JPH11243964A - イネオルニチンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 - Google Patents

イネオルニチンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体

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JPH11243964A
JPH11243964A JP10066070A JP6607098A JPH11243964A JP H11243964 A JPH11243964 A JP H11243964A JP 10066070 A JP10066070 A JP 10066070A JP 6607098 A JP6607098 A JP 6607098A JP H11243964 A JPH11243964 A JP H11243964A
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ornithine
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orizo
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Yoshibumi Ito
義文 伊藤
Akihiro Hino
明寛 日野
Hirohito Miura
裕仁 三浦
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 ファゼオロトキシン耐性を導入した植物由来
オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子の開発
に必要な、イネ由来のオルニチンカルバミルトランスフ
ェラーゼをコードする相補ＤＮＡを単離し、さらに、該
耐性導入遺伝子の機能を簡便に評価するための微生物に
おける発現系を確立すること。 【解決手段】 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
からなる蛋白質をコードするイネオルニチンカルバミル
トランスフェラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド
ベクター並びに該プラスミドベクターを保有する形質転
換体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、イネ由来のオルニ
チンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子、該遺伝子を
含むプラスミドベクター及び形質転換体に関する。
【０００２】オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ
は、オルニチンにカルバミルリン酸からカルバミル基を
転移し、シトルリンを生成する反応を触媒するアルギニ
ン生合成経路の酵素である。植物病原細菌であるシュー
ドモナス・シリンジェ(Pseudomonas syringae pv.phase
olicola) が生産するファゼオロトキシンは、オルニチ
ンカルバミルトランスフェラーゼ活性を阻害する。その
ために、本菌が感染した植物、またはファゼオロトキシ
ンを塗布した植物は、蛋白質の合成に必要なアルギニン
の供給が絶たれるため、細胞の増殖が停止し、最終的に
枯死する。本発明は、ファゼオロトキシン等のオルニチ
ンカルバミルトランスフェラーゼを標的とする阻害化合
物に対し、耐性を有する植物オルニチンカルバミルトラ
ンスフェラーゼをコードする遺伝子の創出、及び植物オ
ルニチンカルバミルトランスフェラーゼを標的とする阻
害化合物の検索に用いる酵素の効率的な生産に利用でき
るイネ由来のオルニチンカルバミルトランスフェラーゼ
遺伝子に関する。
【０００３】
【従来の技術】シュードモナス・シリンジェ (Pseudomo
nas syringae pv. phaseolicola)は、自己が生産するフ
ァゼオロトキシンに耐性を有するオルニチンカルバミル
トランスフェラーゼの遺伝子を保有する植物病原微生物
である。このファゼオロトキシン耐性オルニチンカルバ
ミルトランスフェラーゼの遺伝子を導入した組換え植物
は、病原性シュードモナス・シリンジェに対して耐性を
示すことが報告されている（Hatziloukas, E. and Pano
poulos, N. J., J. Bacteriol., 172: 5895-5909, 199
2) 。しかしながら、該遺伝子は植物病原微生物に由来
するため、実用上の安全性に問題がある。そのため、食
用作物には応用されていない。
【０００４】一方、食物、特に食用作物由来のオルニチ
ンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子は、実用導入遺
伝子としての安全性が優れている。この食用作物のオル
ニチンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子に、ファゼ
オロトキシン耐性変異を導入できれば、実用的なファゼ
オロトキシン耐性導入遺伝子を開発できる可能性もあ
る。ファゼオロトキシン耐性を導入した植物由来オルニ
チンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子の開発には、
食用作物の該酵素をコードする相補ＤＮＡの解明が必要
である。また、該耐性遺伝子の機能を簡便に評価するた
めの微生物における発現系の確立が必要である。しかし
ながら、該酵素をコードすることが証明された植物相補
ＤＮＡや、それを検証するための発現系は、今のところ
未解明であった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ファ
ゼオロトキシン耐性を導入した植物由来オルニチンカル
バミルトランスフェラーゼ遺伝子の開発に必要な、イネ
由来の該酵素をコードする相補ＤＮＡを単離し、さらに
該耐性導入遺伝子の機能を簡便に評価するための微生物
における発現系を確立することである。
【０００６】ところで、オルニチンカルバミルトランス
フェラーゼ阻害活性を利用して、ファゼオロトキシンを
除草剤の成分として使用することが検討されている。従
来、このような化合物の除草剤活性の評価は、供試化合
物を植物に噴霧し、植物に現れる生理的変調を指標にし
て行われてきた。そのため、検査のための植物が別に必
要であった。このような除草剤活性の評価を試験管内で
迅速、かつ簡便に行うためには、イネオルニチンカルバ
ミルトランスフェラーゼを大量に生産する手段が必要で
あり、そのためにも該酵素をコードする相補ＤＮＡを解
明する必要がある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために研究を重ねた結果、農林水産省のイネ
ゲノムプロジェクトが構築したイネの相補ＤＮＡライブ
ラリーから単離されたオルニチンカルバミルトランスフ
ェラーゼのＣ末端側の領域をコードする相補ＤＮＡクロ
ーンと新たに取得したＮ末端側の領域をコードする相補
ＤＮＡクローンを連結することに成功し、本発明を完成
した。すなわち、本発明者らは、イネゲノムプロジェク
トが単離したＳ４４４３クローンの全塩基配列を決定
し、該クローンがイネオルニチンカルバミルトランスフ
ェラーゼのＣ末端領域（２０６アミノ酸残基）をコード
していることを明らかにした。さらに、イネカルスより
調製したメッセンジャーＲＮＡから生成した相補ＤＮＡ
を鋳型として、５’Ｒａｃｅ法により、イネオルニチン
カルバミルトランスフェラーゼのＮ末端領域（３４０ｂ
ｐ）をクローン化した。これらの配列を連結して、該酵
素の触媒領域の相補ＤＮＡを取得した。
【０００８】取得した相補ＤＮＡを、大腸菌プラスミド
ｐＵＣ１１８に再クローン化し、オルニチンカルバミル
トランスフェラーゼ遺伝子が欠失している大腸菌に形質
転換した。その結果、イネオルニチンカルバミルトラン
スフェラーゼが大腸菌で発現し、大腸菌細胞内でアルギ
ニン生合成酵素として機能すること、及び大腸菌で発現
して該酵素がオルニチンカルバミルトランスフェラーゼ
活性を有することを実証することによって、本発明を完
成したのである。
【０００９】請求項１記載の発明は、配列表の配列番号
１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするイネ
オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子であ
る。請求項２記載の発明は、請求項１記載のイネオルニ
チンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラス
ミドベクターである。請求項３記載の発明は、請求項２
記載のプラスミドベクターを保有する形質転換体であ
る。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るオルニチンカルバミルトランスフェラーゼ
相補ＤＮＡは、イネ由来のＤＮＡ配列の一部である。本
発明者らは、エンドウマメ由来のオルニチンカルバミル
トランスフェラーゼをコードすると推定される相補ＤＮ
Ａの配列を用いて、ＤＮＡデータベースに登録されてい
るＤＮＡ配列に対してホモロジー検索を行った。その結
果、Ｓ４４４３クローンの部分配列（３４０ｂｐ）が、
エンドウマメ由来のオルニチンカルバミルトランスフェ
ラーゼをコードすると推定される相補ＤＮＡと、８０％
の相同性を持つことを見出した。
【００１１】次に、このＳ４４４３クローンの相補ＤＮ
Ａの全塩基配列を決定した。塩基配列の決定は、通常用
いられる手段によって達成することができる。例えば、
Ｆｌｅｘ−ｐｒｅｐプラスミド生成キット（ファルマシ
ア社製）を用いて調製したＳ４４４３クローンＤＮＡを
鋳型とし、ダイプライマーサイクルシーケンシングキッ
ト（パーキンエルマー社製）を使用してシーケンス反応
を行う。さらにＡＢＩ３７７シーケンサー（パーキンエ
ルマー社製）を用いて、塩基配列を決定することができ
る。ここで、鋳型として用いるプラスミドＤＮＡの調製
は、アルカリ−ＳＤＳ法（Sambrook, J., Fritsch, E.
F. and Maniatis, T., Molecular Cloning. A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Ne
w York, 1989) によっても可能である。また、塩基配列
の決定は、Sangerの方法 (Sanger, F., Nicklen, S. an
d Coulson, A. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:
5463-5467, 1977)や Maxam-Gilbertの方法(Maxam, A.
M. and Gilbert, W., Methods Enzymol., 65: 499-560,
1980) 等によって行うこともできる。その結果、Ｓ４４
４３クローンが、イネオルニチンカルバミルトランスフ
ェラーゼのＣ末端領域（２０６アミノ酸残基）をコード
している可能性が高いことが明らかとなった。
【００１２】そこで、Ｎ末端領域をコードしている相補
ＤＮＡの取得と解析を行った。まず、イネのＲＮＡを調
製し、これからメッセンジャーＲＮＡを精製した。イネ
のＲＮＡは、種々の培地、例えばＭＳ培地（植物バイオ
テクロノロジー、山田康之・岡田吉美編、東京化学同
人、１９８６）で培養したイネカルスから得ることがで
きる。ＲＮＡの調製手段としては、ＳＤＳ−フェノール
法（Takaiwa, F., Kikuchi,S. and Ohno, K., Mol. Gen
e. Genet., 208: 15-22, 1987) 、グアニジンチオシネ
ート法（Puissant, C. and Houdelbine, L. M., Biotec
hniques, 8: 148-149,1990)、塩化セシウムの密度勾配
遠心 (Groppe, J. C. and Morse, D. E., Anal. Bioche
m., 210: 337-343, 1993) 等を用いることができる。
【００１３】得られるＲＮＡを、さらにオリゴテックス
（Oligotex）−ｄＴ３０（super) (宝社製) 等の手段を
用いてメッセンジャーＲＮＡを精製した。精製メッセン
ジャーＲＮＡを鋳型として、Marathon cDNA Amplicatio
n キット(クローンテック社製) を用いて相補ＤＮＡの
第一鎖を合成し、続いて第二鎖を合成した。第一鎖は、
メッセンジャーＲＮＡ、ｄＮＴＰ及び Marathon ｃＤＮ
Ａプライマーを含む反応液中で、Moloney Murine Leuke
mia Virus(ＭＭＬＶ) 逆転写酵素を反応させることによ
り得ることができた。第二鎖は、ｄＮＴＰの存在下１第
一鎖にＲＮａｓｅＨとＫｌｅｎｏｗ酵素を作用させるこ
とにより得ることができた。得られた二本のＤＮＡ鎖を
連結し、相補ＤＮＡを得た。
【００１４】この相補ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ反応
を行った。ＰＣＲ反応のプライマーとしては、Ｓ４４４
３クローンの１５９〜１６５番目の相補配列からなるオ
リゴヌクレオチドＯＳＯＴ−Ｃ（北海道システムサービ
ス社製、配列表の配列番号２参照）と、ＡＰ１プライマ
ー（クローンテック社製）を用いた。増幅されたＤＮＡ
断片を、制限酵素（ＮｏｔＩ）で切断した後、ＮｏｔＩ
とＰｖｕIIで切断したベクタープラスミドｐＵＣ１１８
（Viera, J. and Messing, J., Methods Enzymol., 15
0: 3-11, 1987) にクローン化し、組換えプラスミドｐ
ＯＳＯＴ４を得た。ｐＯＳＯＴ４にクローン化されたＤ
ＮＡ断片の塩基配列を決定した結果、Ｓ４４４３クロー
ンの１〜１８５番目の配列とその５’上流域の３４０ｂ
ｐを含んでいることが明らかとなった。
【００１５】そこで、イネオルニチンカルバミルトラン
スフェラーゼのＮ末端及びＣ末端領域をそれぞれコード
する２つの相補ＤＮＡを連結して、連続した１本の相補
ＤＮＡを作成した。まず、Ｎ末端領域をコードする相補
ＤＮＡを含むプラスミドｐＯＳＯＴ４を鋳型として、オ
リゴヌクレオチドＯＳＯＴ−Ｄ（北海道システムサービ
ス社製、配列表の配列番号３参照）及びＯＳＯＴ−Ｃ
（北海道システムサービス社製、配列表の配列番号２参
照）をプライマーとして、１５サイクルのＰＣＲ反応で
増幅した。ここでＯＳＯＴ−Ｄとは、Ｎ末端領域をコー
ドする相補ＤＮＡにコードされる蛋白質の５番目のアミ
ノ酸残基ＶａｌのコドンＧＴＧを、翻訳開始コドンＡＴ
Ｇに代え、ＡＴＧ配列が制限酵素ＮｄｅＩの切断配列と
なるように合成したオリゴヌクレオチドである。
【００１６】同様に、Ｓ４４４３クローンを鋳型に、Ｏ
ＳＯＴ−Ａ（配列表の配列番号４参照）、ＯＳＯＴ−Ｂ
（配列表の配列表の配列番号５参照）をプライマーとし
て、１５サイクルのＰＣＲ反応を行い、配列表５の３８
１番目から９４８番目の間の配列を増幅した。上記２回
のＰＣＲ増副産物である二つのＤＮＡ断片を混合し、プ
ライマーとしてＯＳＯＴ−ＤとＯＳＯＴ−Ｂとを添加し
て、さらにＰＣＲ反応を２５サイクル行った。なお、上
記３回のＰＣＲ反応においては、ＤＮＡポリメラーゼと
してＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）を、東洋紡の推奨
する条件下で使用した。
【００１７】その結果得られた、配列表の配列番号１に
示す配列を有する９４８ｂｐのＤＮＡ断片が、本発明の
イネオルニチンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子を
構成する相補ＤＮＡである。なお、上述の方法は、一例
に過ぎず、その他の方法、例えばＳ４４４５の相補ＤＮ
Ａをプローブとしてイネの相補ＤＮＡライブラリーから
コロニーまたはプラークハイブリダイゼーション法（Sa
mbrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis,T., Molecu
lar Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harb
or Laboratory Press, New York, 1989) によっても、
本発明と同一の配列をもつ相補ＤＮＡを得ることができ
る。本発明の遺伝子に含まれる相補ＤＮＡを用いて、以
下の操作によりプラスミドベクター及び形質転換体を作
出した。
【００１８】まず、相補ＤＮＡを、プラスミドｐＵＣ１
１８のＨｉｎｃII部位にクローン化して、ｐＯＳＯＴ９
を作出した。このｐＯＳＯＴ９からオルニチンカルバミ
ルトランスフェラーゼ相補ＤＮＡをＮｄｅＩ−Ｈｉｎｄ
III 断片として単離し、大腸菌の発現ベクターｐＥＴ２
２−ｂ（＋）(Novagen社製) の同部位にクローン化し
た。得られたプラスミドｐＯＳＯＴ１０を、大腸菌ＢＬ
２１（ＤＥ３)(Studier, F. W. and Moffatt, B. A.,
J. Mol. Biol., 189: 113-130 (1986))に形質転換し
た。形質転換は、塩化カルシウム法（Cohen, S. N., Ch
ang, A. C. Y. and Hsu, L., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 69: 2110-2114, 1972) 、エレクトロポレーション
法（三浦 謹一郎ら編、新基礎生化学実験法、遺伝子工
学、１９８８、丸善株式会社）等の通常用いられる方法
で行うことができる。形質転換した大腸菌は、工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託されており、その受託
番号はＦＥＲＭ ＢＰ−６２６０である。
【００１９】この形質転換体である大腸菌を培養し、該
大腸菌の有する酵素のアミノ酸配列を特定し、あるいは
酵素の比活性を測定することにより、本発明のイネオル
ニチンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を確
認することができる。本発明のイネオルニチンカルバミ
ルトランスフェラーゼ遺伝子がオルニチンカルバミルト
ランスフェラーゼをコードしていることが実証された。
従来、植物由来のオルニチンカルバミルトランスフェラ
ーゼが大腸菌で発現し、機能を発揮することを明らかに
した例はない。また、植物由来のオルニチンカルバミル
トランスフェラーゼを大腸菌で大量発現、精製が可能で
あることも、本発明により初めて明らかとなった。
【００２０】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。 実施例１ エンドウマメ由来のオルニチンカルバミルトランスフェ
ラーゼをコードすると推定される相補ＤＮＡの配列を用
いて、ＤＮＡデータベースに登録されているＤＮＡ配列
に対してホモロジー検索を行った。その結果、前述のイ
ネゲノムプロジェクトが単離したＳ４４４３クローンの
部分配列（３４０ｂｐ）が、エンドウマメ由来のオルニ
チンカルバミルトランスフェラーゼをコードすると推定
される相補ＤＮＡと８０％の相同性を持つことを見出し
た。
【００２１】次に、Ｓ４４４３クローンの相補ＤＮＡの
全塩基配列を決定した。すなわち、Ｆｌｅｘ−ｐｒｅｐ
プラスミド生成キット（ファルマシア社製）を用いて調
製したＳ４４４３クローンＤＮＡを鋳型として、ダイプ
ライマーサイクルシーケンシングキット（パーキンエル
マー社製）を使用してシーケンス反応を行い、ＡＢＩ３
７７シーケンサー（パーキンエルマー社製）を用いてＳ
４４４３クローンの相補ＤＮＡの全塩基配列を決定し
た。その結果、Ｓ４４４３クローンが、イネオルニチン
カルバミルトランスフェラーゼのＣ末端領域（２０６ア
ミノ酸残基）をコードしている可能性が高いことが明ら
かとなった。
【００２２】そこで、Ｎ末端領域をコードしている相補
ＤＮＡを以下の方法で取得した。ＭＳ培地（植物バイオ
テクロノロジー、山田康之・岡田吉美編、東京化学同
人、１９８６）で培養した増殖期のイネ（品種：日本
晴）カルスから、全ＲＮＡをＳＤＳ−フェノール法（Ta
kaiwa, F., Kikuchi, S. and Ohno, K., Mol. Gene.Gen
et., 208: 15-22, 1987) で調製し、さらにオリゴテッ
クス（Oligotex）−ｄＴ３０（super) (宝社製) を用い
てメッセンジャーＲＮＡを精製した。
【００２３】精製メッセンジャーＲＮＡを鋳型として、
Marathon cDNA Amplication キット(クローンテック社
製) を用いて相補ＤＮＡの第一鎖を合成し、続けて第二
鎖を合成した。すなわち、メッセンジャーＲＮＡ１μ
ｇ、ｄＮＴＰ１０ｍＭ及び Marathon ｃＤＮＡプライマ
ー（クローンテック社製）１μＭを含む反応液１０μＬ
中で、Moloney Murine Leukemia Virus(ＭＭＬＶ) 逆転
写酵素を、４２℃で１分間反応させて第一鎖を合成し
た。次いで、ｄＮＴＰの存在下、第一鎖にＲＮａｓｅＨ
とＫｌｅｎｏｗ酵素を作用させ、第二鎖を合成した。合
成した二本鎖ＤＮＡの両端に、MarathonｃＤＮＡアダプ
ターをＴ４ＤＮＡリガーゼで連結した。
【００２４】前述のＳ４４４３クローンの１５９〜１６
５番目の相補配列からなるオリゴヌクレオチドＯＳＯＴ
−Ｃ（配列表の配列番号２参照）を、ホスホアミダイド
試薬（パーキンエルマー社製）で合成した（北海道シス
テムサービス社に委託）。このＯＳＯＴ−ＣとＡＰ１プ
ライマー（クローンテック社製）を用い、先に合成した
二本鎖相補ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。増
幅されたＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｏｔＩで切断した
後、ＮｏｔＩとＰｖｕIIで切断したベクタープラスミド
ｐＵＣ１１８（Viera, J. and Messing, J., Methods E
nzymol., 150: 3-11, 1987) にクローン化した。上記の
方法で得た組換えプラスミドｐＯＳＯＴ４にクローン化
されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した結果、Ｓ４４４
３クローンの１〜１８５番目の配列とその５’上流域の
３４０ｂｐを含んでいることが明らかとなった。
【００２５】そこで、以下の操作によって、イネオルニ
チンカルバミルトランスフェラーゼのＮ末端及びＣ末端
領域を別々にコードする２つの相補ＤＮＡを連結して、
連続した１本の相補ＤＮＡを作成した。
【００２６】まず、Ｎ末端領域をコードする相補ＤＮＡ
を含むプラスミドｐＯＳＯＴ４を鋳型にして、オリゴヌ
クレオチドＯＳＯＴ−Ｄ（北海道システムサービス社
製、配列表の配列番号３参照）とＯＳＯＴ−Ｃ（北海道
システムサービス社製、配列表の配列番号２参照）をプ
ライマーとして、１５サイクルのＰＣＲ反応で増幅し
た。ここでＯＳＯＴ−Ｄとは、Ｎ末端領域をコードする
相補ＤＮＡにコードされる蛋白質の５番目のアミノ酸残
基ＶａｌのコドンＧＴＧを、翻訳開始コドンＡＴＧに代
え、ＡＴＧ配列が制限酵素ＮｄｅＩの切断配列となるよ
うに合成したオリゴヌクレオチドである。
【００２７】同様に、Ｓ４４４３クローンを鋳型に、Ｏ
ＳＯＴ−Ａ（配列表の配列番号４参照）とＯＳＯＴ−Ｂ
（配列表の配列番号５参照）をプライマーとして、１５
サイクルのＰＣＲ反応を行った。得られた二つのＤＮＡ
断片を混合し、プライマーとしてＯＳＯＴ−ＤとＯＳＯ
Ｔ−Ｂとを添加して、さらにＰＣＲ反応を２５サイクル
行った。なお、上記３回のＰＣＲ反応においては、ＤＮ
ＡポリメラーゼとしてＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡製）
を、東洋紡の推奨する条件下で使用した。
【００２８】その結果、９４８ｂｐのＤＮＡ断片（配列
表の配列番号１参照）が得られた。この断片のうち、配
列表の配列番号１の１〜５１２番目の配列は、ｐＯＳＯ
Ｔ４を鋳型にしたＰＣＲ産物に由来し、３８１〜９４８
番目の配列は、Ｓ４４４３クローンを鋳型にしたＰＣＲ
産物に由来するものである。
【００２９】この配列番号１記載の配列を有するＤＮＡ
断片を、プラスミドｐＵＣ１１８のＨｉｎｃII部位にク
ローン化して、ｐＯＳＯＴ９を作出した。増幅された配
列が配列表の配列番号５に記載されたものと同一である
ことは、ＤＮＡシーケンスで確認した。
【００３０】ｐＯＳＯＴ９を塩化カルシウム法（Cohen,
S. N., Chang, A. C. Y. and Hsu,L., Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 69: 2110-2114, 1972) で大腸菌ＣＭ２
３６株に形質導入した。大腸菌ＣＭ２３６株は、オルニ
チンカルバミルトランスフェラーゼをコードする二つの
遺伝子ａｒｇＦとＡｒｇＩが欠失しているため、該酵素
を生産できない（Jeenes, D. J., Soldati, L., Baur,
H., Mercenier, A., Reimmann, C., Leisinger, T. and
Haas. D., Mol. Gen. Genet., 203: 421-429 (1986))
。オルニチンカルバミルトランスフェラーゼは、アル
ギニン生合成の中間体であるシトルリンの合成を触媒す
る酵素であることから、該酵素を有さないＣＭ２３６株
は、アルギニンの生合成中間体であるシトルリンの合成
ができず、アルギニン要求性の表現型を示す。
【００３１】ＣＭ２３６株、ベクタープラスミドｐＵＣ
１１８を保有するＣＭ２３６株及びイネオルニチンカル
バミルトランスフェラーゼ相補ＤＮＡを含むプラスミド
ｐＯＳＯＴ９を保有するＣＭ２３６株のそれぞれのアル
ギニン非存在下及び存在下での生育について検討した。
培地はグルコースを炭素源とし、塩化アンモニアを窒素
源としたＭ９最小培地を用いた（Sambrook, J., Fritsc
h, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A La
boratory Manual, 2nd ed. ColdSpring Harvbor Labora
tory, New York, 1989) 。
【００３２】その結果、アルギニン１ｍＭを加えたＭ９
培地では、すべての株が生育したのに対し、アルギニン
を含まないＭ９培地では、ｐＯＳＯＴ９を保有するＣＭ
２３６株のみが生育した。この結果より、ｐＯＳＯＴ９
にクローン化されたイネ相補ＤＮＡは、細胞内で機能す
るオルニチンカルバミルトランスフェラーゼをコードす
ると結論された。
【００３３】さらに、ｐＯＳＯＴ９からオルニチンカル
バミルトランスフェラーゼ相補ＤＮＡをＮｄｅＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 断片として単離し、大腸菌の発現ベクターｐＥ
Ｔ２２−ｂ（＋）(Novagen社製) の同部位にクローン化
した。得られたプラスミドｐＯＳＯＴ１０を大腸菌ＢＬ
２１（ＤＥ３)(Studier, F.W. and Moffatt, B. A., J.
Mol. Biol., 189: 113-130 (1986))に形質転換した。
ｐＯＳＯＴ１０を保有するＢＬ２１（ＤＥ３) を、ＬＢ
培地（Sambrook, J.,Fritsch, E. F. and Maniatis,
T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd ed.
Cold Spring Harvbor Laboratory, New York, 1989)で
培養し、対数増殖期初期に、isopropyl-β-thio-galact
opyranoside(ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３時間培養す
ることによって、該酵素の発現を誘導した。培養後の細
胞を遠心で集め、フレンチプレス（アミコン社製）で細
胞を破砕し、酵素液を調製した。酵素液を、Bio-Scale
DEAEカラム (バイオラッド社製) 、続いてゲル濾過カラ
ム(Superrose 12HR、ファルマシア製) で精製した。
【００３４】精製の各段階における酵素のＳＤＳポリア
クリルアミドゲル電気泳動の結果を図１に示した。図１
の解析図において、左側のレーン（Ｍ）は、分子量マー
カーを、レーン１は、Bio-Scale DEAEカラムで精製後の
酵素の分析結果を、レーン２は、ゲル濾過カラム (Supe
rrose 12HR、ファルマシア製) で精製後の酵素の分析結
果を示す。
【００３５】上記のようにして得られたイネオルニチン
カルバミルトランスフェラーゼの諸性質を以下に示す。 分子量： 単量体： ３５，０００ダルトン 活性型：２４０，０００ダルトン（６量体） Ｎ末端アミノ酸配列：Ser-Ser-Ser-Ala-Gly-Lys-Asp-Al
a-Lys-Gln 至適反応ｐＨ：７．５ オルニチンに対するＫｍ：３．０ｍＭ 比活性：１３μｍｏｌｅ Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ／ｍｉ
ｎ／ｍｇ蛋白質
【００３６】上記の如く、精製した酵素のＮ末端アミノ
酸配列は、塩基配列から推定された配列（配列表の配列
番号１の４番目〜３３番目の塩基配列に対応するアミノ
酸配列）と完全に一致した。さらに、該酵素は高い酵素
活性を有しており、カルバミルリン酸のカルバミル基を
オルニチンに転移してシトルリンを生成する反応を触媒
する能力を有していることがわかった。
【００３７】以上の成績から、本発明の相補ＤＮＡがオ
ルニチンカルバミルトランスフェラーゼをコードしてい
ることが実証された。従来、植物由来のオルニチンカル
バミルトランスフェラーゼが大腸菌で発現し、機能を発
揮することを明らかにした例はない。また、植物由来の
オルニチンカルバミルトランスフェラーゼを大腸菌で大
量発現、精製が可能であることも、本発明によりはじめ
て明らかとなった。
【００３８】形質転換した大腸菌は、工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されており、その受託番号はＦ
ＥＲＭ ＢＰ−６２６０である。
【００３９】
【発明の効果】本発明によれば、イネ由来のオルニチン
カルバミルトランスフェラーゼをコードする相補ＤＮＡ
が提供される。この相補ＤＮＡを用いることにより、安
全性の高いファゼオロトキシン耐性導入オルニチンカル
バミルトランスフェラーゼ遺伝子を開発することがで
き、食用植物への応用が期待される。また、本発明によ
れば、イネオルニチンカルバミルトランスフェラーゼを
コードする相補ＤＮＡを有する形質転換体も提供され
る。この形質転換体は、該ファゼオロトキシン耐性導入
オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子の機能
を簡便に評価するための微生物における発現系として有
効に利用することができる。
【００４０】また、本発明の相補ＤＮＡをもとにしてオ
ルニチンカルバミルトランスフェラーゼを大量に生産す
ることも可能である。このように大量生産された酵素を
利用すれば、除草剤の有効成分としてのファゼオロトキ
シン等のオルニチンカルバミルトランスフェラーゼ阻害
活性を有する化合物の除草剤活性の評価を、評価用の植
物を用いることなく、試験管内における迅速なアッセイ
で簡便に行うことができる。
【００４１】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：９４８ トポロジー：一本鎖 配列の種類：相補ＤＮＡ 起源 生物名：イネ（Oryza sative L. ） 株名：日本晴 直接の起源 プラスミド名：ｐＯＳＯＴ９ 配列の特徴：mat peptide 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG TCG TCC TCT GCT GGT AAA GAT GCC AAA CAG ATT CCT AAG GAC TTT 48 Met Ser Ser Ser Ala Gly Lys Asp Ala Lys Gln Ile Pro Lys Asp Phe 1 5 10 15 CTT CAT ATT GAT GAT TTC GAC AAG GAT ACA ATC ATG AAG ATC CTT AAT 96 Leu His Ile Asp Asp Phe Asp Lys Asp Thr Ile Met Lys Ile Leu Asn 20 25 30 CGG GCT ATT GAG GTC AAG GCA ATG ATA AAG TCA GGA GAC AGG AGC TTC 144 Arg Ala Ile Glu Val Lys Ala Met Ile Lys Ser Gly Asp Arg Ser Phe 35 40 45 CAA CCT TTC AAA GGG AAA TCA ATG GCA ATG ATA TTT GCC AAG CCG TCA 192 Gln Pro Phe Lys Gly Lys Ser Met Ala Met Ile Phe Ala Lys Pro Ser 50 55 60 ATG AGA ACC CGT GTT TCA TTT GAG ACA GGA TTC TTT TTG CTT GGT GGC 240 Met Arg Thr Arg Val Ser Phe Glu Thr Gly Phe Phe Leu Leu Gly Gly 65 70 75 80 CAT GCT ATC TAC CTG GGT CCT GAT GAT ATC CAG ATG GGC AAG CGT GAA 288 His Ala Ile Tyr Leu Gly Pro Asp Asp Ile Gln Met Gly Lys Arg Glu 85 90 95 GAG ACC CGT GAT GTT GCT CGT GTG CTT TCT GGA TAT AAT GAC ATC ATT 336 Glu Thr Arg Asp Val Ala Arg Val Leu Ser Gly Tyr Asn Asp Ile Ile 100 105 110 ATG GCC AGG GTT TTT GCT CAC CAA GAC ATT TTG GAC TTG GCA AAG TAT 384 Met Ala Arg Val Phe Ala His Gln Asp Ile Leu Asp Leu Ala Lys Tyr 115 120 125 GCA GCT GTA CCT GTC ATA AAT GGC CTT ACG GAC TAC AAC CAT CCA TGC 432 Ala Ala Val Pro Val Ile Asn Gly Leu Thr Asp Tyr Asn His Pro Cys 130 135 140 CAG ATA ATG GCT GAT GCA CTT ACT ATG CTC GAA CAC ATT GGT CGT ATT 480 Gln Ile Met Ala Asp Ala Leu Thr Met Leu Glu His Ile Gly Arg Ile 145 150 155 160 GAA AAC ACT AAG GTT GTC TAT GTT GGA GAC GGG AAC AAT ATT GTC CAC 528 Glu Asn Thr Lys Val Val Tyr Val Gly Asp Gly Asn Asn Ile Val His 165 170 175 TCA TGG CTT CGA TTG GCT GCT TTA TTT CCT TTA CAT TTT GTA TGT GCC 576 Ser Trp Leu Arg Leu Ala Ala Leu Phe Pro Leu His Phe Val Cys Ala 180 185 190 TGT CCT AAG GGC TTC GAG CCA GAT GCA AAG ACT GTG GAG ATA GCC AGG 624 Cys Pro Lys Gly Phe Glu Pro Asp Ala Lys Thr Val Glu Ile Ala Arg 195 200 205 AGT GCT GGT AGT AAG ATT GAA ATA ACA GAT GAC CCT ATG GAA GCA GTT 672 Ser Ala Gly Ser Lys Ile Glu Ile Thr Asp Asp Pro Met Glu Ala Val 210 215 220 AAG GGA GCA GAT GTT GTG TAT ACA GAT GTC TGG GCC AGC ATG GGC CAA 720 Lys Gly Ala Asp Val Val Tyr Thr Asp Val Trp Ala Ser Met Gly Gln 225 230 235 240 AAG GAG GAA GCT GAA TAT AGA AAA AAA GTG TTC CAA GGA TTC ACG GTG 768 Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys Lys Val Phe Gln Gly Phe Thr Val 245 250 255 GAT GAA GCT ATG ATG GAG ATG GCT GGG CCA AAT GCC TTC CTT ATG CAT 816 Asp Glu Ala Met Met Glu Met Ala Gly Pro Asn Ala Phe Leu Met His 260 265 270 TGT TTG CCT GCA GAG AGA GGG ATA GAG GTA ACA GAC GGC GCC ATT GAA 864 Cys Leu Pro Ala Glu Arg Gly Ile Glu Val Thr Asp Gly Ala Ile Glu 275 280 285 GCT CCC AAC TCA ATC GTA TTC CCC CAG GCT GAG AAC AGA ATG CAC GCC 912 Ala Pro Asn Ser Ile Val Phe Pro Gln Ala Glu Asn Arg Met His Ala 290 295 300 CAG AAT GCT ATC ATG CTT CAC GTC CTT GGT GCT TAG 948 Gln Asn Ala Ile Met Leu His Val Leu Gly Ala 305 310 315
【００４２】配列番号：２ 配列の長さ：２７ トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 起源 生物名：イネ（Oryza sative L. ） 株名：日本晴 直接の起源 プラスミド名：Ｓ４４４３ 配列の特徴：mat peptide 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCGTCTCCAA CATAGACAAC CTTAGTG 27
【００４３】配列番号：３ 配列の長さ：２８ トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 起源 生物名：イネ（Oryza sative L. ） 株名：日本晴 直接の起源 プラスミド名：ｐＯＳＯＴ９ 配列の特徴：mat peptide 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TACATATGGT CGTCCTCTGC TGGTAAAG 28
【００４４】配列番号：４ 配列の長さ：２７ トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 起源 生物名：イネ（Oryza sative L. ） 株名：日本晴 直接の起源 プラスミド名：ｐＯＳＯＴ９ 配列の特徴：mat peptide 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GTATGCAGCT GTACCTGTCA TAAATGG 27
【００４５】配列番号：５ 配列の長さ：２５ トポロジー：一本鎖 配列の種類：合成オリゴヌクレオチド 起源 生物名：イネ（Oryza sative L. ） 株名：日本晴 直接の起源 プラスミド名：Ｓ４４４３ 配列の特徴：mat peptide 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CTAAGCACCA AGGACGTGAA GCATG 25
【図面の簡単な説明】
【図１】 大腸菌で発現した精製イネオルニチンカルバ
ミルトランスフェラーゼの電気泳動写真である。
【符号の説明】
左側の数値は分子量（単位：ｋＤａ）を示す。Ｍは左
側のレーンが分子量マーカーであることを示す。１はBi
o-Scale DEAEカラムで精製後の分析結果を示し、２はゲ
ル濾過カラムで精製後の分析結果を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 伊藤 義文 茨城県つくば市並木２−10−１−207−308 (72)発明者 日野 明寛 茨城県つくば市竹園１−13−２−804−303 (72)発明者 三浦 裕仁 茨城県つくば市春日１−11−４−205−315

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列
    からなる蛋白質をコードするイネオルニチンカルバミル
    トランスフェラーゼ遺伝子。
  2. 【請求項２】 請求項１記載のイネオルニチンカルバミ
    ルトランスフェラーゼ遺伝子を含むプラスミドベクタ
    ー。
  3. 【請求項３】 請求項２記載のプラスミドベクターを保
    有する形質転換体。
JP10066070A 1998-03-03 1998-03-03 イネオルニチンカルバミルトランスフェラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体 Pending JPH11243964A (ja)

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