JPH11243944A - 製パン用乾燥耐性実用パン酵母 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 ２倍体にしたとき実用パン酵母となる接
合型ａを有する１倍体酵母のＡＴＨ１及び／又はＮＴＨ
１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１及び／又は
ＮＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母と、２倍体にしたとき実
用パン酵母となる接合型αを有する１倍体酵母のＡＴＨ
１及び／又はＮＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなる
ＡＴＨ１及び／又はＮＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母とを
交雑してなる２倍体実用パン酵母を用いて作成した製パ
ン用乾燥酵母。 【効果】 砂糖液で復元する必要がなく、水の存在のみ
ですぐに立ち上がり、迅速に且つ各種のしかも風味のす
ぐれたパンを製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、きわめてすぐれた
乾燥耐性実用パン酵母に関するものである。従来にも乾
燥耐性のパン酵母は作られている。これらの酵母は、製
品形態としていわゆるドライイーストとして使用されて
おり、製品形態では長期間の保存に適している。しかし
現在市販されているドライイーストの種類は、１．比較
的糖濃度の低いパン（フランスパン等）用、２．比較的
糖濃度の高い高糖生地用（菓子パン等）の２種類しか生
産されておらず、特にこの酵母を用いて製造されたパン
が風味面で特徴があるものではなく、単に製パン生地中
の配合中の大雑把に２分された糖濃度にのみ注目し、生
地膨張力がその環境下で比較的強いことから選抜されて
いるものである。本発明では、生地中の糖濃度の違う環
境下における発酵力の強さのみではなく種々の特徴ある
美味な風味を有するパンを作ることができる実用パン酵
母の性能をそのままに、乾燥耐性を付与することが可能
になり、より多くの種類の実用パン酵母を製品形態とし
て保存性が優れたドライイーストとして供給することが
可能になり、この意味で本発明の乾燥耐性実用パン酵母
は格段にすぐれたものである。

【０００２】すなわち、本発明によれば、種々すぐれた
性質を有する実用パン酵母で乾燥耐性を有していないも
のに対してＡＴＨ１遺伝子あるいはＮＴＨ１遺伝子どち
らか一方のみを不活化するだけという新規構成を採用す
ることにより、通常の市販ドライイースト用のパン酵母
と同等もしくはそれ以上の乾燥耐性を、付与することが
可能となるのである。従って、本発明は、現在用途が多
様化する製パン方法に適し、保存性の高いドライイース
トの供給が可能となりパン業界に益するところきわめて
大である。

【０００３】

【従来の技術】乾燥耐性パン酵母は、いわゆるドライイ
ーストという製品形態で製造されている。市販されてい
る製パン用ドライイーストは、その製法と性状から大き
く２種類に分類される。一方は、その製造に特殊な機器
を必要としない一般にアクティブドライイーストと呼称
されるもので水分含量１０％程度で比較的保存可能期間
が短く通常粒状であり、使用に際しては砂糖を加えたぬ
るま湯に溶解して数十分間活性化を行った後パン生地に
混捏する。もう一方は、一般にインスタントドライイー
ストと呼称されるもので、水分含量が４％程度で長期間
（真空未開封であれば数年間）の保存が可能であり、使
用にさいしては、一旦ぬるま湯に溶解した直後あるいは
直接、活性化することなしに生地に混捏する。

【０００４】しかしながら上記したように、従来既知の
製パン用ドライイーストにはバリエーションが少ないこ
とに鑑み、実用パン酵母の性能をそのまま有し（いわゆ
る立上がり早く、且つ各種タイプのパンでしかも風味や
食感がすぐれたパンを製造することができる性能）、乾
燥耐性を有するすぐれた実用パン酵母の開発が当業界に
おいて強く求められている。

【０００５】なお、ここでいう乾燥耐性とは、製パン用
ドライイーストの中でも特に前記したインスタントドラ
イイーストを製造するために必要な菌株に要求される特
性を言う。すなわち、工業的な培養条件で効率良く増殖
することが可能で、流動層乾燥という特殊な工業的乾燥
法で乾燥し保存した後に復水直後からパン生地を良く膨
張させる能力を言う。

【０００６】本発明者らは、先に、トレハロースの保持
力を高めることによって、冷凍生地耐性、高糖生地耐性
を獲得するのに成功し、既に特許出願等も行った（ＮＴ
Ｈ１（中性トレハラーゼ遺伝子）遺伝子破壊：特願平８
−２９７８８６号、ＡＴＨ１（酸性トレハラーゼ遺伝
子）遺伝子破壊：特願平９−３５２０１６号、高野ら
（農水省、食総研）：日本食品工学会大会（１９９
７））。

【０００７】そして、乾燥耐性は、トレハロース含量を
上昇させることによってのみ獲得できるものと考えら
れ、このための手法として、トレハラーゼ遺伝子の破壊
がJohnKimら（California大学）により示唆された（App
lied and Environmental Microbiology, Vol.62, No.5
（1996））。しかし、これらの研究は実験室株を用いて
行われたものであり、実用パン酵母においてこのＡＴＨ
１遺伝子破壊が実際に有用性を持つことは実施されてい
ない。換言すれば、この研究は実際の製パン工業におい
て確認されたものではなく、現時点では工業上の利用性
は全く確認されていない。このように、実際には、トレ
ハロース含量の向上のみでは乾燥耐性を獲得することは
不可能であり、乾燥菌体（ドライイースト）の復水の際
のエネルギー源としてトレハロースが利用されるため、
ＮＴＨ１遺伝子を破壊することによりその菌体内の中性
トレハラーゼ活性が０となる実験室株では獲得できない
性能である。同様にＮＴＨ１活性が実用菌株に比して低
い実験室株において、ＡＴＨ１遺伝子を破壊した株にお
いてＮＴＨ１遺伝子のみで復水の際に必要なトレハラー
ゼ活性を有しているとは考えられない。

【０００８】酵母 Saccharomyces cerevisiae を実用パ
ン酵母として用いるためには、種として Saccharomyces
cerevisiae であることの他に、種々の実用面での要素
が必要である。例えば、1.工業的に培養が可能であるた
めには、現在パン酵母を工業的に培養する際一般的に用
いられている廃糖蜜培地での増殖性（増殖速度が早いこ
と、収量が多いこと）、パン酵母を培地より分離する際
の効率、パン酵母を製品形態にする際の脱水行程の効率
（この行程にはデハイドレーターという特殊な機器が用
いられる）。2.製品としては、長期間（２〜３週間程
度）の冷蔵保存期間に活性（パン生地膨張力）が維持さ
れること、この間軟化しにくいこと、廃糖蜜の色が吸着
しにくく白いこと等が基本的に必要な事項で、この他
に、各種の製パン方法に適合した性能が要求される。

【０００９】このため、これらの選抜をされていない実
験室株がそのまま実用パン酵母として用いることのでき
る可能性はほとんどない。また、これらの要素は通常１
つの遺伝子により支配されていることはまれで、複数の
遺伝子により規定されていることが一般的で、しかも実
用パン酵母の性能と遺伝子との関連を結び付けるような
研究例は極めて少ない。

【００１０】実験室株とは異なり、実用パン酵母は、高
次倍数体であることが多く、また胞子形成をしにくいた
め、実験室株で通常行われていた古典的な育種法を基に
した掛け合わせ／胞子分離による育種法を用いることさ
え非常に困難であり、優良な実用パン酵母の選別には、
専ら長年実用的に用いられてきた菌株の自然突然変異株
の選抜或いは自然界からのスクリーニングに頼ってい
た。古典的な育種法がパン酵母に初めて適用されたの
は、郡家らによるレアーメイティングの開発(Genetics,
Vol.70 (1972))以降で、応用例は1982年出願の特許公
報『サッカロマイセス・スペシーズFD612』（特公平1-1
6155号)に初めて記載された。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】先に記した様に製パン
用ドライイーストにはバリエーションが少ない、これは
乾燥耐性が酵母細胞内のどのような因子に支配されてい
るかが未確定であるため、そのスクリーニングに多大な
労力を要するためであり、実際には、工業的な培養方法
である流加培養法で培養し適度の発酵力と適度のトレハ
ロース含有量とし、工業的に利用されているのと同等の
流動層乾燥装置を用いて乾燥適性試験をしなくてはなら
ないことに起因する。また、パン用ドライイーストを交
雑法により育種しようとする試みはほとんどなされてい
ない。

【００１２】そこで本発明では、菌体内の各種ストレス
対応物質としてトレハロースに注目し、乾燥の際に必要
な保護物質として蓄積量の向上、これに加えて特に製パ
ン用ドライイーストに要求される復水時に細胞が活性を
取り戻すためのエネルギー源としての利用という観点か
ら、研究を進め完成にいたった。

【００１３】

【課題を解決するための手段】ＮＴＨ１遺伝子あるい
は、ＡＴＨ１遺伝子破壊によって乾燥によっても死滅し
にくい酵母は一応の造成は可能であるかもしれないが、
美味なパンを製造することのできる乾燥耐性実用パン酵
母が得られていないところから、本発明者らは、種々優
れた性能を有する実用パン酵母で乾燥耐性を有していな
いものに対して、種々優れた性能はそのままで、市販乾
燥耐性酵母と同等もしくはそれ以上の乾燥耐性を付与す
るために、出発酵母株から最終の乾燥酵母からのパンま
でを詳細に分析し、多くの実験を重ねた結果、本発明を
完成するに至った。

【００１４】本発明は、２倍体にしたとき実用パン酵母
となる１倍体酵母のＮＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作し
てなるＮＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母に関するものであ
る。また、本発明は、２倍体にしたとき実用パン酵母と
なる１倍体酵母のＮＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作して
なるＮＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母を１もしくは２以上
用いて交雑してなる２倍体以上の乾燥耐性実用パン酵母
に関するものである。

【００１５】さらに本発明は、２倍体にしたとき実用パ
ン酵母となる１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊
操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母に関するも
のである。また、本発明は、２倍体にしたとき実用パン
酵母となる１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操
作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母を１もしくは
２以上用いて交雑してなる２倍体以上の乾燥耐性実用パ
ン酵母に関するものである。

【００１６】

【発明の実施の形態】１．（２倍体にした時実用パン酵
母となる１倍体の選抜、マーカーの付与） 本発明においては、遺伝子操作する酵母株の選別が必須
となるものである。まず、その酵母株としては１倍体酵
母を選び、その酵母がａ型かα型かを知らなければなら
ない。選んだ１倍体酵母とあらかじめ用意したα型１倍
体酵母とを等量混合培養することによって数時間以内に
顕微鏡で接合を確認できるものであれば、その酵母はａ
型と確定できる。また、別々にａ型１倍体酵母と等量混
合培養によって接合を確認できるものであればα型と確
定できる。実験を目的とした場合には、この段階でマー
カーを付与する次行程に移ることができるが、実用パン
酵母の造成を目的とするには、以下の選抜行程が必須で
ある。

【００１７】ａ型又はα型の１倍体酵母は、α型又はａ
型の１倍体酵母と交雑させ、ａ／α型の２倍体酵母を造
成し、第１段階として先に述べた工業的に製造が可能で
あることを指標に大量培養試験により選抜した。さらに
第２段階としてここで培養した菌体が先に述べた製品と
しての要件を満たすことを指標に選抜した。最終的に
は、この２段階の選抜を受けた菌株を培養して得た菌体
を用いて各種のパンを作り、すぐれたパンが出来たもの
から選んで遺伝子操作する１倍体酵母を決定する。パン
には、食パン、ロールパン、クロワッサン、フランスパ
ン、菓子パンなど多くの種類があるので、すべてについ
て試食をして、それぞれについて１倍体酵母も同じもの
を用いたり、別の１倍体酵母を用いたりする。交雑する
相手のａ型又はα型の１倍体酵母の選択によっても、パ
ンの特性にかなりの変化をもたらすために、遺伝子操作
する１倍体酵母の選別は困難をきわめるが、乾燥耐性実
用パン酵母を造成するためにはこの工程が必須である。

【００１８】酵母に遺伝子操作を施す際、遺伝的マーカ
ーが必要となる。実用パン酵母にはマーカーが付与され
ておらず、そのまま遺伝子操作に供する場合、薬剤耐性
マーカー等、酵母の遺伝子以外のマーカーを用いること
も可能であるが、安全性の観点から好ましくない。セル
フクローニングの範疇で遺伝子操作をするためには、こ
の１倍体菌株に遺伝的なマーカーを付与する必要があ
り、この場合、酵母を薬剤等で変異させると有用な性能
が同時に欠落する恐れがあり、自然突然変異体を選抜す
る方法が好ましい。このマーカー遺伝子として、ＵＲＡ
３，ＬＹＳ２，ＡＤＥ２等が、欠損株を容易に選抜する
ことができ望ましい。

【００１９】１倍体菌株に遺伝子マーカーとしてｕｒａ
３（ＵＲＡ３欠損株）を付与するには、５−フルオロオ
ロチン酸含有培地での選抜による。すなわち、１倍体菌
株をＹＰＤ液体培地で培養した後、遠心分離により、菌
体を生理食塩水で洗浄し、約１０⁸個の細胞を、５−フ
ルオロオロチン酸を含む培地（０．７％YEAST NITROGEN
BASE(DIFCO)，２％グルコース、０．１％５−フルオロ
オロチン酸、０．０５％ウラシル、２％寒天）に塗布
し、３日間３０℃で培養し、生育したコロニーを選別す
る。この培地で生育した菌株は、自然突然変異によりＵ
ＲＡ３遺伝子を欠損しており、１０⁶〜１０⁷個に１個の
頻度で得られる。これらの菌株は、ウラシルを除く培地
上で生育せず、ＵＲＡ３を含有するプラスミド、ＹＣｐ
５０等により形質転換することにより、ウラシルを除く
培地上で生育できるようになることにより、ＵＲＡ３を
欠損していることを確認することができる。

【００２０】２．（ＮＴＨ１遺伝子の遺伝子破壊株作
製） 本発明においては、１倍体酵母がもつ、図１、図２、図
３及び図４に示すＮＴＨ１（中性トレハラーゼ遺伝子
（J. B. C. 268 : 4766-4774(1993））内に配列番号４
に示すＵＲＡ３（ウリジル酸合成酵素）（Gene, 29 : 1
13-124(1984））やＡＤＥ２、ＬＹＳ２などのマーカー
遺伝子を挿入すれば、ＮＴＨ１遺伝子は破壊されて発現
しなくなり、代りに挿入されたＵＲＡ３や栄養要求性マ
ーカー遺伝子が発現して、遺伝子破壊を確認することが
できる。挿入するＵＲＡ３や他のマーカー遺伝子は、セ
ルフクローニングを達成するためにサッカロミセス・セ
レビシエ、特にパン酵母のものが好ましい。

【００２１】ＮＴＨ１遺伝子の破壊は、ＮＴＨ１遺伝子
が発現して中性トレハロース分解酵素を作り、これがト
レハロースを分解することを防止すれば目的を達成する
ので、ＮＴＨ１の全部もしくは１部を削ってしまっても
よい。本発明では、ＵＲＡ３をＮＴＨ１遺伝子全部乃至
は１部領域内に挿入することによって、ＮＴＨ１遺伝子
の破壊を行うのが好ましい。

【００２２】まず、大腸菌用のベクター例えばｐＵＣ１
９に図１、図２、図３及び図４に示されるＮＴＨ１遺伝
子の１部領域を挿入し、次いでこのＮＴＨ１遺伝子の１
部領域中に配列番号４に示すＵＲＡ３遺伝子を挿入し、
得られたプラスミドを大腸菌で大量にふやして、このプ
ラスミドからＮＴＨ１（前半）−ＵＲＡ３−ＮＴＨ１
（後半）の挿入遺伝子のみを切り出し、単離したものを
そのまま酢酸リチウム法によって、２倍体にしたとき実
用パン酵母となる１倍体酵母に形質転換する。

【００２３】１倍体酵母に入ったＮＴＨ１（前半）−Ｕ
ＲＡ３−ＮＴＨ１（後半）は、ＮＴＨ１（全部あるいは
１部領域）にＵＲＡ３を余すように結合・組換えをおこ
し、ＮＴＨ１を、前半と後半に、ＵＲＡ３をはさんで、
完全に分断し、遺伝子破壊は完成する。

【００２４】３．（ＮＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母の交
雑） ここに得られるＮＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母は、すで
にａ型かα型かは定まっており、２倍体にしたとき実用
パン酵母になるすぐれた性質は有するもので、遺伝子破
壊操作ではＮＴＨ１遺伝子のみ破壊され、その他のすぐ
れた性質を生む遺伝子はそのままである。本発明では２
倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母のＮＴＨ
１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＮＴＨ１遺伝子破壊
１倍体酵母を１もしくは２以上用いて交雑し、２倍体以
上の倍数体乾燥耐性実用パン酵母を得る。

【００２５】好ましいのは、ａ型ＮＴＨ１遺伝子破壊１
倍体酵母とα型ＮＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母を交雑し
て得られた２倍体酵母である。図５は、これを分りやす
く示したもので、得られるのは２倍体乾燥耐性実用パン
酵母である。得られた多くの２倍体乾燥耐性実用パン酵
母の内の１株は、パン酵母、Saccharomyces cerevisiae
T154（FERM BP-5678）として工技院生命研に寄託されて
いる。

【００２６】本発明の倍数体乾燥耐性実用パン酵母は乾
燥耐性、特に工業的に培養し、工業的に乾燥し、製パン
用インスタントドライイーストとしたときの生地発酵力
がきわめてすぐれている。

【００２７】４．（酸性トレハラーゼ遺伝子のクローニ
ング） 酸性トレハラーゼ遺伝子ＡＴＨ１のクローニングは、例
えばＡＴＨ１遺伝子欠損株がトレハロースを唯一の炭素
源とした培地中で生育できないことを利用すること等に
より、通常のショットガンクローニング法により可能で
ある。しかし、酵母Saccharomyces cerevisiaeの染色体
の全塩基配列が既に決定されており、ＡＴＨ１の様に配
列が既に解明されている様な遺伝子の取得には、ＰＣＲ
法（ポリメラーゼチェーンリアクション）を用いてクロ
ーニングするのが常法となっている。また、遺伝子の不
活化（破壊）操作を目的とする場合、全領域をクローニ
ングする必要はなく、一部の領域のクローニングのみで
代替することが可能である。

【００２８】５．（ＡＴＨ１遺伝子破壊用ベクターの構
築と遺伝子破壊操作） ＡＴＨ１遺伝子の破壊は、ＡＴＨ１遺伝子が発現して酸
性トレハロース分解酵素を作り、これがトレハロースを
分解することを防止すれば目的を達成するので、ＡＴＨ
１の全部もしくは１部を削ってしまってもよい。本発明
では、ＵＲＡ３でＡＴＨ１全部を置き換えるかまたはＡ
ＴＨ１内にＵＲＡ３を挿入することによって、実質上Ａ
ＴＨ１を不活化させることにより遺伝子の破壊を行うの
が好ましい。

【００２９】まず、大腸菌用のベクター例えばｐＧＥＭ
−Ｔに配列番号３に示されるＡＴＨ１遺伝子の１部領域
をＰＣＲ法により増幅し挿入し、次いでこのＡＴＨ１遺
伝子の１部領域中に配列番号４に示すＵＲＡ３遺伝子の
全領域を挿入し、得られたプラスミドを大腸菌で大量に
ふやして、このプラスミドからＡＴＨ１（前半）−ＵＲ
Ａ３−ＡＴＨ１（後半）の挿入遺伝子のみを切り出し、
単離したものをそのまま酢酸リチウム法によって、２倍
体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母に形質転換
する。１倍体酵母に導入されたＡＴＨ１（前半）ＵＲＡ
３−ＡＴＨ１（後半）は、１倍体酵母のＡＴＨ１と部位
特異的組換えをおこし、ＵＲＡ３をはさんでＡＴＨ１
を、前半と後半に完全に分断する。その結果、遺伝子破
壊は完成し、ＡＴＨ１は実質上不活化される。

【００３０】６．（２倍体の作成） ここに得られるＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母は、すで
にａ型かα型かは定まっており、また２倍体にしたとき
実用パン酵母になるすぐれた性質は有するもので、遺伝
子破壊操作ではＡＴＨ１遺伝子のみ破壊され、その他の
すぐれた性質を生む遺伝子はそのままである。本発明で
は２倍体にしたとき実用パン酵母となる１倍体酵母のＡ
ＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子
破壊１倍体酵母を１もしくは２以上用いて交雑し、２倍
体以上の倍数体乾燥耐性実用パン酵母を得る。

【００３１】

【実施例１】（２倍体にしたとき実用パン酵母となる１
倍体酵母の選別）野生株として保存する１倍体酵母菌株
中、２５株について、ａ型かα型を確定し、それぞれに
ついて２倍体にしたとき実用パン酵母となり得るかどう
かを試験した結果、表１５の８株を選抜した。これら８
株について、後述の方法でＮＴＨ１遺伝子破壊を行い、
破壊前と破壊後の中性トレハラーゼ活性を測定した。結
果は次の表１５に示され、ＮＴＨ１遺伝子破壊株の中性
トレハラーゼ活性が有意に低下しており、ＮＴＨ１遺伝
子が破壊されていることを確認した。

【００３２】

【表１５】

【００３３】（ＮＴＨ１遺伝子破壊のためのＮＴＨ１遺
伝子）ＮＴＨ１は、パン酵母などの属する種であるSacc
haromyces cerevisiaeの第４染色体のセントロメアの極
く近傍に位置することが知られ、その遺伝子配列は図
１、図２、図３及び図４に示されている通りである。本
発明では一般に入手可能な酵母のベクターであるＹＣｐ
５０の第４染色体のセントロメアを含む領域を用いて、
ジーンエピクション法によって、パン酵母株からＮＴＨ
１を得、図１、図２、図３及び図４の配列を確認した。

【００３４】（ＮＴＨ１破壊用ベクターの構築） １．ｐＮＴＨ１ クローニングしたＮＴＨ１を基に、図６に示す方法によ
る。図６でＮＴＨ１の３′側に位置する、ＫｐｎＩとそ
の上流に位置するＥｃｏＲＩの両切断部位の間約 770bp
を市販の大腸菌用ベクターｐＵＣ１９の同制限酵素
（ＫｐｎＩ及びＥｃｏＲＩ）切断部位に挿入しｐＮＴＨ
１−ＫＥを得た。得られたプラスミドをＸｈｏＩ切断部
位で切断しＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、ここ
で、市販のＹＥｐ２４に含まれる図６のＵＲＡ３遺伝子
をＨｉｎｄIIIで切断分離、回収し、これをＤＮＡポリ
メラーゼを用いて平滑末端として、その約1.170bp 断片
をリガーゼを用いた連結操作で挿入しｐＮＴＨｄ１を得
た。

【００３５】（１倍体酵母のＮＴＨ１遺伝子の破壊） １．ｐＮＴＨ１を用いた遺伝子の破壊 ｐＮＴＨ１をＥｃｏＲＩ及びＫｐｎＩを用いて切断し、
ＮＴＨ１（前半）−ＵＲＡ３−ＮＴＨ１（後半）のＤＮ
Ａ断片を単離し、これを表１５に示した１倍体酵母のＮ
ｏ．２、Ｎｏ．７、Ｎｏ．１２、Ｎｏ．１３、Ｎｏ．１
４、Ｎｏ．１８、Ｎｏ．１９及びＮｏ．２１のそれぞれ
の株に酢酸リチウム法で酵母の形質転換を行った。

【００３６】各菌株より抽出した染色体ＤＮＡをＥｃｏ
ＲＩで分解し、各０．５μｇをアガロースゲル電気泳動
に供し、サザンハイブリダイゼーションを行い遺伝子破
壊を確認し、図７に示した。図中、左側のカラムは、分
子量マーカー（λＤＮＡ−ＨｉｎｄIII分解）のバンド
の位置を示す。

【００３７】各レーンの菌株番号は、ｌａｎｅ１：Ｎ
ｏ．２，ｌａｎｅ２：Ｎｏ．２−ｄ，ｌａｎｅ３：Ｎ
ｏ．７，ｌａｎｅ４：Ｎｏ．７−ｄ，ｌａｎｅ５：Ｎ
ｏ．１２，ｌａｎｅ６：Ｎｏ．１２−ｄ，ｌａｎｅ７：
Ｎｏ．１３，ｌａｎｅ８：Ｎｏ．１３−ｄ，ｌａｎｅ
９：Ｎｏ．１４，ｌａｎｅ１０：Ｎｏ．１４−ｄ，ｌａ
ｎｅ１１：Ｎｏ．１８，ｌａｎｅ１２：Ｎｏ．１８−
ｄ，ｌａｎｅ１３：Ｎｏ．１９，ｌａｎｅ１４：Ｎｏ．
１９−ｄ，ｌａｎｅ１５：Ｎｏ．２１，ｌａｎｅ１６：
Ｎｏ．２１−ｄ（ここでｄはｐＮＴＨｄ１によって遺伝
子破壊操作したことを示す）である。（ｄの表示は他の
表でも同じ意味をもつ）図７の結果より、ＮＴＨ１遺伝
子が破壊されていることが確認された。

【００３８】

【実施例２】（２倍体にしたとき実用パン酵母となる１
倍体酵母の選別）野生株として保存する１倍体酵母２５
株について、ａ型かα型を確定し、それぞれについて２
倍体にしたとき実用パン酵母となり得るかどうかを試験
した結果、表１６の８株を選別した。これら８株につい
て、後述の方法でＡＴＨ１遺伝子破壊を行い、破壊前と
破壊後の酸性トレハラーゼ活性を測定した。結果は表１
６に示され、ＡＴＨ１遺伝子破壊株の酸性トレハラーゼ
活性が有意に低下しており、ＡＴＨ１遺伝子が破壊され
ていることを確認した。

【００３９】

【表１６】

【００４０】（ＡＴＨ１遺伝子のクローニング）ＡＴＨ
１遺伝子の部分配列をPromega社製のｐＧＥＭ−Ｔベク
ターシステムを用いてクローニングした。概要を図８に
示す。

【００４１】既知のＡＴＨ１遺伝子の塩基配列（YEAST
Vol.11,(1995)）より、常法に従い、配列表の配列番号
１、配列番号２に示す各々２０塩基のプライマーを設計
した。酵母Saccharomyces cerevisiae T019株より染色
体ＤＮＡを抽出・精製し、このＤＮＡを鋳型とし、先に
述べた配列番号１及び２で示す合成ＤＮＡをプライマー
として用い、ＰＣＲ法によりＡＴＨ１遺伝子のコーディ
ング領域中の部分配列第４８１塩基〜第１，６３０塩基
間の１，１５０塩基対を増幅した。次いで常法により、
増幅したＤＮＡ断片を精製した後、この断片をｐＧＥＭ
−Ｔベクターに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、プ
ラスミドｐＣＩ１を得た。このプラスミドｐＣＩ１を常
法に従い、大腸菌に導入し（形質転換）、増幅後精製し
た。次いで、この精製プラスミドに唯一存在するＡＴＨ
１遺伝子部分配列上の制限酵素ＨｉｎｄIII切断部位
で、同酵素を用いて切断し、一方、プラスミドとして公
知のＹｅｐ２４のＵＲＡ３遺伝子の全長を含む１，１６
６塩基対のＤＮＡ断片を制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断
し、常法に従い精製後、両者をＴ４ＤＮＡリガーゼによ
り連結し、ＡＴＨ１遺伝子破壊用プラスミドｐＣＹ１を
作成した。

【００４２】（ＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体の作成）接合
型ａの１倍体酵母（野生型株）を段落番号（００１９）
に示した方法でｕｒａ３とした株をＡＴＨ１遺伝子破壊
用プラスミドｐＣＹ１を制限酵素ＰｖｕIIで切断後、酢
酸リチウム法により形質転換した。形質転換体はウラシ
ル要求性から、非要求性になることにより確認した。同
様に、接合型αの１倍体酵母（野生型株）を段落番号
（００１９）に示した方法でｕｒａ３とした株をＡＴＨ
１遺伝子破壊用プラスミドｐＣＹ１を制限酵素ＰｖｕII
で切断後、ＡＴＨ１部分配列とＵＲＡ３を含むＤＮＡ断
片を分離精製し、このＤＮＡで、酢酸リチウム法により
形質転換した。形質転換体はウラシル要求性から、非要
求性になることにより確認した。

【００４３】（ＡＴＨ１遺伝子破壊の確認）理論通り、
当該遺伝子が破壊されていることはＰＣＲ法により確認
した。すなわち、野生型株と遺伝子破壊株より、全染色
体ＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを配列番号１および配列
番号２で示したプライマーを用いて、増幅し、増幅配列
の長さを比較することによって確認した。結果を図９に
示す。理論上野生型株では、１１５０塩基対、遺伝子破
壊株では、２，３１６塩基対のＤＮＡ断片が増幅される
が、図１０に示す結果と合致しており、遺伝子破壊が確
認された。

【００４４】（ＡＴＨ１遺伝子不活化の確認）ＡＴＨ１
遺伝子破壊の確認のため酸性トレハラーゼ活性の測定を
行った。各菌株のＡＴＨ１遺伝子非破壊株（ＡＴＨ１：
野生型株）と、ＡＴＨ１遺伝子破壊株ａｔｈ１）とを、
各々、１８φの試験管中の５ｍｌＹＰＤ培地（１％イー
ストエキス、２％ペプトン、２％グルコース）に、１白
金耳植菌し、４８時間３０℃で振とう培養した。この培
養菌体を用い、常法に従い酸性トレハラーゼ活性を測定
した。結果を表１６に示した。各破壊株の酸性トレハラ
ーゼ活性は、破壊前の野生型株に比して明らかに活性が
低下し、その活性はほぼ０であり、ＡＴＨ１遺伝子の不
活化が確認された。

【００４５】

【実施例３】（ＮＴＨ１、ＡＴＨ１両遺伝子破壊株の作
製）実施例１に記載した方法で作成したＮＴＨ１遺伝子
破壊株８株はウラシル非要求性となっている。再び、 u
ra3 マーカーを用いるために、段落番号（００１９）に
記したのと同一の方法で自然突然変異により、５ＦＯＡ
含有培地上で耐性となった株を選抜することにより、Ｎ
ＴＨ１遺伝子破壊の際同遺伝子中に挿入された URA3 遺
伝子が自然突然変異により不活化した株を選択した。こ
の株を、さらに、実施例２に記したのと同一の方法でＡ
ＴＨ１遺伝子の破壊を行った。（ＡＴＨ１遺伝子破壊の
確認）及び（ＡＴＨ１遺伝子不活化の確認）は、実施例
２に記載した方法で行なった。ここで、２倍体にしたと
きに実用パン酵母となる。

【００４６】

【実施例４】（ａ型１倍体酵母とα型１倍体酵母の交
雑）１．野生株とｐＮＴＨｄ１によって操作した株の組
合せを次の表１７のメイティングマトリクス１に示す。

【００４７】

【表１７】

【００４８】表１７で、横の株はすべてａ型で、縦はす
べてα型菌株であり、数字のあとにｄ−１がついたもの
はｐＮＴＨｄ１によって遺伝子破壊操作したことを示
し、ｄ−１のないものは表１７に示した野生株を示して
いる。表１７における横列の株と縦列の株全てを１対ず
つ交雑して２倍体酵母６４株を得た。（表１７でＴ１０
１からＴ１６４は株番号である。）

【００４９】メイティングマトリクス２を示す表１８で
横の株はすべてａ型で、縦の株はすべてα型であり、数
字のあとにｄ−ＡがついたものはｐＣＹ１によって遺伝
子破壊操作したことを示し、ｄ−Ａと付記のないものは
表１８に示した野生型株を示している。表１８における
横の株と縦の株すべてを１対ずつ交雑して２倍体酵母６
４株を得た。（表１８でＴ１０１からＴ１２８，Ａ３０
１からＡ３６１は菌株番号である。）

【００５０】

【表１８】

【００５１】メイティングマトリクス３を示す表１９で
横の株はすべてａ型で、縦の株はすべてα型であり、数
字のあとにｄ−ＡＴがついたものはｐＮＴＨｄ１及びｐ
ＣＹ１によってＮＴＨ１遺伝子及びＡＴＨ１両遺伝子を
破壊操作したことを示す。表１９における横の株と縦の
株すべてを１対ずつ交雑して２倍体酵母１６株を得た。

【００５２】

【表１９】

【００５３】交雑は、まず対となるａ型株とα型株を別
々にＹＰＤ培地で３０℃１日間培養して増殖させ、両菌
数を同程度として、両酵母を新たなＹＰＤ培地に入れ、
３０℃１２時間培養し、接合酵母を分離し、ＹＰＤ寒天
培地に塗布して、１から２日間３０℃で培養し、比較的
大きなコロニーを分離し、接合性を有していないこと
と、顕微鏡下で１倍体よりも大きくなっていることを観
察することにより、２倍体となっていることを確認し
た。

【００５４】

【実施例５】ＮＴＨ１遺伝子破壊株、ＡＴＨ１遺伝子破
壊株、ＮＴＨ１、ＡＴＨ１遺伝子両破壊株の培養とトレ
ハロースの挙動試験を次のようにして行った。

【００５５】（２倍体乾燥耐性実用菌株の培養）下記条
件で各菌株を３０Ｌジャーファーメンターを用いて培養
した。３０Ｌジャー培養 種培養 本培養 糖量（蔗糖換算） １０３５ｇ １４００ｇ 尿素 １０３ｇ １４０ｇ リン酸１ナトリウム２水和物 ２０．７ｇ ２８ｇ 種酵母量（湿量） ２０ｇ＊１ ４２０ｇ＊２ ３０Ｌジャー メーカー：オリエンタルバイオサービスＫ．Ｋ． 名 称：FERMENTER CONTROL SYSTEM MC-10 容 量：３０Ｌ 攪拌子回転数：６００ｒｐｍ 通気量：１６Ｌ／ｍｉｎ

【００５６】＊１：２５０ｍｌのＹＰＤ培地／１Ｌ容坂
口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃で２日間培養した
のち、４本分全量をそのまま種酵母として用いた。 ＊２：種培養で得られた菌体を遠心分乾燥作によって分
離し、脱イオン水により洗滌した後、その一部を使用し
た。 全ての菌株において市販パン酵母菌株と同等に加えた糖
量に対し１２０−１４０％の収率が得られ、工業レベル
での培養が可能であり、ＮＴＨ１遺伝子、ＡＴＨ１遺伝
子あるいは双方の遺伝子の同時破壊により、増殖性、保
存性等、実用パン酵母に必要な要素が失われていないこ
とが確認できた。

【００５７】（培養過程におけるトレハロースの消長）
上記段落番号（００５４）〜（００５６）の培養条件
は、一般に対数的増殖期と定常期に大きく分けることが
できる。前述の表１７、表１８及び表１９記載の株のう
ち、Ｔ１１８株、Ｔ１２８株、これらのＮＴＨ１遺伝子
破壊株Ｔ１５４株、Ｔ１６４株、ＡＴＨ１遺伝子破壊株
Ａ３１８株、Ａ３２８株およびこれらＮＴＨ１、ＡＴＨ
１遺伝子両破壊株の計８株について、この各時期の初
期、中期、後期で、菌体をサンプリングし、各時点での
トレハロース含量を測定した。結果を図１１に示した。

【００５８】Ｔ１１８株及びＴ１２８株は、これをサッ
カロマイセス セレビシエ Ｔ１１８（Saccharomyces
cerevisiae T118）及びサッカロマイセス セレビシエ
Ｔ１２８（Saccharomyces cerevisiae T128）と命名
し、それぞれ工業技術院生命工学工業技術研究所（生命
研）にＦＥＲＭ ＢＰ−６０９６及びＦＥＲＭ ＢＰ−
６０９７として国際寄託した。また、これらのＡＴＨ１
遺伝子破壊株であるＡ３１８株及びＡ３２８株は、これ
をサッカロマイセス セレビシエ Ａ３１８（Saccharo
myces cerevisiae A318）及びサッカロマイセス セレ
ビシエ Ａ３２８（Saccharomyces cerevisiae A328）
と命名し、それぞれ生命研にＦＥＲＭＢＰ−６０３９及
びＦＥＲＭ ＢＰ−６０４０として国際寄託した。

【００５９】Ｔ１１８株とそのトレハラーゼ遺伝子破壊
株であるＴ１５４株及びＡ３１８株との比較では、遺伝
子破壊により明らかに終点でのトレハロース含量が増加
し、破壊株では野生型株の約２倍のトレハロース含量を
示しＮＴＨ１遺伝子及びＡＴＨ１遺伝子の破壊効果はほ
ぼ同一であった。また、Ｔ１５４株及びＡ３１８株とＡ
Ｔ４１８株との比較では両遺伝子を破壊することにより
相乗効果は認められなかった。これはトレハロースの蓄
積量は、トレハラーゼ遺伝子の破壊により増加し、ＡＴ
Ｈ１遺伝子の破壊効果はＮＴＨ１遺伝子の破壊効果より
遥かに大きく、また、相乗効果も認められるとした前記
John Kimら（California大学）の結果と大きく異なる。
これは、実験室株と実用株との差異、或いは実験で用い
られるバッチ培養法と工業的に用いられる流加培養法の
違いに起因すると思われる。

【００６０】これに対してＴ１２８株とそのトレハラー
ゼ遺伝子破壊株であるＴ１５４株、Ａ３１８株及びＡＴ
４１８株との比較では培養終点でのトレハロース含量は
野生型株よりわずかに増加するに留まり、ＮＴＨ１、Ａ
ＴＨ１遺伝子破壊によるトレハロース蓄積に及ぼす効果
の優劣及び相乗効果は認められなかった。

【００６１】実用パン酵母菌株の性能試験には、通常上
述のような、工業的培養を模した流加培養をした菌体を
用いるが、この際その菌体内トレハロース含量は乾物あ
たり８±２％程度となり、Ｔ１１８株は、通常の実用パ
ン酵母菌株とはやや異なった含量を示す。また、実験室
用の酵母菌株では、このような培養にほとんどの場合適
していないのは前述の通りではあるが、生産効率を無視
して、試験的に培養すると、トレハロース含量は２〜４
％程度であり、実用菌株とは大きく異なる。表に記載の
他の実用パン酵母菌株での試験結果では、ＡＴＨ１遺伝
子に関して野生型の菌株培養終点でのトレハロース含量
に関してＴ１１８株の様に実験室株のそれとほぼ同値を
示すものについては、ＮＴＨ１遺伝子破壊あるいはＡＴ
Ｈ１遺伝子破壊によりトレハロースの蓄積量が顕著に上
昇したが、野生型株で通常の実用パン酵母に近い蓄積量
を示すものは、その効果は僅かであり、この点が実験室
株と実用パン酵母との相違であると考えられる。

【００６２】

【実施例６】ＮＴＨ１遺伝子破壊株、ＡＴＨ１遺伝子破
壊株、ＮＴＨ１、ＡＴＨ１遺伝子両破壊株の製パン性能
試験と冷凍生地試験を次のようにして行った。

【００６３】（野生型株とトレハラーゼ遺伝子破壊株の
製パン試験）実施例５で培養したＴ１１８株、Ｔ１２８
株、これらのＮＴＨ１遺伝子破壊株Ｔ１５４株、Ｔ１６
４株、ＡＴＨ１遺伝子破壊株Ａ３１８株、Ａ３２８株お
よびこれらＮＴＨ１、ＡＴＨ１遺伝子両破壊株の計８株
の菌体、および市販パン酵母（オリエンタル酵母工業
製）を用いて、下記の配合及び表20に示す製パン条件に
より、日本イースト工業会パン用酵母試験法に準ずる製
パン試験を行った。

【００６４】 低糖（食パン）生地配合 高糖生地配合 （配合割合） 小麦粉 １００ １００ 砂糖 ５ ３０ 食塩 ２ ０．５ イースト ２ ４ ショートニング ５ ６ 脱脂粉乳 ０ ２ 水 ６５ ５２

【００６５】

【表２０】

【００６６】表２１および表２２に結果を示した。食パ
ン配合生地での製パンは、野生型株とトレハラーゼ遺伝
子破壊株間で有意な差異は認められなかった。

【００６７】

【表２１】

【００６８】

【表２２】

【００６９】菓子パン配合生地では、トレハラーゼ遺伝
子破壊により製パン性能の向上が認められ特にＴ１１８
に比して、このＡＴＨ１遺伝子破壊株Ａ３１８、Ｔ１２
８株に比して、このＡＴＨ１遺伝子破壊株Ａ３２８株で
顕著であった。これはトレハラーゼ遺伝子の破壊効果に
よりトレハロース含量及び保持力の向上により菌体内の
トレハロースが高濃度で推移する為に、菌体内の浸透圧
が高く保たれる為に高濃度の糖を含有する菓子パン生地
中でも菌体が高発酵力を維持できる為と考えられる。こ
れらの値は、市販パン酵母の値に比して充分対応できる
値である。

【００７０】（冷凍生地耐性試験）実施例５で培養した
Ｔ１１８株、Ｔ１２８株、これらのＮＴＨ１遺伝子破壊
株Ｔ１５４株、Ｔ１６４株、ＡＴＨ１遺伝子破壊株Ａ３
１８株、Ａ３２８株およびこれらＮＴＨ１、ＡＴＨ１遺
伝子両破壊株ＡＴ４１８株、ＡＴ４２８株の計８株の菌
体を用いて、下記の配合及び製パン条件により、日本イ
ースト工業会パン用酵母試験法に準ずる冷凍生地製パン
試験を行った。 （配合割合） 小麦粉 １００ｇ 砂糖 ５ｇ 食塩 ２ｇ イースト ２ｇ ショートニング ５ｇ 水 ６７ｍｌ

【００７１】（製パン条件） 凍結前発酵 ６０分 冷凍期間 １〜２週間（−２０℃） 解凍 ９０分（３０℃） 丸め、ベンチ ３０分 成形 ホイロ ５５分 焼成 ２５分

【００７２】結果を表２３、表２４に示す。野生型株に
比してトレハラーゼ遺伝子の破壊株は明らかに高い冷凍
生地耐性を保有するようになった。これはトレハラーゼ
遺伝子の破壊によるトレハロース含量の上昇及び、トレ
ハロース保持力の向上による冷凍生地耐性の向上と考え
られる。

【００７３】

【表２３】

【００７４】

【表２４】

【００７５】いずれの菌体を用いた試験でも、市販パン
酵母と同等あるいはそれ以上の製パン性能を有すること
が分かった。又、トレハラーゼ遺伝子破壊株は野生型株
に比して明らかに高い冷凍生地耐性を保持している。

【００７６】

【実施例７】ＮＴＨ１遺伝子破壊株、ＡＴＨ１遺伝子破
壊株、ＮＴＨ１、ＡＴＨ１遺伝子両破壊株の乾燥耐性試
験を次のようにして行った。

【００７７】実施例５で得られた各々の培養酵母菌体
を、水分６８％以下にまで脱水して圧搾生酵母とし、該
生酵母１．５ｋｇを準備した。乾燥酵母あたり１．５〜
２．０％となるようにソルビタン脂肪酸エステルの水エ
マルジョンを添加、混合し、次にエクストルーダーによ
り０．４ｍｍφのスクリーンメッシュをパスさせて糸状
とし、初期入り口温度５０℃の温風により定率乾燥期を
約１０分かけて流動乾燥させた。その後、品温が上昇し
始める直前に乾燥温度を３８℃に適宜調節し、減率乾燥
期を約５０分かけて回分方式で乾燥させた。品温は３８
℃を上限とした。乾燥終点は赤外線水分計にて水分５±
０．３％になった時点とし、試料は真空パックさせて保
存させた。

【００７８】この、乾燥酵母を４０℃の水に５％となる
よう溶解し、この酵母懸濁液５ｍｌを１５ｍｌの１３．
３３％蔗糖液と混合し２０ｍｌの発酵液とし、日本イー
スト工業会パン用酵母試験法に準ずる液発酵力測定方法
で１２０分間のガス発生量を測定した。結果を図１２、
図１３に示す。

【００７９】ＡＴＨ１遺伝子あるいはＮＴＨ１遺伝子の
破壊により各菌株は乾燥耐性を獲得している。一方ＡＴ
Ｈ１、ＮＴＨ１遺伝子を両方破壊した株では、野生型株
と同等あるいはそれ以下の乾燥耐性しか保有していない
ことは明らかである。図１２、図１３で示した様に、こ
れらの菌株は野生型株よりトレハロース含量が高く、単
にトレハロース含有量を高くしただけでは製パン用ドラ
イイーストに必要な乾燥耐性を獲得できないことを意味
している。トレハロースは、乾燥耐性、冷凍耐性、浸透
圧耐性に関与するがそのほかに実用製パン用酵母では保
存性（製品の日持ち）に関与して、保存中徐々にトレハ
ロース含量は低下してこの減少量分のトレハロースの消
費が活性を維持するためのエネルギー源となる。製パン
用ドライイーストには、乾燥の際保護剤としてトレハロ
ースが必要であるが、復水時にはトレハロースをこの際
に必要なエネルギー源として利用する。してみるとこの
復水時に充分なトレハラーゼ活性を有していないと、製
パン用ドライイーストに必要なエネルギーが確保できな
くなる。単に乾燥復水による酵母の死滅率が低いことが
即ち製パン用ドライイーストとして適していることには
ならない。

【００８０】同一の種に分類される酵母Saccharomyces
cerevisiae間でも菌体内の酵素活性は異なる。実用パン
酵母菌株においては高野ら（農水省、食総研）の報告
（日本食品工学会大会（１９９７）或いはＡＴＨ１遺伝
子破壊：特願平９−３５２０１６号）と実験室株におい
てはMomoca Destruelleら（Freiburg大学）或いはHelmu
t Holzerら（Freiburg大学)により発表された報告(J.
B. C. Vol. 268, No7（1993））との比較から明らか
に、実用パン酵母菌株のトレハラーゼ活性は実験室株の
それに比して高い。実用菌株ではどちらか一方のトレハ
ラーゼ遺伝子を破壊することにより適度のトレハラーゼ
活性即ち乾燥耐性を得るのに必要なトレハロース含量を
維持し、かつ、復水時にトレハロースを消費し、パン生
地膨張活性を復活させるのに必要なエネルギーを獲得で
きる活性を持たせることができたが、実験室株では同様
な結果が得られるとは考えられない。

【００８１】なお、酵母 Saccharomyces cerevisiae
実験室株の標準株として公知(YEASTGENETIC STOCK CENT
ER (カリフォルニア大学）のカタログに記載）のＸ２１
８０−１Ａ（ａ型）およびＸ２１８０−１Ｂ（α型）株
を用いて同様の操作により、ＮＴＨ１遺伝子破壊２倍体
株およびＡＴＨ１遺伝子破壊２倍体株を作成し、乾燥耐
性試験を行った結果を図１４（乾燥耐性試験−３）に示
す。

【００８２】以上の結果から、ＡＴＨ１遺伝子破壊株、
ＮＴＨ１遺伝子破壊株およびＡＴＨ１、ＮＴＨ１遺伝子
両破壊株は、非破壊株に比べ、各種製パン性能は同等で
あり、実用製パン用酵母として使用可能である。また、
野生型株に比して全て冷凍生地耐性の向上が認められ
る。また、ＡＴＨ１遺伝子破壊株および、ＡＴＨ１、Ｎ
ＴＨ１両遺伝子破壊株は高糖生地耐性の向上が認められ
た。しかし、乾燥耐性はＡＴＨ１遺伝子破壊株およびＮ
ＴＨ１遺伝子破壊株によっては向上は認められたが、Ａ
ＴＨ１、ＮＴＨ１遺伝子両破壊株では、野生型株と同等
もしくはそれ以下に低下している。このことは本発明に
よって初めて明らかにされた事実で、これまでの実験室
株を用いた推論から容易に類推されるものではない。

【００８３】

【発明の効果】本発明に係るＡＴＨ１及び／又はＮＴＨ
１遺伝子破壊株は、きわめてすぐれた乾燥耐性実用パン
酵母であって、本パン酵母は、ドライイーストの形態に
しても、砂糖水で復元する必要はなく、水分の存在のみ
できわめて短時間で立上るため、これを直接生地にねり
込むだけですぐ立上げることができ、しかも、本パン酵
母は各種のパンの製造に広範に使用することができる。

【００８４】

【配列表】配列番号１及び２は、ＰＣＲ用プライマーを
示し、それぞれプライマー１及びプライマー２を示す。
配列番号３は、ＡＴＨ１遺伝子のアミノ酸コード領域を
示し、配列番号４は、ＵＲＡ３遺伝子の全領域を示す。
下記表１〜１４に、配列番号１〜４に示される各配列を
示す。

【００８５】

【表１】

【００８６】

【表２】

【００８７】

【表３】

【００８８】

【表４】

【００８９】

【表５】

【００９０】

【表６】

【００９１】

【表７】

【００９２】

【表８】

【００９３】

【表９】

【００９４】

【表１０】

【００９５】

【表１１】

【００９６】

【表１２】

【００９７】

【表１３】

【００９８】

【表１４】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＴＨ１遺伝子の塩基配列を示す。

【図２】同上続きを示す。

【図３】同上続きを示す。

【図４】同上続きを示す。

【図５】ＮＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母の交雑による２
倍体乾燥耐性実用パン酵母の作成を示す。

【図６】ＮＴＨ１遺伝子破壊用ベクターの構築図であ
る。

【図７】ＮＴＨ１遺伝子破壊を確認した図である。

【図８】ＡＴＨ１遺伝子破壊用ベクターの構築図であ
る。

【図９】ＡＴＨ１遺伝子破壊の概念図である。

【図１０】ＡＴＨ１遺伝子破壊を確認した図であり、レ
ーン１は分子量マーカーを示し、レーン２、４、６、８
は、それぞれ菌株７、２１、１８、１９より調整したＤ
ＮＡのＰＣＲ産物を示し、レーン３、５、７、９は、そ
れぞれ菌株７ｄＡ、２１ｄＡ、１８ｄＡ、１９ｄＡより
調整したＤＮＡのＰＣＲ産物を示す。

【図１１】トレハロース含量の消長を示す。

【図１２】乾燥耐性試験−１の結果を示す。

【図１３】同試験−２の結果を示す。

【図１４】同試験−３の結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 森 勝美 茨城県つくば市大字安食2530番地の54 (72)発明者 鈴木 康生 千葉県印旛郡栄町南ケ丘２丁目12−１ (72)発明者 中島 亮一 東京都板橋区本町35番15 (72)発明者 渡辺 肇 東京都和光市新倉２丁目８番27号 サンビ レッジ花ノ木Ｄ201

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ２倍体にしたとき実用パン酵母となる接
   合型ａを有する１倍体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破
   壊操作してなるＡＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母と、２倍
   体にしたとき実用パン酵母となる接合型αを有する１倍
   体酵母のＡＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＡＴ
   Ｈ１遺伝子破壊１倍体酵母とを交雑してなる２倍体実用
   パン酵母を用いて作成した製パン用乾燥酵母。
2. 【請求項２】 ２倍体にしたとき実用パン酵母となる接
   合型ａを有する１倍体酵母のＮＴＨ１遺伝子を遺伝子破
   壊操作してなるＮＴＨ１遺伝子破壊１倍体酵母と、２倍
   体にしたとき実用パン酵母となる接合型αを有する１倍
   体酵母のＮＴＨ１遺伝子を遺伝子破壊操作してなるＮＴ
   Ｈ１遺伝子破壊１倍体酵母とを交雑してなる２倍体実用
   パン酵母を用いて作成した製パン用乾燥酵母。
3. 【請求項３】 遺伝子破壊操作がＡＴＨ１遺伝子又はＮ
   ＴＨ１遺伝子のどちらか一方の中にＵＲＡ３などのマー
   カー挿入によって行われること、を特徴とする請求項１
   又は２に記載の製パン用乾燥酵母。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の製
   パン用乾燥酵母を使用して調製してなる製パン用乾燥酵
   母含有パン生地。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の製パン用乾燥酵母含有
   パン生地を用いて作成してなるパン。