JPH11239488A

JPH11239488A - シヌクレインに基づく分析物及び新種のシヌクレイン蛋白質

Info

Publication number: JPH11239488A
Application number: JP10306283A
Authority: JP
Inventors: Smith Mccallion Andrew; スミスマッカリオンアンドリュー; Ruvovich Bucchiman Baldimir; ルヴォビッチブッチマンヴァルディミアー; Milward Davis Arun; ミルワードデイビスアルン
Original assignee: NEUROPA Ltd; University of St Andrews
Current assignee: NEUROPA Ltd; University of St Andrews
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-21
Publication date: 1999-09-07
Also published as: EP0908727A1; CA2244880A1; GB9719879D0

Abstract

(57)【要約】シヌクレインファミリーの新規メンバーが同定され、パ
ーシンと命名される。マウスとヒトの同類体に対する完
全アミノ酸配列が、ＳＥＱＩＤＮｏ２及び４に示さ
れ、それぞれのヌクレオチドコーディング配列が、ＳＥ
ＱＩＤＮｏ１及び３として示される。ニューロン及
び皮膚におけるパーシンに対して記された異常な発現パ
ターンから、シヌクレインが細胞内中間フィラメント構
造に影響を与えることが分かった。この様に、異常中間
フィラメント構造を示す細胞に対するアッセイは、細胞
内シヌクレインの評価に基づいて、説明される。アッセ
イは、プラークの沈着により特徴づけられる神経変性疾
患、癌（特に乳がん）及び皮膚障害に特に関連がある。
潜在的に治療価値のある薬剤のスクリーニングに対する
アッセイについても説明される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細胞の中間フィラ
メント構造における異常を検出するためのアッセイ、及
びそれと同様にその様な異常に対する診断方法、遺伝子
治療及び潜在的治療剤をスクリーニングする方法に関す
る。アッセイ方法の開発を導いた新しい蛋白質である新
規シヌクレインもまた、新規シヌクレインをコードする
ポリヌクレオチド（オプションとして遺伝子構築体の形
で）やアッセイにおけるその利用と同様に記述されてい
る。

【０００２】

【従来の技術】シヌクレインは、神経系で発現され、シ
ナプス末端に局在している小さな細胞内蛋白質のユニー
クなファミリーである^１−６。α−シヌクレインはアル
ツハイマー病や家族性パーキンソン病の病因に関係があ
るとされてきた。というのは、これが老人性斑部に存在
し、アミロイドＡβペプチドに結合し、パーキンソン病
を患っているある家族では遺伝子変異を起こしているか
らである^７−１０。しかし、シヌクレインの機能はわか
りにくいままである。

【０００３】

【発明を解決するための手段】我々はパーシン（ｐｅｒ
ｓｙｎ）と命名されるシヌクレインファミリーの新規メ
ンバーを同定した。これは、マウス胎児知覚ニューロン
（Ｅ１３三叉神経ガングリオン）で発現されているが、
中枢ニューロン（Ｅ１３前脳）では発現されていない遺
伝子を単離するためにデザインされた実験でクローン化
された。２個の独立した、オーバーラップしているパー
シンのクローン内で最長のものが、全長のマウス及びヒ
トｃＤＮＡクローンを単離するために使用された。図１
には、パーシンと他のシヌクレイン間の高い相同性が示
される。このファミリーに特徴的であるすべてのＥＫＴ
ＫＥＧＶ（ＳＥＱＩＤＮｏ１６）繰り返し配列がパ
ーシンに保存されていて^１−４、多くのシヌクレインの
ように、パーシンは高い酸性のＣ−端側領域を有してい
る。パーシンは、進化距離を考慮したとき、ラットのシ
ヌクレイン様蛋白質^１５及びシビレエイシヌクレイン^１
と最も近い関係がある。しかしながら、すべての他のフ
ァミリーメンバーに絶対的に保存されている３個のリジ
ンの置換及び別の保存領域^１５における５個のアミノ酸
のまれなストレッチは、ラットのシヌクレイン様蛋白質
はパーシンや他のシヌクレインとは異なっていることを
示す。パーシンｍＲＮＡの発現パターンは他のシヌクレ
インのそれとは異なる。手短に言えば、パーシンは、シ
ナプスに発現されているα−及びβ−シヌクレインとは
対照的に、知覚または運動ニューロンの細胞質基質に発
現されている。異なる発現パターンはパーシンがクロー
ン化された方法を反映している。単一の０．８ｋｂの転
写物がもっぱら神経組織で、マウス胎児とラット新生児
の両方の知覚ガングリアにおいて最も高いレベルで発現
された（Ｆｉｇ２ａ、２ｂ）。全マウス胎児及び低温切
片でのインサイチューハイブリダイゼーションは、全て
の知覚ガングリア、運動ニューロン（図２ｃ、２ｄ、２
ｅ）及び生後の脊椎傍シナプスガングリア（データを示
さない）においてパーシンの発現を明らかにした。三叉
神経ガングリオンにおけるパーシン発現の詳細な発生学
的研究は形成の早い段階からの発現を明らかにし、早期
の軸策がその標的に届くときのＥ１０とＥ１２の間で著
しい発現の増加が見られた。この高いレベルの発現は知
覚ニューロンで成体期まで維持された（ノザンデータは
示されないが、図３ｅの蛋白質発現データを参照）。生
後及び幼年マウスの大脳皮質ではパーシンのｍＲＮＡ及
び蛋白質は検出されなかったけれど、パーシンは成体の
皮質では明確に検出され、年齢と共に増加した（図３
ｇ）。インサイチューハイブリダイゼーションはまたパ
ーシンｍＲＮＡが成体の大脳皮質のニューロンにおいて
発現されていることを示した（図６及び図のリゼンドを
参照）。しかしながら、成体の大脳皮質におけるパーシ
ンの発現レベルは、脊髄や知覚ガングリアにおけるレベ
ルより本質的に低かった。パーシンとは対照的に、ヒト
のα−及びβ−シヌクレイン及びラット、ウシ及びシマ
ウマフィンチのシヌクレインは大脳皮質や他の前脳構造
に主として発現されている^３−６。ラットのシヌクレイ
ン様遺伝子は、パーシンとは異なり（図２ｂ）知覚ニュ
ーロンで主として発現されているけれども、中枢神経系
及び他の新生児ラットの組織では普遍的に発現されてい
る^１５。

【０００４】特異的なウサギ抗パーシン抗体（図１に示
されるペプチドに対して上げられた）を用いたウエスタ
ンブロッティングは、パーシンｍＲＮＡを発現する組織
において単一の蛋白質を示した。この蛋白質は、パーシ
ンの配列から予期されたものより６ｋＤａ大きい１９ｋ
Ｄａに対応する移動度を持つ。移動度における類似の減
少は他のシヌクレインに対しても報告されてきた
^４、１６。発生において、三叉ガングリオンにおけるパ
ーシン発現のレベルはパーシンｍＲＮＡのレベルを反映
した（図３ｅ）。マウスの脳の細胞レベル下の分画は、
パーシンが細胞骨格分画にも小胞分画にも関連しない細
胞質基質蛋白質であることを示した（図３ｆ）。これは
ラットのシヌクレイン及びシマウマフィンチのシヌクレ
インの細胞内分布に類似している^６。しかしながら、主
としてシナプス前部蛋白質^５である他のシヌクレインと
は対照的に、パーシンの免疫活性は、ｉｎｖｉｖｏ
（図３ａ、ｃ）及びｉｎｖｉｔｒｏ（図４）の両方で
末梢ニューロンの細胞体及び軸策中に分散して分布して
いた。

【０００５】パーシンが自己凝集してホモポリマーを形
成できることを見出した。パーシンはまたアミロイドβ
とも結合する。我々は理論的考察に拘束されたくはない
けれども、パーシンの機能は中間フィラメントの構造
（例えばニューロフィラメント及びサイトケラチン）を
細胞内で制御している様に見える。パーシンは、乳がん
のｃＤＮＡライブラリー（４１）から単離されたＥＳＴ
（ＢＣＳＧ１）によりコードされた蛋白質とほぼ同一で
ある。ＢＣＳＧ１ｍＲＮＡは正常乳房組織及び良性乳房
腫瘍では検出されることができないけれど、そのレベル
は高度に浸潤性の悪性カルシノーマ（４１）では劇的に
増加している。もしコードされた蛋白質のレベルが、パ
ーシン／ＢＣＳＧ１ｍＲＮＡのレベルを反映するなら
ば、乳がんの進行度マーカーとして有用となるであろ
う。

【０００６】我々は、神経変性及び悪性化におけるパー
シンの二重の役割が共通のメカニズムを含むことができ
ると仮定した（参考文献４２を参照）。細胞骨格の組織
における変化は、両方のプロセスの最も顕著な特徴のひ
とつである。パーシンがニューロフィラメントネットワ
ークの統合性の制御に含まれていることは、パーシンが
悪性乳がん上皮細胞において中間フィラメントネットワ
ークにも影響を及ぼすかもしれないという可能性を高め
ている。重要な質問は、乳がんの進行度が野生型パーシ
ンの高いレベルの発現に関係しているかどうか、あるい
はパーシンコード領域における突然変異の存在がこのプ
ロセスの義務的特徴であるかどうかである。腫瘍組織か
ら単離されたＢＣＳＧ１と正常脳組織から単離されたパ
ーシンとの間の多くの差（アミノ酸の置換を伴った３個
のもの）は、後者の可能性と一致している。その様な突
然変異は体細胞または生殖細胞であってもよいし、進行
した腫瘍または腫瘍が悪性化する個体の素質を反映して
いるかもしれない。

【０００７】ある局面では、本発明は新規な蛋白質パー
シンを提供する。我々はヒトとマウスのパーシンの同類
体を詳細に説明するが、本発明はこれらの同類体のみに
限られるものではない。ヒトとマウスのパーシンの同類
体の両者に対するアミノ酸配列データが提示され（ＳＥ
ＱＩＤＮｏ２及び４）、好ましい実施形態を形成す
る。

【０００８】別の局面では、本発明はＳＥＱＩＤＮ
ｏ１またはＳＥＱＩＤＮｏ３に提示されているよう
なヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドを提供す
る。さらに別の局面では、本発明はパーシンをコードす
るポリヌクレオチド（例えば、ＳＥＱＩＤＮｏ１ま
たはＳＥＱＩＤＮｏ３に提示されているようなヌク
レオチド配列を含むポリヌクレオチド）を提供する。ポ
リヌクレオチドはいかなる形であってもよい（例えば、
ＤＮＡまたはＲＮＡ、二本鎖または一本鎖）が、一般的
には二本鎖ＤＮＡが最も便利である。同様に、本発明に
よるポリヌクレオチドは、組替え遺伝子構築物の部分と
して存在してもよろしいし、この構築物自身ベクター
（例えば、発現ベクター）に含まれていてもよいし、或
いはトランスジェニック動物の染色体に取り込まれてい
てもよい。上述のポリヌクレオチドを含むいかなるベク
ターまたはトランスジェニック動物も本発明のさらに別
の局面を形成する。

【０００９】ある実施形態では、本発明は、上述のポリ
ヌクレオチドを含みパーシンを発現できる組替え遺伝子
発現システムを提供する。天然に存在する遺伝子のノッ
クアウトまたは別の類似の技術により作られた組替えシ
ステムもまた含まれる。特に、本発明はｉｎｖｉｖｏ
で遺伝子内に目標を定めた突然変異（例えばｎｕｌｌ突
然変異）を想定している。“発現システム”という用語
はここでは蛋白質コード領域を含み、蛋白質コード領域
の発現を達成するために必要なすべての遺伝子シグナル
に実施可能にリンクしている遺伝子配列を言及するため
に用いられる。オプションとして、発現システムは、蛋
白質コード領域の転写及び／または翻訳を増やすため
に、或いは発現に対する制御を提供するために、プロモ
ーターまたはエンハンサーのような制御要素もまた含ん
でいてもよい。制御要素は、蛋白質コード領域の上流ま
たは下流に位置していてもよいし、或いは、蛋白質コー
ド領域を中断するイントロン（非コード部分）に位置し
ていてもよい。或いは、制御蛋白質は、別のプラスミッ
ドにコードされている遺伝子（オプションとしてはゲノ
ムに安定にくみこまれていてもよい）から発現されても
よく、別のプラスミッド（オプションとしてゲノムのど
こかに安定に組み込まれている）に存在しているかもし
れないシヌクレインコード配列の上流または下流に位置
している制御要素にトランスに作用する。蛋白質コード
領域の配列自身が制御能力を含むこともまた可能であ
る。

【００１０】さらに、本発明は、その様な組替え発現シ
ステムを含むベクターとその様な組替え発現システムを
トランスフェクトした宿主細胞（オプションとしてはベ
クターの形で）を含む。好適な宿主細胞はベクターに依
存するであろう。現在、宿主細胞の選別に関し、該分野
の技術者にとって巨大な量の情報が利用可能である。本
発明は、微生物、動物及び植物ホスト細胞を含む。好ま
しい宿主細胞はとしては、ケラチノサイト、神経先祖細
胞、神経芽細胞及び神経系細胞系が挙げられる。

【００１１】特に、ある好ましい実施形態は誘導可能な
プロモーターシステム影響下、特にＴｅｔｏｎ誘導シス
テム（実施例３を参照）下にパーシンを発現できる安定
な細胞系である。さらに別の局面では、本発明はトラン
スジェニック哺乳動物を提供し、前述の動物はパーシン
（好ましくは、ヒトまたはマウスのパーシン同類体）を
発現するように適応した組替え発現システムを取り込ん
でいる細胞を有する。一般的には、組替え発現システム
は、トランスジェニック動物のゲノムに安定に取り込ま
れて遺伝することができる。その結果、その様なトラン
スジェニック動物の子孫はそれ自身トランスジーンを含
み本発明によりカバーされてもよい。好適なトランスジ
ェニック動物としては、マウス，ネズミ，ウサギ，羊，
豚，牛，及びやぎが挙げられる（これらに限られるもの
ではない）。

【００１２】更に別の局面では、本発明は、上述のポリ
ヌクレオチドの発現、好ましくは、本発明の遺伝子組替
え発現システムによって生産されるパーシンを、望まし
くはトランスジェニック哺乳動物で生産されるパーシン
を提供する。ある実施形態では、構築物は、ヒトのパー
シンをコードするｈＰＥＲＳ−ＧＥＸと名づけられるｃ
ＤＮＡ構築物であるか、或いはマウスのパーシンに対す
るｍＰＥＲＳ−ＢＳＩＩと名づけられるｃＤＮＡ構築物
である。構築物ｈＰＥＲＳ−ＧＥＸ及びｍＰＥＲＳ−Ｂ
ＳＩＩは、１９９７年９月１８日にＮＣＴＣ（Ｃｅｎｔ
ｒａｌＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、Ｌｏｎｄｏｎ）にそれぞれ登録番号ＮＣＴＣ１
３０４９及びＮＣＴＣ１３０５０として委託された。ｈ
ＰＥＲＳ−ＧＥＸは発現ベクターであり、一方、ｍＰＥ
ＲＳ−ＢＳＩＩは非発現ベクターである。

【００１３】同様に、上記の特異的構築物またはその修
飾体を含むトランスジェニック哺乳動物が好まれる。遺
伝子工学は、研究目的のみならず商業目的に対しても強
力な技術として認められてきた。この様に、遺伝子工学
技術（ＭａｎｉａｔｉｓらのＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ、ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＣ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇ、ＨａｒｂｏａｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ１９８２年、及び”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
ＯｆＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”Ｏ
ｌｄ及びＰｒｉｍｒｏｓｅ、第５版、１９９４年、この
両者がここにレファレンスとして取り込まれる）を用い
ることにより、外部の遺伝物質を宿主細胞に移入でき、
外部の遺伝物質によりコードされている蛋白質またはポ
リペプチドが宿主内で複製され及び／または発現されて
もよい。単純化の目的のために、遺伝子工学は宿主とし
て普通原核生物微生物、例えばＥ，ｃｏｌｉのような細
菌を用いて実施される。しかし、真核生物、特に酵母ま
たは藻類もまた利用されてきた。さらにある適用では真
核細胞培養が使用されても良い。

【００１４】我々の実験は、ニューロンにおけるパーシ
ンの過剰発現はニューロフィラメント蛋白質の分解を起
こすと考えられている、既存のニューロフィラメントネ
ットワークの変化を起こす（実施例２を参照）ことを示
した。これらの変化はカルシウム依存性蛋白質分解酵素
の阻害剤の添加により抑制される。これはパーシンと他
のシヌクレインがある構造蛋白質を蛋白質分解酵素に対
してより感受性にすることにより、例えば、構造的変化
を誘導することにより機能している。サイトケラチンで
は類似の影響が成熟ケラチノサイトで起こっている。こ
の様に影響を受けている構造蛋白質は、”シヌクレイン
感受性”と呼ばれる。

【００１５】培養知覚ニューロンにおけるパーシンの実
験的過剰発現は、すべての三つのニューロフィラメント
蛋白質に対する免疫活性の迅速な減少を引き起こす。他
の細胞骨格成分、例えばアクチンはパーシンの影響を受
けない。パーシンは、発生中の及び老化神経系でニュー
ロン及びその軸策のサブセットにおいて顕著なパターン
の発現を示し、神経変性状態で見られる皮質軸策病変部
に濃縮されている。我々は老化した皮質にパーシンの蓄
積を発見した。これらの発見は、パーシンが発生及び成
熟神経系で軸策構造を修飾するのに役割を果たしている
ことを示し、変性状態の軸策病理学にパーシンを関係づ
けている。

【００１６】さらに、我々はかなりのレベルのパーシン
を皮膚に検出した。皮膚は、有意のパーシン発現が認め
られた唯一の非神経組織である。特に、パーシンは、皮
膚表皮の顆粒層に発現されている（これは皮膚発生の後
期の段階での役割を持っている）。パーシンの過剰発現
は成熟ケラチノサイトで観察され、この蛋白質が皮膚科
学的状態に関与しているかもしれないことを示してい
る。興味深いことには、α−シヌクレインは、アルツハ
イマー病^７の患者のＣＮＳにおいてＡβ−アミロイドが
形成されるとき分子チャペロンとして機能すること、さ
らに突然変異したα−シヌクレインが、家族性パーキン
ソン病^２５においてＬｅｗｙ体が形成されるとき類似の
機能を有することなどが提案されてきた。しかし、シヌ
クレインはｉｎｖｉｔｒｏでホモポリマー及びアミロ
イド様構造を形成することができるので^８、９、ある状
態ではシヌクレイン自身が細胞内外に沈着物を生成する
という可能性は排除できない。組替えパーシンもまた溶
液中で凝集し、α−シヌクレイン^７と非常に類似の結合
特性を持つＡβ−ペプチドに結合することを示した（図
５ｃ、ｄ）。別の潜在的に重要な観察は、マウスとヒト
のパーシンの両者で、アミノ酸５３（図１ではアステリ
スクによりラベルされている）が野生型のα−シヌクレ
インの様にアラニンではなく、あるパーキンソン病家族
の突然変異α−シヌクレイン^１０のようにスレオニンに
なっていることである。このアラニン／スレオニン置換
が、機能的重要性を持つα−シヌクレイン^{１０、２５}の
二次構造における変化を引き起こすことは可能である。

【００１７】プラーク、繊維濃縮体または抱合体の形で
の細胞内外沈着物の蓄積は多くの神経変性病の太鼓判で
あることがさらに観察されてきた^{１１、１２}。これらの
沈殿物は一つ以上の凝集した蛋白質及びペプチドを含
み、ある微量ポリペプチド成分が主成分の凝集を開始す
ることが示唆された^{１３、１４}。アルツハイマー病のプ
ラークに見出されたこの様な微量成分のひとつがＮＡ
Ｃ、即ち内部ペプチドまたはＮＡＣＰまたはα−シヌク
レインであり、異常なアミノ酸配列と不明な機能を持つ
小蛋白質のファミリーのメンバーである^１−４。α−シ
ヌクレインの自己凝集能力及びアミロイドＡβ−ペプチ
ドに結合して凝集を誘導する能力は、アルツハイマー病
においてアミロイドの沈着を促進する潜在的役割と一致
している^７−９。アルツハイマー病におけるシナプス機
能の損傷の局所学もまたα−シヌクレイン発現のパター
ンとシナプス末端における局在化と一致してい
る^３−６。さらに、シヌクレインは、シマウマフィンチ
の学習と記憶の少なくともひとつの形に関係があるとさ
れた^６。α−シヌクレイン遺伝子における突然変異もま
た最近、パーキンソン病の早期発病の常染色体優勢形と
直接関係していることが報告された^１０。

【００１８】このため、パーシンに関する我々の観察に
続いて、シヌクレイン感受性蛋白質の過剰な分解または
蓄積により特徴づけられるある病態または障害における
シヌクレインの役割が明白になった。さらに別の局面で
は、本発明は、シヌクレイン感受性蛋白質の過剰分解ま
たは蓄積により特徴づけられる病態または障害に対する
診断方法または感受性を決める方法を提供する。前述の
方法は：ａ）患者から適当な組織サンプルを得ること；ｂ）前術のサンプルを用いてシヌクレインの存在または
その特徴を分析すること；及び、ｃ）得られた結果を既知の標準と比較すること；を含
む。

【００１９】ある実施形態では、本発明はシヌクレイン
感受性蛋白質の過剰分解または蓄積により特徴づけられ
る病態または障害に対する診断方法または感受性を決め
る方法を提供する。前述の方法は：ａ）患者から適当な組織サンプルを得ること；ｂ）前述のサンプルのシヌクレイン（例えば、パーシ
ン）のｅｘｖｉｖｏレベルを決定すること；ｃ）そのレベルを既知の標準と比較すること；を含む。

【００２０】別の実施形態ではシヌクレイン感受性蛋白
質の過剰分解または蓄積により特徴づけられる病態また
は障害に対する診断方法または感受性を決める方法を提
供する。前述の方法は：ａ）患者から適当な組織サンプルを得ること；ｂ）前述のサンプルからシヌクレイン（例えば、パーシ
ン）またはそれをコードするポリヌクレオチドを単離す
ること；ｃ）前述のシヌクレインまたは前述のポリヌクレオチド
を既知の標準と比較し、そこに関連のある差（例えば、
配列または物理的性質における差）が存在するかどうか
を決定すること；を含む。

【００２１】シヌクレイン感受性蛋白質の過剰分解また
は蓄積は、細胞内中間フィラメント構造における変更を
伴うかもしれない。上述の方法は、シヌクレイン、好ま
しくはパーシンの細胞内レベルの増加（特に、過剰発
現）が重要な因子となるような状態の診断に特に有用と
なるであろう。同様に、α−シヌクレイン内の突然変異
の同定は特に興味深い。ある実施形態では、上述の方法
は神経変性疾患の診断に対して向けられてもよい。

【００２２】さらに別の実施形態では、上述の方法は高
度に転移性の癌に対して向けられてもよい。特に、上述
のアッセイは、癌（特に乳がん及び皮膚癌）、神経変性
疾患（特に蛋白質／ペプチドの異常沈着が典型的に観察
される障害）、皮膚障害（特に上皮性由来の腫瘍）のス
クリーニング、診断またはモニターに関して適切である
であろう。癌に対し本方法の使用に関しては、異常なシ
ヌクレインの存在のレベルと効果は悪性腫瘍の進展と転
移を示すと同様に腫瘍組織のインディケーターとして有
用であろう。

【００２３】上述のアッセイの主題である”シヌクレイ
ン”は、α−シヌクレイン（特にヒトまたはマウス）ま
たはβ−シヌクレイン（特にヒトまたはマウス）のよう
なパーシンまたは関連蛋白質であってもよい。マウスα
−シヌクレインをコードする全ヌクレオチド配列は、登
録番号ＡＦ０４４６７２、ヌクレオチド同定番号ｇ２８
２９２９の下に入手可能である。パーシン自身に関して
は、マウスまたはヒトの同類体が好ましいが、他の天然
同類体（例えば、ラット）も受諾可能である。我々の予
備的研究は、α−シヌクレインの過剰発現は培養細胞内
のニューロフィラメント蛋白質の類似の崩壊を実証して
いることを示す。ＤＮＡプローブを必要とする方法で
は、プローブの特異性が維持されるならば、選択される
シヌクレインの同類体の全遺伝子配列を使用することは
必要でないかもしれない。同様に、配列への修飾（プロ
ーブが合成的に製造されている場合は特に、）は、もし
特異性が許諾可能のままであるなら、許容されてもよ
い。

【００２４】また、本発明は、突然変異または異常が存
在するかどうかを確立するために、そしてもしそうなら
オプションとしてその突然変異または異常を同定するた
めに、内在性シヌクレイン（例えば、パーシンまたはα
−シヌクレイン）の遺伝子配列を評価する方法を含む。
内在性蛋白質の遺伝子配列は従来技術により決定され、
得られた配列は既知の配列、例えばＳＥＱＩＤＮｏ
１に提示されている配列と比較される。この方法は、病
気または障害の診断において、及び病気または障害の予
後において、特にヒトの診療において使用されることが
できる。例えば、本方法は、配偶子または胎児のスクリ
ーニングにおいて有用性を持つかもしれない。

【００２５】別の局面では、本発明はまたシヌクレイン
の異常レベルによる細胞内（例えばケラチノサイトまた
は神経組織）の中間フィラメント損傷を除去しようと努
める方法を提供する。この方法は、その様に損傷を受け
た細胞を同定し、細胞内の生物学的効果量のシヌクレイ
ン（例えばパーシン）を修飾することを含む。通常は、
内在性機能性シヌクレイン（例えばパーシン）の量を減
少することが望ましい。しかし、ある場合は内在性機能
性シヌクレイン（例えばパーシン）の量を増やすことは
有利であるかもしれない。

【００２６】シヌクレインの生物学的効果量（例えばパ
ーシン）は、その発現に影響を与えることにより修飾さ
れるかもしれない；即ち、核酸から生産されるシヌクレ
イン（例えばパーシン）の量に影響を与えることによ
り、例えばパーシンの欠陥体の同類的組替えにより、修
飾されるかもしれない；或いはシヌクレイン（例えばパ
ーシン）ｍＲＮＡはアンチセンスＲＮＡを提供すること
により中和できる；または、組替え発現システムを、追
加量のまたは別の形のシヌクレイン（例えばパーシン）
を生産するために使用できる。パーシンまたは他のシヌ
クレインに特異的なリボザイムはこの点において有用か
もしれない。異なる研究法では、シヌクレイン（例えば
パーシン）蛋白質の機能は、その機能に影響を与える治
療薬剤により修飾され得る。“戦う（ｃｏｍｂａｔｔｉ
ｎｇ）”ことにより、我々は、既存の損傷を改善したり
及び／または、損傷が起こる前に損傷を予防したり、損
傷に対して保護したりする意図を持っている。

【００２７】本発明によるパーシン及びシヌクレインフ
ァミリーの他の蛋白質もまた、特に、カルシウム依存性
蛋白質分解酵素（シヌクレイン感受性蛋白質）に対する
ある構造蛋白質の感受性への効果に関して特に、シヌク
レインの生物学的活性を修飾するのに有効な潜在的治療
剤をスクリーニングする方法に有用である。さらに別の
局面によれば、本発明は、シヌクレイン（パーシン）の
生物活性を除去しようと努めることができる治療剤をス
クリーニングする方法を提供する。この方法は：ａ）シヌクレインの生物活性を実証できるシステムを得
ること（例えば、プライマリーな細胞培養または、パー
シン発現システムをトランスフェクトするかまたはパー
シンをマイクロインジェクションした成熟ケラチノサイ
ト、神経先祖細胞、神経芽細胞または神経様細胞系の様
なシヌクレイン感受性蛋白質を発現するように適応した
細胞系）；ｂ）前述の系に推定治療剤をあてること；及び、ｃ）前述の治療剤がシヌクレインの生物活性に影響を与
えるかどうかを決定すること；を含む。

【００２８】便宜上、ステップｃは、実施例２に詳細に
記述されているように、免疫蛍光染色を含んでもよろし
い。上述のすべての方法（診断または予後の方法、遺伝
子配列を評価する方法、中間フィラメントの損傷を除去
するように努める方法、及び治療剤をスクリーニングす
る方法を含む）に関して、問題のシヌクレインは好まし
くは安定な細胞系から発現される。望ましくは、細胞系
は、ケラチノサイト、神経先祖細胞、神経芽細胞または
神経様細胞系である。望ましくは、シヌクレインの発現
は、誘導可能なプロモーターシステム、好ましくはＴｅ
ｔｏｎ誘導系（実施例３を参照）の影響下に行われる。

【００２９】上述のすべてのアッセイ及び方法に関し、
シヌクレインはパーシンであってもよい（ＳＥＱＩＤ
Ｎｏ２または４に規定されているような）。さらに、
パーシンの機能的等価物、パーシンの修飾体、及びパー
シン、パーシン機能的等価物またはパーシン修飾体の部
分もまた好適であるかもしれない（一般的には、その様
な部分はパーシンにユニークなものとなるであろう）。
“機能的等価物（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｑｕｉｖａ
ｌｅｎｔ）”という用語は、参照配列または蛋白質と機
能的本質的に類似している誘導体をさす。特に、“機能
的等価物”という用語は、ヌクレオチド塩基及び／また
はアミノ酸が、生物学的機能に有意に逆効果を与えずに
付け加えられ、削除されまたは置換された誘導体を含
む。

【００３０】“修飾体（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）”
という用語は、参照配列または蛋白質と本質的に類似の
誘導体を含む。特に、“修飾体”という用語は、ヌクレ
オチド及び／またはアミノ酸が、生物学的機能に望まし
いように影響を与えるように付け加えられ、削除されま
たは置換された誘導体を含む。カバーされる誘導体は、
ドメインが転位した蛋白質、融合またはキメラ蛋白質
（パーシン及び非パーシン部分）等を含む。

【００３１】本発明の実施形態は、実施例により、付随
の図面と以下の配列リストを用いて説明されるであろ
う：ＳＥＱＩＤＮｏ１：ヒトのパーシンのヌクレオチド
配列ＳＥＱＩＤＮｏ２：ヒトのパーシンに対するアミノ
酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ３：マウスのパーシンをコードする
ヌクレオチド配列ＳＥＱＩＤＮｏ４：マウスのパーシンに対するアミ
ノ酸配列ＳＥＱＩＤＮｏ５：シビレエイ（カリフオルニカ）
のシヌクレインに対するアミノ酸配列（図１）ＳＥＱＩＤＮｏ６：ラットシヌクレイン１に対する
アミノ酸配列（図１）ＳＥＱＩＤＮｏ７：ラットのシヌクレイン２に対す
るアミノ酸配列（図１）ＳＥＱＩＤＮｏ８：ラットのシヌクレイン３に対す
るアミノ酸配列（図１）ＳＥＱＩＤＮｏ９：ヒトのα−シヌクレインに対す
るアミノ酸配列（図１）ＳＥＱＩＤＮｏ１０：ヒトのβ−シヌクレインに対
するアミノ酸配列（図１）ＳＥＱＩＤＮｏ１１：ウシのシヌクレインに対する
アミノ酸配列（図１）ＳＥＱＩＤＮｏ１２：シマウマフィンチのシヌクレ
インに対するアミノ酸配列（図１）ＳＥＱＩＤＮｏ１３：ラットのシヌクレイン様に対
するアミノ酸配列（図１）ＳＥＱＩＤＮｏ１４：センスオリゴヌクレオチドプ
ローブ（実施例３）ＳＥＱＩＤＮｏ１５：アンチセンスオリゴヌクレオ
チドプローブ（実施例３）ＳＥＱＩＤＮｏ１６：シヌクレインに特異的なアミ
ノ酸モチーフ（２頁を参照）。

【００３２】

【実施例】実施例１：パーシンのクローニングと抗体と
の結合材料と方法モルキュラークローニングとハイブリッド形成減法ハイブリッド形成技術^３０が、Ｅ１３マウス前脳に
比較してマウス胎児の三叉神経ガングリアに多いｍＲＮ
ＡのｃＤＮＡクローンを単離するために使用された。得
た減殺されたｃＤＮＡライブラリーから単離されたクロ
ーンの中から、パーシンｍＲＮＡを示す２個の独立した
オーバーラップするクローンが得られた。全長ｃＤＮＡ
が、”ｌａｍｂｏｌａ”ＺＡＰＩＩベクターに構築され
たＥ１３マウスの三叉神経ｃＤＮＡライブラリーと、幼
年のヒトの脳幹（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のｃＤＮＡラ
イブラリーから単離された。ＲＮＡの抽出、ハイブリッ
ド形成のプローブの調製、ノザン、インサイチュー及び
サザンハイブリッド形成、及びＥ１３マウスの三叉神経
ガングリアｃＤＮＡライブラリーの構築とスクリーニン
グは前述したように実施された^３１。

【００３３】組替えパーシンの作成及び結合試験パーシンｃＤＮＡのＮｃｏＩ−ＸｈｏＩフラグメント
が、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）のＳｍａＩサイトにイン−フレームでクローン化さ
れた。ＧＳＴに融合したパーシンが、グルタチオンＳｅ
ｐａｒｏｓｅ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によるアフィ
ニティークロマトで単離され、ヒトのトロンビンで消化
され、ＧＳＴがグルタチオンＳｅｐａｒｏｓｅ４Ｂに再
吸着され、パーシンがさらにＦＰＬＣクロマトにより精
製された（ＭｏｎｏＱカラム、Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）。メンブレンフィルターに固定化したＡβ １−４
０、１−２８及び２５−３５ペプチド（Ｂａｃｈｅｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に対する組替えパーシンのｉｎ
ｖｉｔｒｏ結合が、組替えα−シヌクレイン／ＮＡＣ
Ｐに対して記述されたように実施された^７。

【００３４】結果全長のマウス及びヒトｃＤＮＡクローンが得られた；マ
ウスとヒトのパーシンｃＤＮＡ構築物ｍＰＥＲＳ−ＢＳ
ＩＩ及びｈＰＥＲＳ−ＧＥＸがそれぞれ登録番号１３０
５０及び１３０４９としてＮＣＴＣに委託された。

【００３５】抗パーシン抗体うさぎを、ＭＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で活性化した鍵穴アオ
ガイヘモシアニン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）によりそれ
ぞれコンジュゲートしたマウスパーシンのＣ端側１５マ
ーペプチド及びヒトのパーシンの内部ペプチド（アミノ
酸残基８０−９５）で免疫した^３２。単一特異性抗体
が、それぞれの抗血清から、ＮＨＳ活性化カラム（Ｓｕ
ｐｅｌｃｏ）に結合した抗原を用いるアフィニティーク
ロマトにより精製された。抗マウス及び抗ヒトパーシン
単一特異性抗体が、全細胞蛋白質サンプル中のパーシン
をウエスタンブロット／ＥＣＬで検出するとき、１：５
００及び１：２００の希釈で前述したように使用された
^３３。Ａｍｅｒｓｈａｍからのレインボウマーカーが蛋
白質の大きさの標準物質として使用された。

【００３６】結果特異的うさぎ抗パーシン抗体（図１に示されるペプチド
に対し作られた）を用いたウエスタンブロッティングに
より、パーシンｍＲＮＡを発現する組織に単一の蛋白質
が明らかにされた。この蛋白質は、パーシンの配列から
予期されたより６ｋＤａ大きい１９ｋＤａに相当する移
動度を有する。

【００３７】実施例２：神経におけるパーシンの過剰発
現と免疫組織化学材料と方法細胞レベル下の分画成体マウスの後脳のホモジネートの分画が前述のように
実施された^{３４、３５}。１，０００ｇ上清（ｃｙｔ）、
２０，０００ｇ上清（ｐｍｔ）、２０，０００ｇペレッ
トの洗浄後の２０，０００ｇ上清（ｐｌ）、シュクロー
スグラディエントのミトコンドリア画分（ｍｔ）とシナ
プトゾーム画分（ｓｙｎ）の各分画からの２０μｇの全
蛋白質が、ウエスタンブロット／ＥＣＬによる検出によ
って解析された。

【００３８】免疫組織化学１５μｍの低温切片が−２０℃で１０分間アセトン中で
固定され、乾燥され、１０％ヤギ血清／ＴＢＴ（２０ｍ
ＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．５；１５０ｍＭＮａＣ
ｌ；０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）によりブロック
され、続いて１％ヤギ血清／ＴＢＴ中で抗マウスパーシ
ン抗体（１：５０）により４℃で１６時間インキュベー
トされた。１％ヤギ血清／ＴＢＴにより切片を洗浄し
た。培養ニューロンの免疫染色に対しては、細胞をアセ
トン／メタノール（１：１）で固定し、ブロックする前
にＴＢＴで洗浄した後、類似の手順が用いられた。以下
のモノクローナル抗体が細胞骨格蛋白質を検出するため
に使用された：ＮＦ−Ｌに対してクローン３４（Ａｆｆ
ｉｎｉｔｙ）及びクローンＮＲ４（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、ＮＦ−Ｍに対してはクローン
ＮＮ１８（Ｓｉｇｍａ）、ＮＦ−Ｈに対してはクローン
ＲＴ９７（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）
及びＳＭＩ３１２（ＳｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒＭｏｎｏ
ｃｌｏｎａｌｓ）、ペリフェリンに対してはＭＡＢ１５
２７（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ビメンチンに対してはクロ
ーンＶ９（Ｓｉｇｍａ）、β−チューブリンに対しては
クローンＴＵＢ２．１（Ｓｉｇｍａ）。ＴＲＩＴＣでコ
ンジュゲートしたフィロイジンがアクチンマイクロフィ
ラメントを染色するために使用された。ＴＲＩＴＣでコ
ンジュゲートした抗ウサギ二次抗体及びＦＩＴＣでコン
ジュゲートした抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ’ｓ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）がこの実験で使用され
た。ヒトの脳サンプルのホルマリン固定パラフィン切片
の抗ヒトパーシン抗体（１：２０）による染色が、前述
のように実施された^{２８、２９}。

【００３９】解離した神経培養とマイクロインジェクシ
ョンマウスＰ１知覚ニューロンが、発現プラスミッド（ｐＭ
ＥＸベクター中のマウスパーシンｃＤＮＡ）^３７をマイ
クロインジェクションする前に、２ｎｇ／ｍｌのＮＧＦ
（三叉神経ガングリアニューロン）または２ｎｇ／ｍｌ
のＢＤＮＦ（節状ガングリアニューロン）のいずれかの
存在下前述^３６のように５日間培養された。ある実験で
は、カルペプチンまたはロイペプチン（１０ｍＭ）がマ
イクロインジェクション後培養液に添加された。

【００４０】結果：ニューロンにおけるパーシンの過剰
発現ニューロンにおけるパーシンの過剰発現の結果を調べる
ために、我々はパーシン発現プラスミッドを培養知覚ニ
ューロンにマイクロインジェクトした。インジェクトさ
れたニューロンは強いパーシンの免疫蛍光を示し、一方
インジェクトされないニューロンはずっと低いレベルの
染色を示した。パーシンを過剰発現しているニューロン
においてトリプレットニューロフィラメント蛋白質の染
色が、同じ培養容器のインジェクトされないニューロン
と比べ、劇的に減少することが観察された。この顕著な
免疫染色の低下は、３個のニューロフィラメント蛋白質
のそれぞれに対する数種のモノクローナル抗体：ＮＦ−
Ｌ、ＮＦ−Ｍ及びＮＦ−Ｈにより明らかにされた（図
４、及び図７、図のリジェンドもまた参照）。同様の結
果が新生児の三叉神経及び節状ニューロンを用いて得ら
れた。ニューロフィラメントの染色の低下は、インジェ
クション後２４時間で明白であり、４８時間から７２時
間後にはさらにもっとはっきりした。パーシンを過剰に
発現しているニューロンにおけるニューロフィラメント
の染色強度は、インジェクション時と比べて低く、これ
はパーシンが少なくとも部分的に既存のニューロフィラ
メントネットワークに変化を誘導することを示す。マイ
クロフィラメント（アクチン）、微小細管（チューブリ
ン）または他の中間フィラメント（ペリフェリン）に対
する免疫染色が変化しないことが、インジェクトしたニ
ューロンにおいて観察された（図４）。また、繊維芽細
胞におけるパーシンの異所性発現も、これらの細胞の主
たる中間フィラメントであるビメンチンに対する染色パ
ターンに変化を与えなかった（図８と図のリジェンド参
照）。ニューロフィラメントネットワークの歪みは、神
経変性病に共通であるのみならず、外傷性障害、虚血、
及び神経毒にさらされた後に続いて観察された。これら
の急性障害は、カルシウム依存性蛋白質分解酵素による
ニューロフィラメント蛋白質の分解から生ずると考えら
れているニューロフィラメントの免疫染色の急激な低下
を引き起こすと考えられている^{１７、２０}。これらの蛋
白質分解酵素の阻害剤はこの低下と関連する神経障害を
予防する^{２０、２２}。ここでは、我々は、カルパインと
他のカルシウム依存性蛋白質分解酵素のインヒビターで
あるカルペプチンとロイペプチンがニューロフィラメン
ト蛋白質へのパーシンの過剰発現への効果を抑制するこ
とを示す（図４）。これは、ニューロンにおけるパーシ
ンの過剰発現がカルシウム依存性蛋白質分解酵素による
ニューロフィラメント蛋白質の分解の増加につながるこ
とを示唆する。これは蛋白質分解酵素活性における一般
的な増加によるものではない。なぜなら、これらの蛋白
質分解酵素の基質でもある他の細胞骨格蛋白質は影響を
受けないからである。我々は仮定による拘束を受けたく
ないが、ひとつの説明としては、パーシンがニューロフ
ィラメントの構造的局面を変えて、蛋白質分解酵素に対
する感受性を高めることが考えられる。興味深いこと
に、シヌクレインのＥＫＴＫＥＧＶ繰り返し配列とニュ
ーロフィラメントネットワークの集合に重要であるニュ
ーロフィラメント蛋白質のラセンロッドドメインの領域
の間の配列類似性が存在する。この領域がないニューロ
フィラメント突然変異体はトランスフェクトしたニュー
ロフィラメントの配列に組み込まれない。この領域に対
応するペプチドの発現は、既存のフィラメントの配列の
崩壊につながる^２３。類似の中間フィラメント破壊効果
が、ｉｎｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏでビメンチン
とケラチンのラセンロッドの同じ領域に対応するペプチ
ドに対して実証された^２４。これらの領域のラセン車輪
表示がシヌクレイン１１マーの繰り返し配列のラセン車
輪表示と目覚しく類似している（図８と図のリジェンド
を参照）。これは、その様な両親媒性α−ヘリックスが
中間フィラメントフラグメント及びパーシン蛋白質の観
察された効果の分子的基盤である可能性を高めている。
しかし、我々の免疫染色及び細胞分画の結果（図３）
は、共免疫沈降及びｉｎｖｉｔｒｏ結合試験（示さな
い）と同様に、パーシンが正常ではニューロフィラメン
ト配列の成分ではなく、ニューロフィラメント蛋白質に
しっかり結合しないことを明確に実証している。それゆ
え、パーシンがニューロフィラメントのネットワーク統
合性を制御する分子チャペロンとして働いている可能性
がある。

【００４１】結果：免疫組織化学老化マウスの脳皮質におけるパーシンの発現と共に、そ
の構造的及び生化学的特徴は、パーシンが老化したヒト
の脳の生理学的及び病理学的変化に関与しているかもし
れないことを示す。この可能性を調べるために、神経変
性疾患の患者の後方モーテム脳と同年齢グループの個人
の対照サンプルにおけるパーシンの発現を調べるべく免
疫組織化学を使用した。正常及び病気の脳皮質の両者に
おいて、パーシンは斑点状の免疫活性を示した。これは
シナプスマーカー染色の特徴であり、シヌクレインに対
して観察されたパターンでもある^５。パーシンが強く染
色される末梢軸策と異なり、皮質性の軸策は明らかには
染色されなかった。しかし、パーシンの免疫活性の点状
構造は病態の皮質の白質に観察された（図５ｂ）。これ
らの構造は、正常な老化に伴うが神経変性疾患で増加す
る軸策内のユビキチン免疫反応性リソソーム密集体に対
応する^{２６、２７}。同様の点状構造がプリオン病に伴い
認められた^{２８、２９}。Ｌｅｗｙ小体を持つアルツハイ
マー病や痴呆の限定された数の研究症例では、パーシン
の免疫反応性は皮質の繊維濃縮体、アミロイドプラーク
またはＬｅｗｙ小体には観察されなかった（図５ａ）。
これらの発見は軸策病理学におけるパーシンと関係して
いるかもしれない。この様に、ＰＮＳに高いレベルのパ
ーシン発現があるので、末梢ニューロパチーを含む神経
変性疾患へのパーシンの関与をさらに研究することは、
重要となるであろう。

【００４２】結論として、我々は、発生段階及び老化神
経系において顕著な発現パターンを持つシヌクレイン蛋
白質ファミリーの新規メンバーを同定した。パーシンが
ニューロフィラメントネットワークの統合性に影響を与
えることを実証するとき、シヌクレインファミリーに対
し、潜在的機能、即ち神経変性疾患の病理生理学の理解
に重要な関係を持つかもしれない機能を割り当てた。

【００４３】実施例３シヌクレインベクターシステムの構築ｐＴＲＥへのパーシンのクローニングこの実施例は、ｐＴＲＥへのパーシンのクローニング
と、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体の
誘導的制御下でシヌクレイ（パーシン）を発現する安定
な細胞系の生成を可能とするプラスミッドシステムの生
成とを説明する。この様に、得られた構築物は、製造業
者のインストラクションと一致してｐＴｅｔ^ｏｎ（ＣＬ
ＯＮＴＥＣＨ）と関連して使用される。センスオリゴヌクレオチド：５’ＧＧＡＡＴＴＣＣ
ＡＴＣＣＴＴＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＧＧ３’
（ＳＥＱＩＤＮｏ１４）。アンチセンスオリゴヌクレオチド：５’ＣＧＧＧＡＴ
ＣＣＣＴＡＧＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＣ
ＴＴＧＧＣ３’（ＳＥＱＩＤＮｏ１５）。ＰＣＲ３０ｐモルの各オリゴヌクレオチド（上述の）を用い
て、ｐＭＥＸ−パーシン発現プラスミッド（Ｂｕｃｈｍ
ａｎら、ＮａｔｕｒｅＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、第
１巻、第２号、１９９８年６月）内からパーシンをコー
ドするｃＤＮＡフラグメントをＰＣＲ法で増幅した。ｐ
ＭＥＸ−パーシンのテンプレートＤＮＡは、プラスミッ
ドの−２０℃のストック（グリセロール；Ｌｕｒｉａブ
ロス；１：１）から取り出されたスクレーピングの形で
あった。細胞のスクレーピングが１００μｌのｄＨ_２Ｏ
中に置かれ、１００℃で１０分間インキュベートされ宿
主細菌の細胞壁を溶解し、プラスミッドＤＮＡを溶液中
に放出させた。１００μｌの反応に対し１μｌの細胞溶
解物を用いた。１ｘＰＣＲ緩衝液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒＭａｎｎｈｅｉｍ、高性能ＰＣＲシステム）；１．
５ｍＭＭｇＣｌ_２；２００μＭｄＮＴＰ；２．６Ｕ
高性能ＰＣＲシステム酵素（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭ
ａｎｎｈｅｉｍ）の存在下ＰＣＲが実施された。ＰＣＲ
の条件は以下の通りであった：９４℃ ２分間９４℃ １５秒＊５７℃ ３０秒＊７２℃ １分間＊２０サイクル７２℃ １０分間

【００４４】＊は終了したときに単一サイクルを含む、
設定温度での連続的時間間隔を示す。ＰＣＲに対し２０
サイクルが実行された。ＰＣＲ生産物が等量のクロロフ
ォルムにより抽出された。各反応液に、１／１０容量の
３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２容量の１００
％エタノールが添加された。これらを−２０℃で６０分
間放置し、次に２０分間１４，０００ｒｐｍで遠心し、
上清を吸引で除いた。５００μｌのエタノール（７０
％）が各チューブに添加された。チューブを１５，００
０ｒｐｍで２分間遠心し、上清を吸引で除いた。ペレッ
トを約１０分間空気乾燥して、９０μｌのｄＨ_２Ｏに再
サスペンドした。

【００４５】ＰＣＲ生産物を次に２０ＵのＥｃｏＲＩ及
び２０ＵのＢａｍＨＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ^ＴＭ）及び１
ｘ反応緩衝液３の存在下インキュベーションにより開裂
した。サンプルを１％の並みアガロースゲルで電気泳動
した。パーシンをコードするｃＤＮＡフラグメントに対
応するＤＮＡフラグメントが、アガロースから製造業者
のインストラクションに正確に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ
（ＱＩＡｇｅｎ^ＴＭ）を用いて単離された。

【００４６】ｐＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が上述のよ
うにＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ
^ＴＭ）の存在下開裂された。各反応液に、１／１０容量
の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び２容量の１０
０％エタノールが添加された。これらを−２０゜Ｃで６
０分間放置し、次に２０分間１４，０００ｒｐｍで遠心
し、上清を吸引で除いた。５００μｌのエタノール（７
０％）が各チューブに添加された。チューブを１５，０
００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を吸引で除いた。ペレ
ットを約１０分間空気乾燥して、１０μｌのｄＨ_２Ｏに
再サスペンドした。各残留サンプルを次に１％の並みア
ガロースゲルで電気泳動した。パーシンをコードするｃ
ＤＮＡフラグメントに対応するＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグ
メントが、アガロースから製造業者のインストラクショ
ンに正確に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡｇｅ
ｎ^ＴＭ）を用いて単離された。

【００４７】パーシンをコードするｃＤＮＡフラグメン
トが、線状にされたｐＴＲＥベクターに、最終モル比が
３：１（インサート：ベクター）で、０．５ＵＴ４ＤＮ
Ａリガーゼと１ｘライゲーション緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）の存在下インキュベーションによりライゲートされ
た。ライゲートされたＤＮＡが形質転換能のあるＴｏｐ
１０Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ^Ｒ）細菌宿
主に形質転換された。得られた形質転換体からのＤＮＡ
が、マウスパーシンをコードするｃＤＮＡフラグメント
の存在を証明し既知のオープンリーディングフレームが
保存されていることを確認するために、Ｔａｑサイクル
配列決定を用いて調べられた。

【００４８】実施例４シヌクレイン発現ベクターシステムの構築構成１μｇのｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクター（ＣＬＯＮＴＥ
ＣＨ）が、５０Ｕ（Ｗｅｉｓｓ単位）のＢｓｔＸＩ及び
１ｘ反応緩衝液Ｄ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈ
ｅｉｍ）の存在下、インキュベーション（３７℃、６０
分）により開裂された。パーシンをコードするｃＤＮＡ
フラグメントを含むベクター（ｐＴｒｅ−パーシン、実
施例３を参照）が、１ｘ反応緩衝液Ｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）の存在下、５０ＵのＢａｍＨ
Ｉで開裂された。

【００４９】上述の両方のベクターが、別々に、１０Ｕ
のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１ｘＴＥ（Ｔｒｉｓ１０ｍ
Ｍ、ＥＤＴＡ１ｍＭ）及び５００μＭのｄＮＴＰの存
在下、インキュベートされた（３７℃、５分間）。この
酵素を７５℃で２０分間インキュベートすることにより
熱変性した。各反応液に、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５．２）及び２容量の１００％エタノール
が添加された。サンプルを−２０℃で６０分間放置し、
次に２０分間１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清を吸引
で除いた。５００μｌのエタノール（７０％）が各チュ
ーブに添加された。チューブを１５，０００ｒｐｍで２
分間遠心し、上清を吸引で除いた。ペレットを約１０分
間空気乾燥して、４０μｌのＴＥ（１０ｍＭＴｒｉ
ｓ、１ｍＭＥＤＴＡ）に再サスペンドした。

【００５０】上述のベクターの両方が、別々に、５０Ｕ
（Ｗｅｉｓｓ単位）のＥｃｏＲＩと１ｘ反応緩衝液Ｈ
（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）の存在下
インキュベートされた（３７℃、６０分）。ｐＩＲＥＳ
−ＥＧＦＰを含む反応液に、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５．２）及び２容量の１００％エタノー
ルが添加された。サンプルを−２０℃で６０分間放置
し、次に２０分間１４，０００ｒｐｍで遠心し、上清を
吸引で除いた。５００μｌのエタノール（７０％）が各
チューブに添加された。チューブを１５，０００ｒｐｍ
で２分間遠心し、上清を吸引で除いた。ペレットを約１
０分間空気乾燥して、１６μｌのＴＥ（１０ｍＭＴｒ
ｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ）に再サスペンドした。このサ
ンプルを別々に、０．０２Ｕ（Ｗｅｉｓｓ単位）のコウ
シ腸アルカリ性フォスファターゼ［ＣＩＡＰ、（Ｇｉｂ
ｃｏＢＲＬ^ＴＭ）］、１ｘ脱燐酸化緩衝液及び１／２
０容量の希釈緩衝液の存在下、インキュベート（３０
℃、３０分）された。この酵素を７５℃で２０分間イン
キュベートすることにより熱変性した。

【００５１】残りのサンプル（ｐＴＲＥ−パーシン）を
１％の並みアガロースゲルで電気泳動した。パーシンを
コードするｃＤＮＡフラグメントに対応するＤＮＡフラ
グメントが、アガロースから製造業者のインストラクシ
ョンに正確に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ（ＱＩＡｇｅｎ
^ＴＭ）を用いて単離された。パーシンをコードするｃＤ
ＮＡフラグメントは、線状にされたｐＩＲＥＳ−ＥＧＦ
Ｐベクターに、最終モル比が３：１（インサート：ベク
ター）で、１０ＵＴ４ＤＮＡリガーゼと１ｘライゲーシ
ョン緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下インキュベーシ
ョン（１６℃、１８時間）によりライゲートされた。ラ
イゲートされたＤＮＡがＴｏｐ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎ^Ｒ）細菌宿主に形質転換され、組替えＤＮＡが
２％の並みアガロースゲルにより３個のＤＮＡ限酵素ＥｃｏＲＩとＭｌｕＮＩの存在下開裂された。

【００５２】実施例５：皮膚におけるパーシンの発現材料と方法分子生物学的手法ＲＮＡの抽出、ハイブリダイゼーションプローブの調
製、ｉｎｓｉｔｕ及びノザンハイブリダイゼーション
は前述のように実施された（３１、３８）。パーシン蛋白質のウエスタンブロッティング／ＥＣＬに
よる検出マウスの背中の皮膚のストリップが液体窒素で細かく砕
かれ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのローディング緩衝液中でホモ
ジナイズされ（３９）、沸騰水浴中で５分間インキュベ
ートされた。全蛋白質濃度はｄｏｔＭＥＴＲＩＣアッセ
イ（ＧｅｎｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）により測定され
た。１５μｇの全蛋白質がＳＤＳ−ＰＡＧＥに対して使
用された（３９）。Ｈｙｂｏｎｄ−ＰＶＤＦメンブレン
上への電気ブロッティングが、メンブレン供給業者（Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ）により推薦されたようにＴＲＩＳ／グ
リシン／メタノール緩衝液中で実施された。ＰＢＳで洗
った後、メンブレンは４％脱脂乳／ＰＢＳ／０．０５％
Ｔｗｅｅｎ−２０中室温で１時間ブロックされた。同じ
緩衝液が、一次（ＳＫ２３、１：５００）及び二次（Ｈ
ＲＰでコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇ（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）、１：２０００）抗体とのインキュベーショ
ン及び洗浄に使用された。一次ＳＫ２３抗体は、ウサギ
をマウスパーシンのＣ端側１５アミノ酸を含むペプチド
で免疫することにより作成された（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅ
ｃｈ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）。最終の２回の洗浄は、ＰＢＳ
／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で行われた。ＥＣＬによる
検出は、Ａｍｅｒｓｈａｍのプロトコールにより推薦さ
れたように実施された。

【００５３】免疫組織化学１５μｍの低温切片がアセトン中−２０℃で１０分間固
定され、乾燥され、ＴＢＴ（２０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣ
ｌｐＨ７．５；１５０ｍＭＮａＣＬ；０．１％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００）中の５％ヤギ血清でブロックされ、
続いて、１％ヤギ血清／ＴＢＴ中で４℃で１６時間、Ｓ
Ｋ２３抗体（１：５０）とインキュベートされた。切片
が１ヤギ血清／ＴＢＴで洗浄され、二次ＨＲＰコンジュ
ゲート抗体（Ｓｉｇｍａ）の供給業者により推薦されて
いるようにプロセスされた。

【００５４】結果と考察マウスのパーシンの合成Ｃ端側ペプチドに対する特異的
なポリクローナル抗体（ＳＫ２３）が、異なるマウス組
織から抽出された蛋白質のウエスタンブロット解析に対
し使用された。この抗体は、末梢知覚ガングリア及び中
枢神経系のサンプル中に約１６ｋＤａの単一バンドを検
出した（４０）。成体の皮膚は、パーシン蛋白質のかな
りのレベルが検出される唯一の非神経組織であった。主
たる１６ｋＤａのバンドに加えて、おそらく凝集生産物
を表す移動度がより遅い微量バンドがいくつかの皮膚サ
ンプルに見出された。皮膚と神経サンプルのバンドは、
抗体がパーシン蛋白質のＣ端側ペプチドか組替えＧＳＴ
融合パーシン蛋白質のいずれかの過剰と予めインキュベ
ートされると、消失した。

【００５５】マウスの胎児の皮膚にパーシンｍＲＮＡは
かって検出されたことはないので、我々は皮膚のパーシ
ン発現の発生時間経過を確かめるためにノザン及びウエ
スタンブロッティングを用いた。我々の結果は、皮膚に
おけるパーシンｍＲＮＡと蛋白質の発現は出産５日後に
始まり、成体に至るまで維持されることを示す。パーシ
ン蛋白質の類似のレベルが毛髪の皮膚及び無毛の皮膚か
ら抽出された全蛋白質のサンプルに見出され、パーシン
発現は毛髪の成長とは相関関係がないことを示唆した。
インサイチューハイブリダイゼーション（図１０ａ）と
免疫組織化学（図１０ｂ、ｃ）の両者がパーシン発現は
表皮の顆粒層に限定されていることを示した。

【００５６】パーシンと他のシヌクレインの生理学的役
割は明瞭ではない。最近、我々はパーシンが培養知覚ニ
ューロンでニューロフィラメントネットワークの統合性
の制御に役割を果たしていることを示した（４０）。我
々が顆粒層に発生学的に制御されたパーシン発現のパタ
ーンを証明したことは、皮膚におけるパーシンの平行し
た機能が存在する可能性を高めている。細胞骨格、特に
サイトケラチンネットワークにおける本質的な変化が表
皮の細胞分化の最終段階に生じ、パーシンがこれらの細
胞のサイトケラチンネットワークの再編成に役割を果た
していることが考えられる。興味深いことに、パーシン
／ＢＣＳＧ_１の発現がある上皮性癌で検出され、悪性乳
がんにおけるパーシン発現のレベルは腫瘍の段階と直接
に相関している（４１、４２）。良性から高度に悪性の
浸潤性乳がんへの進展にはまたしばしばサイトケラチン
や他の中間フィラメントネットワークの構造的再編成が
伴う（４３、４４）。

【００５７】α−シヌクレインが神経変性病の患者のＣ
ＮＳにおけるＡβ−アミロイド沈着物及びＬｅｗｙ体の
形成に分子チャペロンとして機能していることが提案さ
れている（７、２５）。しかしながら、ある状況下では
シヌクレイン自体が細胞内外沈殿物を形成している可能
性もある。というのは、シヌクレインはｉｎｖｉｔｒ
ｏホモポリマーやアミロイド状の原繊維を形成すること
ができるからである（８、９）。我々は、組替えパーシ
ンもまた溶液中で凝集し、α−シヌクレインと非常に類
似した結合特性を持つＡβ−ペプチドに結合することを
示してきた。異常な蛋白質および／またはペプチドの沈
着が神経変性病のみならず他の組織を含む幾つかの病理
学的状態に観察される。Ａβ−アミロイドの沈着物を含
むこの様な沈着物は、老化及び病気の皮膚にも観察され
（４５−４７）、パーシンは皮膚における他の高分子の
凝集と沈着の引き金を引く候補因子であるだろう。

【００５８】結論として、我々の発見は、パーシンが表
皮の発生に参加し、皮膚損傷の病因に含まれているかも
しれないことを示唆している。この様に、神経変性及び
腫瘍性疾患に加えて、皮膚疾患におけるパーシン構造と
発現の異常を探索することは重要であろう。

【００５９】実施例６神経芽腫細胞におけるパーシンの過剰発現と免疫細胞化
学材料と方法Ｎｅｕｒｏ２ａ（神経芽腫）細胞を、１２穴組織培養プ
レート内の顕微鏡カバースリップ上で生育した。８ｘ１
０４のＮｅｕｒｏ２ａ細胞に、製造業者のインストラク
ションに従い、１：１及び２：１の充填比でＴｒａｎｓ
ＦａｓｔＴｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下、１．４−２
μｇのＤＮＡ（ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−Ｐｅｒｓｙｎ）
を一時的にトランスフェクトした。細胞を１ｍｌの血清
を含まない培養液（最少必須培養液、２ｍＭグルタミ
ン、１％非必須アミノ酸）の存在下１時間インキュベー
トし、次に、１ｍｌの完全培養液（最少必須培養液、２
ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸及び１０％ウシ胎
児血清）を上に重ね、４８時間インキュベートした。

【００６０】免疫細胞化学全ての培養液がプレートの穴から吸引で除かれ、細胞は
１ｍｌの１ｘＰＢＳ（２回）で洗浄され、生理食塩水は
各洗浄後に吸引で除かれた。細胞は次に４％のパラフォ
ルムアルデヒドに浸され、３０分間室温でインキュベー
トされた。細胞は次に１ｍｌの１ＸＰＢＳ（２回）で洗
浄され、生理食塩水は各洗浄後に吸引で除かれた。細胞
は次にＮＦ−Ｈに対する１０μｌの抗体ＮＥ１４（Ｓｉ
ｇｍａ、［タイター１：４０、製造業者の推薦によ
り］）により上重ねされた。細胞は次にＮＥ１４の存在
下４℃で終夜インキュベートされた。続いて、細胞は１
ｍｌの１ｘＰＢＳにより１−２時間洗浄され、この間３
回生理食塩水は除かれ置換された。細胞は次に１０μｌ
（１０μｇ／ｍｌ）のＴｅｘａｓＲｅｄ−Ｘ（分子プロ
ーブ）により上重ねされ、２時間以上の間暗所でインキ
ュベートされた。続いて、細胞は１ｍｌの１ｘＰＢＳに
より１−２時間洗浄され、この間３回生理食塩水は除か
れ置換された。固定媒質（９：１、グリセロール：１ｘ
ＰＢＳ［２５ｍｇ／ｍｌＤＡＢＣＯ］）を用いてスラ
イドにカバースリップが固定された。

【００６１】結果：神経芽腫細胞におけるパーシンの過
剰発現神経芽腫細胞におけるパーシン蛋白質の過剰発現の効果
を調べるために、我々は一時的にパーシン発現／レポー
タープラスミッドによりｎｅｕｒｏ２ａ細胞をトランス
フェクトした。パーシン蛋白質の発現が陽性の細胞は、
一斉に高い緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ［Ｃｌｏｎｔｅｃ
ｈ］）を発現する（図１１Ａ及びリジェンド）。ニュー
ロフィラメント蛋白質ＮＦ−Ｈの劇的な減少が、ｐＩＲ
ＥＳ−ＥＧＦＰ−パーシンをトランスフェクトされなか
った同じ視野の細胞と比較して、パーシンを過剰発現し
ているニューロンに観察された（図１１Ｂ、Ｃ）。染色
の顕著な減少は、パーシン発現プラスミッド（ｐＩＲＥ
Ｓ−ＥＧＦＰ−パーシン）でトランスフェクトした細胞
でのみ観察された（図１１Ｃ及びリジェンド）。この実
施例は、パーシンが、既存のニューロフィラメントネッ
トワークにおいて変化が誘導されることに対し少なくと
も部分的には責任があることを再び示している。さら
に、この実施例は、パーシンの生物活性が細胞ベースの
アッセイ系内でｉｎｖｉｔｒｏで効率よく再現される
ことができることを示し、実施例２に報告されている実
験を支持している。本発明の範囲を逸脱せずに修飾と改
良が取り込まれてもよい。

【００６２】

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Ｓ．、Ｈｅｉｎｏｎｅｎ、Ｏ．、Ｎｅｉｔｔａａｎｍａ
ｋｉ、Ｈ．、Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ、Ｒ．、Ｐａｌｊａｒ
ｖｉ、Ｌ．、Ｓｙｒｊａｎｅｎ、Ｋ．、Ｂｅｙｒｅｕｔ
ｈｅｒ、Ｋ．、及びＲｉｅｋｋｉｎｅｎ、Ｐ．、Ｌａｎ
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【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、マウスパーシンと他のシヌクレインフ
ァミリーメンバーの間の相同性を示す。ファミリーのメ
ンバーの全てにおいて同一というわけではないか、また
はひとつのメンバーを除いて同一ではないアミノ酸は、
太文字で示される。ギャップ（−）がより良い整列を得
る為に導入された。抗体生産に対する抗原として使用さ
れるペプチドは、箱状に囲まれている。アステリックス
は、ヒトとマウスパーシン両者において野生型のα−シ
ヌクレインの様にアラニンではなく、あるパーキンソン
病家族に見られる突然変異したα−シヌクレインの様に
スレオニンである５３番目のアミノ酸をマークしている
^１０。配列登録番号は：シビレエイ（カリフォルニア）
のシヌクレイン−Ｐ３７３７９；ラットのシヌクレイン
１、２、３−同じ遺伝子からの異なるスプライシング生
産物−Ｓ７３００７、Ｓ７３００８、Ｓ７３００９；ヒ
トα−シヌクレイン（シヌクレイン１／ＮＡＣＰ）−Ｌ
３６６７４；ヒトβ−シヌクレイン（シヌクレイン２）
−Ｓ６９９６５；ウシのシヌクレイン−Ｐ３３５６７；
シマウマフィンチシネルフィン−Ｌ３３８６０；ラット
のシヌクレイン様−Ｘ８６７８９。

【図２】図２は、マウスとラットの組織におけるパーシ
ンｍＲＮＡの発現を示す：（ａ、ｂ）５−２０μｇの全
ＲＮＡとニックトランスレーションしたパーシンプロー
ブとのノザンハイブリダイゼーション。ＲＮＡがＥ１３
マウス胎児組織（ａ）及び新生児ラット組織（ｂ）から
単離された。プローブをはずした後、フィルター上に存
在する各組織からの全ＲＮＡの量を示すために、同じフ
ィルターを、マウスＬ２７リボゾーム蛋白質をコードす
るニックトランスレートしたｃＤＮＡフラグメントでハ
イブリダイズした。ＴＧ−三叉神経ガングリア；ＤＲＧ
−背根ガングリア。（ｃ−ｅ）、胎児マウス組織とＤＩ
ＧラベルしたアンチセンスｃＲＮＡパーシンプローブと
のインサイチューハイブリダイゼーション。（ｃ）、Ｅ
１１マウス胎児のスライドグラス全体のインサイチュー
ハイブリダイゼーション。ＴＧ、三叉神経ガングリオ
ン；ＶＧ、前庭ガングリオン；ＧＧ、膝のガングリオ
ン；ＪＧ、頚のガングリオン；ＮＧ、節状ガングリオ
ン；ＤＲＧ、背根ガングリア；ＭＮ、脊髄の腹側の角の
運動ニューロン。（ｄ）、Ｅ１０、Ｅ１１及びＥ１２胎
児の前肢芽での横断切片。ＶＳＣ、脊髄の腹側の角の運
動ニューロン。バー＝１ｍｍ。（ｅ）、Ｅ１１マウス胎
児頭部の冠状切片のフラグメント。ＴＧ、三叉神経ガン
グリオン；ＨＢ、後部脳；ＯＭＮ、動脈神経の核。バー
＝０．２ｍｍ。

【図３】図３（ａ−ｄ）は、マウスの神経細胞体におけ
るパーシン蛋白質の免疫組織化学的局在と突起を示す：
Ｅ１１マウス胎児頭部の冠状切片の三叉神経（ａ）及び
三叉神経ガングリアニューロン（ｃ）におけるパーシン
蛋白質の検出。抗マウスパーシン抗体及びＦＩＴＣでコ
ンジュゲートした抗−ウサギ免疫グロブリンを使用。
（ｂ、ｄ）、抗−ニューロフィラメント−Ｍモノクロー
ナル抗体及びＴＲＩＴＣでコンジュゲートした抗マウス
免疫グロブリンで染色した同じ切片。（ｃ−ｇ）、抗マ
ウスパーシン抗体を用いたパーシン蛋白質のウエスタン
ブロティング／ＥＣＬ検出。（ｅ）パーシン発現の発生
時間経過。胎児（Ｅ）または新生児（ＰＯ）マウスの三
叉神経ガングリアからの等量（１５μｇ）の全蛋白質が
分析された。（ｆ）、マウス脳からの細胞レベル下のパ
ーシン。細胞レベル下分画からの２０μｇの全蛋白質
（実施例を参照）が分析された。（ｇ）、出産３日後
（Ｐ３）、７週後（７Ｗ）、及び７ヶ月後（７Ｍ）の脊
髄及び脳皮質におけるパーシン発現。

【図４】図４は、パーシンを過剰発現しているニューロ
ンにおける細胞骨格蛋白質を示す。生後の培養知覚ニュ
ーロンの適合顕微鏡写真。パーシン発現プラスミッドを
マイクロインジェクションした７２時間後パーシン（Ｆ
ＩＴＣ）及び細胞骨格蛋白質（ＴＲＩＴＣ）に対して二
重染色された。各顕微鏡写真はインジェクトしたニュー
ロンとインジェクトしていないニューロンを含む。イン
ジェクトしていないニューロンと比べて、パーシン発現
プラスミッドをインジェクトしたニューロンのＮＦ−Ｍ
染色が減少していることに留意を要する（同様な結果が
他のニューロフィラメント蛋白質に対して得られた。図
７を参照）。カルシウム依存性蛋白質分解酵素のインヒ
ビター、カルペプチンをインジェクトしたニューロンを
インキュベートすると、パーシンの過剰発現がニューロ
フィラメント染色に及ぼす効果を抑制した。パーシンの
過剰発現はチュブリン及びペリフェリンに対する染色に
影響を与えなかった。

【図５】図５は、抗ヒトパーシン抗体で染色され、皮質
白質における点状構造を示すＬｅｗｙ体を有する痴呆症
の皮質切片（ａ）と皮質Ｌｅｗｙ体の染色のないもの
（ｂ）の顕微鏡写真を示す。棒グラフは、フィルターに
固定化されたＡβペプチドへのパーシンの結合を示す
（ｃ、ｄ）。０．５ｎｍｏｌのＡｂ１−４０、１−２８
または２５−３５ペプチドがニトロセルロースメンブレ
ンフィルター上にスポットされ、３７℃で１６時間２μ
Ｍのパーシン溶液中でインキュベートされた。三つの実
験の平均と標準誤差が示される（ｃ）。２μＭのパーシ
ンが、０、１０、または５０μＭのＡｂ２５−３５と３
７℃で１６時間予備インキュベートされ、その後０．５
ｎｍｏｌのＡｂ１−４０ペプチドがスポットされたフィ
ルターとインキュベートされた。三つの実験の平均と標
準誤差が示される（ｄ）。

【図６】図６は成体のマウスの皮質ニューロンにおける
パーシンｍＲＮＡの発現を示す。ＤＩＧでラベルしたパ
ーシンｃＲＮＡプローブによる成体マウス脳の低温切片
のインサイチューハイブリダイゼーション。正面の脳皮
質のフラグメントが示される。

【図７】図７は、パーシン発現プラスミッドをマイクロ
インジェクトした培養知覚ニューロンにおけるニューロ
フィラメントの免疫染色の減少を示す。インジェクショ
ン後２４時間でのＮＦ−Ｍに特異的な抗体で染色した三
叉神経ニューロン（ａ、ｃ）、及び、インジェクション
後７２時間でのＮＦ−Ｈに特異的な抗体で染色した節状
ニューロン（ｂ、ｄ）の例。正常（ａ、ｂ）及びパーシ
ン過剰発現（ｃ、ｄ）ニューロンの両者が、免疫蛍光染
色により視覚化されているように、それぞれ一対の顕微
鏡写真上に示される。図は、赤（ｃ、ｄ）と緑（ａ、
ｂ）の細胞が相互に相容れない２集団として存在するこ
とを示す。（上部パネルの”正常”ニューロンの細胞体
における黄色のシグナル（白色の矢）は強いロダミン蛍
光が蛍光チャンネルに流れ出たことによる。）また、あ
る残存ニューロフィラメント染色がパーシンを過剰発現
したニューロンの細胞体に残っているけれども、これら
の細胞の突起は実質的にＮＦ−陰性である。これは、ロ
ダミンと蛍光チャンネルによる突起の染色が完全にオー
バーラップしないパターンを生み出している。

【図８】図８は、３Ｔ３繊維芽細胞におけるパーシンの
異所性発現がビメンチンの免疫染色に影響を与えないこ
とを示す。繊維芽細胞がパーシン発現プラスミッドでト
ランスフェクトされ、ウサギポリクローナル抗パーシン
抗体とマウスモノクローナル抗ビメンチン抗体で免疫染
色された。

【図９】図９は、中間フィラメントの崩壊活性を持つフ
ラグメントのラセン車輪表示を示す。

【図１０】図１０は、皮膚表皮の顆粒層におけるパーシ
ン発現。（ａ）、低温切片をＤＩＧでラベルしたアンチ
センスｃＲＮＡパーシンプローブでインサイチューハイ
ブリダイズしたもの。マウスの厚い皮膚のフラグメント
（足裏の厚肉の横断切片）が示される。（ｂ、ｃ）、隣
接の切片が、アフィニティーで精製したＳＫ２３抗体と
ＨＲＰでコンジュゲートした抗ウサギ免疫グロブリンに
よるパーシン蛋白質の免疫組織化学的検出に対し使用さ
れた。スケールバーはパネルａ及びｂに対して２００μ
ｍであり、パネルｃに対しては５０μｍである。

【図１１】図１１はパーシン発現ベクター（ｐＩＲＥＳ
−ＥＧＦＰ−パーシン）により一時的にトランスフェク
トしたＮｅｕｒｏ２ａ細胞（神経芽細胞腫）。図Ａは、
付随のＥＧＦＰ発現により示される様に、パーシンを発
現する細胞を例証する。図Ｂは、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
−パーシン発現ベクターによりトランスフェクトして４
８時間後、ニューロフィラメント（ＮＦ−Ｈ）蛋白質
（ＴｅｘａｓＲｅｄ−Ｘ）に対して染色された細胞を
例証する。図Ｃは、画像Ａ及びＢの重ねたものを示す。
ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−パーシンによりトランスフェク
トされていない細胞と比べて、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ−
パーシン発現／レポータープラスミッドによりトランス
フェクトした細胞内のニューロフィラメント−Ｈに対応
する染色が劇的に減少している点に留意を要する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者アンドリュースミスマッカリオン英国，ジー３６エスエフ，グラスゴー, フラット３／１ローズストリート (72)発明者ヴァルディミアールヴォビッチブッチマン英国，ケー，ワイ16 ８デーキュー，ファイフェ，セントアンドリュース，47 キルリーモントロード (72)発明者アルンミルワードデイビス英国，ケーワイ16 ９イーティー，ファイフェ，セントアンドリュース，２レードブレス，ネザーバーン

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】シヌクレイン感受性蛋白質の過剰分解また
は蓄積により特徴付けられる疾患または障害の診断方
法、あるいはその疾患へのかかり易さを決定する方法で
あって、ａ）患者から適当な組織サンプルを得ること；ｂ）前記サンプルを用いてシヌクレインの存在またはそ
の特徴を分析すること；及びｃ）得られた結果を既知の標準と比較すること；を含む
方法。
【請求項２】ａ）患者から適当な組織サンプルを得るこ
と；ｂ）前記サンプルのシヌクレイン（例えば、パーシン）
のｅｘｖｉｖｏレベルを決定すること；及びｃ）そのレベルを既知の標準と比較すること；を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】ａ）患者から適当な組織サンプルを得るこ
と；ｂ）前記サンプルからシヌクレイン（例えば、パーシ
ン）またはそれをコード化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）するポ
リヌクレオチドを単離すること；ｃ）前記シヌクレインまたは前記ポリヌクレオチドを既
知の標準と比較し、そこに関連のある差（例えば、配列
または物理的性質における差）が存在するかどうかを決
定すること；を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記シヌクレイン感受性蛋白質は中間フィ
ラメント蛋白質である、請求項１〜３のいずれかに記載
の方法。
【請求項５】前記シヌクレイン感受性蛋白質は神経フィ
ラメント蛋白質またはサイトケラチン蛋白質である、請
求項４に記載の方法。
【請求項６】ステップｂのシヌクレインは、ヒトのパー
シン（ｐｅｒｓｙｎ）（またはそれと同類体、修飾体ま
たは機能的に等価体），マウスのα−シヌクレイン，ヒ
トのα−シヌクレインまたはヒトのβ−シヌクレインで
ある、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】ステップｂのシヌクレインはヒトのパーシ
ンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】ステップｃの既知の標準はヒトのパーシン
またはマウスのパーシン（またはそれと同類体、修飾体
または機能的に等価体）、ヒトのα−シヌクレインまた
はヒトのβ−シヌクレインである、請求項１〜７のいず
れかに記載の方法。
【請求項９】ステップｃのシヌクレインがヒトのパーシ
ンまたはマウスのパーシンである、請求項８に記載の方
法。
【請求項１０】ステップｃの既知の標準は、誘導可能な
プロモーターの制御下に安定な細胞系から発現されるシ
ヌクレインである、請求項１〜９のいずれかに記載の方
法。
【請求項１１】シヌクレインがテトラサイクリンまたは
テトラサイクリン誘導体誘導可能なプロモーターの制御
下に安定な細胞系から発現されている、請求項１０に記
載の方法。
【請求項１２】癌，神経変性障害または皮膚障害のスク
リーニング、診断またはモニターをするための請求項１
〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】乳がんまたは皮膚癌の診断に用いる、請
求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】神経変性障害の診断に用いる、請求項１
〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】シヌクレインの異常細胞内レベルによる
細胞内中間フィラメントの障害と戦うための方法であっ
て、損害を受けている細胞を同定し、そこの生物学的効
果量の前記シヌクレインを修飾する方法。
【請求項１６】中間フィラメントの損傷を有する前記細
胞は請求項１〜１４のいずれかに記載の方法によって同
定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記生物学的効果量の前記シヌクレイン
はアンチセンスＲＮＡの存在により減少している、請求
項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】前記生物学的効果量の前記シヌクレイン
はその遺伝子と欠陥変形体との相同的組み替えにより減
少している、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１９】シヌクレインの生物活性と戦い得る治療
剤をスクリーニングする方法であって、ａ）シヌクレインの生物活性を実証できるシステムを得
ること；ｂ）前記システムに推定治療剤をかけること；及び、ｃ）前記治療剤がシヌクレインの生物活性に影響を与え
るかどうかを決めること；を含む方法。
【請求項２０】ステップａ）のシステムは、シヌクレイ
ンの発現系をトランスフェクトしたプライマリー細胞培
養または細胞系である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】シヌクレインの発現系はシヌクレインｐ
ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰベクターである、請求項２０に記載
の方法。
【請求項２２】ステップａ）のシステムはシヌクレイン
をマイクロインジェクションしたプライマリー細胞培養
または細胞系である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】ステップａ）のシステムは、ケラチノサ
イト，神経先祖細胞，神経芽細胞または神経様細胞系で
ある、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】前記シヌクレインはパーシンである、請
求項１９〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】シヌクレインは誘導可能なプロモーター
の制御下に安定な細胞系で発現されている、請求項１９
〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】シヌクレインはテトラサイクリンまたは
テトラサイクリン誘導体誘導可能なプロモーターの制御
下に安定な細胞系で発現されている、請求項２５に記載
の方法。
【請求項２７】本質的にＳＥＱＩＤＮｏ２またはＳ
ＥＱＩＤＮｏ４に提示されているようなアミノ酸配
列を有するパーシン。
【請求項２８】影響を受けている組織の細胞内中間フィ
ラメント構造が変化しているような癌，神経変性障害ま
たは皮膚障害を診断する方法における、請求項２７に記
載のパーシンの使用。
【請求項２９】本質的にＳＥＱＩＤＮｏ１またはＳ
ＥＱＩＤＮｏ３に提示されているようなヌクレオチ
ド配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３０】パーシンをコードするヌクレオチド配列
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３１】請求項２９または３０に記載のポリヌク
レオチドを含みパーシンを発現し得る、遺伝子組替え発
現システム。
【請求項３２】請求項２９または３０に記載のポリヌク
レオチドを含むベクター。
【請求項３３】請求項３１に記載の発現系を含むベクタ
ー。
【請求項３４】登録番号１３０４９の下にＮＣＴＣに委
託されているベクターｈＰＥＲＳ−ＧＥＸ。
【請求項３５】ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ１３０５０
の下にＮＣＴＣに委託されているベクターｍＰＥＲＳ−
ＢＳＩＩ。
【請求項３６】請求項３２〜３５のいずれかに記載のベ
クターにより形質転換した宿主細胞。
【請求項３７】ゲノムに安定に組み込まれた、請求項３
１に記載の組替え発現系を有するトランスジェニック哺
乳動物。
【請求項３８】請求項２９または３０に記載のポリヌク
レオチドから発現されたパーシン。
【請求項３９】影響を受けている組織の細胞内中間フィ
ラメント構造が変化しているような癌，神経変性障害ま
たは皮膚障害を診断する方法における、請求項３８に記
載のパーシンの使用。