JPH11235190A

JPH11235190A - プロモーターとその使用

Info

Publication number: JPH11235190A
Application number: JP10357972A
Authority: JP
Inventors: Antonio D Ortega; アントニオ・ダザ・オルテガ; Jose A Gil; ホセ・アントニオ・ジル; Tomas V Garcia; トーマス・ビガル・ガルシア; Juan F Martin; ジュアン・フランシスコ・マルティン
Original assignee: CLIVE FROUDE; Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: CLIVE FROUDE; Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1989-05-19
Filing date: 1998-12-16
Publication date: 1999-08-31
Anticipated expiration: 2018-12-16
Also published as: LV10491A; DE69033242D1; WO1990014426A3; AU5721790A; ATE183234T1; IL113307A0; US5118617A; LV10491B; AU638022B2; JP3131192B2; EP0429600B1; DE69033242T2; EP0429600A1; DK0429600T3; IL113307A; CA2033069C; IL94422A; IL94422A0; WO1990014426A2; ES2134760T3

Abstract

(57)【要約】【課題】外来ＤＮＡ配列によりコードされる外来ポリ
ペプチドの生産性を高めること。【解決手段】配列番号１のＤＮＡ配列を有するプロモ
ーターを使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】発明の分野この発明はバイオテクノロジー分野に属する。さらに詳
しくは、この発明は、細胞外酵素の生産性を高める新規
ポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡ、
前記ＤＮＡを含む組換え体ベクター、およびポリペプチ
ドをコードするＤＮＡを含む組換え体ベクターにより形
質転換された宿主生物に関するものである。さらに、こ
の発明は、新規ポリペプチドをコードする遺伝子のプロ
モーター配列に関するものである。さらにこの発明は、
ストレプトマイシス発現系並びにストレプトマイシスに
おいて外来ＤＮＡ配列を発現させ、周囲の培地に前記外
来ＤＮＡ配列によりコードされたポリペプチドおよび蛋
白質を分泌させる方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】発明の背景ストレプトマイシスは、プロテアーゼ、ホスファター
ゼ、キシラナーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ
およびヌクレアーゼを含む様々な細胞外酵素のよく知ら
れた生産体である。

【０００３】さらに、ストレプトマイシス属の構成員
は、多数の抗生物質、色素および他の２次代謝物を産生
し、胞子を形成させる複雑な分化パターンを有する。ス
トレプトマイシスのバッチ培養物では、通常、細胞外酵
素の生産性並びに抗生物質製造および色素生合成および
胞子形成の開始が一致している。これらのプロセスは全
て、高い生長割合に有利な栄養条件により抑制され、
Ｐ、ＣまたはＮ供給源を断つことにより抑制解除され
る。酵素分泌、２次代謝物の形成および分化は完全に独
立したものであるが、似たトリガー機構に反応すると思
われる。

【０００４】細胞外酵素をコードする幾つかのストレプ
トマイシス属は既にクローン化されている。これらの例
としては、ストレプトマイシス・コエリコロルからのア
ガラーゼ、ストレプトマイシス・プリカツスからのエン
ドグリコシダーゼＨ、ストレプトマイシス・リビダンス
からのキシラナーゼ、ストレプトマイシス・ヒグロスコ
ピクスからのアルファ-アミラーゼ、ストレプトマイシ
ス・spＡ２からのセルラーゼ、ストレプトマイシス・リ
ビダンスからのベータ-ガラクトシダーゼおよびストレ
プトマイシス・カカオイ、バジウスおよびフラディアエ
からのベータ-ラクタマーゼがある。

【０００５】しかしながら、これらの遺伝子の発現を制
御する調節機構は事実上未知である。栄養素の取捨選択
(シフトダウン)後に幾つかのポリマー性基質分解酵素の
同時生成がストレプトマイシスにおいて観察されたこと
から、特異的な調節機構、例えばデキストリンまたはマ
ルトトリオースによるアミラーゼの誘導およびアミラー
ゼまたはアガラーゼの炭素代謝物調節に加えて、幾つか
の細胞外酵素の抑制解除の一般的機構が存在すると思わ
れる。それらのトランス作用調節遺伝子は、バチラス・
スブチリス(ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１
６９:３２４−３３３、１９８７)、バチラス・ナット
(ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１６６:２０−
２８、１９８６)およびバチラス・リチェニホルミスに
おいて見出された。

【０００６】酵素合成および／または分泌に作用する陽
性調節遺伝子は、低分泌性株、例えばストレプトマイシ
ス・リビダンスにおいて細胞外酵素の高い分泌性を捜す
ことによりクローン化され得る。

【０００７】ストレプトマイシスにおいて外来ＤＮＡ配
列を発現させるシステムは、例えばＥＰ１４８５５２お
よびＷＯ８８／０７０７９で既に記載されている。これ
らのシステムは、ストレプトマイシスにより産生された
細胞外酵素の内在性プロモーターを使用する。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】発明の目的この発明の主たる目的は、新規アミノ酸ポリペプチド
(以後、ＳＡＦポリペプチドと称す)をコードする、新た
に分離された遺伝子(以後、saf(２次代謝活性化因子)遺
伝子と称する)のクローニングおよび特性検定法の提供
である。ＳＡＦポリペプチドは、細胞外酵素の構造遺伝
子の制御領域と相互作用することにより、ストレプトマ
イシスにおける細胞外酵素に関する遺伝子の発現を直接
的または間接的に変調する。

【０００９】この発明の第２の態様は、発現時に上記Ｓ
ＡＦポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ単位またはフラグメントである。

【００１０】この発明の第３の態様は、上記ＤＮＡを含
むクローニング・ビヒクル(ベクター)である。

【００１１】この発明の第４の態様は、上記クローニン
グ・ビヒクルにより形質転換された結果、細胞外酵素ま
たは所望の異種ポリペプチドの生産性が高められた宿主
生物または細胞である。

【００１２】この発明の第５の態様は、この発明に従い
形質転換された宿主生物を培養し、培養ブロスから生成
物を回収することによる、細胞外酵素または所望のポリ
ペプチドの製造方法である。

【００１３】この発明のさらに別の態様はsaf遺伝子の
プロモーターである。

【００１４】この発明のさらに別の態様は、内在性細胞
外酵素の分泌性シグナル領域と機能し得るように結合し
たsaf遺伝子のプロモーターを含む(両方とも外来ＤＮＡ
配列に機能し得るように結合している)クローニング・
ビヒクル(ベクター)、並びに前記クローニング・ビヒク
ルにより形質転換された結果、外来ＤＮＡ配列によりコ
ードされる外来ポリペプチドを発現および分泌する宿主
生物または細胞の製造に関するものである。

【００１５】この発明のさらに別の態様は、ストレプト
マイシスの染色体ＤＮＡへの、外来ＤＮＡ配列を有する
上記クローニング・ビヒクルの組み込みである。好まし
い実施態様において、saf遺伝子を含む発現ベクターは
また上記形質転換生物に組み込まれる。

【００１６】この発明の上記および他の対象は、さらに
明細書においてより詳細に記載されている。

【００１７】

【課題を解決するための手段】発明の要旨ストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７か
ら、ストレプトマイシス・リビダンスおよびストレプト
マイシス・コエリコロルにおける少なくとも５種の細胞
外酵素に関する共通の制御機構に関与する遺伝子saf(２
次代謝活性化因子)をコードするＤＮＡフラグメントが
単離された。saf遺伝子は試験された全てのストレプト
マイシスに存在することから、この遺伝子が代謝におい
て重要な役割を担うに違いないことが示されている。事
実、我々は、ストレプトマイシス・グリセウスＩＭＲＵ
３５７０というカンディシディン生産株からsafと似た
遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをクローン化した。若
干のストレプトマイシス、例えばストレプトマイシス・
リビダンスおよびストレプトマイシス・ラクタムデュラ
ンスの場合、ハイブリダイゼーション・パターンは、sa
f遺伝子が染色体ＤＮＡにおける幾つかのコピーに存在
することを示唆している。

【００１８】これは、ストレプトマイシスにおける細胞
外酵素の製造および胞子形成に関与する遺伝子の最初の
例である。

【００１９】saf遺伝子は、１１３個のアミノ酸を有す
るポリペプチド(ＳＡＦポリペプチド)をコードする。エ
シェリヒア・コリでのインビトロ転写−翻訳試験は、正
確なサイズが約１５０００ダルトンの蛋白質が形成され
ることを示している。ＳＡＦポリペプチドは、強い正電
荷を有し(１８個の正電荷アミノ酸)、ペプチド・リーダ
ーまたは膜内外蛋白質に典型的な組成を示さないため、
蛋白質排出に対する直接作用はありそうもないと思われ
る。正電荷蛋白質はＤＮＡと容易に相互作用し得る。事
実、幾つかの調節蛋白質に典型的なＤＮＡ結合ドメイン
(アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリー、
５３:２９３−３２１、１９８４)がＳＡＦポリペプチド
において観察されている。safプロモーターは、予想外
にも細胞外酵素の天然プロモーターよりも強力であるこ
とが見出された。例えば、アミラーゼ遺伝子は、safプ
ロモーターを天然アミラーゼ・プロモーターの代わりに
用いた場合、かなり大量のアミラーゼを発現する。すな
わち、蛋白質の天然プロモーターの代わりにsafプロモ
ーターを用いることにより、内在性ポリペプチドまたは
蛋白質の発現を向上させることができる。

【００２０】ＳＡＦポリペプチドは、細胞外酵素、色素
生成および分化に対する多面発現作用、すなわち複数の
経路に作用する効果を有する。この発明により、内在性
(細胞外)蛋白質の生産性増強が達成される。

【００２１】広範には、saf遺伝子および対応するポリ
ペプチドを用いて、細胞外酵素をコードする遺伝子の適
当な開裂部位へ所望の蛋白質をコードする遺伝子を挿入
し(この発現はＳＡＦまたはその一部分により高められ
る)、組換え遺伝子によりsaf遺伝子を含むストレプトマ
イシス宿主を形質転換し、形質転換された細菌を培養し
て選択された蛋白質またはその一部分を排出させること
により、選択された異種蛋白質のストレプトマイシスに
おける発現を増強することができる。好ましくは、saf
プロモーターの制御下において、異種ＤＮＡを染色体Ｄ
ＮＡに挿入し(組み込み)、ＳＡＦポリペプチドをコード
するＤＮＡを含む発現ベクターを同時に挿入する。発現
ベクターを染色体ＤＮＡへ組み込む必要はない。

【００２２】ストレプトマイシスにおける抗生物質の生
合成および分化に作用する多面発現性遺伝子が報告され
ている。ストレプトマイシス・コエリコロルおよびスト
レプトマイシス・リビダンスにおいてＡ因子、アクチノ
ルホジンおよびプロジギオシンの生成を積極的に制御す
る遺伝子afsＢは、ストレプトマイシス・コエリコロル
Ａ３(２)からクローン化された(堀之内等、ジャーナル
・オブ・バクテリオロジー、１５５:１２３８−１２４
８、１９８３)。

【００２３】saf遺伝子はafsＢとは異なる。事実、それ
らはアクチノルホジンの生成に対して反対の作用を有す
る。それらは、ＤＮＡ結合蛋白質に典型的なアミノ酸配
列を有する点で共通している。afsＢおよびsaf遺伝子は
両方とも、−１０および−３５共通配列を伴わないプロ
モーターを有し、潜在的翻訳調節シグナル並びに転写タ
ーミネーターとして作用し得る強いステムおよびループ
構造により結合している(堀之内等、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー、１６８:２５７−２６９、１９８
６)。転写が非常に安定したループを形成する場合、リ
ボソームの結合は排除される。遺伝子発現制御のそれら
の減衰様機構は、ストレプトマイシスにおいて抗生物質
耐性遺伝子の制御を変調することが見出された(堀之内
等、プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユー・エス
・エー、７７:７０７９−７０８３、１９８０)。saf遺
伝子は酵素排出に関する様々な遺伝子を転換する「マス
ター」遺伝子として見なされ得るため、その発現は恐ら
く細胞において堅固に制御されると思われる。saf遺伝
子により刺激された酵素は全て複雑なポリマーの分解に
関与するため、この遺伝子は、バチラスにおいても示唆
されている通り、代替的栄養源の探索に関与する包括的
調節システムの一部分であると予想される(ヘナー等、
ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、１７０:２９６
−３００、１９８８)。

【００２４】図面の簡単な記載第１図は、アルカリ性ホスファターゼ過剰生産の遺伝子
決定基を有するpＩＪ７０２のＢglII部位におけるスト
レプトマイシス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７クロー
ンから得られた染色体ＤＮＡフラグメントの制限地図で
ある。

【００２５】第２図は、pＵＬＡＤ３の１kb ＢglIIフラ
グメントおよび他種のストレプトマイシスのゲノムＤＮ
Ａ間における相同性のサザーン・ハイブリダイゼーショ
ン分析である。(Ａ)ゲノムＤＮＡのＢamＨＩ消化により
生成されたＤＮＡフラグメント(レーン２〜７)。(Ｂ)プ
ローブとして１kbフラグメントを用いた、パネルＡで示
されたＤＮＡのハイブリダイゼーション。レーン:１、
２３、９.５９、６.６８、４.２９、２.２８、１.９４
および０.５８kbのフラグメントを与えるＤＮＡのＨind
III消化; ２、ストレプトマイシス・ラクタムデュラン
ス; ３、ストレプトマイシス・アクリマイシニ; ４、ス
トレプトマイシス・コエリコロル１１５７; ５、ストレ
プトマイシス・グリセウス２２１２; ６、ストレプトマ
イシス・グリセウス３５７０; ７、ストレプトマイシス
・リビダンス１３２６。

【００２６】第３図は、pＩＪ７０２により形質転換さ
れたストレプトマイシス・リビダンス(左)およびpＵＬ
ＡＤ３により形質転換されたストレプトマイシス・リビ
ダンス(右)のプロテアーゼ(Ａ)、アミラーゼ(Ｂ)および
リパーゼ(Ｃ)活性のペトリ皿における分析である。

【００２７】第４図はsaf遺伝子発現に対する遺伝子用
量効果である。pＩＪ７０２により形質転換されたスト
レプトマイシス・リビダンス(左)、pＵＬＡＤ３により
形質転換されたストレプトマイシス・リビダンス(中央)
およびpＵＬＡＤ３０により形質転換されたストレプト
マイシス・リビダンス(右)によるプロテアーゼ(Ａ)およ
びアミラーゼ(Ｂ)の製造。

【００２８】第５図はsaf遺伝子のトリミング・ダウン
状況である。pＵＬＡＤ３の１kb ＢglIIフラグメントを
出発物質として用いた。この記載で示されている通り、
固体培地プレート上において全プラスミド構築物に関す
る細胞外酵素製造を測定した。−は野生型生産体、＋
＋、＋＋＋および＋＋＋＋は相異なる過剰生産割合を示
す。短い白矢印は、プラスミドpＩＪ７０２におけるチ
ロシナーゼ遺伝子(mel)の転写の局在および方向を示
す。白い円(●→)はmel遺伝子プロモーターを示す。黒
い円(○→)は、pＩＪ７０２における推定的右回りプロ
モーター活性を示し、白い四角(□→)はsafプロモータ
ーを示す。翻訳の方向は矢印で示されている。ＯＲＦ１
は、ヌクレオチド配列データから推定されたsafリーデ
ィング・フレームに対応する(第６〜８図参照)。

【００２９】第６〜８図は、pＵＬＡＤ３の１kb ＢglII
フラグメントのヌクレオチド配列およびsaf遺伝子産物
の推定されたアミノ酸配列を示す。第２の推定的ＡＴＧ
開始コドンは下線部である。逆方向相補的反復配列をふ
く合的矢印により示す。波線は、既知ＤＮＡ結合蛋白質
のＤＮＡ結合領域と類似したアミノ酸配列を示す。関連
した制限部位を示す。ヌクレオチドに対しＢglII部位か
ら始めて番号付けする(右側の番号)。

【００３０】第１０図は、既知ＤＮＡ結合蛋白質におけ
るＤＮＡ結合ドメインとsaf遺伝子産物の推定されたア
ミノ酸配列からの領域との比較を示す。データは、パー
ボおよびサウエル(パーボ等、「アニュアル・レビュー・
オブ・バイオケミストリー」、５３:２９３−３２１、１
９８４)並びに堀之内および別府(堀之内等、「ジェネテ
ィックス・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニ
ズムス」、４１頁、プリバ、ザグレブ、ユーゴスラビ
ア、１９８６)から得た。

【００３１】第１１図は、saf遺伝子の「上流および下
流」反復ヌクレオチド配列を示す。

【００３２】第１２図は、saf遺伝子に存在するヌクレ
オチドの反復群を示す。

【００３３】第１３図は、プラスミドpＩＪ２９２１を
示す。

【００３４】第１４〜２１図(第１４〜２１ＡおよびＢ
図)は、ストレプトマイシス・グリセウスのアミラーゼ
遺伝子の完全なヌクレオチド配列および推定されたアミ
ノ酸配列を示す。切断したＢstＥIIは外来遺伝子の融合
に最適な場所であると考えられる。

【００３５】第２２図は、プラスミドpＩＪ６９９を用
いたストレプトマイシス・グリセウスＩＭＲＵ３５７０
のα−アミラーゼ遺伝子のクローニングに使用される戦
略である。

【００３６】第２３図において、一連のグラフは、異な
る培地での異なるプラスミドによる皿での経時的α−ア
ミラーゼ製造を示す。 (△)ＭＭ＋澱粉(％)＋チオ (□)ＭＭ１mＭＰ＋澱粉(１％)＋チオ (■)ＭＭ、燐酸不含有＋澱粉(１％)＋チオ (・)ＭＭ＋澱粉(１％)＋チオ＋ＩＰＴＧ右下のパネルは、最良生産培地においてpＵＬＴＶ１、
ストレプトマイシス・リビダンスおよびpＵＬＴＶ１０
０(第９図参照)と比較したプラスミドpＵＬＶＤ１０の
生産値を示す。(×)燐酸不含有ＭＭ＋１％澱粉＋チオに
おけるストレプトマイシス・リビダンス(pＩＪ６９
９)、(・)前記培地におけるpＵＬＴＶ１、(−)前記培地
におけるpＵＬＴＶ１００、および(△)ＭＭ１mＭＰ＋
１％澱粉＋チオにおけるpＵＬＶＤ１０。

【００３７】第２４図は、ＣＲＦ分子を含む融合蛋白質
を生産する染色体遺伝子を含む組換え体ストレプトマイ
シス細胞およびＳＡＦポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含むプラスミドの構築の概略図を示す。

【００３８】

【発明の実施の形態】好ましい実施態様の記載ここに記載されている作業は、下記の原材料および方法
を用いて行なわれた。細菌株およびプラスミド。この試
験で使用されたストレプトマイシスおよびエシェリヒア
・コリ株を第１表に列挙する。プラスミドおよびファー
ジを第２表に示す。

【００３９】培地および培養条件。Ｒ２ＹＥ、最少培地
(ＭＭ)、ＴＳＢ(ディフコ)または３４％しょ糖および５
ミリモルＭgＣl₂を補ったＹＥＭＥ中でストレプトマイ
シス株を生長させた(ホップウッド等、ジェネティック
・マニピュレーション・オブ・ストレプトマイシス、
「ア・ラボラトリー・マニュアル」、ザ・ジョーン・イネ
ス・ファウンデーション、ノーウィッチ、イギリス国、
１９８５)。２２０rpmで撹はんしながら回転震とう器中
２８℃でトリプル・バッフルド・フラスコにおいてスト
レプトマイシス株を生長させた。

【００４０】３７℃でルリア・ブロス(ＬＢ)(ミラー
等、「エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネ
ティックス」、４３３頁、コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリーズ、ニューヨーク、１９７２)また
はルリア・アガー(ＬＡ)中においてエシェリヒア・コリ
株を生長させた。

【００４１】プレートにおける酵素検定。ストレプトマ
イシスに関するアルカリ性ホスファターゼ(ＡＰ)検定
を、グルコース不含有で、３０mcg／mlの５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルホスフェート−p−トルイ
ジン(ＸＰ)を補った低レベル[１mＭ]のホスフェートを
含むＰＲＭＭ培地(ＭＭ)中において実施した。ＡＰを産
生するコロニーは青く、それを産生し得ないコロニーは
白かった。エシェリヒア・コリの場合、Ｂ−ＸＰ培地を
使用した(１リットル当たり、１０gのバクトペクトン、
１２gのトリスマ−ベース、１０gのＮaＣl、２０gのデ
ィフコ寒天、pＨ７.５および４０mcg／mlのＸＰを含
有)。

【００４２】１％澱粉を補ったＭＭ(グルコース不含有)
においてストレプトマイシス・コロニーのアミラーゼ活
性を検定した。生長３日後、プレートをヨウ素蒸気に晒
した。コロニー周囲の透明ゾーンは、澱粉の分解による
ものであった。２％(w／v)オリーブ油、０.５％(w／v)
トウィーン８０および０.５％(w／v)トウィーン２０を
補ったＭＭにおいてストレプトマイシスを生長させるこ
とにより、リパーゼ活性を測定した。生長３日後、プレ
ートに１mlの１モルＣaＣl₂を注入した。リパーゼ生成
は、Ｃa²＋−脂肪酸複合体の沈澱として観察された(小
寺等、ＦＥＲＭＥＮＴ．ＴＥＣＨＮＯＬ．６４:３６３
−３７１、１９８６)。０.５％カゼインおよび１０ミリ
モルＣaＣl₂を補ったＭＭ(グルコース不含有)において
プロテアーゼ活性を検定した。コロニー周囲の透明ゾー
ンとして酵素活性が検出された。

【００４３】プレートにグラム・ヨウ素溶液を注入する
ことにより、グルコース不含有ＭＭにおいてストレプト
マイシス・コエリコロルのアガラーゼ活性を検定した。
ベータ-ガラクトシダーゼ活性は、Ｘ−gal(３６mcg／m
l)およびＩＰＴＧ(１０mcg／ml)を補ったグルコース不
含有ＭＭで生長しているコロニーの青色として観察され
た。

【００４４】ＤＮＡ分離。ホップウッド等による記載
(ホップウッド等、ア・ラボラトリー・マニュアル、ザ
・ジョーン・イネス・ファウンデーション、ノーウィッ
チ、イギリス国、１９８５)に従いストレプトマイシス
からの全ＤＮＡを製造した。キーザーの方法(キーザー
等、プラスミド、１２:１９−３６、１９８４)に従い、
ストレプトマイシスまたはエシェリヒア・コリからのプ
ラスミドＤＮＡを分離した。

【００４５】クローニング方法。１０mcgのストレプト
マイシス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７染色体ＤＮＡ
および０.５mcgのpＩＪ７０２をＢglIIにより全体的に
消化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１４℃で１２時間
ライゲーションした。ライゲーション混合物を形質転換
に直接使用した。適当な制限酵素(複数も可)で１−２mc
gのプラスミドＤＮＡを消化することによりＤＮＡフラ
グメントのサブクローニングを行い、低融点アガロース
(ＬＭＰＡ)でのゲル電気泳動により反応生成物を分離し
た。ＣＴＡＢ補助方法(ラングリッジ等、「アナリティカ
ル・バイオケミストリー」、１０３:２６４−２７１、１
９８０)を用いて必要とされるＤＮＡ帯を抽出した。

【００４６】形質転換方法。ホップウッド等による記載
(ホップウッド等、「ア・ラボラトリー・マニュアル」、
ザ・ジョーン・イネス・ファウンデーション、ノーウィ
ッチ、イギリス国、１９８５)に従いストレプトマイシ
ス株を形質転換した。形質転換後、プロトプラストをＲ
２ＹＥ培地において培養し、３０℃で１５−２０時間再
生させた。次いで、１mlのチオストレプトン水溶液(３
００mcg／ml)をプレートに注ぎ、１または２時間乾燥
し、２または３日間以上インキュベーションした。形質
転換体を、チオストレプトン(５０mcg／ml)およびＸＰ
(３０mcg／ml)を含むＰＲＭＭ培地へ複製した。

【００４７】コーエン等に従いエシェリヒア・コリの形
質転換を行った(プロシーディングス・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ
・ユー・エス・エー、６９:２１１０−２１１４、１９
７２)。アンピシリンを含む(２００mcg／ml)プレート上
で形質転換体を選択した。必要ならば、Ｘ−gal(３６mc
g／ml)およびＩＰＴＧ(１０mcg／ml)をＬＡプレートに
加えた。

【００４８】ハイブリダイゼーション試験。ホップウッ
ド等の記載(「ア・ラボラトリー・マニュアル」、ザ・ジ
ョーン・イネス・ファウンデーション、ノーウィッチ、
イギリス国、１９８５)に従い、アガロース・ゲルから
ニトロセルロース・フィルターへのＤＮＡの移動および
ハイブリダイゼーションを行った。プラスミドpＵＬＡ
Ｄ１からの７.２kb ＢglIIフラグメントおよびプラスミ
ドpＵＬＡＤ３からの１kb ＢglIIフラグメントをプロー
ブとして用いた。７０℃で２４時間ハイブリダイゼーシ
ョンを行った。フィルターを、７０℃で２gのＳＳＣ、
０.１％ＳＤＳ中３０分間２回、次いで０.２gのＳＳ
Ｃ、０.１％(ＳＤＳ)中で再び３０分間２回洗浄した。

【００４９】ヌクレオチド配列分析。サンガー等の鎖終
結方法(プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・
アカデミー・オブ・サイエンシーズ・オブ・ザ・ユー・
エス・エー、７４:５４６３:５４６７、１９７７)によ
りヌクレオチド配列を決定した。ＤＮＡフラグメントを
Ｍ１３mp１０およびＭ１３mp１１へサブクローニングす
ることにより、いずれかの配向の挿入体が得られた。ラ
イゲーション混合物を適格エシェリヒア・コリＪＭ１０
３細胞へトランスフェクションし、白色プラークを挿入
体の選抜用にスクリーニングした。アマーシャム・イン
ターナショナル・パブリック・リミテッド・カンパニー
(イギリス国)およびシーケナーゼ(ユナイテッド・バイ
オケミカル・コーポレーション、アメリカ合衆国)キッ
トを用いることにより、両鎖において配列決定を行っ
た。dＧＴＰを用いて全フラグメントの配列決定を行っ
たが、必要に応じてdＧＴＰの代わりにdＩＴＰを使用し
た。６％または８％ポリアクリルアミド連続ゲルにおい
て反応混合物を分離し、次いでオートラジオグラフィー
に付すためにＸ線フィルムに暴露した。

【００５０】プロモーター・クローニング。マルチコピ
ー・プロモーター-プローブ・プラスミドpＩＪ４８６を
用いることにより(ワード等、「モレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティックス」、２０３:４６８−４７
８、１９８６)、転写開始活性を有するフラグメントを
選択した。１５mcg／mlのカナマイシンを含むＭＭへの
コロニーの複製により、カナマイシン(Ｋm)耐性形質転
換体を単離した。

【００５１】インビトロ転写−翻訳。アマーシャム・イ
ンターナショナル・パブリック・リミテッド・カンパニ
ーからの原核生物ＤＮＡ指向翻訳キットを用いることに
より、プラスミドpＵＬＡＤ３００およびpＵＣ１９を転
写し、翻訳した。Ｌ(３５Ｓ)メチオニンを放射性標識と
して使用した。ドデシル硫酸ナトリウム含有１２.５％
ポリアクリルアミド・ゲルを用いて、標識蛋白質を分析
した。

【００５２】

【実施例】本発明の実施方法下記の詳細な記載は本発明を説明するものである。

【００５３】種々のストレプトマイシスによるアルカリ
性ホスファターゼ生産。１０種の相異なるストレプトマイシス株(第１表に列挙)
の幾つかの固体培地におけるアルカリ生産ホスファター
ゼ生産を検定した。ストレプトマイシス・グリセウスＩ
ＭＲＵ３５７０およびストレプトマイシス・グリセウス
ＡＴＣＣ１０１３７は、検定された全培地の中で最も優
れた生産体であった。アルカリ性ホスファターゼ生産に
とって最良の固体培地は、ＰＲＭＭ(３０mcg／mlＸＰ含
有)であった。この培地において、ストレプトマイシス
・グリセウスＩＭＲＵ３５７０およびストレプトマイシ
ス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７は、４８時間の生長
後に濃い青色を示した。ストレプトマイシス・リビダン
ス１３２６およびストレプトマイシス・コエリコロルＪ
Ｉ２２８０は、生産性の低いアルカリ性ホスファターゼ
生産体であった。ＸＰ含有ＰＲＭＭにおける９０時間の
生長後には、弱い青色しか観察され得ない。

【００５４】アルカリ性ホスファターゼ生産に関与する
遺伝子のクローニング。ストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７か
ら得た全ＤＮＡをＢglIIにより消化し、ＢglII−消化p
ＩＪ７０２にライゲーションし、ストレプトマイシス・
リビダンス１３２６プロトプラストへの形質転換により
ライゲーション混合物を導入した。形質転換体を、チオ
ストレプトン(５０mcg／ml)およびＸＰ(３０mcg／ml)を
含むＰＲＭＭへ複製した。ストレプトマイシス・リビダ
ンスの２８００個のメラニン陰性形質転換体の中から、
１個の濃青色コロニーが見出された。その濃青色コロニ
ーは、pＵＬＡＤ１(第１図)と称する７.２kb ＢglII挿
入体を有するpＩＪ７０２誘導体を含んでいた。

【００５５】プラスミドpＵＬＡＤ１はストレプトマイ
シス・リビダンスにおいて不安定であり、形質転換後、
白色および青色のコロニーを生じた。青色コロニーは全
て最初のpＵＬＡＤ１を含み、白色コロニーは、pＵＬＡ
Ｄ１の欠失形態を含んでいた(これらはそれ以上試験さ
れない)。この不安定性は、プラスミド、例えばある種
の不安定性を有することが知られているpＩＪ７０２に
おける大きなサイズの挿入体に起因し得るため、７.２k
b挿入体を、プラスミドpＩＪ６９９(キーザー等、「ジー
ン」、６５:８３−９１、１９８８)の５kb ＢglIIフラグ
メントへサブクローニングした。反対配向での挿入体に
より、２種のプラスミドpＵＬＡＤ１００およびpＵＬＡ
Ｄ１０１が得られた。両プラスミドは安定しており、遺
伝子はストレプトマイシス・リビダンスにおいて両配向
で発現された。

【００５６】saf遺伝子の局在性。７.２kb ＢglIIフラグメントをＳau３ＡＩにより部分消
化し、ＢglII−消化pＩＪ７０２にライゲーションし
た。ライゲーション混合物をストレプトマイシス・リビ
ダンス・プロトプラストへ形質転換し、形質転換体をＸ
Ｐ含有ＰＲＭＭへ複製した。プラスミドＤＮＡを幾つか
の青色コロニーから単離した。アルカリ性ホスファター
ゼ生産に関する決定基を有する４種の小さなプラスミ
ド、pＵＬＡＤ２、pＵＬＡＤ３、pＵＬＡＤ１６およびp
ＵＬＡＤ１８を詳細に試験した。それらは安定した形質
転換体ストレプトマイシス・リビダンス・プロトプラス
トであり、各々２.４、１、２.１および１.９kbの挿入
体を有していた(第１図)。プラスミドpＵＬＡＤ３は、
ＢglIIによりレスキューされ得る最小の挿入体(１kb)を
有する。ストレプトマイシス・リビダンスへ導入する
と、pＵＬＡＤ３(ブダペスト条約および規則２８ＥＰＣ
下、１９８９年５月１９日にＣＮＣＭ(コルクティョン
・ナツィオナール・ド・クルツール・ド・ミクロオルガ
ニスム、２８リュ・ドゥ・ドクツール・ルークス、Ｆ７
５７２４パリ・セデックス１５、フランス国)に番号Ｉ
−８５９として寄託)は、pＵＬＡＤ１と同様高いアルカ
リ性ホスファターゼ生産性を示した。

【００５７】幾つかのストレプトマイシスの染色体ＤＮ
Ａとのハイブリダイゼーション。ＢamＨＩまたはＢglIIにより消化されたストレプトマイ
シス・グリセウスＡＴＣＣ１０１３７から得た全ＤＮＡ
を、(３２p)dＣＴＰによるニック翻訳により標識された
pＵＬＡＤ１からの７.２kb ＢglIIフラグメントにハイ
ブリダイゼーションした。予想通り、プローブと相同性
を示す７.２kb ＢglIIフラグメントが、ＢglIIにより消
化されたストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣＣ１０
１３７ＤＮＡに存在していた。フラグメントには、全Ｄ
ＮＡをＢamＨＩで消化したとき、２つの明白なハイブリ
ダイゼーション帯(７.９kbおよび９.４kb)を生じる内部
ＢamＥＨＩ部位が存在した。

【００５８】同じ遺伝子が他のストレプトマイシスに存
在するか否かを試験するため、ストレプトマイシス・ア
クリマイシニ、ストレプトマイシス・コエリコロル１１
５７、ストレプトマイシス・グリセウス２２１２、スト
レプトマイシス・グリセウス３５７０、ストレプトマイ
シス・リビダンス１３２６およびストレプトマイシス・
ラクタムデュランスＮＲＲＬ３８０２からの全ＤＮＡを
ＢamＨＩにより消化し、プローブとしてpＵＬＡＤ３の
１kb ＢglIIフラグメントとハイブリダイゼーションし
た。上記ストレプトマイシスの最初の４株において９.
５Ｋb共通帯とのハイブリダイゼーションが観察され、
ストレプトマイシス・リビダンスおよびストレプトマイ
シス・ラクタムデュランスのＤＮＡでは、各々４つおよ
び５つの弱いハイブリダイゼーション帯が観察された
(第２図)。さらにまた、ストレプトマイシス・アルブス
Ｇ、ストレプトマイシス・コエリコロルＪＩ２２８０、
ストレプトマイシス・クラブリゲルスＮＲＲＬ３５８５
およびストレプトマイシス・フラディアエＡＴＣＣ１０
４７５のＤＮＡとのハイブリダイゼーションが観察され
た。これ以上、ハイブリダイゼーションしている帯の特
性検定の試みは行われなかった。

【００５９】エシェリヒア・コリpho−突然変異体の相
補性の欠如。我々がストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣＣ１０１
３７からのアルカリ性ホスファターゼ構造遺伝子をクロ
ーン化したか否かを確認するため、エシェリヒア・コリ
phoＡ突然変異体Ｅ１５およびＡＷ１０４６の相補性を
試験した。pＵＬＡＤ１からの７.２Ｋb ＢglIIフラグメ
ントおよびpＵＬＡＤ３からの１Ｋb ＢglIIフラグメン
トを、ＢamＨＩ−消化pＵＣ１９において両配向で別々
にサブクローニングした。これらのプラスミド構築物を
全てエシェリヒア・コリＪＭ１０３細胞において確認
し、次いでそれらを用いてエシェリヒア・コリＥ１５
(サーシー等、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー」、１４５:２８８−２９２、１９８１)およびエシェ
リヒア・コリＡＷ１０４６を形質転換した。Ｂ−ＸＰに
おける青色コロニーは一切見出されず、アルカリ性ホス
ファターゼの完全な構造遺伝子がストレプトマイシス・
グリセウスの７.２Ｋbフラグメントには存在しないこ
と、またはそれがエシェリヒア・コリにおいては発現さ
れないことが示された。アルカリ性ホスファターゼ(pho
Ａ)またはバチラス・ルチェニホルミス(ヒューレット、
Ｆ.Ｍ.、「ジャーナル・オブ・バクテリオロジー」、１５
８:９７８−９８２、１９８４)の構造遺伝子は、クロー
ン化された１Ｋbフラグメントとはハイブリダイゼーシ
ョンしなかった(データは示さず)。さらに、phoＢ(調
節)エシェリヒア・コリ突然変異体Ｈ２(クロイツェル
等、「ジェネティックス」、８１:４５９−４６８、１９
７５)は、pＵＬＡＤ３の１kb ＢglIIフラグメントまた
はpＵＬＡＤ１の７.２kb ＢglIIフラグメントのいずれ
とも相補性を示さなかった。

【００６０】他の細胞外酵素の過剰生産。 pＵＬＡＤ３を用いてストレプトマイシス・リビダンス
のプロトプラストを形質転換した場合、明らかに遅れた
色素形成および胞子形成が観察された。これらの多面発
現作用により、蛋白質分泌または遺伝子発現の制御にお
けるこの遺伝子の役割に関する我々の試験は促進され
た。第３図で示す通り、アミラーゼ、プロテアーゼおよ
びリパーゼを含む幾つかの細胞外酵素は、pＵＬＡＤ３
により形質転換されたストレプトマイシス・リビダンス
により過剰生産された。また、β−ガラクトシダーゼ生
産性も増加し、その生産は、非形質転換ストレプトマイ
シス・コエリコロルの場合よりも約２４−３０時間早く
開始した。このクローン化された遺伝子は細胞外酵素、
色素生成および分化に対して多面発現作用を示すため、
この遺伝子はsaf(２次代謝活性化因子)と命名された。

【００６１】遺伝子用量効果。 pＩＪ７０２のコピー数を概算すると、１染色体当たり
１００〜２００である。pＵＬＡＤ３の正確なコピー数
は測定されなかったが、pＩＪ７０２およびpＵＬＡＤ３
の両帯の強度は、似たコピー数であることを示唆してい
た。

【００６２】遺伝子用量効果を試験するため、我々は、
pＵＬＡＤ３の１kb ＢglIIフラグメントを、低コピー数
プラスミドpＩＪ６１(１細胞当たり３〜４コピー)のＢa
mＨＩ部位へサブクローニングした。(ホップウッド等、
「ア・ラボラトリー・マニュアル」、ザ・ジョーンズ・イ
ネス・ファウンデーション、ノーウィッチ、イギリス
国)。この新規プラスミドはpＵＬＡＤ３０と命名され
た。第４図は、pＵＬＡＤ３０により形質転換されたス
トレプトマイシス・リビダンスによる細胞外酵素の生産
性が、pＵＬＡＤ３をもつストレプトマイシス・リビダ
ンスに関して明らかに減少していることを示す。さら
に、pＵＬＡＤ３０をもつストレプトマイシス・リビダ
ンスは、非形質転換ストレプトマイシス・リビダンスと
似た色素生成および胞子形成パターンを示した。

【００６３】エシェリヒア・コリにおける発現および遺
伝子のトリミング・ダウン。エシェリヒア・コリのＰho突然変異体はsaf遺伝子によ
り補足されなかったが、我々は、pＵＬＡＤ３の１kb Ｂ
alII挿入体をpＵＣ１９において一方向でサブクローニ
ングした場合(pＵＬＡＤ３００と命名されたプラスミ
ド)、エシェリヒア・コリにおける発現の結果、固体培
地で生長させた場合に異常形態が誘発されるが、それを
反対方向で挿入した場合(プラスミドpＵＬＡＤ３０１)
には発現しないことを観察した。プラスミドpＵＬＡＤ
３００は、lacＺプロモーターから下流にＯＲＦ(下記参
照)を含む。これらの結果は、saf遺伝子が、pＵＣ１９
に存在するlacＺプロモーターからエシェリヒア・コリ
において発現されることを示唆している。

【００６４】エシェリヒア・コリ検定におけるインビト
ロ転写−翻訳を実施し(pＵＬＡＤ３００を使用)、反応
生成物を１２.５％ポリアクリルアミド・ゲルにおいて
負荷した。分子量１５０００の帯は、対照pＵＣ１９レ
ーンに存在しないpＵＬＡＤ３００対応するレーンに存
在した。

【００６５】saf遺伝子の位置を正確に確認するため、
プラスミドpＵＬＡＤ３００の１Ｋbフラグメントの解離
続行が決定された。これらの試験では、１kbフラグメン
ト内における制限酵素ＳstＩ(nt２１６)、ＫpnＩ(nt６
４８)およびＳalＧＩ(nt９３６)について特有の切断部
位の存在が開発された。pＵＬＡＤ３００の１kb挿入体
から得られた相異なるサブフラグメントを第１段階でp
ＩＪ２９２１、すなわちＢglII部位に近接した修飾ポリ
リンカーを含むpＵＣ１８の誘導体(第１３図参照)へク
ローン化し、次いでＢglII付着末端によりレスキュー
し、ＢglII消化pＩＪ７０２へクローン化した。アルカ
リ性ホスファターゼ、アミラーゼおよびプロテアーゼ生
産性を、全プラスミド構築物を用いてストレプトマイシ
ス・リビダンスにおいて試験した。これらの試験の結果
は第５図において概略形態で現れており、それらの解釈
の結果、下記結論が導き出された。

【００６６】１．１kbフラグメントは、プラスミドpＩ
Ｊ７０２の両配向(プラスミドpＵＬＡＤ３およびpＵＬ
ＡＤ４)において類似レベルで発現されたことから、そ
れ自体のプロモーターを含めて完全なsaf遺伝子を含
む。２．saf遺伝子は、６４８ヌクレオチドＢglII−ＫpnＩ
フラグメント(プラスミドpＵＬＡＤ５およびpＵＬＡＤ
６)に位置すると思われる。３．フラグメントＳstＩ−ＫpnＩ(４３２ヌクレオチド)
は、細胞外酵素過剰生産に関する遺伝子決定基を含むと
思われるが、一配向(プラスミドpＵＬＡＤ１０およびp
ＵＬＡＤ１４)でのみ発現し、反対配向(プラスミドpＵ
ＬＡＤ９およびpＵＬＡＤ１３)では発現しなかったた
め、そのプロモーター領域を喪失したと思われる。４．２１５ヌクレオチド・フラグメントＢglII−ＳstＩ
は、saf遺伝子プロモーター領域を含む。５．細胞外酵素および分化に対する作用は全て、一緒に
保たれるかまたは失われ、単一の遺伝子産物が全酵素に
対する作用に関与することが示された。６．驚くべき態様は、pＩＪ７０２に存在するmel−遺伝
子のチロシナーゼ・プロモーターから始まるフラグメン
トＳstＩ−ＫpnＩ(プロモーターをもたないsaf遺伝子)
の発現の欠如であったにも拘わらず、これは反対方向
(時計回り)では発現された。この発見は、遺伝子melの
前およびＢglIIクローニング部位に位置するプロモータ
ー活性を有するフラグメントが存在することを意味した
(ベルナン等、「ジーン」、３７:１０１−１１０、１９８
５)。その発見は公開されなかったが、数人の著者が時
折述べている(ジルおよびホップウッド、「ジーン」、２
５:１１９１３２、１９８３)。逆方向(ＫpnＩ−−Ｓst
Ｉ)での機能的ＯＲＦの可能性は幾つかの理由により却
下された。

【００６７】Ａ．ヌクレオチド配列を分析したとき、上
記ＯＲＦは検出されなかった。Ｂ．上記ＯＲＦが存在する場合、フラグメントＢglII−
ＫpnＩ(nt１−nt６４８)は両方向で発現されたため(プ
ラスミドpＵＬＡＤ５およびpＵＬＡＤ６)、それはそれ
自体のプロモーターをもたなければならないことは明白
である。次に、ＫpnＩゾーンにプロモーターをもつＫpn
Ｉ−ＳstＩフラグメントが単に一方向でそれ自体を発現
し得ることは意味をなさなかった。Ｃ．エシェリヒア・コリでの発現は、常にプロモーター
lacＺが(前)提案されたＯＲＦに有利な場合に行なわ
れ、反対方向では決して行なわれなかった。

【００６８】ＯＲＦ１上流ＤＮＡフラグメントのプロモ
ーター活性。以前の実験から推論され得る、ＢglII−ＳstＩフラグメ
ントにおけるプロモーターの存在を確認するため、アミ
ノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ(neo)を暗号
化する(codify)遺伝子はもつが、そのプロモーターは随
伴しない・・・・・。この遺伝子の発現によって、スト
レプトマイシス・リビダンスはカナマイシンおよびネオ
マイシンに対する耐性を獲得した。このフラグメントを
pＩＪ４８６(neo遺伝子の隣にＳstＩ端を有する)におい
てサブクローニングすると、プラスミドpＩＪ４８４::
２１６が作製された。pＩＪ４８６::２１６により形質
転換されたストレプトマイシス・リビダンスは、１００
mcg／mlを越えるＫmを含むＭＭにおいて生長するが、p
ＩＪ４８６により形質転換されたストレプトマイシス・
リビダンスは、５mg／mlＫmを補ったＭＭにおいて生長
しないことが観察された。これらの結果は、上記フラグ
メントがプロモーター活性を有することを示し、提案さ
れたＯＲＦを支持するものであった。

【００６９】ヌクレオチド配列および考えられるＯＲＦ
から導き出された他の考察は、次の通りであった。

【００７０】１．遺伝子safは逆方向および相補的反復
配列を有する２つの領域により囲まれており、遺伝子sa
f(nt６３７−６９７)である、mＲＮＡにおいて非常に安
定した結合Ｇ＝−３８.４kcalを形成し得る(第１１
図)。２．配列決定されたフラグメントは、ストレプトマイシ
ス遺伝子において通常見出される高いＧ＋Ｃパーセンテ
ージを含む。３．遺伝子safの前、ＡＴＧ(nt２１９)および反復上流
構造間には、非常に興味深いヌクレオチド領域が存在す
る。すなわち３対の反復ヌクレオチド(各々７ntを有す
る)が存在する(第１２図)。この領域、特にプロモータ
ー・ゾーンは、遺伝子saf発現の調節において非常に重
要な役割を演じるとほぼ考えられる。４．ＳＡＦ蛋白質が１８のネット正負荷を含むことは言
うに値する。仮定的な見通しによると、これはＤＮＡに
対するかなり大きな親和力の存在を示し得る。推定され
たアミノ酸配列の場合でも、ＤＮＡ結合蛋白質のドメイ
ンと非常に類似した領域が観察され得る(パボおよびサ
ウエル、１９８４)(第１０図)。

【００７１】saf遺伝子のヌクレオチド配列。出発物質としてプラスミドpＵＬＡＤ３００を用いるこ
とにより、pＵＬＡＤの全１kb ＢglII挿入体のヌクレオ
チド配列を測定した。Ｍ１３mp１０およびＭ１３mp１１
はＫpnＩ部位をもたないため、まずＫpnＩ端を有するフ
ラグメントをpＵＣ１９へサブクローニングし、次いで
ＥcoＲＩ−ＨindIIIフラグメントとしてレスキューし、
ＥcoＲＩおよびＨindIIIにより消化したmp１０およびmp
１１へ導入した。活性領域の完全ヌクレオチド配列は、
推定的ＳＡＦポリペプチドをコードする３３９個のヌク
レオチドを有するＯＲＦ１を示す(第６〜８図)。nt１８
３のＡＴＧ開始コドンから始まり、nt５２４のＴＧＡ停
止コドンで終結するＢglII−ＫpnＩフラグメントには唯
一の可能なオープン・リーディング・フレームが含まれ
る(第５および６〜８図におけるＯＲＦ１)。プラスミド
pＵＬＡＤ１４に含まれたＳstＩ−ＫpnＩ挿入体は、同
じくＳstＩ部位の下流領域を含むプラスミド(pＵＬＡＤ
３、pＵＬＡＤ４、pＵＬＡＤ４およびpＵＬＡＤ６)より
も低度の活性を示すため、仮定的safリーディング・フ
レームと枠を形成するＡＴＧ(nt２１９)はまた、pＵＬ
ＡＤ１０およびpＵＬＡＤ１４において開始コドンとし
て作用し得るとほぼ考えられる。ＴＧＡ終止コドンが最
初のＡＴＧの上流に存在するため、他の代替的開始トリ
プレットはあり得ない。非常に安定したステムおよびル
ープ構造( Ｇ＝−５３.６kcal)を形成し得る長い逆方
向反復領域は、saf遺伝子の上流、nt９０〜nt１３５に
存在する。別のハイフンで結んだ逆方向配列は、ヌクレ
オチド６３７から６９７へ伸びるＯＲＦ１のターミネー
ター・トリプレットから下流で観察された( Ｇ＝−３
８.４kcal)。

【００７２】saf遺伝子は、高いＧ＋Ｃ含有率(７６.３
％)および著しい遺伝子・・・・・を有する(ホップウッ
ド等、レギュレーション・オブ・ジーン・エクスプレッ
ション２５イヤーズ・オン、キャンブリッジ・ユニバー
シティー・プレス、２５１−２７６頁、１９８６)。

【００７３】ＯＲＦ１の上流のＤＮＡフラグメントのプ
ロモーター活性。ＢglII−ＳstＩフラグメント(nt１〜nt２１６)を欠くプ
ラスミドは一配向でのみ発現され(プラスミドpＵＬＡＤ
１０およびpＵＬＡＤ１４)、反対方向では発現されなか
ったため(プラスミドpＵＬＡＤ９およびpＵＬＡＤ１
０)、恐らくＯＲＦ１プロモーターはそのフラグメント
に位置すると思われた。この領域における転写開始配列
の存在は、このフラグメントを、プロモーター欠失アミ
ノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo)
を含むプロモーター-プローブ・プラスミドpＩＪ４８６
(ワード等、「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェ
ネティックス」、２０３:４６８:４７８、１９８６)へサ
ブクローニングすることにより確認された。この遺伝子
の発現により、ストレプトマイシス・リビダンスにはカ
ナマイシンおよびネオマイシン耐性が付与される。Ｂgl
II−ＳstＩフラグメントをpＩＪ４８６(neo遺伝子に近
接するＳstＩ末端)へサブクローニングした(このプラス
ミドをpＩＪ４８６::２１６と命名)。pＩＪ４８６::２
１６により形質転換されたストレプトマイシス・リビダ
ンスは、１００mcg／mlを越えるＫmを含むＭＭにおいて
生長し得たが、pＩＪ４８６をもつストレプトマイシス
・リビダンスは、５mcg／mlのＫmを含むＭＭにおいて生
長しない。この結果は、ＢglII−ＳstＩフラグメントが
プロモーター活性を有することを示す。しかしながら、
ストレプトマイシスの他のプロモーターとのヌクレオチ
ド相同性によって、典型的な「共通」−１０または−３５
領域は全く同定されなかった(ホップウッド等、レギュ
レーション・オブ・ジーン・エクスプレッション２５イ
ヤーズ・オン、キャンブリッジ・ユニバーシティー・プ
レス、２５１−２７６頁、１９８６)。

【００７４】アミラーゼ遺伝子のクローニング。現在、ストレプトマイシス・グリセウスＩＭＲＵ３５７
０のアミラーゼ遺伝子(amy)の決定的配列が解明され
た。ストレプトマイシス・グリセウスのアミラーゼ遺伝
子の完全なヌクレオチド配列および推定的アミノ酸配列
は第１４〜２１図に現れている。リーダー・ペプチドを
伴う蛋白質は５６６個のアミノ酸を有し(ヌクレオチド
３１８〜２１５５、両端を含む)、５９７１３ＤのＰＭ
に対応する。ストレプトマイシス・アリセウスＩＭＲＵ
３５７０のＤＮＡをＳau３Ａで消化し、３〜９Ｋbのフ
ラグメントを分離し、ＢglII消化pＩＪ６９９にライゲ
ーションすることにより、全α−アミラーゼ遺伝子を含
むプラスミドpＵＬＴＶ１が構築された。α−アミラー
ゼ活性についてスクリーニング後、全α−アミラーゼ遺
伝子を含むpＵＬＴＶ１プラスミドを選別した。pＵＬＴ
Ｖ１の構築を第２２図に示す。全α−アミラーゼ遺伝子
を含むプラスミドを得る別の方法は、それを２つのさら
に小さなフラグメントから構築する方法である。クロー
ニングにより得られたプラスミドの中で、ストレプトマ
イシス・グリセウスの全ＤＮＡライブラリーは、５'末
端から始まる部分的遺伝子を有するもの、および３'末
端から始まる部分的遺伝子を有するものである。前者か
らは、遺伝子の５'末端を含む１.３ＫbフラグメントＢa
mＨＩ−ＳacＩが得られ、後者からは、遺伝子の３'末端
を含む１.２ＫbＳacＩ−ＳalＩフラグメントが得られ
る。次いで、両者をＳalＩ−ＢamＨＩで処理したpＩＪ
２９２１に結合することにより、無傷の天然α−アミラ
ーゼ遺伝子を含むプラスミドが得られる(pＵＬＴＶ２０
０)。

【００７５】safプロモーターの優れた有効性。種々のプロモーターの制御下でのamy遺伝子の発現を試
験するため、ストレプトマイシス・リビダンスＪＩ６６
によるアミラーゼの生産性を試験した。amy遺伝子を相
異なるプロモーターの制御下に置き、アミラーゼ生産性
を、天然プロモーター(ＰamＹ)の使用による生産性と比
較した。試験されたプロモーターは、saf遺伝子のプロ
モーター(Ｐsaf)、Ｋm^r遺伝子のプロモーター(Ｐneo)、
シンテナーゼＰＡＢＡ遺伝子のプロモーター(Ｐpab)お
よびエシェリヒア・コリβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の
プロモーター(Ｐlac)であった。pＵＬＴＶ２００から抽
出されたＥcoＲＩ−ＢglIIフラグメントを、ＥcoＲＩ−
ＢamiＩで消化したpＵＣ１８へライゲーションすること
により、プロモーターを伴わないα−アミラーゼ遺伝子
を含むプラスミドpＵＬＴＶ２２０が得られた。pＵＬＴ
Ｖ２２０からのＥcoＲＩ−ＨindIIIフラグメントを、sa
f、pabまたはＫm^r遺伝子のプロモーターへ直接ライゲー
ションすることにより、pＵＬＶＤ１０、pＵＬＶＡ１お
よびpＵＬＴＶ８０プラスミドが各々得られた。lacのプ
ロモーターを含むpＵＬＴＶ１５０は、pＵＬＴＶ２２０
のＨindIII消化およびpＩＪ６９９の５Ｋb ＨindIIIフ
ラグメントへのライゲーションにより直接得られた。

【００７６】ＭＭ＋澱粉(１％)＋チオストレプトン、Ｍ
Ｍ(１mＭＰ)＋澱粉(１％)＋チオストレプトン、ホスフ
ェート不含有ＭＭ＋澱粉＋チオストレプトンおよびＭＭ
＋澱粉(１％)＋チオストレプトン＋ＩＰＴＧを含む皿に
おいて、生成したプラスミドの生産性試験を行った。p
ＩＪ６９９、pＵＬＴＶ１００(第９図参照)およびpＵＬ
ＴＶ１を対照として用いた。アミラーゼ生産性の相対尺
度は、Ｉ₂含有生長培地の染色時に各コロニーの周囲で
得られる円形コロナ領域であると考えられた。

【００７７】種々の構築物の生産性グラフは第２３図に
示されている。対照の場合を除くと、最高の生産性は、
ＭＭ(１mＭＰ)＋澱粉＋チオストレプトンにおいて達成
された。生産性ピークがpＵＬＶＤ１０(saf遺伝子プロ
モーターを有する)によりいかにして得られたかは(１１
４時間のインキュベーションでＰlacプロモーターを含
む、２番目に高い生産体pＵＬＴＶ１５０の１３３５mm²
と比べて１４８２mm²)、明らかに注目に値することであ
る。

【００７８】第２３図(下部右側パネル)において、pＵ
ＬＶＤ１０の生産値は、各タイプの構築についてこれま
でに知られている最善条件下での対照と比較して表され
ている。pＵＬＴＶ１(天然)の場合と比べたpＵＬＶＤ１
０生産性の増加は、全く無視できない(１１０５mm²に対
して１４８２mm²)。

【００７９】すなわち、saf遺伝子プロモーターを他の
天然プロモーターの代用物として使用することにより、
様々な内在ストレプトマイシス・ポリペプチドおよび蛋
白質の発現が改良され得る。同様に、外来ＤＮＡが挿入
される場合、saf遺伝子プロモーターは、アミラーゼに
より立証された結果と同じく優れた結果を与えると予想
される。

【００８０】外来ポリペプチドまたは蛋白質の発現。外来ポリペプチドまたは蛋白質を発現させるため、好ま
しくは外来ＤＮＡを内在遺伝子、好ましくは細胞外酵素
をコードする遺伝子の適当な認識部位に挿入することに
より、外来ポリペプチドまたは蛋白質を確実に分泌させ
る。遺伝子がアミラーゼ遺伝子である場合、適当な認識
部位はＢstＥII部位である(第１４〜２１図参照)。外来
ＤＮＡは、好ましくは細胞外酵素遺伝子からの分泌シグ
ナルを可能な限り多く保持するように挿入される。これ
らのシグナルがリーダー配列において優勢である場合、
アミラーゼ遺伝子に関してカルボキシル末端もまた分泌
に重要であることが立証される。すなわち、内在ＤＮＡ
の転写部分を除去し、外来ＤＮＡと置き換えるよりも、
外来ＤＮＡを内在ＤＮＡへ挿入することにより融合蛋白
質を作製するのが最善であり得る。

【００８１】saf遺伝子は染色体ＤＮＡにおいて細胞外
酵素の産生を制御することが知られている。恐らく、染
色体ＤＮＡにはＳＡＦポリペプチドを認識し、細胞外酵
素生産性を向上させる認識配列が存在すると思われる。
プラスミドにおけるsaf遺伝子とアミラーゼ遺伝子の組
み合わせは、アミラーゼの生産性向上を誘発しない。す
なわち、ＳＡＦにより制御され得る内在細胞外酵素の分
泌シグナル配列と機能し得るように結合し、好ましくは
さらにsafプロモーターと機能し得るように結合した(天
然プロモーターの非存在下)外来蛋白質を、プラスミド
とは反対側の染色体ＤＮＡへ組み込むのが好ましい。こ
の方法において、外来ポリペプチドまたは蛋白質の生産
性は、天然ＳＡＦによりさらに高められる。さらに好ま
しい実施態様では、saf遺伝子は外来ＤＮＡが染色体Ｄ
ＮＡへ挿入された同じ機構へプラスミドによって挿入さ
れる。これにより外来ポリペプチドまたは蛋白質の分泌
は確実に高められる。ＤＮＡフラグメントは、ストレプ
トマイシスの公知バクテリオファージ・ベクターのいず
れか、例えばφＣ３１またはＲ４によりストレプトマイ
シスの染色体ＤＮＡへクローン化され得る(チャーター
等、「ジーン・クローニング・イン・オーガニズムス・
アザー・ザン・エシェリヒア・コリ」中「ジーン・クロー
ニング・イン・ストレプトマイシス」、Ｐ.Ｈ．ホフシュ
ナイダー等編、スプリンガー-フェルラーク、ベルリ
ン、１９８２、８７−９５頁)。

【００８２】第２４図の図式は、ストレプトマイシスか
らの外来蛋白質、この場合ＣＲＦの分泌を達成するため
の好ましい技術を示す。ＫＣ４００は、結合部位(att)
を欠き、Ｃ⁺遺伝子を有するφ３１誘導体である。チャ
ーター、Ｋ.Ｆ.等、「ストレプトマイシスにおける突然
変異的クローニングおよび抗生物質製造遺伝子の単
離」、「ジーン」、２６:６７−７８(１９８３)参照。Ｃ⁺
遺伝子は、溶原状態の維持に必要なリプレッサーをコー
ドする。野生型ファージにおけるatt部位は、宿主細胞
ＤＮＡへのファージの結合を指示し、そこからの遊離を
指示する。att部位が無い場合、相同性ＤＮＡフラグメ
ントがファージへクローン化されなければ、ファージは
宿主染色体へ組み込まれ得ない。宿主株における内在遺
伝子は全て、この目的に使用され得るため、第２４図で
は単に「遺伝子Ｘ」として表される。ファージφ３１ＫＣ
４００を公知技術で遺伝子操作することにより(ホップ
ウッド、Ｄ.Ａ.等、「ジェネティック・マニピュレーシ
ョン・オブ・ストレプトマイシス。ア・ラボラトリー・
マニュアル」、ザ・ジョーン・イネス・ファウンデーシ
ョン、ノーウィッチ、イギリス国(１９８５)参照)、相
同性遺伝子フラグメント(遺伝子Ｘ)並びにsafプロモー
ターを含む遺伝子および内在性α−アミラーゼ遺伝子お
よびα−アミラーゼ遺伝子に機能し得るように結合し、
これとリーディング・フレームを形成するＣＲＦの遺伝
子が挿入される。このファージによって宿主ストレプト
マイシス株、好ましくはストレプトマイシス・コエリコ
ロルＡ３(２)(イギリス国ノーウィッチ、ザ・ジョーン
・イネス・ファウンデーションのコレクションから入手
可能)の感染後、全ファージＤＮＡは、好ましくはキャ
ンベル型組換えを用いて、相同性遺伝子Ｘから始まる宿
主細胞の染色体ＤＮＡへ挿入される。示されている通
り、これに従う特異的技術の全ては、当業界の熟練者の
技術範囲内に含まれるため、上記挿入は過度の実験無し
で行なわれ得る。

【００８３】次いで、挿入された染色体遺伝子を含む細
胞を処理することにより、pＵＬＡＤ３プラスミドを取
り上げる。前記細胞はＳＡＦポリペプチドを発現し、こ
れが染色体遺伝子による「α−アミラーゼ」の分泌を向上
させる。この遺伝子におけるsafプロモーターの存在に
より、「α−アミラーゼ」の分泌はさらに高められる。分
泌された「α−アミラーゼ」はそこに融合したＣＲＦ分子
を含み、これは適当な酵素消化により容易に分離され得
る。

【００８４】ストレプトマイシスのα−アミラーゼ遺伝
子について具体的に例を挙げて説明したが、safプロモ
ーターを用いて発現を向上させることを目的として、使
用されている種類のストレプトマイシスにより産生され
たポリペプチドまたは蛋白質の遺伝子は、天然プロモー
ターを除去し、safプロモーターと置き換えることによ
り修飾され得るものと理解すべきである。同様に、外来
ポリペプチドまたは蛋白質は上記内在遺伝子へ挿入され
得る。しかしながら、好ましくは、選択された内在遺伝
子は、細胞壁を通って培養培地中へ蛋白質を発現するも
のであり、この場合分泌シグナル配列の保持が重要であ
る。外来遺伝子挿入用に選択されている遺伝子がＳＡＦ
により制御され、前記挿入が染色体ＤＮＡに存在し、好
ましくはsaf遺伝子含有プラスミドの同時挿入を伴う場
合、最善の結果が得られる。

【００８５】ＣＲＦについて具体的に述べたが、外来Ｄ
ＮＡ配列は、蛋白質またはポリペプチドをコードする非
ストレプトマイシス誘導性ＤＮＡ配列であればよく、特
に真核生物またはウイルス起源のものであり得るものと
理解すべきである。それらの真核生物およびウイルスＤ
ＮＡ配列の例には、ヒトおよび動物白血球インターフェ
ロン(ＩＮＦ−α)、線維芽細胞インターフェロン(ＩＮ
Ｆ−β)および免疫インターフェロン(ＩＮＦ−γ)、ヒ
ト・インシュリン、ヒトおよび動物成長および他のホル
モン類、例えばコルチコトロピン放出因子(ＣＲＦ)、ヒ
ト血清アルブミンおよび様々なヒト血液因子およびプラ
スミノゲン活性化因子、両組織およびウロキナーゼ、Ｂ
型肝炎ウイルス・コアおよび表面抗原、ＦＭＤウイルス
抗原および他のヒト、動物およびウイルス性ポリペプチ
ドおよび蛋白質をコードする配列がある。

【００８６】safプロモーターは好ましいが、外来ポリ
ペプチドまたは蛋白質の生産性は、saf遺伝子を含む発
現ベクターで宿主細胞を形質転換することによりさらに
高められる。この発現ベクターは細胞のプラスミドＤＮ
Ａに存在し得る。すなわち、内在性プロモーターまたは
他のプロモーターがあればそれを用いて、さらに外来ポ
リペプチドまたは蛋白質の分泌を達成し得る。

【００８７】実施態様の上記内容は本発明の全般的性質
を充分に開示しているため、他の者でも、最新知識を適
用することにより、包括的概念から逸脱することなく上
記実施態様を容易に修飾および／または様々な適用形態
に適合させることができ、従って、それらの適合および
修飾も開示された具体的態様の均等内容の意味および範
囲内に包含されるものとする。ここに用いられている表
現または用語は、説明を目的とするものであって限定的
ではないものとする。

【００８８】

【表１】第１表．細菌株名称関連特性出所 S.グリセウスATCC10137 野生型ＡＴＣＣ S.グリセウスJI2212 野生型ＪＩ S.グリセウスIMRU3570 野生型ＩＭＲＵ S.リビダンスJI1326 野生型ＪＩ S.アクリマイシニJI2236 野生型ＪＩ S.コエリコロルJI2280 CysE24、PabA1、strl ＪＩ S.コエリコロルJI1157 野生型ＪＩ S.クラブリゲルスNRRL3585 野生型ＮＲＲＬ S.ラクタムドュランスNRRL3802 野生型ＮＲＲＬ S.アルブスG 野生型ＪＩ E.コリE15 phoA8 ＣＧＳＣ E.コリAW1046 PhoA、phoC、tsZ::tn5、leu、Kan^R １ E.コリH2(E.コリCGSC5259) phoB52、pho-35 ＣＧＳＣ E.コリJM103 proAB、lacZ M15 ２

【００８９】ＪＩ:ザ・ジョーン・イネス・インスティ
テュートの微生物コレクション。コレニー・レーン、ノ
ーウィッチＮＲ４ＵＨ、イギリス国。ＡＴＣＣ:アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン。ＩＭＲＵ:ワクスマンズ・インスティテュート・オブ・
マイクロバイオロジー、ルトガーズ・ユニバーシティ
ー、ニューブランスウィック、ニュージャージー、アメ
リカ合衆国。ＮＲＲＬ:ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラ
トリーズ、ペオリア、イリノイ、アメリカ合衆国。ＣＧＳＣ:エシェリヒア・コリ(Ｅ．coli)・ジェネティ
ック・ストック・センター。

【００９０】

【表２】第２表．プラスミドおよびファージ。名称関連特性出所 pIJ702 チオストレプトン耐性およびメラニン＋３ pIJ699 チオストレプトン、ビオマイシンおよびカナマイシン耐性４ pIJ61 チオストレプトンおよびネオマイシン耐性５ pIJ486 チオストレプトン耐性およびプロモーター非随伴saf遺伝子６ pULAD系列 saf遺伝子および/または近接配列をもつ本発明ストレプトマイシスおよびエシェリヒアの作業・コリ・ベクター pIJ486::216 saf遺伝子プロモーター領域をもつ本発明 pIJ486 の作業 pUC19 bla＋、lacＺpＺoＺ' ７ pIJ2921 bla＋、lacＺpＺoＺ' 第13図参照 M13 mp10およびmp11 1本鎖DNAの生成用ファージ８ pULTV1おアミラーゼ遺伝子をもつ本発明よび200 ストレプトマイシス・ベクターの作業 pULTV220 プロモーター無しのアミラーゼ遺伝子を本発明もつストレプトマイシス・ベクターの作業 pULVD10 safプロモーター随伴アミラーゼ遺伝子を本発明もつストレプトマイシス・ベクターの作業 pULNA1 pabプロモーター随伴アミラーゼ遺伝子を本発明もつストレプトマイシス・ベクターの作業 pULTV80 Km^rプロモーター随伴アミラーゼ遺伝子を本発明もつストレプトマイシス・ベクターの作業 pULTV150 lacプロモーター随伴アミラーゼ遺伝子を本発明もつストレプトマイシス・ベクターの作業

【００９１】第１表および第２表で引用された参考文
献。１．ホフマン、Ｃ.Ｓ.、およびＡ．ライト。１９８５。
分泌された蛋白質のアルカリ性ホスファターゼへの融
合: 蛋白質分泌の試験方法。「プロシーディングス・オ
ブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ・オブ・ザ・ユー・エス・エー」、８２:５１０７−５
１１１。２．メッシング、Ｊ.、Ｒ．クレアおよびＰ.Ｈ．シーバ
ーグ。１９８１。ショットガンＤＮＡ配列決定のシステ
ム。「ヌクレイック・アシッズ・リサーチ」、９:３０９
−３２１。３．キャッツ、Ｅ.、Ｃ.Ｊ.トンプソンおよびＤ.Ａ．ホ
ップウッド。１９８３。ストレプトマイシス・リビダン
スにおけるストレプトマイシス・アンティビオティクス
からのチロシナーゼ遺伝子のクローニングおよび発現。
「ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジ
ー」、１２９:２７０３−２７１４。４．キーザー、Ｔ.およびＲ.Ｅ．メルトン。１９８８。
プラスミドpＩＪ６９９、ストレプトマイシスのマルチ
コピー陽性−選択ベクター。「ジーン」、６５:８３−９
１。５．ホップウッド、Ｄ.Ａ.、Ｍ.Ｊ.、ビブ、Ｋ.Ｆ．チ
ャーター、Ｔ．キーザー、Ｃ.Ｊ．ブルトン、Ｈ.Ｍ．キ
ーザー、Ｄ.Ｊ．リディエイト、Ｃ.Ｐ.、スミス、Ｊ.
Ｍ．ワード、およびＨ．シュレンプフ。１９８５。スト
レプトマイシスの遺伝子操作。ア・ラボラトリー・マニ
ュアル。ザ・ジョーン・イネス・ファウンデーション、
ノーウィッチ、イギリス国。６．ワード、Ｊ.Ｍ.、Ｇ.Ｒ．ジャンセン、Ｔ．キーザ
ー、Ｍ.Ｊ．ビブ、Ｍ.Ｊ．ブットナーおよびＭ.Ｊ．ビ
ブ。１９８６。指標としてＴn５からのアミノグリコシ
ド・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を用いた、ストレ
プトマイシスに関する一連のマルチコピー・プロモータ
ー−プローブ・プラスミド・ベクターの構築および特性
検定。「モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ
ィックス」、２０３:４６８−４７８。７．ヤニッシュ−ペロン、Ｃ.、Ｊ．ビエイラおよび
Ｊ．メッシング。１９８５。改良されたＭ１３ファージ
・クローニング・ベクターおよび宿主株:Ｍ１３mp１８
およびpＵＣ１９ベクターのヌクレオチド配列。「ジー
ン」、３３:１０３−１１９。８．メッシング、Ｊ.。１９８３。クローニング用新規
Ｍ１３ベクター。「メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー」、１０１:２０−７８。

【００９２】相異なるプラスミドにより形質転換された
ストレプトマイシス・リビダンスの培養物の培養ブロス
(上清)における担体蛋白質(アミラーゼ)の定量。

【００９３】我々は、３つの異なる方法を使用すること
により、分泌された蛋白質の量を測定した。１．シマズ分光濃度計を用いた、銀染色したＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲルにおける蛋白質帯または同ゲルの写真ネガ
(フィルム)の分光濃度測定法。２．カラムＣ８アクアポアＲＰ−３００(２００×４.６
nm:ブラウンリー・ラブス、アメリカ合衆国)を備えたＨ
ＰＬＣを用いた異なる蛋白質の量の分析。３．分子ふるい(ゲルろ過)カラム・プロテイン・パック
３００ＳＷを備えたＨＰＬＣによる分析。

【００９４】結果ストレプトマイシス・リビダンス[pＵＬＴＶ１００]、
ストレプトマイシス・リビダンス[pＵＬＶＤ１０]およ
びストレプトマイシス・リビダンス[pＵＬＴＶ８０]の
胞子を、培地レチェバリアー＋１％澱粉に接種した。各
々３６、６０および６０時間の発酵後に最大アミラーゼ
活性が得られた。細胞外流体(上清)中の総蛋白質を、ブ
ラッドフォード法により定量化した。各ブロスの蛋白質
５μgをＳＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、銀で染色した。

【００９５】１．分光濃度測定法−ストレプトマイシス
・リビダンス[pＵＬＴＶ１００](蛋白質５μg)、ストレ
プトマイシス・リビダンス[pＵＬＶＤ１０](蛋白質５μ
g)およびストレプトマイシス・リビダンス[pＵＬＴＶ８
０](蛋白質５μg)の上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ(１０％ア
クリルアミド)における帯の分光濃度測定を実施した。２．カラム・アクアポアＲＰ−３００におけるＨＰＬＣ
−５０ミリモル酢酸−酢酸アンモニウム緩衝液およびメ
タノール勾配:０−２０分０％メタノール、３０−３５
分１００％メタノール、４５分０％メタノールにより蛋
白質を溶離した。アミラーゼは、３３−３４分で１００
％メタノールにより溶離する。結果を第３表に示す。３．プロテイン−パック３００ＳＷにおけるＨＰＬＣ−
上記と同じ構築物の培養ブロスの上清を先に透析し、凍
結乾燥により濃縮した。蛋白質は、０.５ml／分の流速
で酢酸−酢酸アンモニウム緩衝液により溶離した。アミ
ラーゼは２１−２２分で集中したピークとして溶離す
る。

【００９６】

【表３】

【配列表】 <110> Applied Research Systems ARS Holding N.V. <110> Clive Froud <120> Promoter and its Use <130> 162775 <150> US 07/354,265 <151> May 19, 1989 <150> US 07/410,706 <151> September 22, 1989 <160> 1 <210> 1 <211> 182 <212> DNA <213> Streptomyces griseus <400> 1 agatctcctc gtcccaccgg ctgtcgaagc tccgcgccta cagcgccatc gacttcgacc 60 gggcgaagta ggaagcggcc ggcgacaaaa cggggagggg cgggaaacgg tggtccgttt 120 cccgcccctg cccgtaggcc gtgcgcgtcc cgccggtgcg cggcgttcag cccgccgccg 180 ct 182

【図面の簡単な説明】

【図１】第１図は、アルカリ性ホスファターゼ過剰生
産の遺伝子決定基を有するpＩＪ７０２のＢglII部位に
おけるストレプトマイシス・グリセウスＡＴＣＣ１０１
３７クローンから得られた染色体ＤＮＡフラグメントの
制限地図である。

【図２】第２図は、pＵＬＡＤ３の１kb ＢglIIフラグ
メントおよび他種のストレプトマイシスのゲノムＤＮＡ
間における相同性のサザーン・ハイブリダイゼーション
分析である。

【図３】第３図は、pＩＪ７０２により形質転換され
たストレプトマイシス・リビダンス(左)およびpＵＬＡ
Ｄ３により形質転換されたストレプトマイシス・リビダ
ンス(右)のプロテアーゼ(Ａ)、アミラーゼ(Ｂ)およびリ
パーゼ(Ｃ)活性のペトリ皿における分析である。

【図４】第４図はsaf遺伝子発現に対する遺伝子用量
効果である。

【図５】第５図はsaf遺伝子のトリミング・ダウン状
況である。

【図６】第６図は、pＵＬＡＤ３の１kb ＢglIIフラグ
メントのヌクレオチド配列およびsaf遺伝子産物の推定
されたアミノ酸配列を示す。

【図７】第７図は、pＵＬＡＤ３の１kb ＢglIIフラグ
メントのヌクレオチド配列およびsaf遺伝子産物の推定
されたアミノ酸配列を示す。

【図８】第８図は、pＵＬＡＤ３の１kb ＢglIIフラグ
メントのヌクレオチド配列およびsaf遺伝子産物の推定
されたアミノ酸配列を示す。

【図９】第９図は、各種プラスミドとその制限部位を
示す。

【図１０】第１０図は、既知ＤＮＡ結合蛋白質におけ
るＤＮＡ結合ドメインとsaf遺伝子産物の推定されたア
ミノ酸配列からの領域との比較を示す。

【図１１】第１１図は、saf遺伝子の「上流および下
流」反復ヌクレオチド配列を示す。

【図１２】第１２図は、saf遺伝子に存在するヌクレ
オチドの反復群を示す。

【図１３】第１３図は、プラスミドpＩＪ２９２１を
示す。

【図１４】第１４図は、ストレプトマイシス・グリセ
ウスのアミラーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列およ
び推定されたアミノ酸配列を示す。

【図１５】第１５図は、ストレプトマイシス・グリセ
ウスのアミラーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列およ
び推定されたアミノ酸配列を示す。

【図１６】第１６図は、ストレプトマイシス・グリセ
ウスのアミラーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列およ
び推定されたアミノ酸配列を示す。

【図１７】第１７図は、ストレプトマイシス・グリセ
ウスのアミラーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列およ
び推定されたアミノ酸配列を示す。

【図１８】第１８図は、ストレプトマイシス・グリセ
ウスのアミラーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列およ
び推定されたアミノ酸配列を示す。

【図１９】第１９図は、ストレプトマイシス・グリセ
ウスのアミラーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列およ
び推定されたアミノ酸配列を示す。

【図２０】第２０図は、ストレプトマイシス・グリセ
ウスのアミラーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列およ
び推定されたアミノ酸配列を示す。

【図２１】第２１図は、ストレプトマイシス・グリセ
ウスのアミラーゼ遺伝子の完全なヌクレオチド配列およ
び推定されたアミノ酸配列を示す。

【図２２】第２２図は、プラスミドpＩＪ６９９を用
いたストレプトマイシス・グリセウスＩＭＲＵ３５７０
のα−アミラーゼ遺伝子のクローニングに使用される戦
略である。

【図２３】第２３図において、一連のグラフは、異な
る培地での異なるプラスミドによる皿での経時的α−ア
ミラーゼ製造を示す。

【図２４】第２４図は、ＣＲＦ分子を含む融合蛋白質
を生産する染色体遺伝子を含む組換え体ストレプトマイ
シス細胞およびＳＡＦポリペプチドをコードするＤＮＡ
を含むプラスミドの構築の概略図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 598173292 クライブ・フラウドＣｌｉｖｅＦｒｏｕｄイギリス国ロンドンダヴリューシー２ビー６ピーピー、キングスウェイ 113 番、ビーコン・ハウス、ケアオブエルキングトン・アンド・ファイフ (72)発明者アントニオ・ダザ・オルテガスペイン国、ベナカゾン（セビリア）、ケアオブサンタ・マリア・デ・ラ・ニーベ 34番 (72)発明者ホセ・アントニオ・ジルスペイン国、レオン 24008、アベデマリアノ・アンドレス 18−３’デ番 (72)発明者トーマス・ビガル・ガルシアスペイン国、レオン 24002、ケアオブアルバロ・ロペズ・ヌネズ 10−４’番 (72)発明者ジュアン・フランシスコ・マルティンスペイン国、レオン 24004、アベデファクルダァッド・デ・ヴェテリナリア13− ４’番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プラスミドpＵＬＡＤ３。
【請求項２】配列番号１のＤＮＡ配列を有するプロモ
ーター。
【請求項３】請求項２記載のプロモーターと機能し得
るように結合したポリペプチドまたは蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列を含むクローニング・ビヒクル。
【請求項４】ＤＮＡ配列が、ストレプトマイシスにと
って内在性の配列である、請求項３記載のクローニング
・ビヒクル。
【請求項５】ＤＮＡ配列が、非ストレプトマイシス・
ポリペプチドまたは蛋白質をコードするＤＮＡ配列と同
じ解読枠内で融合したストレプトマイシスにとって内在
性のポリペプチドまたは蛋白質をコードする配列の全部
または一部分を含む、請求項３記載のクローニング・ビ
ヒクル。
【請求項６】請求項３記載のクローニング・ビヒクル
により形質転換されたストレプトマイシス宿主細胞。
【請求項７】請求項４記載のクローニング・ビヒクル
により形質転換されたストレプトマイシス宿主細胞。
【請求項８】請求項５記載のクローニング・ビヒクル
により形質転換されたストレプトマイシス宿主細胞。
【請求項９】ストレプトマイシスにおいて外来ＤＮＡ
配列を発現させる方法であって、外来ＤＮＡ配列を請求
項２記載のプロモーターを含むストレプトマイシス発現
制御配列と機能し得るように結合させることを含む方
法。
【請求項１０】外来ＤＮＡ配列およびストレプトマイ
シス発現制御配列を、ストレプトマイシスの染色体ＤＮ
Ａに挿入する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】外来ＤＮＡ配列が、ストレプトマイシ
スから分泌される蛋白質またはポリペプチドのシグナル
配列の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ配列を介し
てストレプトマイシス発現制御配列と機能し得るように
結合されており、シグナル配列をコードするＤＮＡ配列
が、ストレプトマイシス発現制御配列の制御下で外来Ｄ
ＮＡ配列と一緒に発現されることにより、外来ＤＮＡ配
列によりコードされる蛋白質またはポリペプチドが分泌
され得る、請求項９記載の方法。