ストレスをか
けても、４℃で少なくとも12ヶ月の貯蔵寿命を得るのに
充分なレベル（少なくとも元の約60％程度のレベル）の
活性成分を有するのが好ましい。
【００５５】好適な態様では、該化合物は、体液または
他のサンプル中に含まれる妨害の可能性のある化合物
（例えば、ヘモグロビンまたはインジカン）とも実質的
に反応しない。好ましくは、該化合物によって、サンプ
ル中に2000mg/dLまでのヘモグロビンが含まれていても
ビリルビンの正確な測定が可能となる。別の態様では、
該化合物によって、サンプル中に10mg/dLまでのインジ
カンが含まれていてもビリルビンの正確な測定が可能と
なる。また、水系で可溶性のアミン前駆体から形成され
る化合物も好適である。先行技術の化合物を用いる際の
問題点は、水系での溶解度が低いことであった。
他のサンプル中に含まれる妨害の可能性のある化合物
（例えば、ヘモグロビンまたはインジカン）とも実質的
に反応しない。好ましくは、該化合物によって、サンプ
ル中に2000mg/dLまでのヘモグロビンが含まれていても
ビリルビンの正確な測定が可能となる。別の態様では、
該化合物によって、サンプル中に10mg/dLまでのインジ
カンが含まれていてもビリルビンの正確な測定が可能と
なる。また、水系で可溶性のアミン前駆体から形成され
る化合物も好適である。先行技術の化合物を用いる際の
問題点は、水系での溶解度が低いことであった。
【００５６】好適なジアゾニウムイオン化合物の一例
は、2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオンで
ある。この化合物は、血清または他の体液サンプル中の
妨害化合物と実質的に反応しない。この化合物によっ
て、著しく溶血したサンプル中に含まれるビリルビンの
正確な測定が可能となる。溶血したサンプル中には、非
常に高濃度のヘモグロビン（例えば、2000mg/dLもの高
濃度）が含まれている。他の妨害化合物（例えば、イン
ジカン）も、2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウム
イオンと有意に反応することはない。例えば10mg/dLも
の高濃度のインジカンレベルを有するサンプル中であっ
ても、ビリルビンをアッセイすることができる。これに
より、広範囲のサンプルのアッセイが可能となる。
は、2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオンで
ある。この化合物は、血清または他の体液サンプル中の
妨害化合物と実質的に反応しない。この化合物によっ
て、著しく溶血したサンプル中に含まれるビリルビンの
正確な測定が可能となる。溶血したサンプル中には、非
常に高濃度のヘモグロビン（例えば、2000mg/dLもの高
濃度）が含まれている。他の妨害化合物（例えば、イン
ジカン）も、2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウム
イオンと有意に反応することはない。例えば10mg/dLも
の高濃度のインジカンレベルを有するサンプル中であっ
ても、ビリルビンをアッセイすることができる。これに
より、広範囲のサンプルのアッセイが可能となる。
【００５７】2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウム
イオンもビリルビンとの反応性が非常に高く、熱的に安
定である。この化合物は、海外輸送の熱的要件を満たす
のに充分安定である。2-メチル-3-ニトロアニリンジア
ゾニウムイオンは比較的高温（42℃）で少なくとも１日
は耐えることができ、分解も40％未満である。例えば、
上で詳述してきたような液体試薬の状態で化合物に熱的
ストレスをかけても、４℃で少なくとも12ヶ月の貯蔵寿
命を得るのに充分なレベルの活性成分を有する。
イオンもビリルビンとの反応性が非常に高く、熱的に安
定である。この化合物は、海外輸送の熱的要件を満たす
のに充分安定である。2-メチル-3-ニトロアニリンジア
ゾニウムイオンは比較的高温（42℃）で少なくとも１日
は耐えることができ、分解も40％未満である。例えば、
上で詳述してきたような液体試薬の状態で化合物に熱的
ストレスをかけても、４℃で少なくとも12ヶ月の貯蔵寿
命を得るのに充分なレベルの活性成分を有する。
【００５８】４℃における安定性のアレニウスの概算よ
り、2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオンが
現在ビリルビンの定量に使われているスルファニルアミ
ドジアゾニウムイオンよりも約２〜2.5倍安定であるこ
とが判る。従って、この試薬は、厳しい熱的ストレス要
件を満たし、４℃で少なくとも12ヶ月の貯蔵寿命を維持
するのに充分なレベルの活性成分を保持する。2-メチル
-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオンも水または他の
水系に対して非常に可溶性である。
り、2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオンが
現在ビリルビンの定量に使われているスルファニルアミ
ドジアゾニウムイオンよりも約２〜2.5倍安定であるこ
とが判る。従って、この試薬は、厳しい熱的ストレス要
件を満たし、４℃で少なくとも12ヶ月の貯蔵寿命を維持
するのに充分なレベルの活性成分を保持する。2-メチル
-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオンも水または他の
水系に対して非常に可溶性である。
【００５９】従って、2-メチル-3-ニトロアニリンジア
ゾニウムイオンは、ビリルビンアッセイ試薬として多く
の利点を有するものである。この化合物は熱的に安定で
あり、ビリルビンとの反応性が非常に高く、高レベルの
ヘモグロビンまたはインジカン等の他の妨害化合物の存
在下でも正確な測定が可能となる。この化合物を使用す
ることにより、広範囲のサンプルタイプ（例えば、血
清、尿、および血漿等の体液）のアッセイが可能とな
る。従って、体液サンプル中に含まれる全ビリルビンレ
ベルまたは直接型ビリルビンレベルのいずれかをアッセ
イすることにより、様々な代謝障害、異常状態、並びに
肝臓、胆嚢および腸に影響を与えるような全ビリルビ
ン、直接型ビリルビンまたは間接型ビリルビンのいずれ
かのレベルの変化に関連する疾患の検出および診断が可
能となる。
ゾニウムイオンは、ビリルビンアッセイ試薬として多く
の利点を有するものである。この化合物は熱的に安定で
あり、ビリルビンとの反応性が非常に高く、高レベルの
ヘモグロビンまたはインジカン等の他の妨害化合物の存
在下でも正確な測定が可能となる。この化合物を使用す
ることにより、広範囲のサンプルタイプ（例えば、血
清、尿、および血漿等の体液）のアッセイが可能とな
る。従って、体液サンプル中に含まれる全ビリルビンレ
ベルまたは直接型ビリルビンレベルのいずれかをアッセ
イすることにより、様々な代謝障害、異常状態、並びに
肝臓、胆嚢および腸に影響を与えるような全ビリルビ
ン、直接型ビリルビンまたは間接型ビリルビンのいずれ
かのレベルの変化に関連する疾患の検出および診断が可
能となる。
【００６０】以下の実施例によって本発明の理解がさら
に容易なるものと思料するが、本発明はこれらの実施例
に限定されるものではない。
に容易なるものと思料するが、本発明はこれらの実施例
に限定されるものではない。
【００６１】
【実施例】実施例１：2-メチル-3-ニトロアニリンジア
ゾニウムイオンの調製およびビリルビンのアッセイ 血清または血漿サンプル中に含まれる直接型および全ビ
リルビンの量を検出した。2-メチル-3-ニトロアニリン
ジアゾニウムイオンを、全ビリルビンアッセイ用の製剤
（全ビリルビンR2製剤）および直接型ビリルビンアッセ
イ用の製剤（直接型ビリルビンR2製剤）とした。さら
に、酸性溶液を全ビリルビンアッセイ用（全ビリルビン
R1製剤）および直接型ビリルビンアッセイ用（直接型ビ
リルビンR1製剤）に用意した。製剤を形成するのに使用
した成分を下記の表５〜８に示す。これらの製剤は水中
で調製した。
ゾニウムイオンの調製およびビリルビンのアッセイ 血清または血漿サンプル中に含まれる直接型および全ビ
リルビンの量を検出した。2-メチル-3-ニトロアニリン
ジアゾニウムイオンを、全ビリルビンアッセイ用の製剤
（全ビリルビンR2製剤）および直接型ビリルビンアッセ
イ用の製剤（直接型ビリルビンR2製剤）とした。さら
に、酸性溶液を全ビリルビンアッセイ用（全ビリルビン
R1製剤）および直接型ビリルビンアッセイ用（直接型ビ
リルビンR1製剤）に用意した。製剤を形成するのに使用
した成分を下記の表５〜８に示す。これらの製剤は水中
で調製した。
【００６２】
【表５】 表５：全ビリルビンR1製剤成分 濃度 販売元 EmpigenBB 11.00％(w/v) Albright & Wilson 消泡FG-10エマルション 1500ppm Dow Corning 酢酸ナトリウム・3H2O 85mM Fisher Scientific スルファミン酸 110mM J.T.Baker
【００６３】
【表６】 表６：全ビリルビンR2製剤成分 濃度 販売元 ＨＣｌ 100mM J.T.Baker 2-メチル-3-ニトロアニリン 3 mM Aldrich 亜硝酸ナトリウム 8 mM Sigma スルファミン酸 5 mM J.T.Baker
【００６４】
【表７】 表７：直接型ビリルビンR1製剤成分 濃度 販売元 ベタイン一水和物 2.00％(w/v) Sigma Thesit(登録商標) 0.20 ％(w/v) BoehringerMannheim ヨウ化カリウム 2 mM J.T.Baker 酢酸ナトリウム・3H2O 85mM Fisher Scientific スルファミン酸 200mM J.T.Baker
【００６５】
【表８】 表８：直接型ビリルビンR2製剤成分 濃度 販売元 ＨＣｌ 100mM J.T.Baker 2-メチル-3-ニトロアニリン 3 mM Aldrich 亜硝酸ナトリウム 8 mM Sigma スルファミン酸 5 mM J.T.Baker
【００６６】全および直接型ビリルビンR2製剤について
は、亜硝酸塩が酸と反応して亜硝酸が生成し、この亜硝
酸が次いで2-メチル-3-ニトロアニリンと反応して2-メ
チル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオンが生成する
ため、亜硝酸塩自体はもはや試薬中には実質的に存在せ
ず、また2-メチル-3-ニトロアニリンも試薬中には実質
的に存在しない。成分を混合した後のR2製剤は、４℃で
少なくとも約18ヶ月間安定であった。
は、亜硝酸塩が酸と反応して亜硝酸が生成し、この亜硝
酸が次いで2-メチル-3-ニトロアニリンと反応して2-メ
チル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオンが生成する
ため、亜硝酸塩自体はもはや試薬中には実質的に存在せ
ず、また2-メチル-3-ニトロアニリンも試薬中には実質
的に存在しない。成分を混合した後のR2製剤は、４℃で
少なくとも約18ヶ月間安定であった。
【００６７】R2溶液を形成するために、2-メチル-3-ニ
トロアニリンを室温で100mMHClに溶解した。溶液を約４
℃に冷却した。溶液を冷却したまま、適切な量の固体亜
硝酸ナトリウムをゆっくりと加え、全ての亜硝酸塩を完
全に溶解させた。溶液を冷却したまま、適切な量の固体
スルファミン酸を溶液に添加し、確実にスルファミン酸
を完全に溶解させた。
トロアニリンを室温で100mMHClに溶解した。溶液を約４
℃に冷却した。溶液を冷却したまま、適切な量の固体亜
硝酸ナトリウムをゆっくりと加え、全ての亜硝酸塩を完
全に溶解させた。溶液を冷却したまま、適切な量の固体
スルファミン酸を溶液に添加し、確実にスルファミン酸
を完全に溶解させた。
【００６８】Boehringer Mannheim Diagnostics, Inc.,
(Indianapolis, IN) Hitachi(登録商標)系列の臨床用
アナライザーH717、H917、またはH747等の臨床用分析機
器を使用してアッセイを行った。検量標準は、既定レベ
ルのビリルビンを有する市販の検量物質であるPrecical
(Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN)とした。他
に使用してもよい既知の濃度のビリルビンを有する血清
をベースとするビリルビンサンプルコントロール物質
は、異常コントロール物質であるPrecitrol-A（PTA）お
よび正常コントロール物質であるPrecitrol-N（PTN）で
ある。使用したブランクまたはゼロ検量物質は生理食塩
水である。
(Indianapolis, IN) Hitachi(登録商標)系列の臨床用
アナライザーH717、H917、またはH747等の臨床用分析機
器を使用してアッセイを行った。検量標準は、既定レベ
ルのビリルビンを有する市販の検量物質であるPrecical
(Boehringer Mannheim; Indianapolis, IN)とした。他
に使用してもよい既知の濃度のビリルビンを有する血清
をベースとするビリルビンサンプルコントロール物質
は、異常コントロール物質であるPrecitrol-A（PTA）お
よび正常コントロール物質であるPrecitrol-N（PTN）で
ある。使用したブランクまたはゼロ検量物質は生理食塩
水である。
【００６９】アッセイでは、６μlのサンプルと250μl
のR1製剤を５分間37℃でインキュベートした。続いて、
65μlのR2製剤を添加し、溶液を５分間37℃でインキュ
ベートした。R2製剤を添加した５分後の546nmでの吸光
度を測定し、標準と相関させてビリルビン濃度を決定し
た。Hitachiアナライザーは、第二の波長（例えば、660
または700nm）における吸光度も差し引いた。
のR1製剤を５分間37℃でインキュベートした。続いて、
65μlのR2製剤を添加し、溶液を５分間37℃でインキュ
ベートした。R2製剤を添加した５分後の546nmでの吸光
度を測定し、標準と相関させてビリルビン濃度を決定し
た。Hitachiアナライザーは、第二の波長（例えば、660
または700nm）における吸光度も差し引いた。
【００７０】図１には、異なる濃度の純粋な非抱合型ビ
リルビンを添加した正常なヒト血清をベースとするサン
プルを分析するのに本方法を使用して得られた吸光度対
全ビリルビン濃度のプロットを示す (NIST-検出可能)。
Hitachi717臨床用アナライザーを、Precicalで検量した
後のサンプルの分析に使用した。Ｙ軸上の校正後の吸光
度は、サンプルの吸光度からブランク（生理食塩水）の
吸光度を引いたものに相当する。このプロットは、検量
物質の吸光度と相関させたサンプルの吸光度から得られ
た濃度並びに本方法の線形性を示すものである。
リルビンを添加した正常なヒト血清をベースとするサン
プルを分析するのに本方法を使用して得られた吸光度対
全ビリルビン濃度のプロットを示す (NIST-検出可能)。
Hitachi717臨床用アナライザーを、Precicalで検量した
後のサンプルの分析に使用した。Ｙ軸上の校正後の吸光
度は、サンプルの吸光度からブランク（生理食塩水）の
吸光度を引いたものに相当する。このプロットは、検量
物質の吸光度と相関させたサンプルの吸光度から得られ
た濃度並びに本方法の線形性を示すものである。
【００７１】以上、発明を明確にし、理解を容易にする
ために例を挙げながら本発明をある程度詳細に説明して
きたが、一定の変更および改変が実施し得ることは当業
者には明らかであろう。従って、上述の説明および実施
例を本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでは
ない。
ために例を挙げながら本発明をある程度詳細に説明して
きたが、一定の変更および改変が実施し得ることは当業
者には明らかであろう。従って、上述の説明および実施
例を本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきでは
ない。
【図１】2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオ
ンを用いるビリルビンアッセイで得られた吸光度対全ビ
リルビン濃度のグラフである。
ンを用いるビリルビンアッセイで得られた吸光度対全ビ
リルビン濃度のグラフである。
フロントページの続き (72)発明者 トレイシー イー．ゴードン アメリカ合衆国 46060 インディアナ州 ノーブルスビル，セミノール ロード 16515 (72)発明者 ジェニファー エス．ボニーク アメリカ合衆国 46239−9500 インディ アナ州，インディアナポリス， ミッドサ マー ドライブ 8526 (72)発明者 シャランパル ケー．ウォーカー アメリカ合衆国 46620 インディアナ州 インディアナポリス， ノース タクセ イドー ストリート 7007
Claims (34)
- 【請求項１】 式Ｉのジアゾニウムイオン化合物： 【化１】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5のうちの少なく
とも１つはＨ、アルキル、スルホネートまたはニトロで
ある）であって、サンプル中に含まれるビリルビンと反
応して検出可能な生成物を生成し得る前記ジアゾニウム
イオン化合物。 - 【請求項２】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5のうちの
１つがメチルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5の
うちの１つがスルホネートまたはニトロであり、Ｒ1、
Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5のうちの残りがＨである、請求
項１記載の化合物。 - 【請求項３】 100mMのHCl水溶液に対する溶解度が少な
くとも約0.038mg/mlであるアミン前駆化合物から形成さ
れるものである、請求項２記載の化合物。 - 【請求項４】 構造： 【化２】 を有する2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオ
ンからなるジアゾニウムイオン。 - 【請求項５】 請求項２記載の化合物の塩を含む試薬組
成物。 - 【請求項６】 請求項２記載の化合物の水溶液を含む試
薬組成物。 - 【請求項７】 前記溶液のpHが約７未満である、請求項
６記載の試薬組成物。 - 【請求項８】 約0.25〜15mMのジアゾニウムイオン化合
物を含み、前記溶液のpHが約0.5〜７である、請求項６
記載の試薬組成物。 - 【請求項９】 請求項２記載の化合物およびこれと複合
体化したアニオンを含む塩であって、テトラフルオロ硼
酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩および金属複塩からなる
群より選ばれる前記塩。 - 【請求項１０】 請求項４記載の化合物を含む固体試薬
組成物。 - 【請求項１１】 請求項４記載のジアゾニウムイオンの
水溶液を含む試薬組成物。 - 【請求項１２】 前記溶液のpHが約７未満である、請求
項11記載の試薬組成物。 - 【請求項１３】 約0.25〜15mMの2-メチル-3-ニトロア
ニリンジアゾニウムイオンを含み、前記溶液のpHが約0.
5〜７である、請求項11記載の試薬組成物。 - 【請求項１４】 請求項４のジアゾニウムイオンおよび
これと複合体化したアニオンを含む塩であって、テトラ
フルオロ硼酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩および金属複
塩からなる群より選ばれる前記塩。 - 【請求項１５】 請求項４記載のジアゾニウムイオンと
担体を含む固体試薬組成物。 - 【請求項１６】 前記化合物が4-アミノトルエン-3-ス
ルホン酸ジアゾニウムイオンである、請求項６記載の試
薬組成物。 - 【請求項１７】 前記化合物が、2-メチル-4-ニトロア
ニリンジアゾニウムイオン、2-メチル-5-ニトロアニリ
ンジアゾニウムイオン、2-メチル-6-ニトロアニリンジ
アゾニウムイオンおよび5-メチル-2-ニトロアニリンジ
アゾニウムイオンからなる群より選ばれるものである、
請求項６記載の試薬組成物。 - 【請求項１８】 サンプル中に含まれるビリルビンをア
ッセイする方法であって、該方法が、 a)ビリルビンを含むと予想されるサンプルを式Ｉ： 【化３】 （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5のうちの少なく
とも１つはＨ、アルキル、スルホネートまたはニトロで
ある）のジアゾニウムイオン化合物と接触させ、 b)該化合物をサンプル中に含まれるビリルビンと反応さ
せて検出可能な生成物を生成させ、 c)該生成物を検出する各工程を含む前記方法。 - 【請求項１９】 Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5のうち
の１つがメチルであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4またはＲ5
のうちの１つがスルホネートまたはニトロであり、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5のうちの残りがＨであ
る、請求項18記載の方法。 - 【請求項２０】 前記ジアゾニウムイオン化合物が、構
造： 【化４】 を有する2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオ
ンである、請求項18記載の方法。 - 【請求項２１】 前記生成物を分光測光法にて検出す
る、請求項19記載の方法。 - 【請求項２２】 サンプル中に含まれるビリルビンを定
量することをさらに含む、請求項19記載の方法。 - 【請求項２３】 前記サンプルが直接型および間接型ビ
リルビンを含むものであり、サンプル中の直接型ビリル
ビンおよび全ビリルビンの濃度を検出することをさらに
含む、請求項22記載の方法。 - 【請求項２４】 検出した直接型および間接型ビリルビ
ンの濃度に基づいて、肝臓、胆嚢もしくは腸の疾患また
は障害を検出することを含む、請求項23記載の方法。 - 【請求項２５】 前記工程a)が、サンプルを約0.25〜15
mMのジアゾニウムイオン化合物を含む水溶液と接触させ
ることを含み、該溶液のpHが約0.5〜７である、請求項1
8記載の方法。 - 【請求項２６】 前記生成物を分光測光法にて検出す
る、請求項20記載の方法。 - 【請求項２７】 サンプル中に含まれるビリルビンを定
量することをさらに含む、請求項20記載の方法。 - 【請求項２８】 前記サンプルが直接型および間接型ビ
リルビンを含むものであり、サンプル中の直接型ビリル
ビンおよび全ビリルビンの濃度を検出することをさらに
含む、請求項27記載の方法。 - 【請求項２９】 検出した直接型および間接型ビリルビ
ンの濃度に基づいて、肝臓、胆嚢もしくは腸の疾患また
は障害を検出することを含む、請求項28記載の方法。 - 【請求項３０】 前記工程a)が、サンプルを約0.25〜15
mMの2-メチル-3-ニトロアニリンジアゾニウムイオンを
含む水溶液と接触させることを含み、該溶液のpHが約0.
5〜７である、請求項20記載の方法。 - 【請求項３１】 前記工程c)が、前記工程b)の後の溶液
を酸性溶液と接触させ、生成物の吸光度を検出すること
を含む、請求項25記載の方法。 - 【請求項３２】 前記工程c)が、前記工程b)の後の溶液
を酸性溶液と接触させ、生成物の吸光度を検出すること
を含む、請求項30記載の方法。 - 【請求項３３】 前記ジアゾニウムイオン化合物が4-ア
ミノトルエン-3-スルホン酸ジアゾニウムイオンであ
る、請求項19記載の方法。 - 【請求項３４】 前記ジアゾニウムイオン化合物が、2-
メチル-4-ニトロアニリンジアゾニウムイオン、2-メチ
ル-5-ニトロアニリンジアゾニウムイオン、2-メチル-6-
ニトロアニリンジアゾニウムイオンおよび5-メチル-2-
ニトロアニリンジアゾニウムイオンからなる群より選ば
れるものである、請求項19記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/975,796 US5935861A (en) | 1997-11-21 | 1997-11-21 | Diazonium ion assay reagents and methods for their use |
| US08/975796 | 1997-11-21 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11228517A true JPH11228517A (ja) | 1999-08-24 |
| JP3569139B2 JP3569139B2 (ja) | 2004-09-22 |
Family
ID=25523408
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33143498A Expired - Fee Related JP3569139B2 (ja) | 1997-11-21 | 1998-11-20 | ジアゾニウムイオンアッセイ試薬およびその使用方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5935861A (ja) |
| EP (1) | EP0918220B1 (ja) |
| JP (1) | JP3569139B2 (ja) |
| CA (1) | CA2254357C (ja) |
| DE (1) | DE69801266T2 (ja) |
| ES (1) | ES2161011T3 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1253466A1 (en) | 2001-04-27 | 2002-10-30 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Diazonium salt and heat-sensitive recording material |
| US7022823B2 (en) | 2002-08-22 | 2006-04-04 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Diazonium salt, its synthesizing method and recording material |
| JP2012185147A (ja) * | 2011-02-18 | 2012-09-27 | Miura Co Ltd | 亜硝酸イオンの定量方法 |
| JP2014187971A (ja) * | 2013-03-28 | 2014-10-06 | Lsi Medience Corp | 肝細胞培養用基板及び肝細胞培養方法 |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6696297B2 (en) * | 2001-02-13 | 2004-02-24 | Medical Analysis Systems, Inc. | Non-oxidizable bilirubin substitutes and uses therefor |
| DE602005025919D1 (de) * | 2004-12-03 | 2011-02-24 | Canon Kk | Herstellungsverfahren für azopigmentdispersion |
| CN102645431A (zh) * | 2011-02-18 | 2012-08-22 | 三浦工业株式会社 | 亚硝酸根离子的定量方法 |
| EP3438089A1 (en) * | 2013-12-18 | 2019-02-06 | Monsanto Technology LLC | Processes for the diazotization of 2,5-dichloroanilines |
| CN110261625A (zh) * | 2019-07-15 | 2019-09-20 | 三诺生物传感股份有限公司 | 一种胆红素复合检测试剂盒及其使用方法 |
| JP2023507281A (ja) * | 2019-12-19 | 2023-02-22 | オルト－クリニカル ダイアグノスティックス インコーポレイテッド | 薄膜ベースのアッセイ用の反射率信号のデュアルセンサー検出 |
| CN113916816A (zh) * | 2021-10-16 | 2022-01-11 | 湖南永和阳光生物科技股份有限公司 | 一种用于直接胆红素测定的试剂盒 |
| CN115096831B (zh) * | 2022-06-17 | 2025-10-31 | 海南迪安医学检验中心有限公司 | 一种直接胆红素测定试剂盒及其使用方法 |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2854317A (en) * | 1950-08-08 | 1958-09-30 | Miles Lab | Method and composition for testing bilirubin in urine |
| DE2240471C3 (de) * | 1972-08-17 | 1975-04-03 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Testpapier zum Nachweis von Bilirubin in Körperflüssigkeiten |
| US3814586A (en) * | 1973-01-02 | 1974-06-04 | Miles Lab | Composition,method and device for determining bilirubin and urobilinogen |
| DE2825655A1 (de) * | 1978-06-12 | 1979-12-20 | Hoechst Ag | Verfahren zur kontinuierlichen diazotierung von aminen |
| US4482489A (en) * | 1980-11-18 | 1984-11-13 | James River Graphics, Inc. | Light-sensitive diazonium trifluoromethane sulfonates |
| JPS5842662A (ja) * | 1981-09-08 | 1983-03-12 | Ueno Seiyaku Oyo Kenkyusho:Kk | 調色されたアゾ顔料の製法 |
| US4468467A (en) * | 1982-02-01 | 1984-08-28 | Eastman Kodak Company | Diazonium salt for bilirubin assay |
| EP0103628A4 (en) * | 1982-03-11 | 1984-09-19 | Arthur Babson | STABILIZATION OF DIAZONIUM SALINE SOLUTIONS. |
| DE3225331A1 (de) * | 1982-07-07 | 1984-01-12 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zur bestimmung von direktem und gesamt-bilirubin sowie hierfuer geeignetes reagens |
| JPS59145965A (ja) * | 1983-02-09 | 1984-08-21 | Fuji Photo Film Co Ltd | ビリルビン定量用分析要素 |
| US4965210A (en) * | 1987-09-29 | 1990-10-23 | Modrovich Ivan Endre | Stable reagent for determining bilirubin in serum and method of preparation |
| DE3738542A1 (de) * | 1987-11-13 | 1989-05-24 | Hoechst Ag | Wasserunloesliche azofarbmittel, ihre herstellung und verwendung |
| JPH02296152A (ja) * | 1989-05-11 | 1990-12-06 | Hidenobu Akutsu | 病状示唆検知用紙 |
| DE4007535A1 (de) * | 1990-03-09 | 1991-09-12 | Hoechst Ag | Wasserunloesliche azofarbmittel, ihre herstellung und verwendung |
| US5278073A (en) * | 1991-05-08 | 1994-01-11 | Streck Laboratories, Inc. | Method of bilirubin assay |
-
1997
- 1997-11-21 US US08/975,796 patent/US5935861A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-11-17 DE DE69801266T patent/DE69801266T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 EP EP98121814A patent/EP0918220B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 ES ES98121814T patent/ES2161011T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-17 CA CA002254357A patent/CA2254357C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-20 JP JP33143498A patent/JP3569139B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1253466A1 (en) | 2001-04-27 | 2002-10-30 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Diazonium salt and heat-sensitive recording material |
| US7022823B2 (en) | 2002-08-22 | 2006-04-04 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Diazonium salt, its synthesizing method and recording material |
| JP2012185147A (ja) * | 2011-02-18 | 2012-09-27 | Miura Co Ltd | 亜硝酸イオンの定量方法 |
| JP2014187971A (ja) * | 2013-03-28 | 2014-10-06 | Lsi Medience Corp | 肝細胞培養用基板及び肝細胞培養方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3569139B2 (ja) | 2004-09-22 |
| US5935861A (en) | 1999-08-10 |
| EP0918220B1 (en) | 2001-08-01 |
| CA2254357A1 (en) | 1999-05-21 |
| CA2254357C (en) | 2009-04-21 |
| DE69801266D1 (de) | 2001-09-06 |
| ES2161011T3 (es) | 2001-11-16 |
| DE69801266T2 (de) | 2002-04-18 |
| EP0918220A1 (en) | 1999-05-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kabasakalian et al. | Enzymatic blood glucose determination by colorimetry of N, N-diethylaniline-4-aminoantipyrine | |
| CN105388146B (zh) | 一种同时检测尿液中钠、肌酐和微量白蛋白的试剂盒 | |
| JP3569139B2 (ja) | ジアゾニウムイオンアッセイ試薬およびその使用方法 | |
| JPH0427839B2 (ja) | ||
| JPS5813398A (ja) | 過酸化水素もしくは過酸化水素を形成する基質またはペルオキシダ−ゼもしくはペルオキシダ−ゼのように作用する物質を検出するための剤および方法 | |
| US4892833A (en) | Process and a reagent kit for the determination of direct and total filirubin | |
| EP0517914A1 (en) | Reagent and methods for calcium determination. | |
| MX2010011763A (es) | Prueba de acetaminofeno. | |
| US5149272A (en) | Assay for total and direct billirubin | |
| JP4115588B2 (ja) | 改良された蛍光偏光免疫測定法 | |
| JP5938713B2 (ja) | ヘモグロビンの高感度測定法と試薬 | |
| US6326208B1 (en) | Assay for total and direct bilirubin | |
| US5885789A (en) | Solution-based assay for peroxidatively-active substances in bodily fluids | |
| EP0433977A2 (en) | Method for optical measurement of bilirubin and reagent therefor | |
| JPS61223651A (ja) | ビリルビンの定量方法 | |
| JP3797603B2 (ja) | 試薬組成物の安定化方法 | |
| JP3403407B2 (ja) | ヒドロキシルアミンまたは酸化防止剤を含有する対照試薬 | |
| JPH09505142A (ja) | 試験片用グルコース検量剤および対照物質 | |
| US4560650A (en) | Method and compositions for determination of gamma glutamyl transpeptidase | |
| US6696297B2 (en) | Non-oxidizable bilirubin substitutes and uses therefor | |
| AU621858B2 (en) | Calcium assay reagent | |
| JPH0638757B2 (ja) | ペルオキシダ−ゼまたはｈ▲下２▼ｏ▲下２▼の測定方法 | |
| CN114544606A (zh) | 一种检测乳酸含量的组合物及试剂盒 | |
| JPS59106476A (ja) | 水溶性テトラゾリウム化合物、およびその化合物を用いて還元性物質を測定する方法 | |
| JPH06209793A (ja) | ソルビトール測定方法およびその組成物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040601 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040617 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080625 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090625 Year of fee payment: 5 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090625 Year of fee payment: 5 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100625 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110625 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110625 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120625 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120625 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130625 Year of fee payment: 9 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |