JPH11239480A - プレニル２リン酸合成酵素をコードするｄｎａを連結させた組換えｄｎａおよびプレニル２リン酸合成酵素の製造方法 - Google Patents
プレニル２リン酸合成酵素をコードするｄｎａを連結させた組換えｄｎａおよびプレニル２リン酸合成酵素の製造方法Info
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- JPH11239480A JPH11239480A JP4358798A JP4358798A JPH11239480A JP H11239480 A JPH11239480 A JP H11239480A JP 4358798 A JP4358798 A JP 4358798A JP 4358798 A JP4358798 A JP 4358798A JP H11239480 A JPH11239480 A JP H11239480A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 プレニル２リン酸合成酵素の新規な分泌生産
方法の提供。 【解決手段】 バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｓ）由来のプロモーター領域にプレニル２
リン酸合成酵素をコードするＤＮＡを連結させた組換え
ＤＮＡ。このＤＮＡを含む発現プラスミドにより形質転
換した宿主細胞を培養し、該培養物からプレニル２リン
酸合成酵素を採取することにより、該酵素を効率よく製
造することができる。
方法の提供。 【解決手段】 バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｓ）由来のプロモーター領域にプレニル２
リン酸合成酵素をコードするＤＮＡを連結させた組換え
ＤＮＡ。このＤＮＡを含む発現プラスミドにより形質転
換した宿主細胞を培養し、該培養物からプレニル２リン
酸合成酵素を採取することにより、該酵素を効率よく製
造することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、プレニル２リン酸
合成酵素の製造方法に関する。
合成酵素の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子組換え技術の発展により、多くの
蛋白質は細菌、真菌、哺乳類をはじめとする多様な発現
系により組換え蛋白質として発現されるようになってき
た。しかし、異種蛋白質の発現の際に一般的に用いられ
る細菌である細胞内発現型の宿主を用いると、多くの場
合問題が発生する。
蛋白質は細菌、真菌、哺乳類をはじめとする多様な発現
系により組換え蛋白質として発現されるようになってき
た。しかし、異種蛋白質の発現の際に一般的に用いられ
る細菌である細胞内発現型の宿主を用いると、多くの場
合問題が発生する。
【０００３】例えば、大腸菌の系を用いた場合、生産さ
れた異種蛋白質は菌体内に蓄積され、細胞封入体を形成
する場合も少なくない。封入体を形成した異種蛋白質
は、生物学的あるいは生化学的に不活性であり、活性型
の蛋白質を得るためには、可溶化、再生の操作が必要と
なる。そして、可溶化、再生の操作が成功しない場合、
必要とされる量の活性型の蛋白質は期待できない。しか
し、可溶化や再生の普遍的な方法は未だ確立されておら
ず、多くの試行錯誤が必要とされる。
れた異種蛋白質は菌体内に蓄積され、細胞封入体を形成
する場合も少なくない。封入体を形成した異種蛋白質
は、生物学的あるいは生化学的に不活性であり、活性型
の蛋白質を得るためには、可溶化、再生の操作が必要と
なる。そして、可溶化、再生の操作が成功しない場合、
必要とされる量の活性型の蛋白質は期待できない。しか
し、可溶化や再生の普遍的な方法は未だ確立されておら
ず、多くの試行錯誤が必要とされる。
【０００４】異種蛋白質が封入体を形成しない場合であ
っても、菌体内に生産、蓄積された異種蛋白質は、菌体
からの抽出やその抽出液からの精製に多大の時間と労力
を必要とするだけでなく、目的とする蛋白質を完全な形
で純粋に得ることができない場合もある。例えば、プレ
ニル２リン酸合成酵素のうちゲラニルゲラニル２リン酸
合成酵素においては別の蛋白質との融合蛋白質化などの
工夫なしで単一に精製できた報告はない。
っても、菌体内に生産、蓄積された異種蛋白質は、菌体
からの抽出やその抽出液からの精製に多大の時間と労力
を必要とするだけでなく、目的とする蛋白質を完全な形
で純粋に得ることができない場合もある。例えば、プレ
ニル２リン酸合成酵素のうちゲラニルゲラニル２リン酸
合成酵素においては別の蛋白質との融合蛋白質化などの
工夫なしで単一に精製できた報告はない。
【０００５】細菌の系の中でもバチルス属に属する微生
物は、古くから種々の菌体外酵素の生産菌として工業的
に利用されている。これらの菌体外酵素のうち、バチル
ス・アミロリクイファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子
〔Ｉ．Ｐａｌｖａ ｅｔ．ａｌ，Ｇｅｎｅ，２２，２２
９（１９８３）〕、バチルス・リケニフォルミスのペニ
シリナーゼ遺伝子やバチルス・サチルスのα−アミラー
ゼの各遺伝子は既にクローン化され、そのプロモーター
や酵素のシグナルペプチドを利用した異種蛋白質の菌体
外分泌生産系が報告されている。この菌体外分泌生産系
では、上記の菌体内発現系で問題となり得る封入体形成
はほとんど認められず、可溶化状態での異種蛋白質の生
産を容易にすると共に、菌体からの抽出操作が不要なた
め、生産コストを大幅に削減できる。
物は、古くから種々の菌体外酵素の生産菌として工業的
に利用されている。これらの菌体外酵素のうち、バチル
ス・アミロリクイファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子
〔Ｉ．Ｐａｌｖａ ｅｔ．ａｌ，Ｇｅｎｅ，２２，２２
９（１９８３）〕、バチルス・リケニフォルミスのペニ
シリナーゼ遺伝子やバチルス・サチルスのα−アミラー
ゼの各遺伝子は既にクローン化され、そのプロモーター
や酵素のシグナルペプチドを利用した異種蛋白質の菌体
外分泌生産系が報告されている。この菌体外分泌生産系
では、上記の菌体内発現系で問題となり得る封入体形成
はほとんど認められず、可溶化状態での異種蛋白質の生
産を容易にすると共に、菌体からの抽出操作が不要なた
め、生産コストを大幅に削減できる。
【０００６】当業界で現在使用されている菌体外発現系
での組換えプレニル２リン酸合成酵素の生産技術の報告
例はなく、研究、診断、治療および工業材料適用におけ
る使用を目的とするプレニル２リン酸合成酵素の製造お
よび精製に関する優れた生産方法が依然として要望され
ている。
での組換えプレニル２リン酸合成酵素の生産技術の報告
例はなく、研究、診断、治療および工業材料適用におけ
る使用を目的とするプレニル２リン酸合成酵素の製造お
よび精製に関する優れた生産方法が依然として要望され
ている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】プレニル２リン酸合成
酵素など外来蛋白質の発現系においては、酵素溶液調製
の煩雑さや発現量、または、封入体の形成、菌体内での
安定性等の問題で、現在報告されているいずれの生産系
も満足できるものとは言えない。従って本発明は、プレ
ニル２リン酸合成酵素を培地中に分泌させることにより
該酵素を効率よく製造することができる新規な方法を提
供しようとするものである。
酵素など外来蛋白質の発現系においては、酵素溶液調製
の煩雑さや発現量、または、封入体の形成、菌体内での
安定性等の問題で、現在報告されているいずれの生産系
も満足できるものとは言えない。従って本発明は、プレ
ニル２リン酸合成酵素を培地中に分泌させることにより
該酵素を効率よく製造することができる新規な方法を提
供しようとするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】発明者らは、組換え発現
系において安定的に異種蛋白質を培地中に発現できる組
換え分泌発現系の開発を行ってきた。一方、元来細胞内
に存在する酵素であるため特別な工夫なくしては細胞外
分泌が期待できないプレニル２リン酸合成酵素を効率的
に分泌発現できる組換え発現系確立の研究を重ねたとこ
ろ、バチルス・ブレビスの分泌生産系において効率的な
発現が可能であることを見出した。
系において安定的に異種蛋白質を培地中に発現できる組
換え分泌発現系の開発を行ってきた。一方、元来細胞内
に存在する酵素であるため特別な工夫なくしては細胞外
分泌が期待できないプレニル２リン酸合成酵素を効率的
に分泌発現できる組換え発現系確立の研究を重ねたとこ
ろ、バチルス・ブレビスの分泌生産系において効率的な
発現が可能であることを見出した。
【０００９】従って、発明によれば、通常限られた量の
蛋白質が培地中に分泌されるある種の宿主細胞におい
て、望ましい立体構造を有するプレニル２リン酸合成酵
素を培地中に多量に分泌させることを可能にするペプチ
ドをコードするＤＮＡ、およびそれらを保持する宿主細
胞、およびその宿主細胞を培養することを特徴とするプ
レニル２リン酸合成酵素の製造方法が提供される。
蛋白質が培地中に分泌されるある種の宿主細胞におい
て、望ましい立体構造を有するプレニル２リン酸合成酵
素を培地中に多量に分泌させることを可能にするペプチ
ドをコードするＤＮＡ、およびそれらを保持する宿主細
胞、およびその宿主細胞を培養することを特徴とするプ
レニル２リン酸合成酵素の製造方法が提供される。
【００１０】
【発明の実施の形態】この発明によると、ある種の宿主
細胞において、安定した可溶性のプレニル２リン酸合成
酵素を培地中に多量に製造することができる。プレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡの構築方
法 選択したプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ
配列としては、例えば、ファルネシル２リン酸合成酵素
については特願平３−２５３７８８（特開平５−２１９
９６１公報）に記載の配列を、またゲラニルゲラニル２
リン酸合成酵素については特願平６−３１５５７９（特
開平７−３０８１９３公報）に記載の配列をそれぞれ用
いることができる。本発明のプレニル２リン酸合成酵素
の発現用のプラスミドの構築は、当業界における一般的
な遺伝子工学技術を使用する〔サムブルック等、「モレ
キュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュ
ル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ、
コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９
８８）参照〕。
細胞において、安定した可溶性のプレニル２リン酸合成
酵素を培地中に多量に製造することができる。プレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡの構築方
法 選択したプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡ
配列としては、例えば、ファルネシル２リン酸合成酵素
については特願平３−２５３７８８（特開平５−２１９
９６１公報）に記載の配列を、またゲラニルゲラニル２
リン酸合成酵素については特願平６−３１５５７９（特
開平７−３０８１９３公報）に記載の配列をそれぞれ用
いることができる。本発明のプレニル２リン酸合成酵素
の発現用のプラスミドの構築は、当業界における一般的
な遺伝子工学技術を使用する〔サムブルック等、「モレ
キュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニュ
ル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ、
コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク（１９
８８）参照〕。
【００１１】発現ベクター 上記の様なプレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮ
Ａ分子は、この発明による異種蛋白質発現のための他の
配列を伴うことができる。この発明による望ましいＤＮ
Ａ配列の一例としては、宿主細胞における転写のプロモ
ーター配列を伴い、その制御下にある様々なＤＮＡ配列
を含む。例えば宿主細胞がバチルス・ブレビスである場
合、ＤＮＡ分子はバチルス・ブレビスで機能するプロモ
ーターやリボソーム結合部位を含み、また蛋白質の細胞
外への移動のための分泌シグナル配列を含む。
Ａ分子は、この発明による異種蛋白質発現のための他の
配列を伴うことができる。この発明による望ましいＤＮ
Ａ配列の一例としては、宿主細胞における転写のプロモ
ーター配列を伴い、その制御下にある様々なＤＮＡ配列
を含む。例えば宿主細胞がバチルス・ブレビスである場
合、ＤＮＡ分子はバチルス・ブレビスで機能するプロモ
ーターやリボソーム結合部位を含み、また蛋白質の細胞
外への移動のための分泌シグナル配列を含む。
【００１２】また、必要に応じて選択マーカー遺伝子を
含んでも良く、さらにＤＮＡ分子が宿主細胞内において
染色体外に存在する場合、複製開始点を含んでも良い。
バチルス・ブレビスで機能する具体的な前記配列は鵜高
ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏ
ｌ．２１７，Ｐ２３−３３（１９９３））により報告さ
れている。細菌を宿主にした発現に関してそれに使用さ
れる発現ベクターも公知にされているほか、当業界では
前記の成分を含む多くの細菌宿主用の発現ベクターが知
られており、標準的な分子生物学的技術により容易に構
築することができる。
含んでも良く、さらにＤＮＡ分子が宿主細胞内において
染色体外に存在する場合、複製開始点を含んでも良い。
バチルス・ブレビスで機能する具体的な前記配列は鵜高
ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏ
ｌ．２１７，Ｐ２３−３３（１９９３））により報告さ
れている。細菌を宿主にした発現に関してそれに使用さ
れる発現ベクターも公知にされているほか、当業界では
前記の成分を含む多くの細菌宿主用の発現ベクターが知
られており、標準的な分子生物学的技術により容易に構
築することができる。
【００１３】プレニル２リン酸合成酵素遺伝子を含むＤ
ＮＡ分子は、当業界で通常行われる様に、選択した宿主
細胞での発現量を最大にするように同一アミノ酸をコー
ドするコドンのうち翻訳に最も適切なコドンに改変する
ことができる。これらのＤＮＡ１分子中にプレニル２リ
ン酸合成酵素遺伝子は多コピー存在しても良い。
ＮＡ分子は、当業界で通常行われる様に、選択した宿主
細胞での発現量を最大にするように同一アミノ酸をコー
ドするコドンのうち翻訳に最も適切なコドンに改変する
ことができる。これらのＤＮＡ１分子中にプレニル２リ
ン酸合成酵素遺伝子は多コピー存在しても良い。
【００１４】宿主 本発明に適した宿主細胞は、好ましくは細菌である。当
業界において分泌発現用の宿主細胞として良く知られて
いるバチルス・ブレビスは鵜高らにより公知である（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．
２１７，Ｐ２３−３３（１９９３））ほか、下記実施例
で使用されるバチルス・ブレビス３１−ＯＫ株は工業技
術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭＰ−１３２７４とし
て寄託されている。またバチルス・サチルスをはじめと
するバチルス属やシュードモナス属等の様々な株もこの
発明において使用できる。
業界において分泌発現用の宿主細胞として良く知られて
いるバチルス・ブレビスは鵜高らにより公知である（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．
２１７，Ｐ２３−３３（１９９３））ほか、下記実施例
で使用されるバチルス・ブレビス３１−ＯＫ株は工業技
術院生命工学技術研究所にＦＥＲＭＰ−１３２７４とし
て寄託されている。またバチルス・サチルスをはじめと
するバチルス属やシュードモナス属等の様々な株もこの
発明において使用できる。
【００１５】
【実施例】以下にプレニル２リン酸合成酵素の生産に関
する実施例を示す。 （１）プレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡの
デザイン プレニル２リン酸合成酵素のＤＮＡ配列は、ファルネシ
ル２リン酸合成酵素については特願平３−２５３７８８
（特開平５−２１９９６１号公報）に記載の配列をまた
ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素については特願平６
−３１５５７９（特開平７−３０８１９３号公報）に記
載の配列をそれぞれ用いた。
する実施例を示す。 （１）プレニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡの
デザイン プレニル２リン酸合成酵素のＤＮＡ配列は、ファルネシ
ル２リン酸合成酵素については特願平３−２５３７８８
（特開平５−２１９９６１号公報）に記載の配列をまた
ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素については特願平６
−３１５５７９（特開平７−３０８１９３号公報）に記
載の配列をそれぞれ用いた。
【００１６】遺伝子の５′末端にＮｃｏＩを含むシグナ
ル配列の一部と３′末端にはＨｉｎｄＩＩＩサイトを合
成ＤＮＡを附加してベクター導入用のＤＮＡを合成し
た。合成された遺伝子をベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ
（Ｎｏｖａｇｅｎ社より購入）に導入して大腸菌ＨＢ１
０１を形質転換を行い、得られたクローンからプラスミ
ドを抽出してダイデオキシ法により塩基配列を決定し変
異がないことを確認した。
ル配列の一部と３′末端にはＨｉｎｄＩＩＩサイトを合
成ＤＮＡを附加してベクター導入用のＤＮＡを合成し
た。合成された遺伝子をベクターｐＴ７Ｂｌｕｅ−Ｔ
（Ｎｏｖａｇｅｎ社より購入）に導入して大腸菌ＨＢ１
０１を形質転換を行い、得られたクローンからプラスミ
ドを抽出してダイデオキシ法により塩基配列を決定し変
異がないことを確認した。
【００１７】（２）プレニル２リン酸合成酵素遺伝子の
バチルス・ブレビス発現ベクターへの導入 構築したプラスミドよりプレニル２リン酸合成酵素の遺
伝子断片をＮｃｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで切り出した。こ
れを、エリスロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベ
クターｐＮＵ２１２（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１７，Ｐ２３−３３（１９９
３））のＮｃｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入しＤＮＡ
リガーゼで結合させ発現プラスミドベクターを得た。
（図１）
バチルス・ブレビス発現ベクターへの導入 構築したプラスミドよりプレニル２リン酸合成酵素の遺
伝子断片をＮｃｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩで切り出した。こ
れを、エリスロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドベ
クターｐＮＵ２１２（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１７，Ｐ２３−３３（１９９
３））のＮｃｏＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入しＤＮＡ
リガーゼで結合させ発現プラスミドベクターを得た。
（図１）
【００１８】（３）形質転換体の取得 形質転換は、高木らのＡｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．５３，３０９９−３１００，（１９８３）記載のエ
レクトロポーレション法により行った。構築したｐＮＵ
２１２ベースの発現ベクター約５００ng用いてバチルス
・ブレビス３１−ＯＫ株を形質転換した。
ｍ．５３，３０９９−３１００，（１９８３）記載のエ
レクトロポーレション法により行った。構築したｐＮＵ
２１２ベースの発現ベクター約５００ng用いてバチルス
・ブレビス３１−ＯＫ株を形質転換した。
【００１９】（４）プレニル２リン酸合成酵素の発現と
その解析 得られた形質転換体をＹＣ培地〔３０ｇポリペプトンＰ
１（日本製薬）、２ｇイーストイクストラクト、３０ｇ
グルコース、０．１ｇ塩化カルシウム２水和物、０．１
ｇ硫酸マグネシウム７水和物、１０mg硫酸鉄７水和物、
硫酸マンガン７水和物、１mg硫酸亜鉛４水和物／１ｌ当
たり、pH７．２〕で３０℃、３日間培養した。
その解析 得られた形質転換体をＹＣ培地〔３０ｇポリペプトンＰ
１（日本製薬）、２ｇイーストイクストラクト、３０ｇ
グルコース、０．１ｇ塩化カルシウム２水和物、０．１
ｇ硫酸マグネシウム７水和物、１０mg硫酸鉄７水和物、
硫酸マンガン７水和物、１mg硫酸亜鉛４水和物／１ｌ当
たり、pH７．２〕で３０℃、３日間培養した。
【００２０】培養上清１０μｌを用いてその中の蛋白質
をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）により分離し、ＣＢＢ染
色により可視化、または、ウエスタンブロットの手法を
用いてニトロセルロース膜上に固定化した。ウエスタン
ブロットの後のプレニル２リン酸合成酵素の可視化のた
めの免疫染色に用いた一次抗体は各種のプレニル２リン
酸合成酵素をラビットに免疫して得た抗血清を用いた。
をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）により分離し、ＣＢＢ染
色により可視化、または、ウエスタンブロットの手法を
用いてニトロセルロース膜上に固定化した。ウエスタン
ブロットの後のプレニル２リン酸合成酵素の可視化のた
めの免疫染色に用いた一次抗体は各種のプレニル２リン
酸合成酵素をラビットに免疫して得た抗血清を用いた。
【００２１】ブロットしたニトロセルロースフィルター
を一次抗体と反応させた後、二次抗体としてアルカリフ
ォスファターゼ標識抗ラビットＩｇＧ抗体を用いて、Ｂ
ＣＩＰ／ＮＢＴ（バイオラッド社発色キット）を用いて
検出した。図２にそれぞれのプレニル２リン酸合成酵素
の発現をウエスタンブロットで確認したときの図を示
す。目的の分子量の位置に単一バンドとして確認され
た。ｐＮＵ２１２を発現ベクターにした場合の発現量は
数１０mg／Ｌ程度であった。
を一次抗体と反応させた後、二次抗体としてアルカリフ
ォスファターゼ標識抗ラビットＩｇＧ抗体を用いて、Ｂ
ＣＩＰ／ＮＢＴ（バイオラッド社発色キット）を用いて
検出した。図２にそれぞれのプレニル２リン酸合成酵素
の発現をウエスタンブロットで確認したときの図を示
す。目的の分子量の位置に単一バンドとして確認され
た。ｐＮＵ２１２を発現ベクターにした場合の発現量は
数１０mg／Ｌ程度であった。
【００２２】（５）発現させたプレニル２リン酸合成酵
素の活性の確認 ５−１．酵素サンプル 各クローンの培養上清を酵素サンプルとして用いた。 ５−２．反応溶液 応溶液の組成は次の通りであった。 ０．５Ｍ ｂｉｓ Ｔｒｉｓ（９．５） ２０．０μｌ ０．３３６１ｍＭ ＩＰＰ（１Ｃｉ／mol) ７４．４μｌ ０．５ｍＭ ＤＭＡＰＰ ５０．０μｌ ０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 １０．０μｌ サンプル １０．０μｌ Ｈ2 Ｏ ３５．６μｌ
素の活性の確認 ５−１．酵素サンプル 各クローンの培養上清を酵素サンプルとして用いた。 ５−２．反応溶液 応溶液の組成は次の通りであった。 ０．５Ｍ ｂｉｓ Ｔｒｉｓ（９．５） ２０．０μｌ ０．３３６１ｍＭ ＩＰＰ（１Ｃｉ／mol) ７４．４μｌ ０．５ｍＭ ＤＭＡＰＰ ５０．０μｌ ０．１Ｍ ＭｇＣｌ2 １０．０μｌ サンプル １０．０μｌ Ｈ2 Ｏ ３５．６μｌ
【００２３】５−３．活性測定 活性測定は次のように行った。７０℃で３０分間反応さ
せた後、５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ及び１５０μｌ
のＮａＣｌを加えさらに水で飽和させたブタノールを加
え撹拌した後、遠心分離を行い、ブタノール層中の放射
活性を測定した。その結果バチルス・ブレビスで生産さ
れたプレニル２リン酸合成酵素はもとの酵素と同等の活
性を有し生産量は電気泳動法で算出したのと同じく数１
０mg／Ｌであった。
せた後、５０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ及び１５０μｌ
のＮａＣｌを加えさらに水で飽和させたブタノールを加
え撹拌した後、遠心分離を行い、ブタノール層中の放射
活性を測定した。その結果バチルス・ブレビスで生産さ
れたプレニル２リン酸合成酵素はもとの酵素と同等の活
性を有し生産量は電気泳動法で算出したのと同じく数１
０mg／Ｌであった。
【図１】図１は、本発明のプレニル２リン酸合成酵素図
発現ベクターの構築を示す図である。
発現ベクターの構築を示す図である。
【図２】図２は、ゲラニルゲラニル２リン酸合成酵素
（ＧＧＰＳ）及びファルネシル２リン酸合成酵素（ＦＰ
Ｓ）発現プラスミドを有するバチルス・ブレビス菌の培
養液から発現生成物をウエスタンブロットにより検出し
た結果を示す電気泳の図面代用写真である。
（ＧＧＰＳ）及びファルネシル２リン酸合成酵素（ＦＰ
Ｓ）発現プラスミドを有するバチルス・ブレビス菌の培
養液から発現生成物をウエスタンブロットにより検出し
た結果を示す電気泳の図面代用写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:08） (72)発明者 高橋 治雄 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 平井 正名 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 山田 幸生 愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番 地の１ 株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者 村松 正善 愛知県豊田市トヨタ町１番地 トヨタ自動 車株式会社内 (72)発明者 大音 徳 愛知県豊田市トヨタ町１番地 トヨタ自動 車株式会社内 (72)発明者 鵜▲高▼ 重三 愛知県名古屋市名東区植園町１丁目24番地 の３
Claims (3)
- 【請求項１】 バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｓ）由来のプロモーター領域の下流にプレ
ニル２リン酸合成酵素をコードするＤＮＡを連結させた
組換えＤＮＡ。 - 【請求項２】 請求項１記載の組換えＤＮＡの細胞内へ
の導入により外来蛋白質の分泌発現能を持つ宿主細胞。 - 【請求項３】 請求項２に記載の宿主細胞を栄養培地で
培養し、それにより生産されたプレニル２リン酸合成酵
素を培養物から採取することを特徴とするプレニル２リ
ン酸合成酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4358798A JPH11239480A (ja) | 1998-02-25 | 1998-02-25 | プレニル２リン酸合成酵素をコードするｄｎａを連結させた組換えｄｎａおよびプレニル２リン酸合成酵素の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4358798A JPH11239480A (ja) | 1998-02-25 | 1998-02-25 | プレニル２リン酸合成酵素をコードするｄｎａを連結させた組換えｄｎａおよびプレニル２リン酸合成酵素の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11239480A true JPH11239480A (ja) | 1999-09-07 |
Family
ID=12667927
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4358798A Pending JPH11239480A (ja) | 1998-02-25 | 1998-02-25 | プレニル２リン酸合成酵素をコードするｄｎａを連結させた組換えｄｎａおよびプレニル２リン酸合成酵素の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11239480A (ja) |
-
1998
- 1998-02-25 JP JP4358798A patent/JPH11239480A/ja active Pending
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