JPH11235194A - リボフラビン・グルコシドを製造する方法 - Google Patents
リボフラビン・グルコシドを製造する方法Info
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- JPH11235194A JPH11235194A JP10343843A JP34384398A JPH11235194A JP H11235194 A JPH11235194 A JP H11235194A JP 10343843 A JP10343843 A JP 10343843A JP 34384398 A JP34384398 A JP 34384398A JP H11235194 A JPH11235194 A JP H11235194A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 醗酵により、デンプンからリボフラビン・グ
ルコシドを製造する方法の提供。 【解決手段】 リボフラビン・グルコシドを産生するこ
とができるバチルス（Bacillus）属に属する微生物を、
好気的条件下で、デンプンを含有する水性培地中で培養
することを特徴とする、リボフラビン・グルコシドを製
造する方法。
ルコシドを製造する方法の提供。 【解決手段】 リボフラビン・グルコシドを産生するこ
とができるバチルス（Bacillus）属に属する微生物を、
好気的条件下で、デンプンを含有する水性培地中で培養
することを特徴とする、リボフラビン・グルコシドを製
造する方法。
Description
【０００１】本発明は、リボフラビン・グルコシドを産
生することができるバチルス（Bacillus）属に属する微
生物を、好気的条件下で、デンプンを含有する水性培地
中で培養することを特徴とする、リボフラビン・グルコ
シドを製造する方法に関する。
生することができるバチルス（Bacillus）属に属する微
生物を、好気的条件下で、デンプンを含有する水性培地
中で培養することを特徴とする、リボフラビン・グルコ
シドを製造する方法に関する。
【０００２】また、本発明は、微生物が、バチルス・ブ
レビス（Bacillus brevis）種、バチルス・セレウス（B
acillus cereus）種、バチルス・サーキュランス（Baci
llus circulans）種、バチルス・コアギュランス（Baci
llus coagulans）種、バチルス・リケニフォルミス（Ba
cillus licheniformis）種、バチルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）種、バチルス・プミルス（Bac
illus pumilus）種またはバチルス・ズブチリス（Bacil
lus subutilis）種に属するものである、前記方法に関
する。
レビス（Bacillus brevis）種、バチルス・セレウス（B
acillus cereus）種、バチルス・サーキュランス（Baci
llus circulans）種、バチルス・コアギュランス（Baci
llus coagulans）種、バチルス・リケニフォルミス（Ba
cillus licheniformis）種、バチルス・メガテリウム
（Bacillus megaterium）種、バチルス・プミルス（Bac
illus pumilus）種またはバチルス・ズブチリス（Bacil
lus subutilis）種に属するものである、前記方法に関
する。
【０００３】更に、本発明は、微生物が、バチルス・ブ
レビス（Bacillus brevis）ＩＦＯ１５３０４、バチル
ス・セレウス（Bacillus cereus）ＩＦＯ１５３０５、
バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）ＩＦ
Ｏ１３６２６、バチルス・コアギュランス（Bacillus c
oagulans）ＩＦＯ１２５８３、バチルス・リケニフォル
ミス（Bacillus licheniformis）ＩＦＯ１２２００、バ
チルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＦＯ
１５３０８、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）
ＩＦＯ１２０９２またはバチルス・ズブチリス（Bacill
us subutilis）ＩＦＯ１３７１９である、前記方法に関
する。
レビス（Bacillus brevis）ＩＦＯ１５３０４、バチル
ス・セレウス（Bacillus cereus）ＩＦＯ１５３０５、
バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）ＩＦ
Ｏ１３６２６、バチルス・コアギュランス（Bacillus c
oagulans）ＩＦＯ１２５８３、バチルス・リケニフォル
ミス（Bacillus licheniformis）ＩＦＯ１２２００、バ
チルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）ＩＦＯ
１５３０８、バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）
ＩＦＯ１２０９２またはバチルス・ズブチリス（Bacill
us subutilis）ＩＦＯ１３７１９である、前記方法に関
する。
【０００４】また、本発明は、微生物が、バチルス・ズ
ブチリス（Bacillus subutilis）ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ
６９〕６０Ａｄｅ＋またはバチルス・ズブチリス（Baci
llussubutilis）ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０〔ｐ
ＲＦ９３〕１２０Ａｄｅ＋である、前記方法に関する。
ブチリス（Bacillus subutilis）ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ
６９〕６０Ａｄｅ＋またはバチルス・ズブチリス（Baci
llussubutilis）ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０〔ｐ
ＲＦ９３〕１２０Ａｄｅ＋である、前記方法に関する。
【０００５】更に、本発明は、培地中のデンプンの初期
濃度が約２５g/l〜約４００g/l、好ましくは約２００g/
l〜約３００g/lである、前記方法に関する。
濃度が約２５g/l〜約４００g/l、好ましくは約２００g/
l〜約３００g/lである、前記方法に関する。
【０００６】また、本発明は、培養が約４．０〜約９．
０、好ましくは約４．５〜約８．０のpHで行われる、前
記方法に関する。
０、好ましくは約４．５〜約８．０のpHで行われる、前
記方法に関する。
【０００７】更に、本発明は、培養が約２０〜約４５
℃、好ましくは２５〜４０℃の温度で行われる、前記方
法に関する。
℃、好ましくは２５〜４０℃の温度で行われる、前記方
法に関する。
【０００８】本発明は、醗酵により、デンプンからリボ
フラビン・グルコシドを製造する方法に関する。本明細
書において使用される「リボフラビン・グルコシド」と
いう用語は、リボフラビン１分子当たり１個以上のグル
コース残基を有することを特徴とするリボフラビン・グ
ルコシド類を包含する。
フラビン・グルコシドを製造する方法に関する。本明細
書において使用される「リボフラビン・グルコシド」と
いう用語は、リボフラビン１分子当たり１個以上のグル
コース残基を有することを特徴とするリボフラビン・グ
ルコシド類を包含する。
【０００９】リボフラビン・グルコシドは、尿中に見出
されるリボフラビンの代謝産物の一つとして知られてい
る。それは、リボフラビンよりも水溶性が高い。２０℃
および３７℃におけるリボフラビン・グルコシドの溶解
度は、それぞれ、２．２および３．５mg/mlである。そ
れに対し、これらの温度におけるリボフラビンの溶解度
は、０．１および０．２mg/mlである〔Methods in Enzy
mology, Academic Press, 18B, 404-417 (1971) を参照
のこと〕。
されるリボフラビンの代謝産物の一つとして知られてい
る。それは、リボフラビンよりも水溶性が高い。２０℃
および３７℃におけるリボフラビン・グルコシドの溶解
度は、それぞれ、２．２および３．５mg/mlである。そ
れに対し、これらの温度におけるリボフラビンの溶解度
は、０．１および０．２mg/mlである〔Methods in Enzy
mology, Academic Press, 18B, 404-417 (1971) を参照
のこと〕。
【００１０】リボフラビン自体は、着色および／または
栄養摂取のための飲料添加物として広く使用されている
が、水溶性が低いためにその飲料は濁ったものとなる。
静脈内点滴用のリボフラビン含有溶液も、濁って、点滴
チューブに目詰まりを起こしやすい。このような溶解性
の問題を解決するため、より溶解度の高いリボフラビン
・グルコシドを、リボフラビンの代わりに使用すれば、
透明な飲料および（注射用）溶液を調製することができ
る。
栄養摂取のための飲料添加物として広く使用されている
が、水溶性が低いためにその飲料は濁ったものとなる。
静脈内点滴用のリボフラビン含有溶液も、濁って、点滴
チューブに目詰まりを起こしやすい。このような溶解性
の問題を解決するため、より溶解度の高いリボフラビン
・グルコシドを、リボフラビンの代わりに使用すれば、
透明な飲料および（注射用）溶液を調製することができ
る。
【００１１】リボフラビン・グルコシドは、ウィットビ
ー（Whitby）により、ラット肝臓のアセトン乾燥粉末を
用いて最初に得られた〔Biochem. J. 50, 433 (195
2)〕。トランスグルコシダーゼと、マルトース、デキス
トリン、デンプン、グリコーゲン、およびサリシンのよ
うなグルコシル・ドナーとを含む溶液中でリボフラビン
をインキュベートすると、リボフラビンのグルコシル化
が起こる。トランスグルコシダーゼは、動物臓器、微生
物、および植物、例えばラット肝臓、アスペルギルス・
オリゼ（Aspergillus oryzae）、大腸菌（Escherichia
coli）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leucon
ostoc mesenteroides）、ならびにカボチャ、キュキュ
ルビタ・ペポ（Cucurbita pepo）およびテンサイの子
葉、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）などに広く
分布していることが報告されている。しかし、これらの
酵素反応法またはリボフラビンおよびグルコシル・ドナ
ーを含む培地における醗酵によるリボフラビン・グルコ
シドの生産性はかなり低く、しかもその精製操作は実用
上あまりにも複雑である〔J. Vitaminology 6, 139-144
(1960) およびMethods in Enzymology 18B, 404-417
(1971) を参照のこと〕。
ー（Whitby）により、ラット肝臓のアセトン乾燥粉末を
用いて最初に得られた〔Biochem. J. 50, 433 (195
2)〕。トランスグルコシダーゼと、マルトース、デキス
トリン、デンプン、グリコーゲン、およびサリシンのよ
うなグルコシル・ドナーとを含む溶液中でリボフラビン
をインキュベートすると、リボフラビンのグルコシル化
が起こる。トランスグルコシダーゼは、動物臓器、微生
物、および植物、例えばラット肝臓、アスペルギルス・
オリゼ（Aspergillus oryzae）、大腸菌（Escherichia
coli）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leucon
ostoc mesenteroides）、ならびにカボチャ、キュキュ
ルビタ・ペポ（Cucurbita pepo）およびテンサイの子
葉、ベータ・ブルガリス（Beta vulgaris）などに広く
分布していることが報告されている。しかし、これらの
酵素反応法またはリボフラビンおよびグルコシル・ドナ
ーを含む培地における醗酵によるリボフラビン・グルコ
シドの生産性はかなり低く、しかもその精製操作は実用
上あまりにも複雑である〔J. Vitaminology 6, 139-144
(1960) およびMethods in Enzymology 18B, 404-417
(1971) を参照のこと〕。
【００１２】本発明の方法によれば、デンプンを含む培
地中でリボフラビン・グルコシド産生微生物を培養する
ことにより、リボフラビン・グルコシドを、はるかに高
い収率で、しかもリボフラビンの添加なしに製造するこ
とができる。該方法は、リボフラビン・グルコシドを産
生することができるバチルス（Bacillus）属に属する微
生物を、好気的条件下で、デンプンを含有する水性培地
中で培養することを特徴とする。
地中でリボフラビン・グルコシド産生微生物を培養する
ことにより、リボフラビン・グルコシドを、はるかに高
い収率で、しかもリボフラビンの添加なしに製造するこ
とができる。該方法は、リボフラビン・グルコシドを産
生することができるバチルス（Bacillus）属に属する微
生物を、好気的条件下で、デンプンを含有する水性培地
中で培養することを特徴とする。
【００１３】本発明において使用できる微生物には、ア
ミラーゼ活性を有するバチルス（Bacillus）属に属する
全ての株、例えばバチルス・ブレビス（Bacillus brevi
s）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチル
ス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス
・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・
リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチル
ス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス
・プミルス（Bacillus pumilus）およびバチルス・ズブ
チリス（Bacillus subutilis）、ならびにリボフラビン
を産生できるそれらの組換え体が含まれる。
ミラーゼ活性を有するバチルス（Bacillus）属に属する
全ての株、例えばバチルス・ブレビス（Bacillus brevi
s）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチル
ス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス
・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・
リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチル
ス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス
・プミルス（Bacillus pumilus）およびバチルス・ズブ
チリス（Bacillus subutilis）、ならびにリボフラビン
を産生できるそれらの組換え体が含まれる。
【００１４】これらの微生物株のいくつかは、財団法人
醗酵研究所（ＩＦＯ）（日本、大阪）に寄託されてい
る。これらは、バチルス・ブレビス（Bacillus brevi
s）ＩＦＯ１５３０４、バチルス・セレウス（Bacillus
cereus）ＩＦＯ１５３０５、バチルス・サーキュランス
（Bacillus circulans）ＩＦＯ１３６２６、バチルス・
コアギュランス（Bacillus coagulans）ＩＦＯ１２５８
３、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus lichenifo
rmis）ＩＦＯ１２２００、バチルス・メガテリウム（Ba
cillus megaterium）ＩＦＯ１５３０８、バチルス・プ
ミルス（Bacilluspumilus）ＩＦＯ１２０９２およびバ
チルス・ズブチリス（Bacillus subutilis）ＩＦＯ１３
７１９という名称で寄託されており、ＩＦＯの菌株リス
ト（List of Cultures），微生物（Microorganisms）,
第１０版, １９９６に挙げられている。このように、本
発明の微生物試料は、ＩＦＯから公的に入手可能であ
る。
醗酵研究所（ＩＦＯ）（日本、大阪）に寄託されてい
る。これらは、バチルス・ブレビス（Bacillus brevi
s）ＩＦＯ１５３０４、バチルス・セレウス（Bacillus
cereus）ＩＦＯ１５３０５、バチルス・サーキュランス
（Bacillus circulans）ＩＦＯ１３６２６、バチルス・
コアギュランス（Bacillus coagulans）ＩＦＯ１２５８
３、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus lichenifo
rmis）ＩＦＯ１２２００、バチルス・メガテリウム（Ba
cillus megaterium）ＩＦＯ１５３０８、バチルス・プ
ミルス（Bacilluspumilus）ＩＦＯ１２０９２およびバ
チルス・ズブチリス（Bacillus subutilis）ＩＦＯ１３
７１９という名称で寄託されており、ＩＦＯの菌株リス
ト（List of Cultures），微生物（Microorganisms）,
第１０版, １９９６に挙げられている。このように、本
発明の微生物試料は、ＩＦＯから公的に入手可能であ
る。
【００１５】本発明において最も好ましく使用される株
の例は、バチルス・ズブチリス（Bacillus subutilis）
ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０：：〔ｐＲＦ９３〕１
２０Ａｄｅ＋、バチルス・ズブチリス（Bacillus subut
ilis）ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０Ａｄｅ＋などで
ある〔欧州特許公開（ＥＰ）４０５３７０Ａ１および８
２１０６３Ａ２〕。宿主株、ＲＢ５０は、ロセオフラビ
ン（roseoflavin）耐性の非制御（deregulated）バチル
ス・ズブチリス株である。プラスミドｐＲＦ６９は、ｒ
ｉｂオペロンと同方向にＳＰＯ１−１５プロモーターお
よびｃａｔ遺伝子を含む。宿主微生物およびプラスミド
ｐＲＦ６９の詳細は、ＥＰ４０５３７０Ａ１に記載され
ている。該宿主微生物ＲＢ５０およびプラスミドｐＲＦ
６９は、ブタペスト条約の下、それぞれ、以下のような
寄託番号および日付で、アグリカルチュラル・リサーチ
・カルチャー・コレクション（Agricultural ResearchC
ulture Collection）（ＮＲＲＬ）（Peoria, Illinoi
s）およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）（ＡＴＣ
Ｃ）（Rockville, Maryland）に寄託されている。 バチルス・ズブチリスＲＢ５０：（ＮＲＲＬ）Ｂ−１８
５０２（最初は１９８９年５月２３日、１９８９年８月
２４日に再寄託） ｐＲＦ６９：ＡＴＣＣ６８３３８（１９９０月６月６
日） 前者の寄託は、S. L. Misrock（1155 Avenue of the Am
ericas, New York, NY10036, USAのPennie & Edmonds気
付）によりなされた。この寄託に関する責任が転々とし
た結果、現在の有効な寄託者はHoffman-La Roche Inc.
（340 Kingsland Street, Nutley, New Jersey 07110）
である。後者の寄託は、BioTechnica International, I
nc.（85 Bolton Street, Cambridge, Massachusetts 02
140, USA）によりなされた（これに関する現在の寄託者
はOmniGene Bioproducts, Inc.（763-D Concord Avenu
e, Cambridge, Massachusetts 02138）である）。
の例は、バチルス・ズブチリス（Bacillus subutilis）
ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０：：〔ｐＲＦ９３〕１
２０Ａｄｅ＋、バチルス・ズブチリス（Bacillus subut
ilis）ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０Ａｄｅ＋などで
ある〔欧州特許公開（ＥＰ）４０５３７０Ａ１および８
２１０６３Ａ２〕。宿主株、ＲＢ５０は、ロセオフラビ
ン（roseoflavin）耐性の非制御（deregulated）バチル
ス・ズブチリス株である。プラスミドｐＲＦ６９は、ｒ
ｉｂオペロンと同方向にＳＰＯ１−１５プロモーターお
よびｃａｔ遺伝子を含む。宿主微生物およびプラスミド
ｐＲＦ６９の詳細は、ＥＰ４０５３７０Ａ１に記載され
ている。該宿主微生物ＲＢ５０およびプラスミドｐＲＦ
６９は、ブタペスト条約の下、それぞれ、以下のような
寄託番号および日付で、アグリカルチュラル・リサーチ
・カルチャー・コレクション（Agricultural ResearchC
ulture Collection）（ＮＲＲＬ）（Peoria, Illinoi
s）およびアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（American Type Culture Collection）（ＡＴＣ
Ｃ）（Rockville, Maryland）に寄託されている。 バチルス・ズブチリスＲＢ５０：（ＮＲＲＬ）Ｂ−１８
５０２（最初は１９８９年５月２３日、１９８９年８月
２４日に再寄託） ｐＲＦ６９：ＡＴＣＣ６８３３８（１９９０月６月６
日） 前者の寄託は、S. L. Misrock（1155 Avenue of the Am
ericas, New York, NY10036, USAのPennie & Edmonds気
付）によりなされた。この寄託に関する責任が転々とし
た結果、現在の有効な寄託者はHoffman-La Roche Inc.
（340 Kingsland Street, Nutley, New Jersey 07110）
である。後者の寄託は、BioTechnica International, I
nc.（85 Bolton Street, Cambridge, Massachusetts 02
140, USA）によりなされた（これに関する現在の寄託者
はOmniGene Bioproducts, Inc.（763-D Concord Avenu
e, Cambridge, Massachusetts 02138）である）。
【００１６】ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０Ａｄｅ＋
は、ｐＲＦ６９をＲＢ５０のｒｉｂ部位に導入した後、
高まるレベルのクロラムフェニコールの存在下で成育す
るコロニーを選択することにより遺伝子を増幅すること
により調製される。プラスミドｐＲＦ９３は、テトラサ
イクリン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子
と交換することにより（ＥＰ４０５３７０Ａ１の実施例
８、第二部位組み込みを参照のこと）、ｐＲＦ８９（Ｅ
Ｐ４０５３７０Ａ１の図１４を参照のこと）から誘導さ
れる。ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０：：〔ｐＲＦ９
３〕１２０Ａｄｅ＋は、染色体のｂｐｒ部位に第二のプ
ラスミドｐＲＦ９３を組み込むことにより得られる（Ｅ
Ｐ８２１０６３Ａ２）。染色体部位に改変ｒｉｂオペロ
ンを有する組換え株が、薬物耐性により増幅される。
は、ｐＲＦ６９をＲＢ５０のｒｉｂ部位に導入した後、
高まるレベルのクロラムフェニコールの存在下で成育す
るコロニーを選択することにより遺伝子を増幅すること
により調製される。プラスミドｐＲＦ９３は、テトラサ
イクリン耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子
と交換することにより（ＥＰ４０５３７０Ａ１の実施例
８、第二部位組み込みを参照のこと）、ｐＲＦ８９（Ｅ
Ｐ４０５３７０Ａ１の図１４を参照のこと）から誘導さ
れる。ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０：：〔ｐＲＦ９
３〕１２０Ａｄｅ＋は、染色体のｂｐｒ部位に第二のプ
ラスミドｐＲＦ９３を組み込むことにより得られる（Ｅ
Ｐ８２１０６３Ａ２）。染色体部位に改変ｒｉｂオペロ
ンを有する組換え株が、薬物耐性により増幅される。
【００１７】バチルス・ズブチリス（Bacillus subutil
is）ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０：：〔ｐＲＦ９
３〕１２０Ａｄｅ＋は、最適化された通気撹拌形（jar
fermentation）培養条件で、１４．０g/lを超えるリボ
フラビンを産生できることが知られている（ＥＰ８２１
０６３Ａ２）。プラスミドｐＲＦ９３の調製も、該欧州
特許公開公報に記載されている。
is）ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０：：〔ｐＲＦ９
３〕１２０Ａｄｅ＋は、最適化された通気撹拌形（jar
fermentation）培養条件で、１４．０g/lを超えるリボ
フラビンを産生できることが知られている（ＥＰ８２１
０６３Ａ２）。プラスミドｐＲＦ９３の調製も、該欧州
特許公開公報に記載されている。
【００１８】本発明の好ましい実施態様において、リボ
フラビン・グルコシドの製造は、デンプン、特に可溶性
デンプンおよび／または一種以上のその他のデンプン類
を含有し、適当な栄養物が添加された水性培地中、好気
的条件下、前記の微生物株を培養することにより行われ
る。該培地は、可溶性デンプンおよび／または一種以上
のその他のデンプン類を、約２５g/l〜約４００g/l、好
ましくは約２００g/l〜約３００g/lの（総）濃度で含
む。微生物の接種量は、一般的に、約１％〜約３０％、
好ましくは約５％〜約２０％である。
フラビン・グルコシドの製造は、デンプン、特に可溶性
デンプンおよび／または一種以上のその他のデンプン類
を含有し、適当な栄養物が添加された水性培地中、好気
的条件下、前記の微生物株を培養することにより行われ
る。該培地は、可溶性デンプンおよび／または一種以上
のその他のデンプン類を、約２５g/l〜約４００g/l、好
ましくは約２００g/l〜約３００g/lの（総）濃度で含
む。微生物の接種量は、一般的に、約１％〜約３０％、
好ましくは約５％〜約２０％である。
【００１９】培地に含まれるデンプンとしては、可溶性
デンプン、ジャガイモ・デンプン、トウモロコシ・デン
プン、および小麦デンプンなど、原則的にいかなる種類
のデンプンを使用することもできる。通常、培地は栄養
物も含んでいることが必要である。これらは、分解性窒
素源、例えばペプトン、酵母抽出物、大豆ミール、コー
ン・スティープ・リカー、綿実廃物、乾燥酵母、および
肉抽出物などの有機物質；例えば硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸カリウム、
およびリン酸カリウムなどの無機物質；ビタミン；金
属；アミノ酸；稀少元素；ならびに、必要であれば、例
えばＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノー
ス、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、ショ糖、糖
蜜、デンプン加水分解物、酢酸、およびエタノールなど
の同化性炭素源である。
デンプン、ジャガイモ・デンプン、トウモロコシ・デン
プン、および小麦デンプンなど、原則的にいかなる種類
のデンプンを使用することもできる。通常、培地は栄養
物も含んでいることが必要である。これらは、分解性窒
素源、例えばペプトン、酵母抽出物、大豆ミール、コー
ン・スティープ・リカー、綿実廃物、乾燥酵母、および
肉抽出物などの有機物質；例えば硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸カリウム、
およびリン酸カリウムなどの無機物質；ビタミン；金
属；アミノ酸；稀少元素；ならびに、必要であれば、例
えばＤ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノー
ス、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、ショ糖、糖
蜜、デンプン加水分解物、酢酸、およびエタノールなど
の同化性炭素源である。
【００２０】培養は、好都合には、約４．０〜約９．０
のpHで行われ、好ましくは約４．５〜約８．０のpHで行
われる。培養時間は、使用される特定の微生物および栄
養培地により異なるが、一般的には約１０〜約１５０時
間である。培養を行うための温度範囲は、好都合には、
約２０〜約４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。
のpHで行われ、好ましくは約４．５〜約８．０のpHで行
われる。培養時間は、使用される特定の微生物および栄
養培地により異なるが、一般的には約１０〜約１５０時
間である。培養を行うための温度範囲は、好都合には、
約２０〜約４５℃、好ましくは２５〜４０℃である。
【００２１】このようにして蓄積したリボフラビン・グ
ルコシドは、リボフラビン１分子当たり１個以上のグル
コース残基を有するリボフラビン・グルコシドの混合物
からなる。必要ならば、このようにして製造されたリボ
フラビン・グルコシドを、容易にリボフラビン・モノグ
ルコシドへと濃縮することができ、そして例えば以下の
ようにしてこれを回収することができる。まず、リボフ
ラビンおよびリボフラビン・グルコシドを含む培養ブロ
スを、濾過または遠心分離して細胞を除去する。次に、
分離された濾過物をグルコアミラーゼで処理することに
より、リボフラビン・モノグルコシドへと濃縮する。１
mgのリボフラビン・グルコシド当たり約１ユニットのグ
ルコアミラーゼが、通常、この目的に充分である（１ユ
ニットは、pH４．５および５５℃で３分間にデンプンか
ら１．０mgのグルコースを生成する）。使用される酵素
の量は、インキュベーションの温度、時間、およびその
他の反応条件、例えばpHにより異なる。酵素濃度および
／または温度が低い場合には、長いインキュベーション
時間が必要となる。３７℃における２〜３日のインキュ
ベーションが試みられ、良好な結果を示した。これらの
データを考慮すると、０．００１〜１００ユニット/m
g、２５〜７０℃、１分間〜１００時間、好ましくは
０．１〜１０ユニット/mg、３０〜６０℃、３分間〜７
０時間が好適に使用できる。必要に応じて、さらなる精
製のため、処理された溶液を吸着樹脂に適用してもよ
い。リボフラビン・モノグルコシド自体を得るか否かに
関わらず、醗酵中に蓄積したリボフラビン・グルコシド
は、各成分を分離するための標準的な方法、好ましくは
吸着樹脂およびゲル濾過樹脂を用いた方法により、醗酵
培地から単離することができる。
ルコシドは、リボフラビン１分子当たり１個以上のグル
コース残基を有するリボフラビン・グルコシドの混合物
からなる。必要ならば、このようにして製造されたリボ
フラビン・グルコシドを、容易にリボフラビン・モノグ
ルコシドへと濃縮することができ、そして例えば以下の
ようにしてこれを回収することができる。まず、リボフ
ラビンおよびリボフラビン・グルコシドを含む培養ブロ
スを、濾過または遠心分離して細胞を除去する。次に、
分離された濾過物をグルコアミラーゼで処理することに
より、リボフラビン・モノグルコシドへと濃縮する。１
mgのリボフラビン・グルコシド当たり約１ユニットのグ
ルコアミラーゼが、通常、この目的に充分である（１ユ
ニットは、pH４．５および５５℃で３分間にデンプンか
ら１．０mgのグルコースを生成する）。使用される酵素
の量は、インキュベーションの温度、時間、およびその
他の反応条件、例えばpHにより異なる。酵素濃度および
／または温度が低い場合には、長いインキュベーション
時間が必要となる。３７℃における２〜３日のインキュ
ベーションが試みられ、良好な結果を示した。これらの
データを考慮すると、０．００１〜１００ユニット/m
g、２５〜７０℃、１分間〜１００時間、好ましくは
０．１〜１０ユニット/mg、３０〜６０℃、３分間〜７
０時間が好適に使用できる。必要に応じて、さらなる精
製のため、処理された溶液を吸着樹脂に適用してもよ
い。リボフラビン・モノグルコシド自体を得るか否かに
関わらず、醗酵中に蓄積したリボフラビン・グルコシド
は、各成分を分離するための標準的な方法、好ましくは
吸着樹脂およびゲル濾過樹脂を用いた方法により、醗酵
培地から単離することができる。
【００２２】一般的な用語で本発明を記載してきたが、
以下に本発明をより詳細に例示するために図面および実
施例を記載する。これらは決して本発明を限定するもの
ではない。
以下に本発明をより詳細に例示するために図面および実
施例を記載する。これらは決して本発明を限定するもの
ではない。
【００２３】実施例１ ６０μl/mlのクロラムフェニコールおよび１２０μg/ml
のテトラサイクリンを含むトリプトース・ブラッド・ア
ガー・ベース（Tryptose Blood Agar Base）（TBAB, DI
FCO Laboratories, Detroit, USA）培地の寒天プレート
上で培養されたバチルス・ズブチリス（Bacillus subut
ilis）ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０：：〔ｐＲＦ９
３〕１２０Ａｄｅ＋を、１白金耳（loopful）の試験管
に含まれた８mlの種培地に接種した。
のテトラサイクリンを含むトリプトース・ブラッド・ア
ガー・ベース（Tryptose Blood Agar Base）（TBAB, DI
FCO Laboratories, Detroit, USA）培地の寒天プレート
上で培養されたバチルス・ズブチリス（Bacillus subut
ilis）ＲＢ５０：：〔ｐＲＦ６９〕６０：：〔ｐＲＦ９
３〕１２０Ａｄｅ＋を、１白金耳（loopful）の試験管
に含まれた８mlの種培地に接種した。
【００２４】試験管振とう器を用いて、試験管の内容物
を３７℃で２．７５時間インキュベートした。このよう
にして調製された種培養物（４ml）を、ヘソ付５００ml
のエルレンマイヤー（Erlenmeyer）フラスコに接種した
後、４０mlまでに調製された生産培地へと接種した。種
培養物および生産培地の組成は以下のとおりであった。 種培養物 生産培地 酵母抽出物 ２０．０g/l ２０．０g/l ＫＨ2ＰＯ4 ７．５ ７．５ グルタミン酸ナトリウム ５．０ ５．０ （ＮＨ4)2ＳＯ4 ５．０ ５．０ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １．５ １．５ ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ ０．０５ ０．０５ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １．０ １．０ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ ０．０２５ ０．０２５ 滅菌前にpH６．７に調整 グルコース １３．３g/l − マルトース ２６．７ − 可溶性デンプン − ２００g/l （硫酸マグネシウムの水和の程度は様々であるため、ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏのｎは 、４〜６までの整数を表す。）
を３７℃で２．７５時間インキュベートした。このよう
にして調製された種培養物（４ml）を、ヘソ付５００ml
のエルレンマイヤー（Erlenmeyer）フラスコに接種した
後、４０mlまでに調製された生産培地へと接種した。種
培養物および生産培地の組成は以下のとおりであった。 種培養物 生産培地 酵母抽出物 ２０．０g/l ２０．０g/l ＫＨ2ＰＯ4 ７．５ ７．５ グルタミン酸ナトリウム ５．０ ５．０ （ＮＨ4)2ＳＯ4 ５．０ ５．０ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ １．５ １．５ ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏ ０．０５ ０．０５ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ １．０ １．０ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ ０．０２５ ０．０２５ 滅菌前にpH６．７に調整 グルコース １３．３g/l − マルトース ２６．７ − 可溶性デンプン − ２００g/l （硫酸マグネシウムの水和の程度は様々であるため、ＭｎＳＯ4・ｎＨ2Ｏのｎは 、４〜６までの整数を表す。）
【００２５】生産培地を、３７℃、２４０rpmで３日間
インキュベートした。薄層クロマトグラフィーによりリ
ボフラビン関連化合物の産生レベルについてブロスを分
析した。１μlのブロスをシリカゲル・プレート（Kiese
lgel 60F254, MERCK, Darmstadt, Germany）にスポット
し、５：４：１の容量比のアセトン、ｎ−ブタノールお
よび水からなる溶媒系により展開させた。リボフラビン
以外に、全て黄色の、少なくとも３つの化合物が検出さ
れ、成分Ａ、ＢおよびＣと名付けられた。成分Ａ、Ｂ、
Ｃ、およびリボフラビンのＲｆ値は、それぞれ、０．２
７、０．１５、０（展開後もスポット部位に残留）およ
び０．４１であった。したがって、成分Ａが優勢であっ
た。フラビン・モノヌクレオチドまたはフラビン・アデ
ニン・ジヌクレオチドと直接的に比較すると、いずれの
成分もこれらのヌクレオチドとは一致しないことが示さ
れた。
インキュベートした。薄層クロマトグラフィーによりリ
ボフラビン関連化合物の産生レベルについてブロスを分
析した。１μlのブロスをシリカゲル・プレート（Kiese
lgel 60F254, MERCK, Darmstadt, Germany）にスポット
し、５：４：１の容量比のアセトン、ｎ−ブタノールお
よび水からなる溶媒系により展開させた。リボフラビン
以外に、全て黄色の、少なくとも３つの化合物が検出さ
れ、成分Ａ、ＢおよびＣと名付けられた。成分Ａ、Ｂ、
Ｃ、およびリボフラビンのＲｆ値は、それぞれ、０．２
７、０．１５、０（展開後もスポット部位に残留）およ
び０．４１であった。したがって、成分Ａが優勢であっ
た。フラビン・モノヌクレオチドまたはフラビン・アデ
ニン・ジヌクレオチドと直接的に比較すると、いずれの
成分もこれらのヌクレオチドとは一致しないことが示さ
れた。
【００２６】培養ブロスのＨＰＬＣ分析を、図１に記載
された条件下で行った。成分Ａの保持時間は８．６分で
あったが、リボフラビンは９．６分であった。成分Ａ、
ＢおよびＣの紫外−可視吸収スペクトルは、リボフラビ
ンとよく一致していた。
された条件下で行った。成分Ａの保持時間は８．６分で
あったが、リボフラビンは９．６分であった。成分Ａ、
ＢおよびＣの紫外−可視吸収スペクトルは、リボフラビ
ンとよく一致していた。
【００２７】４４４nmにおける紫外吸収により測定され
た成分Ａ、ＢおよびＣの全生産性は、リボフラビンに基
づき３．５１g/lであった。
た成分Ａ、ＢおよびＣの全生産性は、リボフラビンに基
づき３．５１g/lであった。
【００２８】実施例２ 実施例１と同様にして得られた培養ブロスを、５５℃で
２．５時間、酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）中で、
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のグル
コアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）（Sigma Chemical
Co., Missouri, USA）で処理した。薄層クロマトグラ
フィー分析により、培養ブロス中の成分Ａ、ＢおよびＣ
が成分Ａに集中するのが観察された。さらに、標品グル
コースと同一のスポットが検出された。したがって、こ
の処理により成分ＢおよびＣからグルコースが放出され
た。その溶液を吸着樹脂、アンバーライト（Amberlit
e）（登録商標）ＸＡＤ−７（Rohm and Haas Co., Phil
adelphia, USA）を充填したカラムにかけた。成分Ａお
よびリボフラビンはいずれも樹脂に吸着され（グルコー
スは吸着されない）、水で洗浄後、１：１水性アセトン
溶液で溶出された。アセトンを蒸発させて濃縮した後、
溶出液を凍結乾燥させた。得られた粉末を少量の水酸化
ナトリウム溶液に溶解し、ゲル濾過樹脂、トーヨーパー
ル（Toyopearl）ＨＷ−４０Ｆ（TOYO SODA Mfg. Co. Lt
d., Tokyo, Japan）を充填したカラムにかけ、成分Ａと
リボフラビンを分離した。溶出した成分Ａ画分を凍結乾
燥させた。このようにして得られた粉末の純度は９７％
であった。
２．５時間、酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．５）中で、
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）のグル
コアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）（Sigma Chemical
Co., Missouri, USA）で処理した。薄層クロマトグラ
フィー分析により、培養ブロス中の成分Ａ、ＢおよびＣ
が成分Ａに集中するのが観察された。さらに、標品グル
コースと同一のスポットが検出された。したがって、こ
の処理により成分ＢおよびＣからグルコースが放出され
た。その溶液を吸着樹脂、アンバーライト（Amberlit
e）（登録商標）ＸＡＤ−７（Rohm and Haas Co., Phil
adelphia, USA）を充填したカラムにかけた。成分Ａお
よびリボフラビンはいずれも樹脂に吸着され（グルコー
スは吸着されない）、水で洗浄後、１：１水性アセトン
溶液で溶出された。アセトンを蒸発させて濃縮した後、
溶出液を凍結乾燥させた。得られた粉末を少量の水酸化
ナトリウム溶液に溶解し、ゲル濾過樹脂、トーヨーパー
ル（Toyopearl）ＨＷ−４０Ｆ（TOYO SODA Mfg. Co. Lt
d., Tokyo, Japan）を充填したカラムにかけ、成分Ａと
リボフラビンを分離した。溶出した成分Ａ画分を凍結乾
燥させた。このようにして得られた粉末の純度は９７％
であった。
【００２９】質量分析器により、成分Ａの分子量はm/z
５３９であることが決定された。この値は、リボフラビ
ン・モノグルコシドの分子量に相当する。次に、成分Ａ
を、９５℃で２．５時間、１N塩酸により加水分解し、
グルコース残基がリボフラビンに結合している可能性を
調べた。次に、加水分解物を、薄層クロマトグラフィー
・プレートに、リボフラビンおよびグルコースの標品と
共にスポットし、展開させた。その結果、リボフラビン
およびグルコースが成分Ａから放出されたことが確認さ
れた。さらに、成分Ａの1Ｈ ＮＭＲおよび1 3Ｃ ＮＭＲ
スペクトルを分析することにより、グルコシド結合がリ
ボフラビンの５′位におけるα結合からなっていること
が示された。これらの結果から、成分Ａは５′−Ｄ−リ
ボフラビン・α−Ｄ−グルコシド：６，７−ジメチル−
９−（５′−〔α−Ｄ−グルコピラノシル〕−Ｄ−リビ
チル）−イソアロキサジンと同一であると結論付けられ
た。
５３９であることが決定された。この値は、リボフラビ
ン・モノグルコシドの分子量に相当する。次に、成分Ａ
を、９５℃で２．５時間、１N塩酸により加水分解し、
グルコース残基がリボフラビンに結合している可能性を
調べた。次に、加水分解物を、薄層クロマトグラフィー
・プレートに、リボフラビンおよびグルコースの標品と
共にスポットし、展開させた。その結果、リボフラビン
およびグルコースが成分Ａから放出されたことが確認さ
れた。さらに、成分Ａの1Ｈ ＮＭＲおよび1 3Ｃ ＮＭＲ
スペクトルを分析することにより、グルコシド結合がリ
ボフラビンの５′位におけるα結合からなっていること
が示された。これらの結果から、成分Ａは５′−Ｄ−リ
ボフラビン・α−Ｄ−グルコシド：６，７−ジメチル−
９−（５′−〔α−Ｄ−グルコピラノシル〕−Ｄ−リビ
チル）−イソアロキサジンと同一であると結論付けられ
た。
【００３０】実施例３ バチルス・プミルス（Bacillus pumilus）ＲＣ１５（Ｆ
ＥＲＭ−ＢＰ２８３４、特開平７−２０３９８２号）を
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで
２回処理することにより得られた、黄色のリボフラビン
を産生する変異株である、バチルス・プミルス（Bacill
us pumilus）ＲＬＸ３を、実施例１と同様にして培養し
た。ただし、この株の場合には、抗生物質を添加しなか
った。その結果、３日間の培養後、０．２５g/lのリボ
フラビン・グルコシドが産生された（リボフラビンに基
づき、４４４nmにおける紫外吸収により測定）。
ＥＲＭ−ＢＰ２８３４、特開平７−２０３９８２号）を
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで
２回処理することにより得られた、黄色のリボフラビン
を産生する変異株である、バチルス・プミルス（Bacill
us pumilus）ＲＬＸ３を、実施例１と同様にして培養し
た。ただし、この株の場合には、抗生物質を添加しなか
った。その結果、３日間の培養後、０．２５g/lのリボ
フラビン・グルコシドが産生された（リボフラビンに基
づき、４４４nmにおける紫外吸収により測定）。
【図１】典型的な培養ブロスのＨＰＬＣ分析を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】 リボフラビン・グルコシドを産生するこ
とができるバチルス（Bacillus）属に属する微生物を、
好気的条件下で、デンプンを含有する水性培地中で培養
することを特徴とする、リボフラビン・グルコシドを製
造する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP97121315.2 | 1997-12-04 | ||
| EP97121315 | 1997-12-04 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11235194A true JPH11235194A (ja) | 1999-08-31 |
Family
ID=8227739
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10343843A Ceased JPH11235194A (ja) | 1997-12-04 | 1998-12-03 | リボフラビン・グルコシドを製造する方法 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6190888B1 (ja) |
| EP (1) | EP0926243B1 (ja) |
| JP (1) | JPH11235194A (ja) |
| KR (1) | KR100521730B1 (ja) |
| CN (1) | CN1162548C (ja) |
| BR (1) | BR9805145A (ja) |
| CA (1) | CA2255099A1 (ja) |
| DE (1) | DE69825852T2 (ja) |
| DK (1) | DK0926243T3 (ja) |
| ES (1) | ES2227759T3 (ja) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3669835A (en) * | 1970-04-14 | 1972-06-13 | Hayashibara Co | Process for preparing vitamin b{11 -glucoside |
| US5837528A (en) | 1989-06-22 | 1998-11-17 | Hoffmann La Roche, Inc. | Bacterial strains which overproduce riboflavin |
| CN1066486C (zh) * | 1989-06-22 | 2001-05-30 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 高产核黄素的细菌菌株 |
| JP3129773B2 (ja) | 1990-07-27 | 2001-01-31 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | Ｄ−リボースの製造法 |
| JPH1084978A (ja) | 1996-07-24 | 1998-04-07 | F Hoffmann La Roche Ag | 改良されたリボフラビン生産 |
-
1998
- 1998-11-27 ES ES98122499T patent/ES2227759T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-27 DE DE69825852T patent/DE69825852T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-27 EP EP98122499A patent/EP0926243B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-11-27 DK DK98122499T patent/DK0926243T3/da active
- 1998-12-02 CA CA002255099A patent/CA2255099A1/en not_active Abandoned
- 1998-12-03 KR KR10-1998-0052820A patent/KR100521730B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-03 JP JP10343843A patent/JPH11235194A/ja not_active Ceased
- 1998-12-03 US US09/204,186 patent/US6190888B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-12-04 BR BR9805145A patent/BR9805145A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-12-04 CN CNB981227732A patent/CN1162548C/zh not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2227759T3 (es) | 2005-04-01 |
| EP0926243A2 (en) | 1999-06-30 |
| DE69825852T2 (de) | 2005-09-01 |
| BR9805145A (pt) | 2000-03-21 |
| EP0926243A3 (en) | 2000-03-08 |
| KR100521730B1 (ko) | 2005-11-25 |
| CN1230597A (zh) | 1999-10-06 |
| US6190888B1 (en) | 2001-02-20 |
| EP0926243B1 (en) | 2004-08-25 |
| DE69825852D1 (de) | 2004-09-30 |
| CN1162548C (zh) | 2004-08-18 |
| CA2255099A1 (en) | 1999-06-04 |
| DK0926243T3 (da) | 2004-12-20 |
| KR19990062767A (ko) | 1999-07-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20040206 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20040319 |
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