JPH11235184A - ヒト７回膜貫通受容体をコードするｃＤＮＡクローンＨＮＥＡＡ８ １ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 HNEAA81ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ド並びに前記ポリペプチドの組換え法による生産方法を
提供する。 【解決手段】 配列番号２のHNEAA81ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも９
７％同一であり、かつHNEAA81ポリペプチドの活性を有
するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、また
はこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。 【効果】 HNEAA81ポリペプチドおよびポリヌクレオチ
ドは感染症、疼痛、癌、拒食症、過食症、喘息、パーキ
ンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗し
ょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前
立腺肥大、精神および神経障害を含む機能障害または疾
病の治療と、このような症状の診断アッセイに有用であ
りうる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドによりコード
されるポリペプチド、前記のポリヌクレオチドおよびポ
リペプチドの使用、並びにその生産方法に関する。より
詳細には、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチ
ドはＧタンパク質共役受容体ファミリーに関係してお
り、以後HNEAA81と記す。本発明はまた、このようなポ
リヌクレオチドおよびポリペプチドの作用を阻害または
活性化することに関する。

【０００２】

【従来の技術】医学的に重要な生物学的プロセスの多く
が、Ｇタンパク質を含めたシグナル伝達経路に関与して
いるタンパク質および／または第二メッセンジャー（例
えば、ｃＡＭＰ）により媒介されることはよく知られて
いる (Lefkowitz, Nature, 1991, 351:353-354) 。ここ
では、これらのタンパク質はＧタンパク質を含む経路に
関与しているタンパク質、つまりＰＰＧタンパク質と称
される。こうしたタンパク質の例として、アドレナリン
作動薬やドーパミンの受容体(Kobilka, B.K.ら,Proc. N
atl. Acad. Sci. USA, 1987, 84:46-50; Kobilka, B.K.
ら, Science, 1987, 238:650-656; Bunzow, J.R.ら, Na
ture, 1988, 336:783-787)、Ｇタンパク質それ自体、エ
フェクタータンパク質（例：ホスホリパーゼＣ、アデニ
ルシクラーゼ、ホスホジエステラーゼ）、およびアクチ
ュエータータンパク質（例：プロテインキナーゼＡ、プ
ロテインキナーゼＣ）(Simon, M.I.ら, Science, 1991,
252:802-8) の受容体のようなＧＰＣ受容体を挙げるこ
とができる。

【０００３】例えば、シグナル伝達の一つのタイプで
は、ホルモンの結合の結果として細胞内で酵素アデニル
酸シクラーゼが活性化される。この酵素のホルモンによ
る活性化はヌクレオチドＧＴＰの存在に依存し、このＧ
ＴＰもホルモンの結合に影響を及ぼす。Ｇタンパク質は
ホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼと結びつけてい
る。ホルモン受容体により活性化されると、Ｇタンパク
質は結合していたＧＤＰをＧＴＰと交換することが見い
だされた。その後、ＧＴＰ担持形態が活性化されたアデ
ニル酸シクラーゼと結合する。ＧＴＰがＧＤＰへ加水分
解されると（この加水分解はＧタンパク質自体により触
媒される）、Ｇタンパク質はその不活性な基底形態へと
戻る。こうして、Ｇタンパク質は二重の役割を果たして
おり、すなわち、受容体からのシグナルをエフェクター
に中継する中間体として、さらにシグナルの持続時間を
制御する時計として機能している。

【０００４】Ｇタンパク質共役受容体の膜タンパク質遺
伝子スーパーファミリーは、７つの推定上の膜貫通ドメ
インを有すると特性付けられた。これらのドメインは細
胞外または細胞質ループにより接続された膜貫通αヘリ
ックスに相当すると考えられる。Ｇタンパク質共役受容
体には、ホルモン、ウイルス、増殖因子、神経の受容体
などの多くの生物学的に活性な受容体が含まれる。

【０００５】Ｇタンパク質共役受容体（７ＴＭ受容体と
しても知られる）は、少なくとも８つの異なる親水性ル
ープをつなぐ、約２０〜３０個のアミノ酸からなる７つ
の保存された疎水性領域を含むと特性付けられてきた。
Ｇタンパク質共役受容体のファミリーには、精神疾患お
よび神経疾患の治療に用いられる神経弛緩薬と結合する
ドーパミン受容体が含まれる。このファミリーに含まれ
るメンバーのその他の例としては、カルシトニン、アド
レナリン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、ムス
カリン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、ト
ロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮
細胞分化遺伝子−１、ロドプシン、におい物質、サイト
メガロウイルスの受容体が挙げられるが、これらに限ら
ない。

【０００６】大部分のＧタンパク質共役受容体は、機能
性タンパク質の構造を安定化させると考えられるジスル
フィド結合を形成する保存されたシステイン残基を、最
初の２つの細胞外ループのそれぞれに１個もっている。
７つの膜貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、
ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と呼ばれる。ＴＭ３がシグ
ナル伝達に係わっている。

【０００７】システイン残基のリン酸化およびリピド化
（パルミチル化またはファルネシル化）は、いくつかの
Ｇタンパク質共役受容体のシグナル伝達に影響を与える
ことができる。Ｇタンパク質共役受容体はその第三細胞
質ループおよび／またはカルボキシ末端にリン酸化部位
を含むことが多い。βアドレナリン受容体のような数種
のＧタンパク質共役受容体においては、プロテインキナ
ーゼＡおよび／または特異的な受容体キナーゼによるリ
ン酸化が受容体の脱感受性を媒介している。

【０００８】いくつかの受容体では、Ｇタンパク質共役
受容体のリガンド結合部位はＧタンパク質共役受容体の
数個の膜貫通ドメインにより形成される親水性ソケット
(socket)を含み、このソケットがＧタンパク質共役受容
体の疎水性残基によりとり囲まれていると考えられてい
る。Ｇタンパク質共役受容体のそれぞれの膜貫通ヘリッ
クスの親水側は、内側に面して極性のリガンド結合部位
を形成していると仮定される。一部のＧタンパク質共役
受容体では、ＴＭ３がＴＭ３のアスパラギン酸残基のよ
うなリガンド結合部位をもつとしてリガンドの結合に関
与してきた。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギン、
さらにＴＭ６やＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシ
ンもリガンドの結合に関与している。

【０００９】Ｇタンパク質共役受容体は、ヘテロ三量体
のＧタンパク質により、種々の細胞内酵素、イオンチャ
ンネルおよびトランスポーターに細胞内で結合すること
ができる (Johnson ら, Endoc. Rev., 1989, 10:317-33
1 を参照のこと) 。個々のＧタンパク質のαサブユニッ
トが特定のエフェクターを優先的に刺激して細胞のさま
ざまな生物学的機能をモジュレートする。Ｇタンパク質
共役受容体の細胞質側の残基のリン酸化は、一部のＧタ
ンパク質共役受容体のＧタンパク質共役を調節するため
の重要な作用機構として同定された。Ｇタンパク質共役
受容体は哺乳動物宿主のいろいろな部位で見いだされて
いる。

【００１０】ここ１５年の間に、細胞膜を７回貫通する
（7 transmembrane:７ＴＭ）受容体をターゲットとする
３５０種類ほどの治療薬が市場に導入され、成功を収め
てきた。こうしたことは、これらの受容体に治療標的と
しての確立され実証された歴史があることを示してい
る。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】明らかに、感染症（例
えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染
症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染
症）、疼痛、癌、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン
病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう
症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺
肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、そうう
つ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例
えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット
症候群を含む）を含むがこれらに限らない、機能障害ま
たは疾病を予防し、改善し、治療する上で何らかの役割
を果たす新たな受容体を同定して特性付ける必要性が存
在している。本発明はこのような受容体を提供するもの
である。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明は、一つの態様に
おいて、HNEAA81ポリペプチドおよび組換え物質、並び
にその生産方法に関する。本発明のもう一つの態様はHN
EAA81ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用方法
に関する。こうした使用には、とりわけ、感染症（例え
ば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染
症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染
症）、疼痛、癌、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン
病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう
症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺
肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、そうう
つ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例
えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット
症候群を含む）の治療が含まれる。他の態様では、本発
明は、本発明により提供される物質を用いてアゴニスト
およびアンタゴニストを同定する方法、並びに同定され
た化合物を用いてHNEAA81の平衡異常と関連した状態を
治療することに関する。本発明のさらに他の態様は、不
適当なHNEAA81活性またはHNEAA81レベルと関連した疾病
を検出するための診断アッセイに関する。

【００１３】定義 下記の定義は、本明細書中で頻繁に使用される用語を理
解しやすくするためのものである。「HNEAA81」とは、
特に、一般的には配列番号２で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドまたはそのアレル変異体を意味す
る。「受容体活性」または「受容体の生物学的活性」と
は、類似の活性、向上した活性、または望ましくない副
作用が低下したこれらの活性を含めて、HNEAA81の代謝
的または生理的機能を意味する。さらに、前記HNEAA81
の抗原的および免疫原的活性も含まれる。「HNEAA81遺
伝子」とは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を
有するポリヌクレオチドまたはそのアレル変異体および
／またはそれらの相補体を意味する。

【００１４】本明細書中で用いる「抗体」には、ポリク
ローナルおよびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本
鎖抗体、ヒト化抗体、さらにＦａｂまたは他の免疫グロ
ブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメン
トが含まれる。「単離された」とは、天然の状態から
「人間の手によって」改変されたことを意味する。「単
離された」組成物または物質が天然に存在するのであれ
ば、それはそのもとの環境から変化しているか移動して
おり、またはその両方である。例えば、生存している動
物の体内に自然界で存在するポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドは「単離された」ものではないが、その天然
状態の共存物質から分離されたポリヌクレオチドまたは
ポリペプチドは、本明細書中で用いられるように、「単
離された」ものである。

【００１５】「ポリヌクレオチド」とは、一般に任意の
ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオ
チドをさし、これは修飾されていないＲＮＡもしくはＤ
ＮＡ、または修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡであり得
る。「ポリヌクレオチド」には、制限するものではない
が、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、
一本鎖領域と二本鎖領域が混じり合ったＲＮＡ、ＤＮＡ
とＲＮＡを含むハイブリッド分子（一本鎖でも、または
より典型的には二本鎖でもよく、一本鎖領域と二本鎖領
域が混じり合ったものでもよい）が含まれる。加えて、
「ポリヌクレオチド」はＲＮＡまたはＤＮＡまたはＲＮ
ＡとＤＮＡの両方からなる三重鎖領域を意味する。「ポ
リヌクレオチド」という用語はまた、１個以上の修飾塩
基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性または
他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたは
ＲＮＡも含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチ
ル化された塩基およびイノシンのような特殊な塩基があ
る。ＤＮＡおよびＲＮＡに対してさまざまな修飾が行わ
れてきた。こうして、「ポリヌクレオチド」は、自然界
に一般的に存在するポリヌクレオチドの化学的、酵素的
または代謝的に修飾された形態、並びにウイルスおよび
細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含
する。また、「ポリヌクレオチド」は、しばしばオリゴ
ヌクレオチドと称される比較的短いポリヌクレオチドも
包含する。

【００１６】「ポリペプチド」とは、ペプチド結合また
は修飾されたペプチド結合（すなわち、ペプチドアイソ
スター）により連結された２個以上のアミノ酸を含む任
意のペプチドまたはタンパク質を意味する。「ポリペプ
チド」は短鎖（通常はペプチド、オリゴペプチドまたは
オリゴマーという）と長鎖（一般的にはタンパク質とい
う）の両方をさす。ポリペプチドは２０種類の受容体コ
ード化アミノ酸以外のアミノ酸を含んでもよい。「ポリ
ペプチド」は、翻訳後プロセシングのような天然のプロ
セスで、または当技術分野で公知の化学的修飾法のいず
れかで修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾
は基本的な教科書、より詳細な学術論文および研究文献
に詳述されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側
鎖、アミノまたはカルボキシル末端を含めてポリペプチ
ドのどこでも行うことができる。同じタイプの修飾が所
定のポリペプチドのいくつかの部位に同程度でまたはさ
まざまに異なる程度で存在してもよい。また、所定のポ
リペプチドが多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。
ポリペプチドはユビキチン化のために分枝していても、
分枝のある又はない環状であってもよい。環状の、分枝
した、または分枝した環状のポリペプチドは翻訳後の天
然プロセスから生じることがあり、また、合成法によっ
て製造することもできる。修飾としては、アセチル化、
アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの
共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌ
クレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の
共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架
橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有
架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形
成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、
ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチ
ル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リ
ン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸
化、アルギニル化のようなタンパク質へのアミノ酸の転
移ＲＮＡ媒介付加、ユビキチン化などがある。例えば、
PROTEINS - STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd
Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Ne
w York, 1993; POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICAT
ION OF PROTEINS, B.C. Johnson 編, Academic Press,
New York,1983中のWold, F., Posttranslational Prote
in Modifications: Perspectivesand Prospects, pgs.
1-12; Seifter ら, “Analysis for protein modificat
ions and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (199
0) 182:626-646;および Rattan ら, “Protein Synthes
is: Posttranslational Modifications and Aging",Ann
NY Acad Sci (1992) 663:48-62を参照のこと。

【００１７】本明細書中で用いる「変異体」とは、基準
のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、不
可欠な性質を保持しているポリヌクレオチドまたはポリ
ペプチドのことである。典型的なポリヌクレオチドの変
異体は基準ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列の点で
相違する。この変異体のヌクレオチド配列の変化は、基
準ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド
のアミノ酸配列を変更しても、しなくてもよい。ヌクレ
オチドの変化は、以下で述べるように、基準配列により
コードされるポリペプチドにおいてアミノ酸の置換、付
加、欠失、融合および末端切断（truncation）を生じさ
せることができる。典型的なポリペプチドの変異体は基
準ポリペプチドとアミノ酸配列の点で相違する。一般的
には、基準ポリペプチドの配列と変異体の配列が全般的
によく類似しており、多くの領域で同一となるような相
違に限られる。変異体と基準ポリペプチドは任意に組み
合わせた１以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列
が相違していてよい。置換または挿入されるアミノ酸残
基は遺伝子コードによりコードされるものであっても、
なくてもよい。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの
変異体はアレル変異体のように天然に存在するもので
も、天然に存在することが知られていない変異体であっ
てもよい。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの天然
に存在しない変異体は、突然変異誘発法または直接合成
により調製することができる。

【００１８】「同一性」はヌクレオチド配列またはアミ
ノ酸配列の同一性の尺度である。一般に、最大級の整合
（一致）が得られるように配列を並べる。「同一性」そ
れ自体は当技術分野で認識された意味をもち、発表され
た技法を使って計算することができる。例えば、COMPUT
ATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M. 編, OxfordUn
iversity Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING: INFO
RMATICS AND GENOMEPROJECTS, Smith, D.W. 編, Academ
ic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQ
UENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. and Griffin, H.
G. 編, HumanaPress, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANA
LYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academ
ic Press, 1987; および SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, G
ribskov, M. and Devereux, J.編, M Stockton Press,
New York, 1991を参照のこと。２つのポリヌクレオチド
またはポリペプチド配列間の同一性を決定する方法は多
数存在していると同時に、「同一性」なる用語は当業者
には公知である (Carillo, H. and Lipton, D., SIAM J
Applied Math (1988) 48:1073) 。２つの配列間の同一
性または類似性を決定するために汎用される方法として
は、Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop 編,
Academic Press, San Diego, 1994 およびCarillo, H.
and Lipton, D., SIAM J Applied Math (1988) 48:1073
に記載される方法があるが、これらに限らない。同一
性および類似性の決定方法はコンピュータプログラムに
集成されている。２つの配列間の同一性および類似性を
決定するための好適なコンピュータプログラム法として
は、GCS プログラムパッケージ (Devereux, J.ら, Nucl
eic Acids Research (1984) 12(1):387)、BLASTP、BLAS
TN、FASTA (Atschul, S.F.ら, J Molec Biol (1990) 21
5:403)があるが、これらに限らない。

【００１９】一例として、配列番号１の基準ヌクレオチ
ド配列に対して、例えば、少なくとも９５％の「同一
性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配
列番号１の基準ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌク
レオチドにつき最高で５つの点突然変異を含みうること
を除けば、基準配列と同一であることを意図している。
言い換えると、基準ヌクレオチド配列と少なくとも９５
％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチ
ドを得るには、基準配列中の５％までのヌクレオチドを
欠失させるか、他のヌクレオチドで置換するか、または
基準配列中の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド
数を基準配列に挿入すればよい。基準配列のこれらの突
然変異は、基準ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端位
置、またはこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基
準配列中のヌクレオチドの間に個々に、または基準配列
内に１以上の連続するグループとして配置することがで
きる。

【００２０】同様に、配列番号２の基準アミノ酸配列に
対して、例えば、少なくとも９５％の「同一性」を有す
るアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、このポリペ
プチド配列が配列番号２の基準アミノ酸配列のそれぞれ
１００アミノ酸につき最高で５つのアミノ酸変更を含み
うることを除けば、基準配列と同一であることを意図し
ている。言い換えると、基準アミノ酸配列と少なくとも
９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを
得るには、基準配列中の５％までのアミノ酸残基を欠失
させるか、他のアミノ酸で置換するか、または基準配列
中の全アミノ酸残基の５％までのアミノ酸数を基準配列
に挿入すればよい。基準配列のこれらの変更は、基準ア
ミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、また
はこれらの末端位置の間のどこかで起こり、基準配列中
のアミノ酸残基の間に個々に、または基準配列内に１以
上の連続するグループとして配置することができる。

【００２１】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチド 一つの態様において、本発明はHNEAA81ポリペプチド
（またはHNEAA81タンパク質）に関する。このHNEAA81ポ
リペプチドには、配列番号２のポリペプチドだけでな
く、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチド、そ
の全長において配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも
８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは
少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
プチドも含まれる。さらに、少なくとも９７〜９９％同
一であるものが非常に好適である。また、その全長にお
いて配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドと
少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より
好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を
有するポリペプチドもHNEAA81ポリペプチドに含まれ
る。さらに、少なくとも９７〜９９％同一であるものが
非常に好適である。HNEAA81ポリペプチドはこの受容体
の少なくとも１つの生物学的活性を示すことが好まし
い。

【００２２】HNEAA81ポリペプチドは「成熟」タンパク
質の形であっても、融合タンパク質のような、より大き
いタンパク質の一部であってもよい。しばしば、追加の
アミノ酸配列を含めることが有利であり、このようなア
ミノ酸配列としては、分泌すなわちリーダー配列、プロ
配列、多重ヒスチジン残基のような精製に役立つ配列、
または組換え生産の際の安定性を確保する付加的配列な
どがある。

【００２３】また、HNEAA81ポリペプチドの断片も本発
明に含まれる。こうした断片は全体的に前記HNEAA81ポ
リペプチドのアミノ酸配列の一部と同一であるが、全部
とは同一でないアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る。HNEAA81ポリペプチドと同様に、断片は「フリース
タンディング」（それ自体で独立）していても、より大
きいポリペプチド内に含まれていてもよく、つまりその
大きいポリペプチドの一部または一領域、最も好ましく
は一つの連続領域、を断片が構成していてもよい。本発
明のポリペプチド断片の代表的な例として、およその見
当でアミノ酸番号１−２０、２１−４０、４１−６０、
６１−８０、８１−１００、および１０１からHNEAA81
ポリペプチドの末端までの断片が挙げられる。ここで、
「およそ」とは、上記の範囲の一端または両端で数個、
５個、４個、３個、２個または１個のアミノ酸が増えた
り減ったりした範囲を含むものである。

【００２４】好適な断片としては、例えば、アミノ末端
を含む一連の残基もしくはカルボキシル末端を含む一連
の残基の欠失、またはアミノ末端を含むものとカルボキ
シル末端を含むものとの二連の残基の欠失を除いた、HN
EAA81ポリペプチドのアミノ酸配列を有する末端切断型
ポリペプチドが含まれる。また、αヘリックスとαヘリ
ックス形成領域、βシートとβシート形成領域、ターン
とターン形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領
域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可
変性領域、表面形成領域、基質結合領域、および高抗原
指数領域を含む断片のような、構造的または機能的特性
により特徴づけられる断片も好適である。その他の好適
な断片は生物学的に活性な断片である。生物学的に活性
な断片は、同様の活性をもつ断片、その活性が向上した
断片、または望ましくない活性が減少した断片を含め
て、HNEAA81活性を媒介するものである。さらに、動
物、特にヒトにおいて抗原性または免疫原性がある断片
も含まれる。

【００２５】これらのポリペプチド断片はどれも、抗原
活性を含めたHNEAA81の生物学的活性を保持することが
好ましい。特定された配列および断片の変異型も本発明
の一部を構成する。好適な変異型は同類アミノ酸置換に
より対象物と異なるもの、すなわち、ある残基が同様の
性質の他の残基で置換されているものである。典型的な
こうした置換は、Ala, Val, Leu と Ileの間；Ser とTh
r の間；酸性残基 AspとGlu の間；Asn とGln の間；塩
基性残基 LysとArg の間；または芳香族残基 PheとTyr
の間で起こる。特に、数個、５〜１０個、１〜５個また
は１〜２個のアミノ酸が任意の組合せで置換、欠失また
は付加されている変異型が好適である。

【００２６】本発明のHNEAA81ポリペプチドは任意の適
当な方法で製造することができる。このようなポリペプ
チドには、単離された天然に存在するポリペプチド、組
換え的に生産されたポリペプチド、合成的に製造された
ポリペプチド、またはこれらの方法の組合せにより製造
されたポリペプチドが含まれる。このようなポリペプチ
ドの製造のための手段は当業界でよく理解されている。

【００２７】本発明のポリヌクレオチド 本発明のもう一つの態様はHNEAA81ポリヌクレオチドに
関する。HNEAA81ポリヌクレオチドには、HNEAA81ポリペ
プチドおよび断片をコードする単離されたポリヌクレオ
チド、並びにこれらと密接に関連したポリヌクレオチド
が含まれる。さらに特定すると、本発明のHNEAA81ポリ
ヌクレオチドとしては、配列番号２のHNEAA81ポリペプ
チドをコードする配列番号１中に含まれるヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチド、および配列番号１の特定
配列を有するポリヌクレオチドがある。さらに、HNEAA8
1ポリヌクレオチドには、配列番号２のHNEAA81ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列とその全長において
少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含むポ
リヌクレオチド、および配列番号１のヌクレオチド配列
とその全長において少なくとも８０％同一であるヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。これに
関連して、少なくとも９０％同一であるポリヌクレオチ
ドが好適であり、特に少なくとも９５％同一であるもの
が好適である。さらに、少なくとも９７％同一であるも
のがより好ましく、少なくとも９８〜９９％同一である
ものがより一層好ましく、少なくとも９９％同一である
ものが最も好ましい。また、増幅反応に使用できる条件
下、またはプローブやマーカーとして使用できる条件下
でハイブリダイズするのに十分な、配列番号１中に含ま
れるヌクレオチド配列との同一性を有するヌクレオチド
配列もHNEAA81ポリヌクレオチドに含まれる。本発明は
また、このようなHNEAA81ポリヌクレオチドと相補的な
ポリヌクレオチドを提供する。

【００２８】本発明のHNEAA81は、ヒトHNEAA81をコード
するｃＤＮＡの塩基配列決定の結果により示されるよう
に、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーの他のタンパク
質と構造的に関連している。配列番号１のｃＤＮＡ配列
は配列番号２の333個のアミノ酸からなるポリペプチド
をコードするオープンリーディングフレーム（ヌクレオ
チド番号98−1096）を含んでいる。表２のアミノ酸配列
（配列番号２）は293個のアミノ酸残基中の約74.914％
がヒトＧタンパク質共役受容体GPR3(Geneseqpパテント
データベース、アクセス番号W04246, Bult,C.J.ら、13
Dec.1996)と同一である。さらに、HNEAA81（配列番号
２）は293個のアミノ酸残基において血小板活性化因子
受容体(Honda,Z.I.ら、Nature, 349:342-346,1991)と2
8.0％同一である( FASTA，Swissproデータベース)。そ
の上さらに、HNEAA81(配列番号２)は305個のアミノ酸残
基においてトロンビン受容体(アクセス番号P47749、Tur
ck,C.W.ら、Nature, 368:648-651,1994)と約25.6％同一
である。さらに、HNEAA81(配列番号２)は313個のアミノ
酸残基においてEBV誘導Ｇタンパク質共役受容体、EBI2
(アクセス番号P32249、Elliott,Kら、J.Virol.67:2209-
2220,1993)と26.5％同一である。表１のヌクレオチド配
列（配列番号１）は1124個のヌクレオチド残基中の約9
６％がヒトＧタンパク質共役受容体(Geneseqn パテント
データベース、アクセス番号T33904, Bult,C.Jら、13 D
ec.1996）と同一である。さらに、HNEAA81（配列番号
１）は850個のヌクレオチド残基においてKIA0001遺伝子
についてのヒトｍＲＮＡ（アクセス番号D13626, Nomur
a,N.ら、未発表，1994）と56.47％同一である( BLAST,
Genebankデータベース使用)。したがって、本発明のHNE
AA81ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、とりわ
け、それらの相同ポリペプチドおよびポリヌクレオチド
と同様の生物学的機能／特性をもつことが予測される
が、それらの有用性は当業者には自明である。

【００２９】ヒトHNEAA81のヌクレオチド配列（配列番
号１）

【表１】 1 TCTGGTTTTT AAAAAATAGC ATTTGAAAAT CATGAAGGGC TTTTTGTTTT 51 CTTTTGTTTG TATATATGTT TATTGGTAAC AGGTGACACT GGAAGCAATG 101 AACACCACAG TGATGCAAGG CTTCAACAGA TCTGAGCGGT GCCCCAGAGA 151 CACTCGGATA GTACAGCTGG TATTCCCAGC CCTCTACACA GTGGTTTTCT 201 TGACCGGCAT CCTGCTGAAT ACTTTGGCTC TGTGGGTGTT TGTTCACATC 251 CCCAGCTCCT CCACCTTCAT CATCTACCTC AAAAACACTT TGGTGGCCGA 301 CTTGATAATG ACACTCATGC TTCCTTTCAA AATCCTCTCT GACTCACACC 351 TGGCACCCTG GCAGCTCAGA GCTTTTGTGT GTCGTTTTTC TTCGGTGATA 401 TTTTATGAGA CCATGTATGT GGGCATCGTG CTGTTAGGGC TCATAGCCTT 451 TGACAGATTC CTCAAGATCA TCAGACCTTT GAGAAATATT TTTCTAAAAA 501 AACCTGTTTT TGCAAAAACG GTCTCAATCT TCATCTGGTT CTTTTTGTTC 551 TTCATCTCCC TGCCAAATAC GATCTTGAGC AACAAGGAAG CAACACCATC 601 GTCTGTGAAA AAGTGTGCTT CCTTAAAGGG GCCTCTGGGG CTGAAATGGC 651 ATCAAATGGT AAATAACATA TGCCAGTTTA TTTTCTGGAC TGTTTTTATC 701 CTAATGCTTG TGTTTTATGT GGTTATTGCA AAAAAAGTAT ATGATTCTTA 751 TAGAAAGTCC AAAAGTAAGG ACAGAAAAAA CAACAAAAAG CTGGAAGGCA 801 AAGTATTTGT TGTCGTGGCT GTCTTCTTTG TGTGTTTTGC TCCATTTCAT 851 TTTGCCAGAG TTCCATATAC TCACAGTCAA ACCAACAATA AGACTGACTG 901 TAGACTGCAA AATCAACTGT TTATTGCTAA AGAAACAACT CTCTTTTTGG 951 CAGCAACTAA CATTTGTATG GATCCCTTAA TATACATATT CTTATGTAAA 1001 AAATTCACAG AAAAGCTACC ATGTATGCAA GGGAGAAAGA CCACAGCATC 1051 AAGCCAAGAA AATCATAGCA GTCAGACAGA CAACATAACC TTAGGCTGAC 1101 AACTGTACAT AGGGTTAACT TCTA

【００３０】ヒトHNEAA81のアミノ酸配列（配列番号
２）

【表２】 1 MNTTVMQGFN RSERCPRDTR IVQLVFPALY TVVFLTGILL NTLALWVFVH 51 IPSSSTFIIY LKNTLVADLI MTLMLPFKIL SDSHLAPWQL RAFVCRFSSV 101 IFYETMYVGI VLLGLIAFDR FLKIIRPLRN IFLKKPVFAK TVSIFIWFFL 151 FFISLPNTIL SNKEATPSSV KKCASLKGPL GLKWHQMVNN ICQFIFWTVF 201 ILMLVFYVVI AKKVYDSYRK SKSKDRKNNK KLEGKVFVVV AVFFVCFAPF 251 HFARVPYTHS QTNNKTDCRL QNQLFIAKET TLFLAATNIC MDPLIYIFLC 301 KKFTEKLPCM QGRKTTASSQ ENHSSQTDNI TLG

【００３１】HNEAA81をコードする本発明の一つのポリ
ヌクレオチドは、標準的なクローニングおよびスクリー
ニングにより、ヒト脳、白血球、肺の細胞中のｍＲＮＡ
から誘導されたｃＤＮＡライブラリーから、エクスプレ
スド・シークエンス・タグ（expressed sequence tag:
EST)分析 (Adams, M.D. ら, Science (1991) 252:1651-
1656; Adams, M.D. ら, Nature (1992) 355:632-634; A
dams, M.D.ら, Nature(1995) 377 Supp:3-174) を用い
て得ることができる。また、本発明のポリヌクレオチド
はゲノムＤＮＡライブラリーのような天然源から得るこ
とができ、商業的に入手可能な公知の技法を用いて合成
することもできる。

【００３２】配列番号２のHNEAA81ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列は、表１中に含まれるポリペプ
チドコード配列（配列番号１のヌクレオチド番号98−10
96）と同一であっても、遺伝子コードの重複性（縮重）
のため、やはり配列番号２のポリペプチドをコードする
配列であってもよい。

【００３３】本発明のポリヌクレオチドをHNEAA81ポリ
ペプチドの組換え生産のために用いる場合、そのポリヌ
クレオチドには、成熟ポリペプチドのコード配列または
その断片単独、他のコード配列（例えば、リーダーもし
くは分泌配列、プレ−、プロ−もしくはプレプロ−タン
パク質配列、または他の融合ペプチド部分をコードする
もの）と同じリーディングフレーム内にある成熟ポリペ
プチドのコード配列またはその断片が含まれる。例え
ば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列
がコードされ得る。本発明のこの態様の好ましい具体例
として、マーカー配列は、ｐＱＥベクター(Qiagen, In
c.)により提供されかつGentz ら, Proc. Natl. Acad. S
ci. USA (1989) 86:821-824に記載されるようなヘキサ
−ヒスチジンペプチド、またはＨＡタグである。また、
このポリヌクレオチドは5'および3'非コード配列、例え
ば、転写されるが翻訳されない配列、スプライシングお
よびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位、お
よびｍＲＮＡ安定化配列を含んでいてもよい。

【００３４】さらに好適な具体例は、数個、５〜１０
個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、または１個のアミ
ノ酸残基が任意の組合せで置換、欠失または付加されて
いる、表２のHNEAA81ポリペプチドのアミノ酸配列（配
列番号２）を含むHNEAA81変異型をコードするポリヌク
レオチドである。

【００３５】本発明はさらに、前記の配列とハイブリダ
イズするポリヌクレオチドに関する。これに関して、本
発明は特にストリンジェントな条件下で前記のポリヌク
レオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドに関す
る。本明細書中で用いる「ストリンジェントな条件」と
は、配列間に少なくとも８０％、好ましくは少なくとも
９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好
ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性があるときだ
けハイブリダイゼーションが起こる条件を指す。

【００３６】配列番号１中に含まれるヌクレオチド配列
またはその断片と同一であるか実質的に同一である本発
明のポリヌクレオチドは、HNEAA81ポリペプチドをコー
ドする全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するた
めに、また、HNEAA81遺伝子との配列類似性が高い他の
遺伝子（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソロ
グ体(ortholog)をコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡ
およびゲノムクローンを単離するために、ｃＤＮＡおよ
びゲノムＤＮＡのハイブリダイゼーションプローブとし
て用いることができる。このようなハイブリダイゼーシ
ョン技法は当業者には公知である。一般的に、これらの
ヌクレオチド配列は対象物のヌクレオチド配列と８０
％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一であ
る。プローブはたいてい１５個以上のヌクレオチドを含
み、好ましくは３０個以上を含み、５０個以上のヌクレ
オチドを有していてもよい。特に好ましいプローブは３
０〜５０個の範囲のヌクレオチドを有するものである。

【００３７】一実施態様において、HNEAA81ポリペプチ
ド（ヒト以外の種に由来する相同体およびオーソログ体
を含む）をコードするポリヌクレオチドを得ることは、
配列番号１のヌクレオチド配列またはその断片を有する
標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で適当なライブラリーをスクリーニ
ングし、前記のポリヌクレオチド配列を含む全長ｃＤＮ
Ａおよびゲノムクローンを単離する各工程を含んでな
る。かくして、もう一つの態様では、本発明のHNEAA81
ポリヌクレオチドはさらに、配列番号１のヌクレオチド
配列またはその断片とストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするヌクレオチド配列を含んでなるヌクレオ
チド配列を含むものである。HNEAA81ポリペプチドも、
前記のハイブリダイゼーション条件により得られたヌク
レオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を含んで
なるポリペプチドを含む。このようなハイブリダイゼー
ション技法は当業者に公知である。ストリンジェントな
ハイブリダイゼーション条件は上で定義したとおりであ
るか、または、50% ホルムアミド、５×SSC (150mM NaC
l, 15mM クエン酸三ナトリウム) 、50mMリン酸ナトリウ
ム (pH7.6)、５×Denhardt溶液、10% デキストラン硫酸
および20μg/mlの変性し剪断したサケ精子ＤＮＡを含有
する溶液中で４２℃で一夜インキュベートし、次いでフ
ィルターを 0.1×SSC 中約６５℃で洗浄する条件であ
る。

【００３８】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、動物およびヒトの疾病に対する治療薬および診
断薬を探索するための研究用の試薬および材料として利
用することができる。

【００３９】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含有するベ
クター、このベクターにより遺伝子操作された宿主細
胞、および組換え法による本発明のポリペプチドの生産
に関する。本発明のＤＮＡ構築物から誘導されたＲＮＡ
を用いてこの種のタンパク質を生産するための無細胞翻
訳系も使用することができる。

【００４０】組換え体生産に関しては、本発明のポリヌ
クレオチドの発現系またはその一部を組み入れるため
に、宿主細胞が遺伝子操作される。宿主細胞へのポリヌ
クレオチドの導入は、Davis ら, BASIC METHODS IN MOL
ECULAR BIOLOGY (1986) およびSambrook ら, MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.
Y. (1989) などの多くの標準的な実験室マニュアルに記
載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェ
クション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェク
ション、トランスベクション(transvection)、マイクロ
インジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェク
ション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレー
プローディング(scrape loading)、弾丸導入(ballistic
introduction)または感染により行うことができる。

【００４１】適当な宿主の代表的な例として、細菌細胞
（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸
菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵
母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラＳ
２、スポドプテラＳｆ９）、動物細胞（例：ＣＨＯ、Ｃ
ＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ 127、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ 29
3、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞が挙げられ
る。

【００４２】多種多様な発現系を使用することができ
る。こうした発現系として、特に、染色体、エピソーム
およびウイルス由来の系、例えば、細菌プラスミド由
来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵
母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エ
レメント由来、ウイルス（例：バキュロウイルス、ＳＶ
４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、ア
デノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レ
トロウイルス）由来のベクター、およびこれらの組合せ
に由来するベクター、例えば、コスミドやファージミド
のようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素
に由来するものがある。この発現系は発現を起こさせる
だけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよ
い。一般的に、宿主内でのポリペプチドの産生のために
ポリヌクレオチドを維持し、増やし、発現するのに適し
た系またはベクターはどれも使用することができる。Sa
mbrookら, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL
(前掲) に記載されるような、日常的に用いられる公知
の技法のいずれかにより、適当なヌクレオチド配列を発
現系に挿入することができる。

【００４３】翻訳されたタンパク質を小胞体の内腔に、
細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるため
に、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込
むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチ
ドに対して内因性であっても、異種シグナルであっても
よい。

【００４４】スクリーニングアッセイで使用するためHN
EAA81ポリペプチドを発現させようとする場合、そのポ
リペプチドを細胞の表面に産生させることが好適であ
る。この場合は、スクリーニングアッセイでの使用に先
立って細胞を回収する。HNEAA81ポリペプチドが培地に
分泌される場合は、そのポリペプチドを回収し精製する
ために培地を回収する。細胞内に産生される場合は、そ
の細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する
必要がある。

【００４５】組換え細胞培養物からHNEAA81ポリペプチ
ドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタ
ノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロ
マトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィ
ー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティ
ークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマ
トグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含め
た公知の方法を用いることができる。最も好ましくは、
高速液体クロマトグラフィーが精製に用いられる。ポリ
ペプチドが単離および／または精製中に変性されるとき
は、タンパク質を再生させるための公知の技法を用い
て、活性のあるコンフォメーションを復元することが可
能である。

【００４６】診断アッセイ 本発明はまた、診断薬としてのHNEAA81ポリヌクレオチ
ドの使用に関する。機能障害と関連したHNEAA81遺伝子
の変異型の検出は、HNEAA81の過少発現、過剰発現また
は変化した発現により生ずる疾病またはその罹病性の診
断に追加しうる、またはその診断を下しうる診断用ツー
ルを提供するだろう。HNEAA81遺伝子に変異がある個体
を、さまざまな技法によりＤＮＡレベルで見つけ出すこ
とができる。

【００４７】診断用の核酸は、被験者の細胞、例えば血
液、尿、唾液、組織の生検または剖検材料から得ること
ができる。検出のためにゲノムＤＮＡを直接使用して
も、分析前にＰＣＲまたは他の増幅法を使って酵素的に
増幅してもよい。同様の方法でＲＮＡまたはｃＤＮＡを
使用することもできる。欠失および挿入変異は、正常な
遺伝子型と比較したときの増幅産物のサイズの変化によ
り検出できる。点突然変異は増幅ＤＮＡを標識HNEAA81
ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせることで同定で
きる。完全に整合した配列とミスマッチの二重鎖とはＲ
Ｎアーゼ消化により、または融解温度の差異により区別
できる。また、ＤＮＡ配列の差異は、変性剤を用いるも
しくは用いないゲルでのＤＮＡ断片の電気泳動の移動度
の変化により、または直接ＤＮＡ配列決定によっても検
出できる（例えば、Myers ら, Science (1985) 230:124
2 を参照のこと）。特定位置での配列変化はヌクレアー
ゼプロテクションアッセイ（例えば、ＲＮアーゼおよび
Ｓ１プロテクション）または化学的開裂法によっても確
認できる（Cottonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (19
85) 85:4397-4401を参照のこと）。別の実施態様では、
例えば、遺伝子変異の効率のよいスクリーニングを行う
ため、HNEAA81ヌクレオチド配列またはその断片を含む
オリゴヌクレオチドプローブのアレイを構築することが
できる。アレイ技法は公知で、一般的な適用可能性を有
し、遺伝子発現、遺伝的連鎖および遺伝的変異性を含め
た分子遺伝学のさまざまな問題を解きあかすために用い
られている（例えば、M. Chee ら, Science, Vol.274,
pp.610-613 (1996) を参照のこと）。

【００４８】診断アッセイは、前記の方法によりHNEAA8
1遺伝子の変異を検出することで、感染症（例えば、細
菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染症、特に
ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼
痛、癌、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性
心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心
症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精
神および神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん
妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例えばハン
チントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群を
含む）への罹りやすさを診断または判定する方法を提供
する。

【００４９】さらに、被験者から得られたサンプルから
HNEAA81ポリペプチドまたはHNEAA81ｍＲＮＡのレベルの
異常な低下または増加を測定する方法により、感染症
（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる
感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす
感染症）、疼痛、癌、拒食症、過食症、喘息、パーキン
ソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょ
う症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立
腺肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、そうう
つ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例
えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット
症候群を含む）の診断を下すことができる。発現の低下
または増加は、当技術分野で公知のポリヌクレオチド定
量法のいずれか、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮア
ーゼプロテクション、ノーザンブロット、その他のハイ
ブリダイゼーション法によりＲＮＡレベルで測定するこ
とができる。宿主から得られたサンプル中のHNEAA81ポ
リペプチドのようなタンパク質のレベルを測定するため
のアッセイ法は当業者によく知られている。こうしたア
ッセイ法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッ
セイ、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイな
どがある。

【００５０】かくして、もう一つの態様において、本発
明は、疾病特に、感染症（例えば、細菌、真菌、原生動
物およびウイルスによる感染症、特にＨＩＶ−１または
ＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、拒食症、
過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、
高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰
瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神および神経障害
（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症の精
神遅滞および運動異常、例えばハンチントン舞踏病また
はジル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）またはこのよ
うな疾病への罹りやすさを診断するためのキットに関
し、このキットは、(a) HNEAA81ポリヌクレオチド（好
ましくは、配列番号１のヌクレオチド配列）もしくはそ
の断片、(b) (a) のヌクレオチド配列に相補的なヌクレ
オチド配列、(c) HNEAA81ポリペプチド（好ましくは、
配列番号２のポリペプチド）もしくはその断片、または
(d) HNEAA81ポリペプチド（好ましくは、配列番号２の
ポリペプチド）に対する抗体、を含んでなる。このよう
なキットにおいて、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質
的な構成成分であることが理解されよう。

【００５１】染色体アッセイ 本発明のヌクレオチド配列はまた、染色体の同定にも有
用である。この配列は個々のヒト染色体上の特定の位置
を標的指向し、その特定位置とハイブリダイズすること
ができる。本発明に従って関連配列の染色体地図を作成
することは、これらの配列と遺伝子関連疾患とを相関さ
せる上で重要な第一段階である。ひとたび配列が正確な
染色体位置にマッピングされたら、その染色体上のその
配列の物理的位置を遺伝地図データと相関させることが
できる。この種のデータは、例えば、V. McKusick, Men
delian Inheritance in Man (Johns Hopkins Universit
yWelch Medical Library からオンラインで入手可能)
中に見いだせる。その後、同一の染色体領域にマッピン
グされた遺伝子と疾患との関係を連鎖分析（物理的に隣
接した遺伝子の共遺伝）により同定する。

【００５２】患者と正常個体とのｃＤＮＡまたはゲノム
配列の差異も調べることができる。患者の一部または全
部に変異が観察されるが、どの正常個体にも観察されな
い場合は、その変異が疾病の原因である可能性がある。

【００５３】抗体 本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、
またはそれらを発現する細胞は、HNEAA81ポリペプチド
に免疫特異的な抗体を産生するための免疫原としても使
用することができる。「免疫特異的」とは、その抗体が
従来技術における他の関連ポリペプチドに対するその親
和性よりも本発明のポリペプチドに対して実質的に高い
親和性を有することを意味する。

【００５４】HNEAA81ポリペプチドに対する抗体は、慣
用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以
外）に該ポリペプチドまたはエピトープを含む断片、類
似体もしくは細胞を投与することにより得られる。モノ
クローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により
産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることがで
きる。例を挙げると、ハイブリドーマ技法 (Kohler, G.
およびMilstein, C., Nature (1975) 256:495-497)、ト
リオーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法 (Kozbor
ら, Immunology Today (1983) 4:72) およびＥＢＶ−ハ
イブリドーマ技法(Coleら, MONOCLONAL ANTIBODIES AND
CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R. Liss, Inc., 198
5) などがある。

【００５５】本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体
をつくるために、一本鎖抗体の調製法（米国特許第4,94
6,778 号）を適応させることができる。また、ヒト化抗
体を発現させるために、トランスジェニックマウスまた
は他の哺乳動物を含む他の生物を利用することができ
る。前記の抗体を用いて、そのポリペプチドを発現する
クローンを単離・同定したり、アフィニティークロマト
グラフィーでそのポリペプチドを精製することもでき
る。HNEAA81ポリペプチドに対する抗体は、とりわけ、
感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルス
による感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き
起こす感染症）、疼痛、癌、拒食症、過食症、喘息、パ
ーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨
粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良
性前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、
そううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異
常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツ
レット症候群を含む）の治療に使用できる可能性があ
る。

【００５６】ワクチン 本発明の別の態様は、哺乳動物において免疫学的応答を
引き出す方法に関し、この方法は、特に感染症（例え
ば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染
症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染
症）、疼痛、癌、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン
病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう
症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺
肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、そうう
つ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、例
えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット
症候群を含む）から前記動物を防御するための抗体およ
び／またはＴ細胞免疫応答を生ずるのに十分なHNEAA81
ポリペプチドまたはその断片を哺乳動物に接種すること
を含んでなる。本発明のさらに別の態様は、哺乳動物を
疾病から防御する抗体を産生させるような免疫学的応答
を引き出すために、in vivo でHNEAA81ポリヌクレオチ
ドの発現を指令するベクターを介してHNEAA81ポリペプ
チドを供給することを含んでなる、哺乳動物において免
疫学的応答を引き出す方法に関する。

【００５７】本発明の更なる態様は、哺乳動物宿主に導
入したとき、その哺乳動物においてHNEAA81ポリペプチ
ドに対する免疫学的応答を引き出す免疫学的／ワクチン
製剤（組成物）に関し、この組成物はHNEAA81ポリペプ
チドまたはHNEAA81遺伝子を含有する。ワクチン製剤は
適当な担体をさらに含んでいてもよい。HNEAA81ポリペ
プチドは胃の中で分解されうるので、非経口的（皮下、
筋肉内、静脈内、皮内等への注射を含む）に投与するこ
とが好ましい。非経口投与に適した製剤としては、酸化
防止剤、緩衝液、静菌剤およびこの製剤を受容者の血液
と等張にする溶質を含みうる水性および非水性の無菌注
射液、並びに懸濁化剤または増粘剤を含みうる水性およ
び非水性の無菌懸濁液がある。こうした製剤は１回量容
器または数回量容器（例えば、密閉アンプルおよびバイ
アル）で提供することができ、また、使用直前に無菌の
液状担体を添加するだけでよい凍結乾燥状態で保管する
こともできる。ワクチン製剤はこの製剤の免疫原性を増
強するためのアジュバント系、例えば水中油型のアジュ
バント系や当技術分野で公知の他のアジュバント系を含
んでいてもよい。投与量はワクチンの比活性で変化し、
ルーチンな実験操作により簡単に決定できる。

【００５８】スクリーニングアッセイ 本発明のHNEAA81ポリペプチドは、このポリペプチドを
活性化する化合物（アゴニスト）またはその活性を阻害
する化合物（アンタゴニスト、または阻害剤ともいう）
のスクリーニング法において使用することができる。こ
うして、本発明のポリペプチドは、例えば、細胞、無細
胞調製物、化学物質ライブラリーおよび天然産物の混合
物中の小分子基質およびリガンドの結合を評価するため
にも用いられる。これらの基質およびリガンドは天然の
基質またはリガンドであっても、また、構造的または機
能的な模擬物であってもよい（Coligan ら, Current Pr
otocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)を参照
のこと）。

【００５９】HNEAA81ポリペプチドは多くの病理を含め
て多数の生物学的機能に関与している。したがって、一
方ではHNEAA81ポリペプチドを刺激し、他方ではHNEAA81
ポリペプチドの機能を阻害し得る化合物および薬物を見
つけ出すことが望まれる。一般的に、アゴニストは感染
症（例えば、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによ
る感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２が引き起こ
す感染症）、疼痛、癌、拒食症、過食症、喘息、パーキ
ンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗し
ょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前
立腺肥大、精神および神経障害（不安、精神分裂、そう
うつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞および運動異常、
例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレッ
ト症候群を含む）のような症状の治療および予防目的で
用いられる。アンタゴニストは感染症（例えば、細菌、
真菌、原生動物およびウイルスによる感染症、特にＨＩ
Ｖ−１またはＨＩＶ−２が引き起こす感染症）、疼痛、
癌、拒食症、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不
全、低血圧、高血圧、尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心
筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、精神およ
び神経障害（不安、精神分裂、そううつ、せん妄、痴
呆、重症の精神遅滞および運動異常、例えばハンチント
ン舞踏病またはジル・ド・ラ・ツレット症候群を含む）
のような症状のさまざまな治療および予防目的で使用し
うる。

【００６０】一般に、こうしたスクリーニング法は本発
明の受容体ポリペプチドをその表面に発現する適当な細
胞を用いるものである。この種の細胞には哺乳動物、酵
母、ショウジョウバエ由来の細胞または大腸菌細胞が含
まれる。次いで、この受容体を発現する細胞（もしくは
発現された受容体を含む細胞膜）を試験化合物と接触さ
せて、その結合または機能的応答の刺激もしくは阻害を
観察する。

【００６１】一つのスクリーニング法は、受容体の活性
化により生じた細胞外ｐＨまたは細胞内カルシウムの変
化を測定する系において本発明の受容体を発現する細胞
（例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）を使用
するものである。この技法では、本発明の受容体ポリペ
プチドを発現する細胞を化合物と接触させる。その後、
第二メッセンジャーの応答、例えばシグナル伝達、ｐＨ
変化またはカルシウムレベルの変化を測定して、候補化
合物がこの受容体を活性化するか阻害するかを判定す
る。

【００６２】もう一つの方法は、受容体により媒介され
るｃＡＭＰおよび／またはアデニル酸シクラーゼ蓄積の
阻害または刺激を調べることにより受容体阻害剤をスク
リーニングするものである。この種の方法は、本発明の
受容体を用いて真核細胞をトランスフェクトし、その細
胞表面に該受容体を発現させることを含む。次に、本発
明の受容体の存在下でこの細胞を候補アンタゴニストに
さらし、その後ｃＡＭＰの蓄積量を測定する。候補アン
タゴニストが該受容体と結合し、その結果受容体への結
合を阻害する場合は、受容体により媒介されるｃＡＭＰ
またはアデニル酸シクラーゼの活性レベルが低下または
増加するだろう。

【００６３】本発明の受容体のアゴニストまたはアンタ
ゴニストを検出するための別の方法は、米国特許第5,48
2,835 号に記載されるような酵母ベースの技法である。
これらのアッセイでは候補化合物の結合を簡単に試験す
ることができ、そこでは候補化合物と直接または間接に
結合された標識により、または標識した競合物質との競
合を用いるアッセイにより、該受容体を担持する細胞へ
の付着が検出される。さらに、これらのアッセイでは、
該受容体をその表面に担持する細胞に適した検出系を用
いて、候補化合物が該受容体の活性化により生ずるシグ
ナルを結果的にもたらすか否かを試験することができ
る。一般的に、活性化の阻害剤は既知のアゴニストの存
在下でアッセイされ、そして候補化合物の存在がアゴニ
ストによる活性化に与える影響が調べられる。

【００６４】さらに、これらのアッセイは、候補化合物
とHNEAA81ポリペプチドを含む溶液とを混ぜ合わせて混
合物をつくり、この混合物中のHNEAA81活性を測定し、
そしてこの混合物のHNEAA81活性を標準と比較する各ス
テップを単に含むだけでよい。

【００６５】また、HNEAA81のｃＤＮＡ、タンパク質ま
たはこのタンパク質に対する抗体を用いて、細胞内での
HNEAA81ｍＲＮＡまたはタンパク質の生産に及ぼす添加
化合物の作用を検出するためのアッセイを組み立てるこ
とができる。例えば、当技術分野で公知の標準方法によ
りモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、
HNEAA81タンパク質の分泌レベルまたは細胞結合レベル
を測定するためのＥＬＩＳＡを構築することができ、こ
れは適切に操作された細胞または組織からのHNEAA81の
生産を抑制または増強する物質（それぞれアンタゴニス
トまたはアゴニストともいう）の探索に用いることがで
きる。スクリーニングアッセイを行うための標準的な方
法は当技術分野でよく理解されている。

【００６６】HNEAA81の潜在的なアンタゴニストの例と
しては、抗体、ある場合には、HNEAA81のリガンドと密
接な関係があるオリゴヌクレオチドもしくはタンパク質
（例えば、リガンドの断片）、または該受容体と結合す
るが応答を誘導しない（それゆえ該受容体の活性を妨げ
る）小分子などがある。

【００６７】かくして、他の態様において、本発明は、
HNEAA81ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニスト、
リガンド、受容体、基質、酵素など、またはHNEAA81ポ
リペプチドの生産を低下または増加させる化合物を同定
するためのスクリーニングキットに関し、このキット
は、(a) HNEAA81ポリペプチド（好ましくは、配列番号
２のポリペプチド）(b) HNEAA81ポリペプチド（好まし
くは、配列番号２のポリペプチド）を発現する組換え細
胞、(c) HNEAA81ポリペプチド（好ましくは、配列番号
２のポリペプチド）を発現する細胞膜、または(d) HNEA
A81ポリペプチド（好ましくは、配列番号２のポリペプ
チド）に対する抗体、を含んでなる。このようなキット
において、(a) 、(b) 、(c) または (d)が実質的な構成
成分であることが理解されよう。

【００６８】予防および治療法 本発明は、HNEAA81活性の過剰量と不足量のどちらにも
関係した感染症（例えば、細菌、真菌、原生動物および
ウイルスによる感染症、特にＨＩＶ−１またはＨＩＶ−
２が引き起こす感染症）、疼痛、癌、拒食症、過食症、
喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧、高血圧、
尿閉、骨粗しょう症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレル
ギー、良性前立腺肥大、精神および神経障害（不安、精
神分裂、そううつ、せん妄、痴呆、重症の精神遅滞およ
び運動異常、例えばハンチントン舞踏病またはジル・ド
・ラ・ツレット症候群を含む）などの異常な状態の治療
法を提供する。HNEAA81の活性が過剰である場合は、い
くつかのアプローチが利用可能である。一つのアプロー
チは、HNEAA81に対するリガンドの結合をブロックする
ことにより、または第２のシグナルを抑制することで異
常な状態を軽減することにより、活性を阻害するのに有
効な量で、前記の阻害剤化合物（アンタゴニスト）を製
剤学上許容される担体とともに患者に投与することを含
んでなる。もう一つのアプローチでは、内因性のHNEAA8
1との競合状態でリガンドと結合する能力がまだある可
溶性形態のHNEAA81ポリペプチドを投与することができ
る。このような競合物質の典型的な例はHNEAA81ポリペ
プチドの断片である。

【００６９】さらに別のアプローチでは、発現阻止法を
使って内因性HNEAA81ポリペプチドをコードする遺伝子
の発現を抑制することができる。こうした公知技術は、
体内で生成されるか別個に投与されるアンチセンス配列
の使用を必要とする。例えば、Oligodeoxynucleotides
as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRCPre
ss, Boca Raton, FL (1988)中のO'Connor, J Neurochem
(1991) 56:560 を参照のこと。あるいはまた、この遺
伝子と共に三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを
供給することもできる。例えば、Lee ら, Nucleic Acid
s Res (1979) 6:3073; Cooney ら, Science (1988) 24
1:456; Dervanら, Science (1991) 251:1360 を参照の
こと。これらのオリゴマーはそれ自体を投与することも
できるし、関連オリゴマーをin vivo で発現させること
もできる。

【００７０】HNEAA81およびその活性の過少発現に関係
した異常な状態を治療する場合も、いくつかのアプロー
チを取ることができる。一つのアプローチは、治療上有
効な量のHNEAA81を活性化する化合物（すなわち、前記
のアゴニスト）を製剤学上許容される担体とともに患者
に投与して、異常な状態を緩和することを含んでなる。
別法として、患者の関連細胞においてHNEAA81を内因的
に産生させるために遺伝子治療を用いることができる。
例えば、上で述べたような複製欠損レトロウイルスベク
ターによる発現のために本発明のポリヌクレオチドを遺
伝子操作する。次にレトロウイルス発現構築物を単離
し、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有す
るレトロウイルスプラスミドベクターで形質導入された
パッケージング細胞に導入する。その結果、パッケージ
ング細胞は対象の遺伝子を含有する感染性のウイルス粒
子を産生するようになる。in vivo での細胞処理および
in vivo でのポリペプチド発現のために、これらの産生
細胞を患者に投与する。遺伝子治療の概論に関しては、
Human Molecular Genetics, T Strachanand A P Read,
BIOS Scientific Publishers Ltd (1996) 中のChapter
20, Gene Therapy andother Molecular Genetic-based
Therapeutic Approaches(およびその中の引用文献) を
参照のこと。もう一つのアプローチは治療量のHNEAA81
ポリペプチドを適当な製剤学上の担体とともに投与する
ことである。

【００７１】製剤および投与 可溶性形態のHNEAA81ポリペプチドのようなペプチド、
アゴニストおよびアンタゴニストペプチド、または小分
子は適当な製剤学上の担体と組み合わせて製剤化するこ
とができる。このような製剤は治療上有効な量のポリペ
プチドまたは化合物と、製剤学上許容される担体または
賦形剤を含有する。この種の担体としては、食塩水、生
理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノ
ール、およびこれらの組合せがあるが、これらに限らな
い。製剤は投与様式に適合させるべきであり、これは当
技術分野の技量の範囲内である。本発明はさらに、前記
の本発明組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器
を含んでなる医薬用パックおよびキットに関する。本発
明のポリペプチドおよび他の化合物は単独で使用して
も、他の化合物、例えば治療用化合物と一緒に使用して
もよい。

【００７２】医薬組成物を全身投与するときの好ましい
形態は、注入（注射）、典型的には静注である。皮下、
筋肉内または腹腔内のような他の注入経路も使用でき
る。全身投与の別の手段は、胆汁酸塩、フシジン酸、そ
の他の界面活性剤などの浸透剤を用いた経粘膜および経
皮投与である。さらに、腸溶剤またはカプセル剤として
適切に製剤化されているのであれば、経口投与も可能で
ある。これらの化合物は軟膏、ペースト、ゲルなどの剤
形で局所に投与しても、かつ／または局在化させてもよ
い。

【００７３】必要な投与量範囲はペプチドの選択、投与
経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左
右される。しかし、適当な投与量は患者の体重１kgあた
り0.1 〜100 μg の範囲である。利用可能な化合物が多
種多様であり、それぞれの投与経路の効率も異なるた
め、必要とされる投与量は広範に変動することを予想す
べきである。例えば、経口投与は静注による投与よりも
高い投与量を必要とすることが予想される。こうした投
与量レベルの変動は、当技術分野でよく理解されている
ような、標準的経験的な最適化手順を用いて調整するこ
とができる。

【００７４】治療に用いるポリペプチドは、上述したよ
うな「遺伝子治療」と称する治療法において、患者の体
内で産生させることもできる。例えば、患者由来の細胞
を、ex vivo でポリペプチドをコードするＤＮＡまたは
ＲＮＡのようなポリヌクレオチドにより、例えばレトロ
ウイルスプラスミドベクターを用いて、遺伝子工学的に
操作する。その後、この細胞を患者に導入する。

【００７５】

【実施例】実施例１： 哺乳動物細胞による発現 ヒト胚腎臓 293 (ＨＥＫ293)細胞または接着dhfrＣＨＯ
細胞のいずれかで本発明の受容体を発現させた。受容体
の発現を最大限高めるために、一般的には、ｐＣＤＮま
たはｐＣＤＮＡ３ベクターに挿入する前に受容体ｃＤＮ
Ａから全部の5'および3'非翻訳領域（ＵＴＲ）を除去し
た。リポフェクションを用いて細胞を個々の受容体ｃＤ
ＮＡによりトランスフェクトし、400 mg/ml のＧ４１８
の存在下で選択した。３週間の選択後、個々のクローン
を取り上げ、更なる分析のため増殖させた。ベクターの
みでトランスフェクトしたＨＥＫ293 またはＣＨＯ細胞
を陰性対照として用いた。各受容体を安定して発現して
いる細胞系を分離するため、一般的には約２４個のクロ
ーンを選択し、ノーザンブロットにより分析した。受容
体ｍＲＮＡは、通常、分析したＧ４１８耐性クローンの
約５０％において検出可能であった。

【００７６】実施例２： 結合および機能アッセイ用の
リガンドバンク スクリーニングのために２００以上の推定上の受容体リ
ガンドを含むバンクが構成されている。このバンクに
は、ヒト７回膜貫通（７ＴＭ）受容体を介して作用する
ことが知られている伝達物質、ホルモンおよびケモカイ
ン；ヒト７ＴＭ受容体の推定上のアゴニストでありうる
天然の化合物；哺乳動物の等価物がまだ同定されていな
い非哺乳動物の生理活性ペプチド；および天然には見い
だせないが未知の天然リガンドと共に７ＴＭ受容体を活
性化する化合物が含まれる。このバンクは、結合アッセ
イと機能（すなわち、カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロフ
ィジオメーター(microphysiometer)、卵母細胞の電気生
理学など、下記参照）アッセイの両方を用いて、既知リ
ガンドについて該受容体を最初にスクリーニングするた
めに使用された。

【００７７】実施例３： リガンド結合アッセイ リガンド結合アッセイは受容体の薬理を確かめるための
直接的な方法を提供するもので、高処理量のフォーマッ
トに適応可能である。結合実験のために、受容体の精製
したリガンドを高比活性（50〜2000 Ci/mmol) に放射性
標識した。次に、この放射性標識化のプロセスがリガン
ドのその受容体の方へ向かう活性を弱めないことを確認
した。膜受容体源と全細胞受容体源の両方に使用可能な
シグナル対ノイズ比を確立するために、緩衝液、イオ
ン、ｐＨおよび他のモジュレーター（例えば、ヌクレオ
チド）についてのアッセイ条件を最適化した。これらの
アッセイでは、特異的な受容体結合を、過剰の未標識競
合リガンドの存在下で測定した放射能を全結合放射能か
ら引いた放射能値として規定した。可能な場合は、２以
上の競合リガンドを用いて残留非特異的結合を規定す
る。

【００７８】実施例４： ツメガエル卵母細胞による機
能アッセイ 本発明の受容体ｃＤＮＡをコードする線状プラスミド鋳
型からのキャップされたＲＮＡ転写物を、標準的な手法
に従ってＲＮＡポリメラーゼを用いてin vitroで合成し
た。このin vitro転写物を0.2 mg/mlの最終濃度で水中
に懸濁した。成熟雌カエルから卵巣葉(ovarian lobes)
を摘出し、卵胞を取り除いた第Ｖ期の卵母細胞を得、マ
イクロインジェクション装置を使って50 nlボーラスで
ＲＮＡ転写物（卵母細胞につき10 ng)を注入した。２個
の電極電圧クランプを用いて、アゴニストへの暴露に応
答して発生した個々のツメガエル卵母細胞からの電流を
測定した。Ｃａ2+不含のBarth培地中で室温にて記録し
た。このツメガエル系は活性化用リガンドに関して既知
のリガンドおよび／または組織／細胞抽出物をスクリー
ニングするのに使用できる。

【００７９】実施例５： ミクロフィジオメトリックア
ッセイ さまざまな第二メッセンジャー系を活性化すると、細胞
から少量の酸が排出される。この酸は主に細胞内シグナ
ル伝達プロセスを刺激するのに必要とされる代謝活性の
増強の結果として生成される。この細胞の周辺培地のｐ
Ｈ変化はごくわずかであるが、CYTOSENSORミクロフィジ
オメーター (Molecular Devices Ltd.,Menlo Park, CA)
により検出可能である。かくして、このCYTOSENSOR
は、本発明のＧタンパク質共役受容体のような、細胞内
シグナル伝達経路を利用するエネルギーと共役する受容
体の活性化を検出することが可能である。

【００８０】実施例６： 抽出物／細胞上清スクリーニ
ング 多数の哺乳動物受容体は、同一動物種のその活性化用リ
ガンド（アゴニスト）が今のところまだ見いだされてい
ない。それゆえ、これらの受容体の活性リガンドはこれ
までに同定されたリガンドバンクに含まれていない可能
性がある。したがって、本発明の７ＴＭ受容体も、天然
リガンドを同定するために組織抽出物に対して機能的に
（カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロフィジオメーター、卵
母細胞の電気生理学などの機能スクリーンを用いて）ス
クリーニングされた。活性化用リガンドが単離・同定さ
れるまで、陽性の機能応答をもたらした抽出物を順次サ
ブ分画化する。

【００８１】実施例７： カルシウムおよびｃＡＭＰ機
能アッセイ ＨＥＫ293 細胞において発現された７ＴＭ受容体は、Ｐ
ＬＣおよびカルシウムの動員の活性化および／またはｃ
ＡＭＰの刺激または阻害に機能的に共役することが判明
した。受容体−トランスフェクト細胞またはベクター対
照細胞におけるＨＥＫ293 細胞での基底カルシウムレベ
ルは、正常な100 nM〜200 nMの範囲にあることが観察さ
れた。組換え受容体を発現しているＨＥＫ293 細胞にfu
ra 2を添加し、一日で150を超える選択したリガンドま
たは組織／細胞抽出物をアゴニスト誘導カルシウム動員
に関して評価した。同様に、組換え受容体を発現してい
るＨＥＫ293 細胞を、標準的なｃＡＭＰ定量アッセイを
用いて、ｃＡＭＰ生成の刺激または阻害について評価し
た。カルシウムの一過性動員またはｃＡＭＰの変動を示
すアゴニストをベクター対照細胞において試験し、その
応答が受容体を発現しているトランスフェクト細胞に特
異なものであるかを調べた。

【００８２】本明細書中に引用された、特許および特許
出願明細書を含めた全ての刊行物は、あたかも各刊行物
が明確にかつ個々に示されているかのように、その全体
を参考としてここに組み入れるものとする。

【００８３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING ＜110＞ SmithKline Beecham Corporation ＜120＞ cDNA Clone HNEAA81 that Encodes A Human 7-Transmembrane Receptor ＜130＞ PA98-258 ＜150＞ U.S.Application Serial No.08/956,975 ＜151＞ 1997-10-23 ＜160＞ 2 ＜170＞ FastSEQ for Windows Version 2.0 ＜210＞ 1 ＜211＞ 1124 ＜212＞ DNA ＜213＞ Homo Sapiens ＜400＞ 1 tctggttttt aaaaaatagc atttgaaaat catgaagggc tttttgtttt cttttgtttg 60 tatatatgtt tattggtaac aggtgacact ggaagcaatg aacaccacag tgatgcaagg 120 cttcaacaga tctgagcggt gccccagaga cactcggata gtacagctgg tattcccagc 180 cctctacaca gtggttttct tgaccggcat cctgctgaat actttggctc tgtgggtgtt 240 tgttcacatc cccagctcct ccaccttcat catctacctc aaaaacactt tggtggccga 300 cttgataatg acactcatgc ttcctttcaa aatcctctct gactcacacc tggcaccctg 360 gcagctcaga gcttttgtgt gtcgtttttc ttcggtgata ttttatgaga ccatgtatgt 420 gggcatcgtg ctgttagggc tcatagcctt tgacagattc ctcaagatca tcagaccttt 480 gagaaatatt tttctaaaaa aacctgtttt tgcaaaaacg gtctcaatct tcatctggtt 540 ctttttgttc ttcatctccc tgccaaatac gatcttgagc aacaaggaag caacaccatc 600 gtctgtgaaa aagtgtgctt ccttaaaggg gcctctgggg ctgaaatggc atcaaatggt 660 aaataacata tgccagttta ttttctggac tgtttttatc ctaatgcttg tgttttatgt 720 ggttattgca aaaaaagtat atgattctta tagaaagtcc aaaagtaagg acagaaaaaa 780 caacaaaaag ctggaaggca aagtatttgt tgtcgtggct gtcttctttg tgtgttttgc 840 tccatttcat tttgccagag ttccatatac tcacagtcaa accaacaata agactgactg 900 tagactgcaa aatcaactgt ttattgctaa agaaacaact ctctttttgg cagcaactaa 960 catttgtatg gatcccttaa tatacatatt cttatgtaaa aaattcacag aaaagctacc 1020 atgtatgcaa gggagaaaga ccacagcatc aagccaagaa aatcatagca gtcagacaga 1080 caacataacc ttaggctgac aactgtacat agggttaact tcta 1124 ＜210＞ 2 ＜211＞ 333 ＜212＞ PRT ＜213＞ Homo Sapiens ＜400＞ 2 Met Asn Thr Thr Val Met Gln Gly Phe Asn Arg Ser Glu Arg Cys Pro 1 5 10 15 Arg Asp Thr Arg Ile Val Gln Leu Val Phe Pro Ala Leu Tyr Thr Val 20 25 30 Val Phe Leu Thr Gly Ile Leu Leu Asn Thr Leu Ala Leu Trp Val Phe 35 40 45 Val His Ile Pro Ser Ser Ser Thr Phe Ile Ile Tyr Leu Lys Asn Thr 50 55 60 Leu Val Ala Asp Leu Ile Met Thr Leu Met Leu Pro Phe Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ser Asp Ser His Leu Ala Pro Trp Gln Leu Arg Ala Phe Val Cys Arg 85 90 95 Phe Ser Ser Val Ile Phe Tyr Glu Thr Met Tyr Val Gly Ile Val Leu 100 105 110 Leu Gly Leu Ile Ala Phe Asp Arg Phe Leu Lys Ile Ile Arg Pro Leu 115 120 125 Arg Asn Ile Phe Leu Lys Lys Pro Val Phe Ala Lys Thr Val Ser Ile 130 135 140 Phe Ile Trp Phe Phe Leu Phe Phe Ile Ser Leu Pro Asn Thr Ile Leu 145 150 155 160 Ser Asn Lys Glu Ala Thr Pro Ser Ser Val Lys Lys Cys Ala Ser Leu 165 170 175 Lys Gly Pro Leu Gly Leu Lys Trp His Gln Met Val Asn Asn Ile Cys 180 185 190 Gln Phe Ile Phe Trp Thr Val Phe Ile Leu Met Leu Val Phe Tyr Val 195 200 205 Val Ile Ala Lys Lys Val Tyr Asp Ser Tyr Arg Lys Ser Lys Ser Lys 210 215 220 Asp Arg Lys Asn Asn Lys Lys Leu Glu Gly Lys Val Phe Val Val Val 225 230 235 240 Ala Val Phe Phe Val Cys Phe Ala Pro Phe His Phe Ala Arg Val Pro 245 250 255 Tyr Thr His Ser Gln Thr Asn Asn Lys Thr Asp Cys Arg Leu Gln Asn 260 265 270 Gln Leu Phe Ile Ala Lys Glu Thr Thr Leu Phe Leu Ala Ala Thr Asn 275 280 285 Ile Cys Met Asp Pro Leu Ile Tyr Ile Phe Leu Cys Lys Lys Phe Thr 290 295 300 Glu Lys Leu Pro Cys Met Gln Gly Arg Lys Thr Thr Ala Ser Ser Gln 305 310 315 320 Glu Asn His Ser Ser Gln Thr Asp Asn Ile Thr Leu Gly 325 330

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ウェンディー エス．ハルセイ アメリカ合衆国 19348 ペンシルバニア 州， ケネット スクエア，ベイヤード ロード 435

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２のHNEAA81ポリペプチドをコ
   ードするヌクレオチド配列と全長において少なくとも９
   ７％同一であり、かつHNEAA81ポリペプチドの活性を有
   するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、また
   はこのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド
   配列を含んでなる単離されたポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 前記のポリヌクレオチドが、配列番号２
   のHNEAA81ポリペプチドをコードする配列番号１中に含
   まれるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１に記載
   のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 前記のポリヌクレオチドが、その全長に
   おいて配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９７
   ％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１
   に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号１のポリヌクレオチドである、
   請求項３に記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１に
   記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 配列番号２のHNEAA81ポリペプチドのア
   ミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、
   欠失または置換されており、かつHNEAA81ポリペプチド
   の活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド
   配列を含んでなるポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 下記発現系が適合性の宿主細胞内に存在
   するとき配列番号２のポリペプチドと少なくとも８０％
   同一であるアミノ酸配列を含むHNEAA81ポリペプチドを
   産生することができる発現系を含んでなるＤＮＡまたは
   ＲＮＡ分子。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の発現系を含有する宿主
   細胞。
9. 【請求項９】 HNEAA81ポリペプチドを産生させるのに
   十分な条件下で請求項８に記載の宿主細胞を培養し、こ
   の培養物から前記ポリペプチドを回収することを含んで
   なる、HNEAA81ポリペプチドの産生方法。
10. 【請求項１０】 宿主細胞が適当な培養条件下でHNEAA8
    1ポリペプチドを産生するように、請求項７に記載の発
    現系を用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェク
    ションすることを含んでなる、HNEAA81ポリペプチドを
    産生する細胞の作製方法。
11. 【請求項１１】 全長において配列番号２のアミノ酸配
    列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含んで
    なるHNEAA81ポリペプチド。
12. 【請求項１２】 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請
    求項１１に記載のポリペプチド。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のHNEAA81ポリペプ
    チドに免疫特異的な抗体。
14. 【請求項１４】 請求項１１に記載のHNEAA81ポリペプ
    チドの増大した活性または発現を必要としている患者を
    治療するための医薬組成物であって、治療上有効な量
    の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアゴニスト、および／ま
    たは(b) 前記ポリペプチド活性のin vivo 生産をもたら
    す形の、配列番号２のHNEAA81ポリペプチドをコードす
    るヌクレオチド配列と全長において少なくとも９７％同
    一であるヌクレオチド配列、または前記ヌクレオチド配
    列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離
    されたポリヌクレオチド、を含んでなる医薬組成物。
15. 【請求項１５】 請求項１１に記載のHNEAA81ポリペプ
    チドの活性または発現を抑制する必要がある患者を治療
    するための医薬組成物であって、治療上有効な量の、 (a) 前記ポリペプチドに対するアンタゴニスト、および
    ／または(b) 前記ポリペプチドをコードするヌクレオチ
    ド配列の発現を抑制する核酸分子、および／または(c)
    前記ポリペプチドとそのリガンドについて競合するポリ
    ペプチド、を含んでなる医薬組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１１に記載のHNEAA81ポリペプ
    チドの発現または活性と関連した被験者の疾病またはそ
    の罹病性の検出方法であって、 (a) 前記被験者由来のゲノム中のHNEAA81ポリペプチド
    をコードするヌクレオチド配列に突然変異があるかどう
    かを調べる、および／または(b) 前記被験者から得られ
    たサンプル中のHNEAA81ポリペプチド発現の存在または
    量を分析する、ことを含んでなる方法。
17. 【請求項１７】 請求項１１に記載のHNEAA81ポリペプ
    チドに対するアゴニストの同定方法であって、 (a) HNEAA81ポリペプチドを産生する細胞と候補化合物
    とを接触させ、そして(b) その候補化合物がHNEAA81ポ
    リペプチドの活性化によりシグナルを発生させるか否か
    を調べる、ことを含んでなる方法。
18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の方法により同定さ
    れたアゴニスト。
19. 【請求項１９】 請求項１１に記載のHNEAA81ポリペプ
    チドに対するアンタゴニストの同定方法であって、 (a) HNEAA81ポリペプチドを産生する細胞とアゴニスト
    とを接触させ、そして(b) 前記アゴニストにより発生し
    たシグナルが候補化合物の存在下で減少するか否かを調
    べる、ことを含んでなる方法。
20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の方法により同定さ
    れたアンタゴニスト。
21. 【請求項２１】 請求項１０に記載の方法により作製さ
    れた組換え宿主細胞またはHNEAA81ポリペプチドを発現
    しているその膜。