JPH11253184A - Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原の逸出突然変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク
質を提供すること。 【解決手段】 ヒトを感染させるＢ型肝炎ウイルスの表
面抗原タンパク質のアミノ酸配列であって、位置１２１
におけるアミノ酸がシステインではなく、位置１２０、
１２２、１２３、１４７又は１４９におけるアミノ酸の
少なくとも１種がそれの位置に対する保存アミノ酸では
ない前記アミノ酸配列を含む、単離した突然変異Ｂ型肝
炎表面抗原タンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス
の表面抗原の逸出突然変異体（escape mutant）に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）に感染した
患者からの血清は一般にＢ型表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を
含有する３種類の異なる構造：Ｄａｎｅ粒子、球状粒子
及びフィラメント状粒子を共通に有する。Ｄａｎｅ粒子
は、直径２８ｎｍのコアを有する直径４２ｎｍである球
体である。球状粒子は約２２ｎｍの直径を有する。フィ
ラメント状粒子は約２２ｎｍの直径と、約５０ｎｍ−約
２３０ｎｍの長さを有する。

【０００３】これらの粒子は主要タンパク質、ミドル・
タンパク質（middle protein）及びラージ・タンパク
質（large protein）と呼ばれる３種類の糖タンパク質
を含有する。ＨＢＡ−ＤＮＡのＢ型肝炎表面抗原オープ
ンリーディングフレームは３領域：プレ−Ｓ１、プレ−
Ｓ２及びＳに分割される。このオープンリーディングフ
レームは主要タンパク質、ミドル・タンパク質及びラー
ジ・タンパク質をコードする。主要タンパク質の完全な
アミノ酸配列はＶａｌｅｎｚｕｅｌａ等のＮａｔｕｒ
ｅ，２８０：８１５−８１９（１９７９）に記載されて
いる。Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ等におけるアミノ酸配列は
２２６アミノ酸長さであり、この出願において記載する
アミノ酸位置はＶａｌｅｎｚｕｅｌａ等において開示さ
れたアミノ酸配列を意味する。ＨＢｓＡｇは幾つかの抗
原決定基を含有しており、これらのうちで最も重要な決
定基はａ決定基と、ｄ／ｙ決定基と、ｗ／ｒ決定基とで
ある。

【０００４】Ｂ型肝炎ワクチンは近年、ヒトに広く用い
られている。Ｍｅｒｃｋから得られる、例えばＲＥＣＯ
ＭＢＩＶＡＸ ＨＢワクチンのような、典型的なワクチ
ンは酵母において組換え的に産生されているａｄｗサブ
タイプのＨＢｓＡｇを含有する。ヒト集団がワクチン接
種されると、ウイルスはワクチンの周囲に発生せざるを
得なくなる。ワクチンに反応して発生する突然変異体は
“逸出突然変異体”と呼ばれる。現在のワクチンはこれ
らの逸出突然変異体に対して有効ではないと考えられ
る。さらに、幾つかの現在の免疫診断試験はこれらの逸
出突然変異体を検出することはできない。

【０００５】ある一定のＨＢＶ逸出突然変異体は今まで
に記録されている。位置１４５におけるグリシンからア
ルギニンへの突然変異はＣａｒｍａｎ等，Ｌａｎｃｅ
ｔ，３３６：３２５−３２９（１９９０）によって報告
された。さらに、アミノ酸１２２の後ろに付加的なアミ
ノ酸が挿入された突然変異はＷＯ９５／２１１８９に報
告された。他の突然変異体はＭｃＭａｈｏｎ等，Ｈｅｐ
ａｔｏｌｏｇｙ，１５（５）：７５７−７６６（１９９
２）に述べられている。さらに、人為的な突然変異タン
パク質に関する研究が行われている。この種の研究の１
例は、Ｍａｎｇｏｌｄ等のＶｉｒｏｌｏｇｙ，２１１：
５３５−５４３（１９９５）である。Ｍａｎｇｏｌｄ等
は位置１２１、１２４、１３７、１３９、１４７及び１
４９に種々な突然変異を生じさせた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、単離した突
然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメン
ト、あるいはこれらのタンパク質を含有する粒子を提供
する。これらのタンパク質、フラグメント及び粒子は改
良されたワクチンに用いることができ、これらの突然変
異タンパク質、フラグメント及び粒子、並びにそれらに
対する特異的結合剤は改良されたイムノアッセイに用い
ることができる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、ヒトを感染さ
せるＢ型肝炎ウイルスの表面抗原タンパク質のアミノ酸
配列であって、位置１２１におけるアミノ酸がシステイ
ンではなく、位置１２０、１２２、１２３、１４７又は
１４９におけるアミノ酸の少なくとも１個がそれの位置
に対する保存アミノ酸ではない前記アミノ酸配列を含
む、単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質を提
供する。本発明はさらに、ヒトを感染させるＢ型肝炎ウ
イルスの表面抗原タンパク質のアミノ酸配列であって、
位置１２２におけるアミノ酸がそれの位置に対する保存
アミノ酸ではない前記アミノ酸配列を含む、単離した突
然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質を提供する。

【０００８】本発明はまた、薬剤学的に受容されるキャ
リヤー中に突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそ
のフラグメント、あるいは該タンパク質を含有する粒子
の免疫原量（immunogenic amount）を含むワクチンを
提供する。本発明はさらに、突然変異Ｂ型肝炎表面抗原
タンパク質又はそのフラグメント、あるいは該タンパク
質を含有する粒子を特異的に認識する特異的結合剤をも
提供する。

【０００９】本発明はまた、サンプル中の突然変異Ｂ型
肝炎表面抗原タンパク質又は該タンパク質を含有する粒
子を検出する方法であって：（ａ）サンプルに、結合が
生ずるために適した条件下で本発明の突然変異表面抗原
タンパク質を特異的に認識する特異的結合剤を接触さ
せ；そして（ｂ）特異的結合剤の結合度を、この結合度
がサンプル中の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又
は該タンパク質を含有する粒子の存在又は量に相関する
場合に、測定して、サンプル中の突然変異Ｂ型肝炎表面
抗原タンパク質又は該タンパク質を含有する粒子の存在
又は量を判定することを含む上記方法を提供する。サン
プル中の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又は該タ
ンパク質を含有する粒子の量を測定する方法をキャリブ
レートする方法と、突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク
質又はそのフラグメント又は該タンパク質を含有する粒
子に対する特異的結合剤の結合アフィニティを試験する
ための方法も提供する。

【００１０】本発明は、サンプル中の突然変異Ｂ型肝炎
表面抗原タンパク質をコードする核酸配列を検出する方
法であって；（ａ）本発明の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原
タンパク質をコードする核酸配列を含有すると疑われる
サンプルを用意し；そして（ｂ）突然変異Ｂ型肝炎表面
抗原タンパク質をコードする核酸配列を検出することを
含む上記方法を提供する。

【００１１】本発明の他の特徴及び利点は、以下の説明
に記載するので、一部はこの説明から明らかになるであ
ろう。本発明の目的と他の利点は、記載した説明、特許
請求の範囲及び添付図面に指摘するように、単離した突
然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメン
ト又はこれらのタンパク質を含有する粒子、それらに対
する特異的結合剤と、これらのタンパク質、それらのフ
ラグメント及びこれらのタンパク質を含有する粒子及び
／又は特異的結合剤を用いるイムノアッセイ及びワクチ
ンとによって、実現され、達成される。上記一般的な説
明と以下の詳細な説明の両方が例示的かつ解説的であ
り、特許請求する本発明を詳しく説明することを意図す
るものであることを理解すべきである。

【００１２】本発明は、ヒトを感染させるＢ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原タンパク質のアミノ酸配列であって、位
置１２１におけるアミノ酸がシステインではなく、位置
１２０、１２２、１２３、１４７又は１４９におけるア
ミノ酸の少なくとも１個がそれの位置に対する保存アミ
ノ酸ではない前記アミノ酸配列を含む、単離した突然変
異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質を提供する。１実施態様
において、単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク
質は野生型Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質の抗原性とは異
なる抗原性を示す。他の実施態様では、位置１２０、１
２２又は１２３におけるアミノ酸の少なくとも１つがそ
れの位置に対する保存アミノ酸ではない；さらに他の実
施態様では、位置１４７又は１４９におけるアミノ酸の
少なくとも１個がそれの位置に対する保存アミノ酸では
ない。

【００１３】本発明の１実施態様では、位置１２０、１
２２、１２３、１４７又は１４９におけるアミノ酸の少
なくとも２個がそれらの位置に対する保存アミノ酸では
ない。他の実施態様では、位置１２０、１２２、１２
３、１４７又は１４９におけるアミノ酸の少なくとも３
個、少なくとも４個又は５個の全てがそれらの位置に対
する保存アミノ酸ではない。

【００１４】他の実施態様では、位置１２１における保
存システインがチロシンによって置換され；位置１２０
における保存プロリンがアラニンによって置換され；位
置１２２における保存リシン又はアルギニンがグルタミ
ンによって置換されている、及び／又は位置１２３にお
ける保存スレオニンがプロリンによって置換されてい
る。他の実施態様では、位置１２０における保存プロリ
ンがアラニンによって置換され、位置１２２における保
存リシン又はアルギニンがグルタミンによって置換さ
れ、位置１２３における保存スレオニンがプロリンによ
って置換されている。

【００１５】別の実施態様では、位置１２７におけるア
ミノ酸がそれの位置に対する保存アミノ酸ではなく；好
ましくは、位置１２７における保存プロリンがイソロイ
シンによって置換されている。他の実施態様では、位置
１１７におけるアミノ酸がそれの位置に対する保存アミ
ノ酸ではなく；好ましくは、位置１１７における保存セ
リンがアルギニンによって置換されている。他の実施態
様では、位置９６におけるアミノ酸がそれの位置に対す
る保存アミノ酸ではなく；好ましくは位置９６における
保存バリンがアラニンによって置換されている。他の実
施態様では、位置１１３におけるアミノ酸がそれの位置
に対する保存アミノ酸ではなく；好ましくは、位置１１
３における保存セリン又はスレオニンがロイシンによっ
て置換されている。 別の実施態様において、位置１３
３におけるアミノ酸がそれの位置に対する保存アミノ酸
ではなく；好ましくは、位置１３３における保存メチオ
ニンがスレオニンによって置換されている。別の実施態
様では、位置１４０におけるアミノ酸がそれの位置に対
する保存アミノ酸ではなく；好ましくは、位置１４０に
おける保存スレオニンがイソロイシンによって置換され
ている。別の実施態様では、位置１４７におけるアミノ
酸がそれの位置に対する保存アミノ酸ではなく；好まし
くは、位置１４７における保存システインがチロシンに
よって置換されている。別の実施態様では、位置１４９
におけるアミノ酸がそれの位置に対する保存アミノ酸で
はなく；好ましくは、位置１４９における保存システイ
ンがチロシンによって置換されている。

【００１６】別の実施態様では、位置１４７と１４９に
おけるアミノ酸がそれらの位置に対する保存アミノ酸で
はない。別の実施態様では、位置１２１、１４７及び１
４９における保存システインがチロシンによって置換さ
れている。別の実施態様では、位置１４５におけるアミ
ノ酸が保存グリシンである。別の実施態様では、位置１
３７、１３８及び１３９におけるアミノ酸が全て保存シ
ステインである。別の実施態様では、位置１２４におけ
るアミノ酸が保存システインである。

【００１７】本発明は、ヒトを感染させるＢ型肝炎ウイ
ルスの表面抗原タンパク質のアミノ酸配列であって、位
置１２２におけるアミノ酸がそれの位置に対する保存ア
ミノ酸ではない前記アミノ酸配列を含む、単離した突然
変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質を提供する。１実施態
様では、単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質
が、野生型Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質の抗原性とは異
なる抗原性を示す。別の実施態様では、位置１２２にお
ける保存リシン又はアルギニンがグルタミンによって置
換されている。

【００１８】本発明の実施態様では、単離した突然変異
Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質はｂ型肝炎表面抗原の主要
なタンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原のミドルタンパク質、
Ｂ型肝炎表面抗原のラージタンパク質である。本発明の
別の実施態様では、タンパク質はプレ−Ｓ配列を包含す
る。本発明の他の実施態様では、プレ−Ｓ１配列の一部
若しくは完全なプレ−Ｓ１配列又はプレ−Ｓ２配列の一
部若しくは完全なプレ−Ｓ２配列を包含する。

【００１９】本発明の１実施態様では、単離した突然変
異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質は、位置１１７−１２３
において下記アミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−
Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）を
含む。別の実施態様では、単離した突然変異Ｂ型肝炎表
面抗原タンパク質は、位置１１３−１３３において下記
アミノ酸配列：Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｒ
ｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ
−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−
Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（配列番号：２９）を
含む。別の実施態様では、単離した突然変異Ｂ型肝炎表
面抗原タンパク質は位置１４０−１４７において下記ア
ミノ酸配列：Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ
−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（配列番
号：３０）を含む。１実施態様では、単離した突然変異
Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質は位置１１７−１２３にお
いて下記アミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌ
ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）を含
み、位置１４０−１４７において下記アミノ酸配列：Ｉ
ｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓ
ｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（配列番号：３０）を含
む。別の実施態様では、単離した突然変異Ｂ型肝炎表面
抗原タンパク質は位置１１７−１４７において下記アミ
ノ酸配列：Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−
Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａ
ｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙ
ｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ
−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−
Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（配列番号：３１）を含む。別
の実施態様では、単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タ
ンパク質は配列番号：２（以下参照）にリストされるア
ミノ酸配列を含む。

【００２０】本発明は、本発明の突然変異Ｂ型肝炎表面
抗原タンパク質を含む、単離した突然変異Ｂ型肝炎粒子
を提供する。本発明はまた、本発明の単離した突然変異
Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質のフラグメントを提供す
る。本出願に用いる場合に、突然変異Ｂ型肝炎表面抗原
タンパク質の“フラグメント”は、位置１２０−１４９
におけるアミノ酸配列を含有する、少なくとも３０個の
アミノ酸の配列を含むフラグメントを意味する。好まし
いフラグメントは、単離したフラグメントが少なくとも
３０個のアミノ酸の配列を含み、前記配列が位置１２０
−１４９におけるアミノ酸を含み、位置１２１における
アミノ酸がシステインではなく、位置１２０、１２２、
１２３、１４７又は１４９におけるアミノ酸の少なくと
も１個がそれの位置に対する保存アミノ酸ではない、突
然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質の単離したフラグメ
ントである。他の好ましいフラグメントは、単離したフ
ラグメントが少なくとも３０個のアミノ酸の配列を含
み、前記配列が位置１２０−１４９におけるアミノ酸を
含み、位置１２２におけるアミノ酸がそれの位置に対す
る保存アミノ酸ではない、突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タ
ンパク質の単離したフラグメントである。

【００２１】本発明はまた、本発明の突然変異Ｂ型肝炎
表面抗原タンパク質又はそのフラグメント又は該タンパ
ク質を含有する粒子を含み、実質的に血液を含まない組
成物を提供する。

【００２２】本発明は、本発明の突然変異Ｂ型肝炎表面
抗原タンパク質又はそのフラグメント又は該タンパク質
を含有する粒子の免疫原量を薬剤学的に受容されるキャ
リヤー中に含むワクチンを提供する。

【００２３】本発明は、本発明の突然変異Ｂ型肝炎表面
抗原タンパク質又はそのフラグメント、あるいは該タン
パク質を含有する粒子を特異的に認識する特異的結合剤
であって、突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそ
のフラグメント、あるいは該タンパク質を含有する粒子
に対して特異的に調製される（raised）上記特異的結合
剤を提供する。１実施態様では、特異的結合剤は下記表
現型：ａｙｗ、ａｙｒ、ａｄｒ又はａｄｗのいずれかを
有するネイティブＨＢＶに実質的に結合しない。別の実
施態様では、特異的結合剤は下記表現型：ａｙｗ、ａｙ
ｒ、ａｄｒ又はａｄｗのいずれかを有するネイティブＨ
ＢＶに実質的に結合する。１実施態様では、特異的結合
剤は逐次エピトープ（sequential epitope）を認識す
る；別の実施態様では、特異的結合剤はコンホメーショ
ン・エピトープ（conformationalepitope）を認識す
る。特異的結合剤はモノクローナル抗体、フラグメント
状モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体でありう
る。

【００２４】本発明は、本発明のモノクローナル抗体の
分泌ハイブリドーマを提供する。本発明は、突然変異Ｂ
型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメント、ある
いは該タンパク質を含有する粒子の既知量を含む対照サ
ンプルを提供する。

【００２５】本発明は、サンプル中の突然変異Ｂ型肝炎
表面抗原タンパク質又は該タンパク質を含有する粒子を
検出する方法であって：（ａ）サンプルに、結合が生ず
るために適した条件下で本発明の突然変異表面抗原タン
パク質を特異的に認識する特異的結合剤を接触させ；そ
して（ｂ）サンプル中の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タン
パク質又は該タンパク質を含有する粒子の存在又は量に
相関する、特異的結合剤の結合度を測定して、サンプル
中の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又は該タンパ
ク質を含有する粒子の存在又は量を判定することを含む
上記方法を提供する。１実施態様では、結合度とサンプ
ル中の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又は該タン
パク質を含有する粒子の存在又は量との間の相関関係
が、突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラ
グメント又は該タンパク質を含有する粒子の既知量を含
有する対照サンプルを用いて測定されている。別の実施
態様では、特異的結合剤は突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タ
ンパク質又は該タンパク質を含有する粒子に対して特異
的に調製されたものである。別の実施態様では、この方
法は非競合分析を含む。さらに他の実施態様では、分析
はラベルを有する第２特異的結合剤を含み、ラベルは放
射性ラベル、酵素ラベル、蛍光ラベル、化学発光ラベ
ル、バイオ発光ラベル、又はエピ蛍光レベルであること
ができる。別の実施態様では、この方法は凝集分析を含
み；さらに他の実施態様では、この方法は競合分析を含
む。この方法は、突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質
又は該タンパク質を含有する粒子と交差反応する標識基
質を用いることを含む。サンプルは血液サンプル又はワ
クチンであることができる。

【００２６】本発明は、突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タン
パク質又は該タンパク質を含有する粒子に関する分析を
キャリブレートする方法であって；（ａ）本発明の突然
変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメント
又は該タンパク質を含有する粒子の既知量を含む２つ以
上の対照サンプルを用意し；（ｂ）対照サンプルの各々
を分析において試験して、各々の対照サンプルが発生し
たシグナルを記録し；そして（ｃ）発生したシグナル
を、サンプル中の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質
又はそのフラグメント又は該タンパク質を含有する粒子
の量と相関させる検量曲線を作成する、ことを含む上記
方法を提供する。

【００２７】本発明は、特異的結合剤の結合アフィニテ
ィを試験する方法であって；（ａ）本発明の突然変異Ｂ
型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメント又は該
タンパク質を含有する粒子の既知量を含む対照サンプル
を用意し；（ｂ）結合が生ずるのに適した条件下で、対
照サンプルに特異的結合剤を接触させ；そして（ｃ）特
異的結合剤の結合度を測定して、突然変異Ｂ型肝炎表面
抗原タンパク質又はそのフラグメント、あるいは該タン
パク質を含有する粒子に対する該特異的結合剤の結合ア
フィニティを判定する、ことを含む上記方法を提供す
る。１実施態様では、結合アフィニティを結合アフィニ
ティの予め定められた最小値と比較する。別の実施態様
では、この比較は診断イムノアッセイ・キットを製造す
るための品質管理方法の一部である。好ましい実施態様
では、特異的結合剤はモノクローナル抗体又はフラグメ
ント状モノクローナル抗体である。

【００２８】本発明は、本発明の特異的結合剤を含む診
断免疫アッセイ・キットを提供する。本発明はさらに、
本発明の対照サンプルを含む診断免疫アッセイ・キット
を提供する。

【００２９】本発明は、組換え的に作製された、本発明
の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグ
メント、あるいは該タンパク質を含有する粒子を提供す
る。１実施態様では、タンパク質、粒子又はフラグメン
トは酵母、細菌又は哺乳動物細胞中に組換え的に作製さ
れている。

【００３０】本発明は、本発明の突然変異Ｂ型肝炎表面
抗原タンパク質又はそのフラグメント、あるいは該タン
パク質を含有する粒子をコードする単離ＤＮＡを提供す
る。１実施態様では、単離ＤＮＡは配列番号：２のアミ
ノ酸配列をコードする配列を含む。別の実施態様では、
単離ＤＮＡは下記アミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌ
ｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ
−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−
Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｃ
ｙｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（配列番
号：３１）をコードする配列を含む。

【００３１】本発明は、本発明のＢ型肝炎表面抗原タン
パク質又はそのフラグメント又は該タンパク質を含有す
る粒子をコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。

【００３２】本発明は、突然変異Ｂ型肝炎表面還元タン
パク質をコードする核酸配列をサンプル中で検出する方
法であって；（ａ）本発明の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原
タンパク質をコードする核酸配列を含有すると疑われる
サンプルを用意し；そして（ｂ）突然変異Ｂ型肝炎表面
抗原タンパク質をコードする核酸配列を検出する、こと
を含む上記方法を提供する。好ましい実施態様では、工
程（ｂ）の前に、核酸配列の少なくとも一部を増幅す
る。別の実施態様では、増幅した核酸を、増幅した突然
変異Ｂ型肝炎核酸に相補的なヌクレオチド配列を含むヌ
クレオチドプローブの少なくとも一部とハイブリダイズ
させ；そして、プローブを検出することによって、検出
工程をおこなう。別の実施態様では、プローブを標識す
る。さらに他の実施態様では、ハイブリダイズしたプロ
ーブと増幅した核酸の複合体を二本鎖ＤＮＡに特異的で
ある特異的結合剤によって検出する；特異的結合剤は好
ましくはモノクローナル抗体又はフラグメント状モノク
ローナル抗体である。別の実施態様では、検出工程が、
増幅した核酸をヌクレオチド配列の長さに応じて分離
し、増幅したＢ型肝炎核酸に対応するヌクレオチド配列
を検出することによっておこなわれる。

【００３３】本発明は、下記ヌクレオチド配列： センスプローブ＃１（ｎｔ４９１からｎｔ５２６ま
で）：５’−ＧＧＡＹＴＭＴＣＧＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡ
ＣＧＧＧＡＧＣＡＴＡＣＣＡＡＣＣＣ−３’（配列番
号：３４）； アンチセンスプローブ＃２（ｎｔ５２６からｎｔ４９１
まで）：５’−ＧＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＣＴＣＣＣＧＴ
ＧＣＫＧＡＴＧＧＴＣＧＡＫＡＲＴＣＣ−３’（配列番
号：３５）； センスプローブ＃３（ｎｔ５００からｎｔ５２３ま
で）：５’−ＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡＴ
ＡＣＣＡＡ−３’（配列番号：３６）； アンチセンスプローブ＃４（ｎｔ５２３からｎｔ５００
まで）：５’−ＴＴＧＧＴＡＴＧＣＴＣＣＣＧＴＧＣＫ
ＧＡＴＧＧＴ−３’（配列番号：３７）； センスプローブ＃５（ｎｔ４８８からｎｔ５１１ま
で）：５’−ＣＣＡＧＧＡＹＴＭＴＣＧＡＣＣＡＴＣＭ
ＧＣＡＣＧ−３’（配列番号：３８）； アンチセンスプローブ＃６（ｎｔ５１４からｎｔ４９１
まで）：５’−ＴＣＣＣＧＴＧＣＫＧＡＴＧＧＴＣＧＡ
ＫＡＲＴＣＣ−３’（配列番号：３９）； センスプローブ＃７（ｎｔ５１５からｎｔ５３８ま
で）：５’−ＧＣＡＴＡＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＣＧＡ
ＣＴＡＴＴＧ−３’（配列番号：４０）； アンチセンスプローブ＃８（ｎｔ５３８からｎｔ５１５
まで）：５’−ＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＧＣＡＧＧＧＴＴ
ＧＧＴＡＴＧＣ−３’（配列番号：４１）； センスプローブ＃９（ｎｔ５７３からｎｔ６０５ま
で）：５’−ＧＴＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＧＡＣＧＧ
ＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣＴＡＴＡ−３’（配列番号：４
２）； センスプローブ＃１０（ｎｔ５８４からｎｔ６０５ま
で）：５’−ＴＣＧＧＡＣＧＧＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣＴ
ＡＴＡ−３’（配列番号：４３）； アンチセンスプローブ＃１１（ｎｔ６１６からｎｔ５９
５まで）：５’−ＴＧＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＡＴＡＧＧ
ＴＧＴＡＡ−３’（配列番号：４４）；又は上記ヌクレ
オチド配列のいずれかと実質的に同じヌクレオチド配列
を有し、実質的に同じハイブリダイゼーション活性を有
するヌクレオチド配列、から選択されるヌクレオチド配
列を含むヌクレオチドプローブを提供する。好ましい実
施態様では、プローブは上記配列の１つから本質的に成
る。好ましい実施態様では、これらのプローブは本発明
の方法及びキットに用いられる。これらのプローブはさ
らに検出可能なラベルを含むことができる。これらのプ
ローブと共に用いるために適当なプライマーは当業者に
自明である。

【００３４】本発明は、本発明の突然変異Ｂ型肝炎表面
抗原タンパク質をコードする核酸配列の検出用キットで
あって：Ｂ型肝炎表面抗原に特徴的な核酸にアニーリン
グして、この核酸による増幅をプライミングすることが
できるヌクレオチド・プライマーを含む少なくとも１種
の試薬；および、増幅した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原核
酸とハイブリダイズすることができるヌクレオチドプロ
ーブを含む少なくとも１種の試薬とを含む上記キットを
提供する。

【００３５】ＥＴＩ−ＭＡＫ−３アッセイ（Ｓｏｒｉｎ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓａｌｕｇｇｉａ，Ｉｔａ
ｌｙ）においてＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）に関し
て陽性であり、ＡＸＳＹＭ−ＨＢｓＡｇアッセイ（Ａｂ
ｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において陰性で
あると試験された腎移植患者から採取した血清サンプル
（ＣＴＳと表示）から、Ｂ型肝炎表面抗原ＤＮＡをクロ
ーン化し、配列決定した。ＣＴＳと表示されたＢ型肝炎
表面抗原はＢ型肝炎ウイルスの突然変異のために、ＣＴ
Ｓと表示されたＢ型肝炎表面抗原はＡｂｏｔｔアッセイ
によって検出されなかった。偽陰性の徴候を示すアッセ
イを用いると、突然変異によって感染した患者に対する
有効な治療の提供の遅延が生じうる、又は血液ドナーか
らレシピエントへの突然変異ＨＢＶを伝染させる可能性
がある。

【００３６】クローン化されたヌクレオチド配列を翻訳
すると、その生成物は、抗原の二次構造及び三次構造に
おける差異を決定すると考えられる多数の突然変異を示
す。このような突然変異はタンパク質の抗原性における
差異をも決定する。

【００３７】この突然変異ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳはａｙｗ
サブタイプのネイティブＨＢｓＡｇに非常に密接に相同
する。この相対的相同性は、ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳがａｙ
ｗサブタイプから発生したことを示唆する。類似性にも
拘わらず、ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳは、それがａｙｗサブタ
イプから系統学的に（phylogenically）重要な方法で取
り出されることを示唆する、ある一定の特徴を有する。
特に、位置１２２における塩基性アミノ酸（Ａｒｇ
（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ））の存在によって同定されるｄ
／ｙ決定基はＨＢｓＡｇ−ＣＴＳ中に欠失している。そ
の代わりに、突然変異ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳはこの位置に
グルタミン（Ｇｌｎ（Ｑ））残基を有する。しかし、注
目すべきは、位置１６０における残基はリシン（Ｌｙｓ
（Ｋ））であるので、ｗ／ｒ決定基は維持される。ｗ／
ｒ決定基は位置１６０における塩基性アミノ酸（Ａｒｇ
（Ｒ）又はＬｙｓ（Ｋ））の存在によって同定される。

【００３８】他の重要な差異も同様に見いだすことがで
きる。例えば、共通にシステイン（Ｃｙｓ（Ｃ））であ
る位置１２１、１４７及び１４９における残基は、チロ
シン（Ｔｙｒ（Ｔ））によって置換されている。注目す
べきは、位置１２１、１４７及び１４９は、タンパク質
の該当位置において、ＨＢｓＡｇのａ決定基をジスルフ
ィド架橋によって安定化される二重ループに折り畳むた
めに非常に重要であると考えられる。このような安定化
二重ループはａ決定基の特徴であり、抗原の抗原性に影
響を与えると考えられる。より重要なことには、ＨＢｓ
Ａｇのａ決定基における安定化二重ループはイムノドミ
ナント（immunodominant）・エピトープを表し、これに
対して宿主は抗体を生じることができる。これらはイム
ノドミナント・エピトープの異常なコンホメーションを
有するために、Ｂ型肝炎ウイルスの突然変異株は慣用的
なアッセイ方法を用いた検出を免れることができる。

【００３９】しかし、二重ループ・イムノドミナント・
エピトープを欠失した場合にも、コンホメーション・エ
ピトープ（conformational epitope）を介して突然変
異ＨＢｓＡｇに結合する抗体を有することがまだ可能で
ある。さらに、抗体は逐次エピトープ（sequential ep
itope）を介して突然変異ＨＢｓＡｇに結合することが
できる。同様に、ＨＢｓＡｇに対してアフィニティを有
するモノクローナル抗体をＢ型肝炎ウイルスの突然変異
株を検出し、定量することができるアッセイの作成と、
Ｂ型肝炎ウイルスのこのような突然変異株に対して免疫
反応を生じさせることができるワクチンとに用いること
ができる。

【００４０】ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳは付加的な突然変異を
包含する。種々なＢ型肝炎ウイルス・サブタイプに属す
るアミノ酸配列によってＨＢｓＡｇ−ＣＴＳのアミノ酸
配列のアラインメント（alignment）を分析することに
よって、種々なサブタイプのなかに一般に良好に保存さ
れる位置における他の８個の突然変異が明らかになる。
これらの付加的な突然変異（位置９６、１１３、１１
７、１２０、１２３、１２７、１３３、１４０、１４７
及び１４９における）を表１に示す、表１において保存
アミノ酸は種々なサブタイプのなかで特定の位置に共通
に見い出される保存アミノ酸であり、置換アミノ酸はＨ
ＢｓＡｇにおけるこのような位置において見い出される
ことができる置換アミノ酸である。

【００４１】

【表１】 表１ 位置 保存アミノ酸 置換アミノ酸 ９ Ｖａｌ Ａｌａ １１３ Ｓｅｒ／Ｔｈｒ Ｌｅｕ １１７ Ｓｅｒ Ａｒｇ １２０ Ｐｒｏ Ａｌａ １２１ Ｃｙｓ Ｔｙｒ １２２ Ｌｙｓ Ｇｌｎ １２３ Ｔｈｒ Ｐｒｏ １２７ Ｐｒｏ Ｉｌｅ １３３ Ｍｅｔ Ｔｈｒ １４０ Ｔｈｒ Ｉｌｅ １４７ Ｃｙｓ Ｔｙｒ １４９ Ｃｙｓ Ｔｙｒ 突然変異ＨＢｓＡｇをコードするＤＮＡは、２７６ヌク
レオチドの下記配列を含む：ＴＧＴＣＴＧＣＧＧＣＧＴ
ＴＴＴＡＴＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣ
ＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＧＧＣ
ＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＴＡＴＣＡＡＧＧＴＡＴＧＴＴＧ
ＣＣＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＣ
ＴＣＴＣＧＡＣＣＡＴＣＣＧＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡＴＡ
ＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＣＧＡＣＴＡＴＴＧＣＴＣＡＡ
ＧＧＡＡＣＣＴＣＴＡＣＧＴＡＴＣＣＣＴＣＣＴＧＴＴ
ＧＣＴＧＴＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＧＡＣＧＧＡＡＡ
ＴＴＡＣＡＣＣＴＡＴＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＣＡＴＣＡ
ＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＣＧＧＡＡＡＡＹＹＣＣＴＡＴ
ＧＧＧＡＧＴＧＧＧＣＣＴＣＡ（配列番号：１） ２７６ヌクレオチドのこの配列は９２アミノ酸の下記配
列をコードする：

【００４２】

【化１】 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe １０ Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu ２０ Ala Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro ３０ Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Leu Ser Thr ４０ Ile Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro Cys Thr ５０ Thr Ile Ala Gln Gly Thr Ser Thr Tyr Pro ６０ Ser Cys Cys Cys Ile Lys Pro Ser Asp Gly ７０ Asn Tyr Thr Tyr Ile Pro Ile Pro Ser Ser ８０ Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp ９０ Ala Ser（配列番号：２）。

【００４３】配列番号：２において、アミノ酸位置に
“１”から初めて連続的に番号を付ける。これらの位置
をＨＢｓＡｇゲノムにおける標準位置に換算するため
に、各位置に“７５”を加える。この換算は配列番号：
２−６に対して必要である。配列番号：７−２７におい
て位置をＨＢｓＡｇゲノムにおける標準位置に換算する
ために、各位置に“３３”を加える。図１では、配列番
号：２をアミノ酸に対する単一文字を用いて提示する。
ヌクレオチド配列（配列番号：１）とヌクレオチド配列
（配列番号：２）の両方は全配列の一部に過ぎず；ＨＢ
ｓＡｇの主要なタンパク質をコードするＤＮＡは全体で
２２６アミノ酸を有する。

【００４４】ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳの突然変異は、９２ア
ミノ酸配列（配列番号：２）をＨＢｓＡｇの種々なサブ
タイプ（ａｙｗ３、ａｄｒ、ａｄｗ２及びａｙｗ）と共
にアラインする（aligned）ならば、容易に明らかにな
る。これらの種々なサブタイプの部分的な配列は添付配
列表に記載する。（配列番号：３はＨＢＶＡＹＷ３から
であり、配列番号：４はＨＢＶＡＤＲからであり、配列
番号：５はＨＢＶＡＤＷ２であり、配列番号：６はＨＢ
ＶＡＹＷからである。）比較を容易にするために、配列
を図２においてアミノ酸に対する単一文字記号を用い
て、配列番号：２と比較する。これらのアライメントに
おいて、突然変異アミノ酸は肉太で（bold）及び下線を
付けて表示する。

【００４５】各サブタイプにおいてこの比較を多重種に
拡大することが、１５４アミノ酸の長さであるアミノ酸
配列によっておこなわれている。これらの分析におい
て、ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳは４種類の異なるＨＢｓＡｇサ
ブタイプ内に含有される２０種類の異なるＨＢｓＡｇ種
と比較される。これらの異なるサブタイプの部分配列は
添付配列表に記載する。配列番号：７は７ＡＹＷＳから
であり、配列番号：８は６ＡＹＷＳからであり、配列番
号：９は３ＡＹＷＳからであり、配列番号：１０は２Ａ
ＹＷＳからであり、配列番号：１１は１ＡＹＷＳからで
あり、配列番号：１２は１ＡＤＹＷＳからであり、配列
番号：１３は５ＡＹＷＳからであり、配列番号：１４は
５ＡＤＷＳＨＢＶＡＹＷからであり、配列番号：１５は
２ＡＤＷＳからであり、配列番号：１６は３ＡＤＷＭＵ
Ｔからであり、配列番号：１７は２ＡＤＷＭＵＴからで
あり、配列番号：１８は１ＡＤＷＳからであり、配列番
号：１９は４ＡＤＷＭＵＴからであり、配列番号：２０
は３ＡＤＷＳからであり、配列番号：２１は１ＡＤＷＭ
ＵＴからであり、配列番号：２２は４ＡＤＲＳからであ
り、配列番号：２３は１ＡＤＲＳからであり、配列番
号：２４は３ＡＤＲＳからであり、配列番号：２５は２
ＡＤＲＳからであり、配列番号：２６は４ＡＤＷＳから
であり、配列番号：２７はＣＴＳからである。

【００４６】比較を容易にするために、配列を図３にお
いてアミノ酸に対する単一文字記号を用いて、配列番
号：２と比較する。これらのアライメントにおいて、突
然変異アミノ酸は肉太で及び下線を付けて表示する。記
号“＊”は、アラインメントにおける位置が突然変異体
において完全に保存されることを意味し、記号“．”は
アラインメントにおける位置が突然変異体において良好
に保存されることを意味する。

【００４７】これらの１５４アミノ酸配列において、突
然変異体ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳは他の２０サブタイプの各
々の対応する位置におけるアミノ酸に同じである（“完
全に保存される”）１００アミノ酸（６４．９％）と、
他の２０サブタイプの各々の対応する位置におけるアミ
ノ酸に類似する（“良好に保存される”）３２アミノ酸
（２０．８％）とを有した。

【００４８】本発明の単離物と他のサブタイプとの間の
アミノ酸相同性は表２に提示する。ヌクレオチドと演繹
されたアミノ酸配列とをＰＣ／ＧＥＮＥシフトウェア・
パッケージ（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕ
ｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中に含
有されるＣＬＵＳＴＡＬプログラムを用いて分析し；ア
ラインメントに用いた配列はＧｅｎＢａｎｋ Ｄａｔａ
ｂａｓｅ（受け入れ番号：ＪＯ２２０３、Ｘ５９７９
５、Ｘ６５２５７、Ｘ７７３１０、Ｘ７７３０８、Ｘ６
５２５８、ＪＯ２２０２、Ｄ００３２９、Ｄ００３３
０、Ｘ５１９７０、Ｘ６９７９８、Ｍ５４９２３、Ｓ８
１９４５、Ｓ８１９４６、Ｄ１６６６５、Ｘ０１５８
７、Ｓ５０２２５、Ｄ２３６７７、Ｄ２３６７８及びＺ
７２４７８）からダウンロードされた（downloaded）。

【００４９】

【表２】 表２ ａｙｗ ａｄｗ／１ ａｄｗ／２ ａｄｒ ＣＴＳ ８９−９１％ ８２−８３％ ８３−９４％ ａｙｗ ＞９６％ ８９−９１．５％ ８８−９２％ａｄｗ／１ − ９８％ ９２−９３％ −ａｄｗ／２ − − ９６％ − ａｄｒ − ８９−９２％ ＞９６％ ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳからの１５４アミノ酸配列（配列番
号：２７）を２０種類の種（配列番号：７−２６）の等
しいサイズのフラグメントと比較する、系統学的分析
を、ワシントン大学（Ｓｅａｔｔｌｅ）の遺伝学部門の
Ｄｒ．Ｊ．Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎから直接分与された
ＰＨＹＬＩＰパッケージ（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン３．
５ｃ，１９９３を用いておこなった。種々な系統学的ク
ラスターに対して非特異的な（aspecific）影響を及ぼ
すことができる幾つかの要素を除去するために、ＰＨＹ
ＬＩＰパッケージ中に同様に含まれるＳＥＱＢＯＯＴプ
ログラムを用いて、データを２５０回再サンプリングし
ながら、ブートストラップ分析を実施することによっ
て、種々なサブタイプのクラスターリングを達成した。
系統学的分析の結果は図４と５に示す。関連するサブタ
イプを同定することを目的とする図４では、ＨＢｓＡｇ
−ＣＴＳ突然変異体がＨＢｓＡｇのａｙｗサブタイプの
メンバーであることが示される。しかし、図５では、Ｈ
ＢｓＡｇのａｙｗサブタイプからのＨＢｓＡｇ−ＣＴＳ
の系統学的距離が明確に明らかである。図５では、ブラ
ンチ（branch）の長さは系統学的距離に比例する。

【００５０】種々なＨＢｓＡｇサブタイプからのＨＢｓ
Ａｇ−ＣＴＳの系統学的距離と、種々なＨＢｓＡｇサブ
タイプの相互からの系統学的距離とは表３に提示する。

【００５１】

【表３】 表３ ａｙｗ ａｄｗ／１ ａｄｗ／２ ａｄｒ ＣＴＳ 0．097−0．119 0．191−0．200 0．175−0．191 ａｙｗ ＜0．04 0．089−0．119 0．082−0．127ａｄｗ／１ − ＜0．0131 0．068−0．082 −ａｄｗ／２ − − ＜0．033 −ａｄｒ − 0．082−0．119 ＜0．033 表２と３及び図４と５のデータは、ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳ
がａｙｗサブタイプから発生したが；ａｙｗサブタイプ
からのその系統学的距離は種々なサブタイプ間に見られ
る距離に比較可能である。さらに、ａｙｗサブタイプ内
の他のメンバーからのＨＢｓＡｇ−ＣＴＳの系統学的距
離（０．０９７−０．１１９）は、種々なサブタイプの
各々内に存在する系統学的距離（＜０．０４）よりも非
常に大きい。

【００５２】ＲＥＡＣ８０１確認試験（Confirmatory
Test）（ＦＤＡ ＬｉｃｅｎｓｅＮｏ．８９−０３７
６）に述べられているプロトコールに従う中和分析を用
いて、ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳは逸出突然変異体として確認
されている。３種類の中和溶液：（ａ）ヒト血漿抗ＨＢ
ｓＡｇ陽性（Ｓｏｒｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓ
ａｌｕｇｇｉａ，Ｉｔａｌｙから入手可能な、ＲＥＡＣ
８０１自然感染と同定されたキットに使用）；（ｂ）ヒ
トＩｇＧ抗ＨＢｓＡｇ陽性（Ｂｉａｇｉｎｉ血清、受動
予防（passive prophylaxis）に用いられる自然感染物
質、ＦａｒｍａＢｉａｇｉｎｉ Ｓ．ｐ．Ａ．から入手
可能）；及び（ｃ）ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ Ｂｅｅｃｈ
ａｍから入手可能なＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂワクチンによる
予防接種後のドナーから得られたヒト血清を用いた。

【００５３】合衆国食品医薬品局によって認可されたプ
ロトコールを用いた、このプロトコールでは、３０％を
越える中和が生じたときに、サンプルは中和されたと見
なされるので、ＨＢｓＡｇ陽性と確認された。当然、３
０％が中和抗体の抗体価とサンプル中の抗原の濃度とに
よって影響されうる相対的値であることを認識すべきで
ある。種々な抗原と抗体間の相対的比較は、種々な濃度
における中和抗体を標準化することによって達成され
た。これらの濃度はｍＩＵで表現された。抗原の濃度を
標準化することはより困難であるが、抗原の濃度を天然
ＨＢｓＡｇサブタイプａｄに関しては約１．３ＰＥＩＵ
／ｍｌ（ＰＥＩはＰａｕｌ ＥｒｌｉｃｈＩｎｓｔｉｔ
ｕｔ，Ｇｅｒｍａｎｙの略号である）に、突然変異体
（ＣＴＳ）に関しては約０．５ＰＥＩＵ／ｍｌに定め
た。これらの条件下で、抗体が天然種よりも高度に突然
変異体を阻害することが予想される。これは、濃度のた
めに事実である：天然種に比べて突然変異抗原に関して
は抗体の、抗原に対する高い比率が存在する。そこで、
突然変異抗原の中和度が天然抗原の中和度よりも低いた
めに、これらの結果は、突然変異体がワクチンと診断試
薬の両方に導入されるべきであることを非常に明確に示
す。

【００５４】中和分析の結果は以下に提示する。各分析
において、ＥＴＩ−ＭＡＫ−２ＰＬＵＳキット、ロット
ＰＰ８８５（Ｓｏｒｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｓ
ａｌｕｇｇｉａ，Ｉｔａｌｙから入手可能）を用いてＨ
ＢｓＡｇ検出をおこなった；このキットはＲＥＡＣ８０
１ Ｓｏｌ．Ａを含有する。結果は表４に示す：

【００５５】

【表４】 表４ 標本 ＲＥＡＣ８０１ Ｓｏｌ．Ａ， Ｏ．Ｄ． 陰性対照（Ｎ．Ｃ．） ０．０２７ 陽性対照（Ｐ．Ｃ．） １．４９０ （１ ＵＰＥＩ／ｍｌ） カットオフ ０．０７７ ＣＴＳ ０．８０４ （０．５ ＵＰＥＩ／ｍｌ） 天然ＨＢｓＡｇ １．７９９ サブタイプａｄ （１．３ ＵＰＥＩ／ｍｌ） 表４に報告した結果は、非阻害形のＨＢｓＡｇ陽性標本
の基底値を決定して、中和％を算出するために中和分析
（ＲＥＡＣ８０１のＳｏｌ．Ａ）にＨＢｓＡｇ陰性ヒト
血清を用いることによって試験標本に関して得られた値
を示す。

【００５６】３種類のサンプル溶液に対する中和分析の
結果は表５−７に示す。

【００５７】

【表５】 表５ ＲＥＡＣ８０１（ヒト血漿抗ＨＢｓ＋） サンプル １００００ １０００ １００ ｍＩＵ／ｍｌ ｍＩＵ／ｍｌ ｍＩＵ／ｍｌ （抗HBs） ％neu （抗HBs） ％neu （抗HBs） ％neu ＣＰ 0．418 73 1．029 32 1．372 8 ＣＴＳ 0．385 54 0．782 3 0．825 −3ＨＢｓＡｇ 0．366 81 1．236 32 1．759 2 ％ｎｅｕは中和％を意味する。

【００５８】

【表６】 表６ ｈＩｇＧ抗ＨＢｓ（Ｂｉａｇｉｎｉ血清） サンプル １００００ １０００ １００ ｍＩＵ／ｍｌ ｍＩＵ／ｍｌ ｍＩＵ／ｍｌ （抗HBs） ％neu （抗HBs） ％neu （抗HBs） ％neu ＣＰ 0．416 73 0．855 43 1．135 24 ＣＴＳ 0．356 58 0．610 25 0．677 16ＨＢｓＡｇ 0．354 82 0．931 49 1．329 27

【００５９】

【表７】 表７ ワクチン接種血清（ＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ） サンプル １００００ １０００ １００ ｍＩＵ／ｍｌ ｍＩＵ／ｍｌ ｍＩＵ／ｍｌ （抗HBs） ％neu （抗HBs） ％neu （抗HBs） ％neu ＣＰ 0．451 71 0．884 41 1．273 15 ＣＴＳ 0．416 50 0．745 8 1．090 −37ＨＢｓＡｇ 0．251 87 1．048 42 1．594 12 最後に、抗体価（Ａｂ、ｍＩＵ／ｍｌで表現）の、抗原
濃度（Ａｇ、ＰＥＩＵ／ｍｌで表現）に対する比率を以
下の表８−１０に示す。

【００６０】

【表８】 表８ ＲＥＡＣ８０１（ヒト血漿抗ＨＢｓ＋） ＣＴＳ 天然ＨＢｓＡｇＡｂ／Ａｇ 中和％ Ａｂ／Ａｇ 中和％ ２０ ５４ ７．７ ８１ ２ ３ ０．８ ３２ ０．２ −３ ０．１ ２

【００６１】

【表９】 表９ ｈＩｇＧ抗ＨＢｓ（Ｂｉａｇｉｎｉ血清） ＣＴＳ 天然ＨＢｓＡｇＡｂ／Ａｇ 中和％ Ａｂ／Ａｇ 中和％ ２０ ５８ ７．７ ８２ ２ ２５ ０．８ ４９ ０．２ １６ ０．１ ２７

【００６２】

【表１０】 表１０ ワクチン接種血清（ＥＮＧＥＲＩＸ−Ｂ） ＣＴＳ 天然ＨＢｓＡｇＡｂ／Ａｇ 中和％ Ａｂ／Ａｇ 中和％ ２０ ５０ ７．７ ８７ ２ ８ ０．８ ４２ ０．２ −３７ ０．１ １２ 表８−１０の結果は、それぞれ、図６−８にプロットし
て、グラフによっても示す。表８−１０と図６−８に示
す結果は、ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳが逸出突然変異体である
ことを実証する。

【００６３】上述したように、ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳの存
在はＥＴＩ−ＭＡＫ−３アッセイで検出されたが、ＡＸ
ＳＹＭ−ＨＢｓＡｇアッセイでは検出されなかった。こ
の結果は、ＡＸＳＹＭ−ＨＢｓＡｇアッセイがＨＢｓＡ
ｇ−ＣＴＳにおいて突然変異したコンホメーションを有
するイムノドミナント・エピトープ“ａ”の存在に依存
することを示唆する。これとは対照的に、ＥＴＩ−ＭＡ
Ｋ−３アッセイは天然又は突然変異したコンホメーショ
ンにおけるイムノドミナント・エピトープ“ａ”を検出
する。本明細書で用いる限り、イムノアッセイに関連す
る“検出する”及び“検出”及び“測定（determinatio
n）”なる用語がサンプル中のターゲット種の存在又は
量の一方又は両方を決定することを意味するように意図
することが認められる。

【００６４】ＥＴＩ−ＭＡＫ−３アッセイは、酵素結合
イムノソルベント・アッセイ（ＥＬＩＳＡ）テクノロジ
ーを用いる直接の非競合サンドイッチ分析を用いてＨＢ
ｓＡｇの定性的測定を提供する。一般的に述べると、Ｈ
ＢｓＡｇに対してアフィニティを有するモノクローナル
抗体は例えばマイクロタイター穴の壁のような表面に結
合する。抗体は、ＨＢｓＡｇを含有する又は含有しない
と考えられるサンプルに暴露される。ＨＢｓＡｇがサン
プル中に存在する場合には、ＨＢｓＡｇは抗体に結合し
て、抗体／ＨＢｓＡｇ複合体を形成する。次に、表面
が、抗体／ＨＢｓＡｇ複合体に結合する酵素トレーサー
に暴露される。結合したトレーサーのレベルを検出する
ことによって、サンプル中のＨＢｓＡｇレベルを測定す
ることが可能になる。好ましいトレーサーの１種類は、
ホースラディシュ・ペルオキシダーゼが結合する、羊か
ら得られる抗ＨＢｓＡｇ抗体である。

【００６５】商業的に入手可能なアッセイは典型的に、
特定の生物学的物質の存在を決定するために必要な、多
様な試薬を包含する。例えば、ＥＴＩ−ＭＡＫ−３アッ
セイは、ＨＢｓＡｇに対してアフィニティを有するモノ
クローナル抗体で被覆された穴を有するマイクロタイタ
ー・プレートと、酵素トレーサーと、陽性及び陰性対照
溶液と、トレーサー希釈剤と、洗浄緩衝剤と、色原体溶
液と、基質溶液と、ブロッキング試薬とを包含する。こ
れらの最後の３種類の試薬は、サンプル中のトレーサー
（及びそれによる抗原）の存在とレベルを示す検出可能
なシグナルを適当に発生させるために用いられる。

【００６６】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスのイムノアッ
セイ・キット中に提供されるモノクローナル抗体がその
天然コンホメーションにおいてイムノドミナント・エピ
トープの不存在下においてもＨＢｓＡｇへのアフィニテ
ィを維持することを保証するために使用可能である点
で、このようなキットの製造に特に有用である。詳しく
は、突然変異Ｂ型肝炎ウイルスは、その天然コンホメー
ションにおいてＨＢｓＡｇのイムノドミナント・エピト
ープ（ａ）の検出に基づく分析では検出されることがで
きない。したがって、突然変異株の検出は突然変異抗原
に結合する抗体の使用を必要とする。イムノアッセイ・
キットに用いられる抗体が突然変異Ｂ型肝炎ウイルスを
検出することを保証するために、アッセイ製造方法は、
供給される抗体が突然変異抗原に対するそれらのアフィ
ニティを維持することを必要とする。このことは製造に
おいて、抗体標本を突然変異抗原の既知のキャリブレー
ション標準に暴露させ、抗原の存在とレベルとを検出す
ることによって、達成される。アッセイが正確な測定を
提供するならば、その抗体がイムノアッセイ・キットに
備えられる。アッセイが正確な測定を提供することがで
きないならば、その抗体はイムノアッセイの必要条件を
満たす抗体と交換するべきである。このようにすること
で、商業的なイムノアッセイ・キットが、ＨＢｓＡｇが
イムノドミナント・エピトープを有さない突然変異変種
（mutant variety）である場合にも、サンプル中のＨ
ＢｓＡｇの存在及びレベルを検出する能力を有すること
が保証される。

【００６７】突然変異ＨＢｓＡｇは、イムノアッセイ・
キットと共に供給される陽性対照試薬に含めて提供する
こともできる。このような陽性対照は典型的に、熱不活
化されて、保存されていたＨＢｓＡｇを含有する。例え
ば、ＥＴＩ−ＭＡＫ−３アッセイの陽性対照は、０．４
−１Ｕ／ｍｌの熱不活化され保存されたＨＢｓＡｇ（サ
ブタイプａｄとａｙ）の最大濃度を有するヒト再石灰化
（recalcified）血漿の２．５ｍｌサンプルである。

【００６８】当然、本発明が特定の診断アッセイ又はキ
ットの特定の種類に限定されることを意図せず、むしろ
非常に多様な診断アッセイと、このようなアッセイを実
施するためのキットを包含するように意図することは明
らかである。アッセイは、非限定的に、競合、直接反応
に基づくアッセイ、又はサンドイッチ型アッセイを包含
することができる。アッセイは固相を用いることができ
る、又は免疫沈降若しくは、固相を用いない任意の他の
方法によっておこなうことができる。

【００６９】アッセイは多くのフォーマットをとること
ができる。あるアッセイは標識された、例えば抗体のよ
うな特異的結合分子の使用に依存するが、あるアッセイ
は生ずる沈降を観察することによって、抗体（又は他の
特異的結合剤）と抗原との相互作用を検出する。標識抗
体に頼らない定性的及び定量的アッセイの例は、ゲル沈
降、単純放射状免疫拡散、免疫電気泳動（ロケット電気
泳動と二次元電気泳動を包含する）、入射光源の散乱に
よる定量（ネフェロメトリー（nephelometry））を包含
する。好ましいアッセイは凝集分析であり、凝集分析の
例は米国特許第５，２８６，４５２号（Ｈａｎｓｅｎ）
及び第５，５８９，４０１号（Ｈａｎｓｅｎ等）に提供
されている。

【００７０】しばしば、ある形式の標識が抗原−抗体相
互作用の検出に用いられる。ラベルは放射性でも非放射
性でもよい。分析のフォーマットに依存して、本発明の
特異的結合剤を標識することができるか、又は本発明の
特異的結合剤に結合する他の特異的結合剤を標識するこ
とができる。イムノアッセイ（ラジオイムノアッセイを
包含する）及び免疫測定アッセイ（免疫測定ラジオアッ
セイと酵素結合イムノソルベントアッセイを包含する）
が、イムノブロッティング方法（immunoblotting tech
nique）と同様に、使用可能である。化学発光、蛍光、
酵素、バイオ発光（bioluminescent）及びエピ蛍光（ep
ifluorescent）ラベルも考えられる。ＡｂｂｏｔＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉ
ｓ，ＵＳＡ）によって販売される種類のＩＭＸアッセイ
も考えられる。

【００７１】突然変異Ｂ型肝炎核酸の分析も使用可能で
ある。これらの方法において、核酸プローブは、突然変
異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質をコードする核酸配列を
検出するために用いられる。核酸プローブと共に例えば
ポリメラーゼ連鎖反応のような増幅方法を用いることが
できる。突然変異Ｂ型肝炎核酸の好ましい分析方法は、
プローブを一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズさせ、ハイブ
リダイズしたプローブ−ＤＮＡ複合体を、一本鎖ＤＮＡ
と二本鎖ＤＮＡとを区別することができるモノクローナ
ル抗体によって検出するＤＮＡ酵素イムノアッセイ（Ｄ
ＥＩＡ）として知られた方法を用いる。ＤＥＩＡ分析は
Ｍａｎｔｅｒｏ等のＣｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３７／３：
４２２−４２９（１９９１）に述べられている。

【００７２】本発明の逸出突然変異ＨＢｓＡｇは、診断
アッセイにおけるその使用の他に、Ｂ型肝炎ウイルスに
対するワクチンに用いることもできる。特に、このワク
チンは薬剤学的に受容されるキャリヤー中に本発明の逸
出突然変異体の免疫原量を含有することができる。ワク
チンの免疫原量は当業者に周知の方法を用いて決定する
ことができる。薬剤学的に受容されるキャリヤーは生理
的食塩水又は他の適当なキャリヤーを含むことができ、
さらに種々な添加剤、アジュバント等を包含することも
できる。さらに、ワクチンは通常のＨＢｓＡｇ又は、プ
レ−Ｓ１若しくはプレ−Ｓ２ポリペプチドの全て若しく
は一部を含有する複合ＨＢｓＡｇ粒子のような他のＨＢ
ｓＡｇ抗原を含有することができる。

【００７３】増幅プロトコール ＨＢＶの“Ｓ”遺伝子は６５７ヌクレオチドの全長（ｎ
ｔ１５７からｎｔ８３７まで、ＨＢＶゲノムの固有Ｅｃ
ｏＲＩ部位から番号を付ける）を有する；この遺伝子は
ＨＢｓＡｇと名付けられた２１９アミノ酸のタンパク質
をコードする。増幅反応をおこなうために２プライマー
を用いた、これらのプライマーはｎｔ１５７からｎｔ８
３７までのこの範囲内にターゲットを有する。

【００７４】下記プライマーを用いて、４５サイクルの
増幅をおこなった：プライマーセンス“ａ４”５’−Ｃ
ＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴ−
３’（配列番号：３２）（ヌクレオチド２５５−２７
８）；プライマーアンチセンス“ａ５”５’−ＧＧＡＡ
ＡＧＣＣＣＴＡＣＧＡＡＣＣＡＣＴＧ−３’（配列番
号：３３）（ヌクレオチド７１７−６９７）。

【００７５】増幅された“Ｓ”遺伝子フラグメントは４
６３ｎｔの全長を有し、１５４ａａのポリペプチド（Ｈ
ＢｓＡｇのアミノ酸残基３４と１８７を包含する）をコ
ードする。

【００７６】反応ミックスの組成はＴｒｉｓ ＨＣｌ
ｐＨ＝８．８（６７ｍＭ）、（ＮＨ ₄）₂ＳＯ₄（１．６
ｍＭ）、ＭｇＣｌ₂（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノ
ール（１０ｍＭ）、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブ
ミン、デオキシリボヌクレオチド・トリホスフェート
（ｄＮＴＰ）（各２００μＭ）、２．５ＵのＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、及び５
０ｐｍｏｌの各プライマーであった。

【００７７】増幅の前に、血清サンプルのアリコートを
５分間沸騰させてから、１４０００ｒｐｍ（４℃）にお
いて１５分間遠心分離させた；上澄み液を回収し、５μ
ｌの処理済みサンプルを用いて、増幅を５０μｌの総量
でおこなった。

【００７８】全体で４５サイクルの各増幅サイクルは、
１分間の９４℃における変性工程（denaturation ste
p）と、１分間の６４℃におけるアニーリング工程と、
１分間の７２℃における伸長工程とを包含した；最後の
サイクルはクローニング効率を改良するために１０分間
の伸長時間を有した、増幅はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒによっておこなった。

【００７９】４６３ｂｐの増幅生成物を、Ｑｉａｇｅｎ
樹脂（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒ
ｍａｎｙ）によるアガロースゲル上での精製後に、ｐＣ
Ｒ２．１ベクターにクローン化し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｘ
Ｌ−１ブルーＥ．ｃｏｌｉ菌株において形質転換し、次
のスクリーニングをコロニーに対して実施して、陽性ク
ローンを同定した。

【００８０】４クローンを選択して、配列決定した、こ
れらの全てが同じ結果を示した。さらに詳しくは、アン
ピシリンを補充したＬＢブロス中３７℃において、クロ
ーンを一晩増殖させ；翌日、プラスミドＤＮＡを５ｍｌ
の液体培養物からＱＩＡ穴系（QIA well system）
（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）を用いて、精製した。

【００８１】タンパク質、染色体ＤＮＡ及び有機溶剤を
含まない、このように製造されたＤＮＡテンプレートを
Ａ．Ｌ．Ｆ．自動化ＤＮＡシーケンサーと、Ａｕｔｏｒ
ｅａｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅ
ｎ）とを用いて配列決定した。

【００８２】この系は配列決定のために非放射化学アプ
ローチを用い、その５’末端においてフルオレセインに
よって標識されたプライマーをテンプレートにアニーリ
ングさせる。

【００８３】標準ジデオキシ配列決定方法を用いると、
蛍光プライマーを４種類の別々の反応においてＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼによって伸長させてから、ポリアクリア
ミドゲルに負荷させた。

【００８４】上記説明と添付図面は、本発明の実施態様
を説明するために提供するものであり、本発明の範囲を
如何なる意味でも限定することは意図しない。単離した
突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質、そのフラグメン
ト及びこれらのタンパク質を含有する粒子と、これらに
対する特異的結合剤、これらのタンパク質、それらのフ
ラグメント及びこれらのタンパク質を含有する粒子及び
／又は特異的結合剤を用いたイムノアッセイ及びワクチ
ンとにおいて種々な修正及び変更が、本発明の要旨又は
範囲から逸脱せずになされうることは、当業者に自明で
あろう。したがって、本発明は本発明の修正及び変更を
も、それらが特許請求の範囲内及びその同等物の範囲内
に入るかぎり、包含することが意図される。

【００８５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING ＜110＞ DiaSorin， S．r．l． ＜120＞ Escape Mutant of the Surface Antigen of Hepatitis B Virus ＜130＞ SBD1004EPsequence ＜140＞ ＜141＞ ＜150＞ EP 97830635．5 ＜151＞ 1997−12−01 ＜160＞ 44 ＜170＞ PatentIn Ver．2．0 ＜210＞ 1 ＜211＞ 276 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜220＞ ＜221＞ CDS ＜222＞（1）．．（276） ＜400＞ 1 tgt ctg cgg cgt ttt atc atc ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc 48 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 1 5 10 15 atc ttc ttg ttg gct ctt ctg gac tat caa ggt atg ttg ccc gtt tgt 96 Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 20 25 30 cct cta att cca gga ctc tcg acc atc cgc acg gga gca tac caa ccc 144 Pro Leu Ile Pro Gly Leu Ser Thr Ile Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro 35 40 45 tgc acg act att gct caa gga acc tct acg tat ccc tcc tgt tgc tgt 192 Cys Thr Thr Ile Ala Gln Gly Thr Ser Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys 50 55 60 atc aaa cct tcg gac gga aat tac acc tat att ccc atc cca tca tcc 240 Ile Lys Pro Ser Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Ile Pro Ile Pro Ser Ser 65 70 75 80 tgg gct ttc gga aaa yyc cta tgg gag tgg gcc tca 276 Trp Ala Phe Gly Lys Xaa Leu Trp Glu Trp Ala Ser 85 90 ＜210＞ 2 ＜211＞ 92 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 2 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 1 5 10 15 Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 20 25 30 Pro Leu Ile Pro Gly Leu Ser Thr Ile Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro 35 40 45 Cys Thr Thr Ile Ala Gln Gly Thr Ser Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys 50 55 60 Ile Lys Pro Ser Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Ile Pro Ile Pro Ser Ser 65 70 75 80 Trp Ala Phe Gly Lys Xaa Leu Trp Glu Trp Ala Ser 85 90 ＜210＞ 3 ＜211＞ 92 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 3 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 1 5 10 15 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 20 25 30 Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr 35 40 45 Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys 50 55 60 Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 65 70 75 80 Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser 85 90 ＜210＞ 4 ＜211＞ 92 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 4 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 1 5 10 15 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 20 25 30 Pro Leu Ile Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr 35 40 45 Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys 50 55 60 Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 65 70 75 80 Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser 85 90 ＜210＞ 5 ＜211＞ 92 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 5 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 1 5 10 15 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 20 25 30 Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr 35 40 45 Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys 50 55 60 Ser Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 65 70 75 80 Trp Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser 85 90 ＜210＞ 6 ＜211＞ 92 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 6 Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu 1 5 10 15 Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys 20 25 30 Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr 35 40 45 Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys 50 55 60 Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser 65 70 75 80 Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser 85 90 ＜210＞ 7 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 7 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Arg Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Gly Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Glu Tyr Gln Gly Met Leu His Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Thr 65 70 75 80 Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Thr Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 8 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 8 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser His Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Met Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 9 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 9 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 10 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 10 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Asn Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 11 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 11 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 12 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 12 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Ile Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Ser Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Ile Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 13 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 13 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Leu Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 14 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 14 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Leu Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 15 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 15 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 16 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 16 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Ser Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 17 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 17 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ile Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 18 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 18 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Met Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 19 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 19 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Ile Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Val Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 20 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 20 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Arg Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Leu Gly Ser 65 70 75 80 Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 21 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 21 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Ile Ile Pro Gly Ser 65 70 75 80 Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Asn Ser Leu Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Arg Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 22 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 22 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe 115 120 125 Leu Trp Glu Gly Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 23 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 23 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 24 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 24 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Glu Ala Pro Thr Cys Pro 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Ala Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 25 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 25 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro 1 5 10 15 Gly Arg Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr 65 70 75 80 Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln 85 90 95 Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 26 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 26 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Leu Pro Gly Cys Pro 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Leu Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Ser 65 70 75 80 Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Leu Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Ser Lys Pro Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Leu Gly Lys Tyr 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Gln Phe Val Gln Trp Cys Val Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 27 ＜211＞ 154 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 27 Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu 1 5 10 15 Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys 20 25 30 Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile 35 40 45 Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Ala Leu 50 55 60 Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Leu 65 70 75 80 Ser Thr Thr Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro Cys Thr Thr Ile Ala Gln 85 90 95 Gly Thr Ser Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Ile Lys Pro Ser Asp Gly 100 105 110 Asn Tyr Thr Tyr Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe 115 120 125 Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val 130 135 140 Pro Phe Val Gln Trp Phe Ala Gly Leu Ser 145 150 ＜210＞ 28 ＜211＞ 7 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 28 Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro 1 5 ＜210＞ 29 ＜211＞ 21 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 29 Leu Ser Thr Ile Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro Cys Thr Thr Ile Ala 1 5 10 15 Gln Gly Thr Ser Thr 20 ＜210＞ 30 ＜211＞ 10 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 30 Ile Lys Pro Ser Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr 1 5 10 ＜210＞ 31 ＜211＞ 33 ＜212＞ PRT ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 31 Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro Cys Thr Thr Ile Ala Gln Gly Thr Ser 1 5 10 15 Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Ile Lys Pro Ser Asp Gly Asn Tyr Thr 20 25 30 Tyr ＜210＞ 32 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 32 ctcgtggtgg acttctctca attt 24 ＜210＞ 33 ＜211＞ 21 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 33 ggaaagccct acgaaccact g 21 ＜210＞ 34 ＜211＞ 36 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 34 ggaytmtcga ccatcmgcac gggagcatac caaccc 36 ＜210＞ 35 ＜211＞ 36 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 35 gggttggtat gctcccgtgc kgatggtcga kartcc 36 ＜210＞ 36 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 36 accatcmgca cgggagcata ccaa 24 ＜210＞ 37 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 37 ttggtatgct cccgtgckga tggt 24 ＜210＞ 38 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 38 ccaggaytmt cgaccatcmg cacg 24 ＜210＞ 39 ＜211＞ 24 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 39 tcccgtgckg atggtcgaka rtcc 24 ＜210＞ 40 ＜211＞ 25 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 40 gcataccaac cctgcacgac tattg 25 ＜210＞ 41 ＜211＞ 25 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 41 caatagtcgt gcagggttgg tatgc 25 ＜210＞ 42 ＜211＞ 33 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 42 gtatcaaacc ttcggacgga aattacacct ata 33 ＜210＞ 43 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 43 tcggacggaa attacaccta ta 22 ＜210＞ 44 ＜211＞ 22 ＜212＞ DNA ＜213＞ Hepatitis B virus ＜400＞ 44 tgggatggga atataggtgt aa 22

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＣＴＳ突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タン
パク質の部分アミノ酸配列を示す。

【図２】図２は、ＣＴＳ突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タン
パク質の部分アミノ酸配列を、幾つかの他のＨＢＶサブ
タイプに比較する。

【図３】図３Ａは、ＣＴＳ突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タ
ンパク質の部分アミノ酸配列を、幾つかの他のＨＢＶサ
ブタイプに比較する。

【図４】図３Ｂは、ＣＴＳ突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タ
ンパク質の部分アミノ酸配列を、幾つかの他のＨＢＶサ
ブタイプに比較する。

【図５】図３Ｃは、ＣＴＳ突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タ
ンパク質の部分アミノ酸配列を、幾つかの他のＨＢＶサ
ブタイプに比較する。

【図６】図３Ｄは、ＣＴＳ突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タ
ンパク質の部分アミノ酸配列を、幾つかの他のＨＢＶサ
ブタイプに比較する。

【図７】図３Ｅは、ＣＴＳ突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タ
ンパク質の部分アミノ酸配列を、幾つかの他のＨＢＶサ
ブタイプに比較する。

【図８】図４は、突然変異ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳと２０サ
ブタイプのＢ型肝炎ウイルスとに関する距離系統学的サ
ブタイプのグルーピングと距離を示す。

【図９】図５は、突然変異ＨＢｓＡｇ−ＣＴＳと２０サ
ブタイプのＢ型肝炎ウイルスとに関する距離系統学的サ
ブタイプのグルーピングと距離を示す。

【図１０】図６は、表８のデータのグラフによる表示を
示す、抗体価の抗原濃度に対する比率の関数として中和
％をプロットする。

【図１１】図７は、表９のデータのグラフによる表示を
示す、抗体価の抗原濃度に対する比率の関数として中和
％をプロットする。

【図１２】図８は、表１０のデータのグラフによる表示
を示す、抗体価の抗原濃度に対する比率の関数として中
和％をプロットする。図６〜８において、実線と方形印
とは天然ＨＢｓＡｇに対する抗体反応を表し、点線とダ
イヤ印とは突然変異ＨＢｓＡｇに対する抗体反応を表
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/576 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マリオ・パッラ イタリア国ヴェルチェッリ，13040 サル ッジャ，ヴィア・ポンテ・ロッカ 21

Claims (99)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトを感染させるＢ型肝炎ウイルスの表
   面抗原タンパク質のアミノ酸配列であって、位置１２１
   におけるアミノ酸がシステインではなく、位置１２０、
   １２２、１２３、１４７又は１４９におけるアミノ酸の
   少なくとも１種がそれの位置に対する保存アミノ酸では
   ない前記アミノ酸配列を含む、単離した突然変異Ｂ型肝
   炎表面抗原タンパク質。
2. 【請求項２】 タンパク質が野生型Ｂ型肝炎表面抗原タ
   ンパク質の抗原性とは異なる抗原性を示す、請求項１記
   載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
3. 【請求項３】 位置１２０、１２２又は１２３における
   アミノ酸の少なくとも１つがそれの位置に対する保存ア
   ミノ酸ではない、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ型
   肝炎表面抗原タンパク質。
4. 【請求項４】 位置１４７又は１４９におけるアミノ酸
   の少なくとも１個がそれの位置に対する保存アミノ酸で
   はない、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面
   抗原タンパク質。
5. 【請求項５】 位置１２０、１２２、１２３、１４７又
   は１４９におけるアミノ酸の少なくとも２個がそれらの
   位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単
   離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
6. 【請求項６】 位置１２０、１２２、１２３、１４７又
   は１４９におけるアミノ酸の少なくとも３個がそれらの
   位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単
   離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
7. 【請求項７】 位置１２０、１２２、１２３、１４７又
   は１４９におけるアミノ酸の少なくとも４個がそれらの
   位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単
   離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
8. 【請求項８】 位置１２０、１２２、１２３、１４７又
   は１４９における５個のアミノ酸の全てがそれらの位置
   に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単離し
   た突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
9. 【請求項９】 位置１２１における保存システインがチ
   ロシンによって置換されている、請求項１記載の単離し
   た突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
10. 【請求項１０】 位置１２０における保存プロリンがア
    ラニンによって置換されている、請求項１記載の単離し
    た突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
11. 【請求項１１】 位置１２２における保存リシン又はア
    ルギニンがグルタミンによって置換されている、請求項
    １記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク
    質。
12. 【請求項１２】 位置１２３における保存スレオニンが
    プロリンによって置換されている、請求項１記載の単離
    した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
13. 【請求項１３】 位置１２０における保存プロリンがア
    ラニンによって置換され、位置１２２における保存リシ
    ン又はアルギニンがグルタミンによって置換され、そし
    て位置１２３における保存スレオニンがプロリンによっ
    て置換されている、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ
    型肝炎表面抗原タンパク質。
14. 【請求項１４】 位置１２７におけるアミノ酸がそれの
    位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
15. 【請求項１５】 位置１２７における保存プロリンがイ
    ソロイシンによって置換されている、請求項１４記載の
    単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
16. 【請求項１６】 位置１１７におけるアミノ酸がそれの
    位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
17. 【請求項１７】 位置１１７における保存セリンがアル
    ギニンによって置換されている、請求項１６記載の単離
    した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
18. 【請求項１８】 位置９６におけるアミノ酸がそれの位
    置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単離
    した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
19. 【請求項１９】 位置９６における保存バリンがアラニ
    ンによって置換されている、請求項１８記載の単離した
    突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
20. 【請求項２０】 位置１１３におけるアミノ酸がそれの
    位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
21. 【請求項２１】 位置１１３における保存セリン又はス
    レオニンがロイシンによって置換されている、請求項２
    ０記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク
    質。
22. 【請求項２２】 位置１３３におけるアミノ酸がそれの
    位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
23. 【請求項２３】 位置１３３における保存メチオニンが
    スレオニンによって置換されている、請求項２２記載の
    単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
24. 【請求項２４】 位置１４０におけるアミノ酸がそれの
    位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
25. 【請求項２５】 位置１４０における保存スレオニンが
    イソロイシンによって置換されている、請求項２４記載
    の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
26. 【請求項２６】 位置１４７におけるアミノ酸がそれの
    位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
27. 【請求項２７】 位置１４７における保存システインが
    チロシンによって置換されている、請求項２６記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
28. 【請求項２８】 位置１４９におけるアミノ酸がそれの
    位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項１記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
29. 【請求項２９】 位置１４９における保存システインが
    チロシンによって置換されている、請求項２８記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
30. 【請求項３０】 位置１４７と１４９におけるアミノ酸
    がそれらの位置に対する保存アミノ酸ではない、請求項
    １記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク
    質。
31. 【請求項３１】 位置１２１、１４７及び１４９におけ
    る保存システインがチロシンによって置換されている、
    請求項３０記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タ
    ンパク質。
32. 【請求項３２】 位置１４５におけるアミノ酸が保存グ
    リシンである、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ型肝
    炎表面抗原タンパク質。
33. 【請求項３３】 位置１３７、１３８及び１３９におけ
    るアミノ酸が全て保存システインである、請求項１記載
    の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
34. 【請求項３４】 位置１２４におけるアミノ酸が保存シ
    ステインである、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ型
    肝炎表面抗原タンパク質。
35. 【請求項３５】 ヒトを感染させるＢ型肝炎ウイルスの
    表面抗原タンパク質のアミノ酸配列であって、位置１２
    ２におけるアミノ酸がそれの位置に対する保存アミノ酸
    ではない前記アミノ酸配列を含む、単離した突然変異Ｂ
    型肝炎表面抗原タンパク質。
36. 【請求項３６】 タンパク質が野生型Ｂ型肝炎表面抗原
    タンパク質の抗原性とは異なる抗原性を示す、請求項３
    ５記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク
    質。
37. 【請求項３７】 位置１２２における保存リシン又はア
    ルギニンがグルタミンによって置換されている、請求項
    ３５記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク
    質。
38. 【請求項３８】 タンパク質がＢ型肝炎表面抗原の主要
    なタンパク質である、請求項１記載の単離した突然変異
    Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
39. 【請求項３９】 タンパク質がＢ型肝炎表面抗原のミド
    ル・タンパク質である、請求項１記載の単離した突然変
    異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
40. 【請求項４０】 タンパク質がＢ型肝炎表面抗原のラー
    ジ・タンパク質である、請求項１記載の単離した突然変
    異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
41. 【請求項４１】 タンパク質がプレ−Ｓ配列を包含す
    る、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原
    タンパク質。
42. 【請求項４２】 タンパク質がプレ−Ｓ１配列の一部又
    は完全なプレ−Ｓ１配列を包含する、請求項１記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
43. 【請求項４３】 タンパク質がプレ−Ｓ２配列の一部又
    は完全なプレ−Ｓ２配列を包含する、請求項１記載の単
    離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
44. 【請求項４４】 タンパク質が位置１１７−１２３にお
    いて下記アミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌ
    ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）を含
    む、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原
    タンパク質。
45. 【請求項４５】 タンパク質が位置１１３−１３３にお
    いて下記アミノ酸配列：Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌ
    ｅ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ
    −Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
    Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ（配列番号：
    ２９）を含む、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ型肝
    炎表面抗原タンパク質。
46. 【請求項４６】 タンパク質が位置１４０−１４７にお
    いて下記アミノ酸配列：Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅ
    ｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ
    （配列番号：３０）を含む、請求項１記載の単離した突
    然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質。
47. 【請求項４７】 タンパク質が位置１１７−１２３にお
    いて下記アミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌ
    ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ（配列番号：２８）を含
    み、位置１４０−１４７において下記アミノ酸配列：Ｉ
    ｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓ
    ｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（配列番号：３０）を含
    む、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原
    タンパク質。
48. 【請求項４８】 タンパク質が位置１１７−１４９にお
    いて下記アミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌ
    ａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ
    −Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−
    Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃ
    ｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌ
    ｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（配列番号：３
    １）を含む、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎
    表面抗原タンパク質。
49. 【請求項４９】 配列番号：２にリストされるアミノ酸
    配列を含む、請求項１記載の単離した突然変異Ｂ型肝炎
    表面抗原タンパク質。
50. 【請求項５０】 請求項１−４９のいずれかに記載の突
    然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質を含む、単離した突
    然変異Ｂ型肝炎粒子。
51. 【請求項５１】 単離したフラグメントが少なくとも３
    ０個のアミノ酸の配列を含み、前記配列が位置１２０−
    １４９においてアミノ酸を含み、位置１２１におけるア
    ミノ酸がシステインではなく、位置１２０、１２２、１
    ２３、１４７又は１４９におけるアミノ酸の少なくとも
    １個がそれの位置に対する保存アミノ酸ではない、請求
    項１記載の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質の単離
    したフラグメント。
52. 【請求項５２】 単離したフラグメントが少なくとも３
    ０個のアミノ酸の配列を含み、前記配列が位置１２０−
    １４９においてアミノ酸を含み、位置１２２におけるア
    ミノ酸がそれの位置に対する保存アミノ酸ではない、請
    求項３５記載の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質の
    単離したフラグメント。
53. 【請求項５３】 請求項１−３５のいずれかに記載の突
    然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメン
    ト又は該タンパク質を含有する粒子を含み、実質的に血
    液を含まない組成物。
54. 【請求項５４】 請求項１−３５のいずれか１項に記載
    の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグ
    メント、あるいは該タンパク質を含有する粒子の免疫原
    量を薬剤学的に受容されるキャリヤー中に含むワクチ
    ン。
55. 【請求項５５】 請求項１−３５のいずれか１項に記載
    の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグ
    メント、あるいは該タンパク質を含有する粒子を特異的
    に認識する特異的結合剤であって、該突然変異Ｂ型肝炎
    表面抗原タンパク質又はそのフラグメント、あるいは該
    タンパク質を含有する粒子に対して特異的に調製される
    上記特異的結合剤。
56. 【請求項５６】 特異的結合剤が逐次エピトープを認識
    する、請求項５５記載の特異的結合剤。
57. 【請求項５７】 特異的結合剤がコンホメーション・エ
    ピトープを認識する、請求項５５記載の特異的結合剤。
58. 【請求項５８】 特異的結合剤がモノクローナル抗体で
    ある、請求項５５記載の特異的結合剤。
59. 【請求項５９】 特異的結合剤がフラグメント状モノク
    ローナル抗体である、請求項５５記載の特異的結合剤。
60. 【請求項６０】 特異的結合剤がポリクローナル抗体で
    ある、請求項５５記載の特異的結合剤。
61. 【請求項６１】 請求項５８記載のモノクローナル抗体
    の分泌ハイブリドーマ。
62. 【請求項６２】 請求項１又は３５のいずれかに記載の
    突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメ
    ント、あるいは該タンパク質を含有する粒子の既知量を
    含む対照サンプル。
63. 【請求項６３】 サンプル中の突然変異Ｂ型肝炎表面抗
    原タンパク質又は該タンパク質を含有する粒子を検出す
    る方法であって、 （ａ）サンプルに、結合が生ずるために適した条件下で
    請求項１又は３５のいずれかに記載の突然変異表面抗原
    タンパク質を特異的に認識する特異的結合剤を接触さ
    せ；そして（ｂ）サンプル中の突然変異Ｂ型肝炎表面抗
    原タンパク質又は該タンパク質を含有する粒子の存在又
    は量に相関する、特異的結合剤の結合度を測定して、サ
    ンプル中の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又は該
    タンパク質を含有する粒子の存在又は量を判定すること
    を含む上記方法。
64. 【請求項６４】 結合度とサンプル中の突然変異Ｂ型肝
    炎表面抗原タンパク質又は該タンパク質を含有する粒子
    の存在又は量との間の相関関係が、該突然変異Ｂ型肝炎
    表面抗原タンパク質又はそのフラグメント、あるいは該
    タンパク質を含有する粒子の既知量を含む対照サンプル
    を用いて決定されている、請求項６３記載の方法。
65. 【請求項６５】 特異的結合剤が突然変異Ｂ型肝炎表面
    抗原タンパク質又は該タンパク質を含有する粒子に対し
    て特異的に調製される、請求項６３記載の方法。
66. 【請求項６６】 非競合分析を含む、請求項６３記載の
    方法。
67. 【請求項６７】 分析が、ラベルを有する第２特異的結
    合剤を含む、請求項６６記載の方法。
68. 【請求項６８】 ラベルが放射性ラベル、酵素ラベル、
    蛍光ラベル、化学発光ラベル、バイオ発光ラベル、又は
    エピ蛍光レベルである、請求項６７記載の方法。
69. 【請求項６９】 凝集分析を含む、請求項６３記載の方
    法。
70. 【請求項７０】 競合分析を含む、請求項６３記載の方
    法。
71. 【請求項７１】 突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質
    又は該タンパク質を含有する粒子と交差反応する標識基
    質を用いることを含む、請求項６３記載の方法。
72. 【請求項７２】 サンプルが血液サンプルである、請求
    項６３記載の方法。
73. 【請求項７３】 サンプルがワクチンである、請求項６
    ３記載の方法。
74. 【請求項７４】 突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質
    又は該タンパク質を含有する粒子に関する分析をキャリ
    ブレートする方法であって、 （ａ）請求項１又は３５のいずれか１項に記載の突然変
    異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメント、
    あるいは該タンパク質を含有する粒子の既知量を含む２
    つ以上の対照サンプルを用意し； （ｂ）対照サンプルの各々を分析において試験して、各
    々の対照サンプルが発生したシグナルを記録し；そして （ｃ）発生するシグナルを、サンプル中の突然変異Ｂ型
    肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメント、あるい
    は該タンパク質を含有する粒子の量と相関させる検量曲
    線を作成することを含む上記方法。
75. 【請求項７５】 特異的結合剤の結合アフィニティを試
    験する方法であって、 （ａ）請求項１又は３５のいずれかに記載の突然変異Ｂ
    型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメント、ある
    いは該タンパク質を含有する粒子の既知量を含む対照サ
    ンプルを用意し； （ｂ）結合が生ずるのに適した条件下で、対照サンプル
    に特異的結合剤を接触させ；そして （ｃ）特異的結合剤の結合度を測定して、突然変異Ｂ型
    肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメント又は該タ
    ンパク質を含有する粒子に対する該特異的結合剤の結合
    アフィニティを判定することを含む上記方法。
76. 【請求項７６】 結合アフィニティを、結合アフィニテ
    ィの予め定められた最小値と比較することを含む、請求
    項７５記載の方法。
77. 【請求項７７】 診断免疫アッセイ・キットを製造する
    ための品質管理手段の一部である、請求項７６記載の方
    法。
78. 【請求項７８】 特異的結合剤がモノクローナル抗体又
    はフラグメント状モノクローナル抗体である、請求項７
    ５記載の方法。
79. 【請求項７９】 請求項５５記載の特異的結合剤を含む
    診断免疫アッセイ・キット。
80. 【請求項８０】 請求項６２記載の対照サンプルを含む
    診断免疫アッセイ・キット。
81. 【請求項８１】 組換え的に作製された、請求項１又は
    ３５のいずれか１項に記載の突然変異Ｂ型肝炎表面抗原
    タンパク質又はそのフラグメント、あるいは該タンパク
    質を含有する粒子。
82. 【請求項８２】 酵母、細菌又は哺乳動物細胞中で組換
    え的に作製された、請求項８１記載のタンパク質、粒子
    又はフラグメント。
83. 【請求項８３】 請求項１又は３５のいずれかに記載の
    突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメ
    ント、あるいは該タンパク質を含有する粒子をコードす
    る単離ＤＮＡ。
84. 【請求項８４】 配列番号：２のアミノ酸配列をコード
    する配列を含む、請求項８３記載の単離ＤＮＡ。
85. 【請求項８５】 下記アミノ酸配列：Ａｒｇ−Ｔｈｒ−
    Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｔ
    ｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈ
    ｒ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ
    −Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−
    Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ（配
    列番号：３１）をコードする配列を含む、請求項８３記
    載の単離ＤＮＡ。
86. 【請求項８６】 請求項１又は３５のいずれかに記載の
    Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質又はそのフラグメント、あ
    るいは該タンパク質を含有する粒子をコードする単離Ｄ
    ＮＡ。
87. 【請求項８７】 突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質
    をコードする核酸配列をサンプル中で検出する方法であ
    って、 （ａ）請求項１又は３５のいずれかに記載の突然変異Ｂ
    型肝炎表面抗原タンパク質をコードする核酸配列を含有
    すると疑われるサンプルを用意し；そして（ｂ）突然変
    異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質をコードする核酸配列を
    検出することを含む上記方法。
88. 【請求項８８】 検出工程（ｂ）の前に、核酸配列の少
    なくとも一部を増幅する、請求項８７記載の方法。
89. 【請求項８９】 検出工程が、増幅した核酸を、増幅し
    た突然変異Ｂ型肝炎核酸に相補的なヌクレオチド配列を
    含むヌクレオチドプローブの少なくとも一部とハイブリ
    ダイズさせ、該プローブを検出することによっておこな
    われる、請求項８８記載の方法。
90. 【請求項９０】 プローブが標識されている、請求項８
    ９記載の方法。
91. 【請求項９１】 ハイブリダイズしたプローブと増幅し
    た核酸の複合体が、二本鎖ＤＮＡに特異的である特異的
    結合剤によって検出される、請求項８９記載の方法。
92. 【請求項９２】 特異的結合剤がモノクローナル抗体又
    はフラグメント状モノクローナル抗体である、請求項９
    １記載の方法。
93. 【請求項９３】 検出工程が、増幅した核酸をヌクレオ
    チド配列の長さに応じて分離し、増幅したＢ型肝炎核酸
    に対応するヌクレオチド配列を検出することによってお
    こなわれる、請求項８８記載の方法。
94. 【請求項９４】 ヌクレオチドプローブが、５’−ＧＧ
    ＡＹＴＭＴＣＧＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡ
    ＴＡＣＣＡＡＣＣＣ−３’；５’−ＧＧＧＴＴＧＧＴＡ
    ＴＧＣＴＣＣＣＧＴＧＣＫＧＡＴＧＧＴＣＧＡＫＡＲＴ
    ＣＣ−３’；５’−ＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡＣＧＧＧＡＧ
    ＣＡＴＡＣＣＡＡ−３’；５’−ＴＴＧＧＴＡＴＧＣＴ
    ＣＣＣＧＴＧＣＫＧＡＴＧＧＴ−３’；５’−ＣＣＡＧ
    ＧＡＹＴＭＴＣＧＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡＣＧ−３’；
    ５’−ＴＣＣＣＧＴＧＣＫＧＡＴＧＧＴＣＧＡＫＡＲＴ
    ＣＣ−３’；５’−ＧＣＡＴＡＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡ
    ＣＧＡＣＴＡＴＴＧ−３’；５’−ＣＡＡＴＡＧＴＣＧ
    ＴＧＣＡＧＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＣ−３’；５’−ＧＴ
    ＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＧＡＣＧＧＡＡＡＴＴＡＣＡ
    ＣＣＴＡＴＡ−３’；５’−ＴＣＧＧＡＣＧＧＡＡＡＴ
    ＴＡＣＡＣＣＴＡＴＡ−３’；５’−ＴＧＧＧＡＴＧＧ
    ＧＡＡＴＡＴＡＧＧＴＧＴＡＡ−３’；又は上記ヌクレ
    オチド配列のいずれかと実質的に同じハイブリダイゼー
    ション活性を有し、実質的に同じヌクレオチド配列を有
    するヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列
    を含む、請求項８９記載の方法。
95. 【請求項９５】 下記ヌクレオチド配列：５’−ＧＧＡ
    ＹＴＭＴＣＧＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡＴ
    ＡＣＣＡＡＣＣＣ−３’；５’−ＧＧＧＴＴＧＧＴＡＴ
    ＧＣＴＣＣＣＧＴＧＣＫＧＡＴＧＧＴＣＧＡＫＡＲＴＣ
    Ｃ−３’；５’−ＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡＣＧＧＧＡＧＣ
    ＡＴＡＣＣＡＡ−３’；５’−ＴＴＧＧＴＡＴＧＣＴＣ
    ＣＣＧＴＧＣＫＧＡＴＧＧＴ−３’；５’−ＣＣＡＧＧ
    ＡＹＴＭＴＣＧＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡＣＧ−３’；５’
    −ＴＣＣＣＧＴＧＣＫＧＡＴＧＧＴＣＧＡＫＡＲＴＣＣ
    −３’；５’−ＧＣＡＴＡＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡＣＧ
    ＡＣＴＡＴＴＧ−３’；５’−ＣＡＡＴＡＧＴＣＧＴＧ
    ＣＡＧＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＣ−３’；５’−ＧＴＡＴ
    ＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＧＡＣＧＧＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣ
    ＴＡＴＡ−３’；５’−ＴＣＧＧＡＣＧＧＡＡＡＴＴＡ
    ＣＡＣＣＴＡＴＡ−３’；５’−ＴＧＧＧＡＴＧＧＧＡ
    ＡＴＡＴＡＧＧＴＧＴＡＡ−３’；又は上記ヌクレオチ
    ド配列のいずれかと実質的に同じヌクレオチド配列を有
    し、実質的に同じハイブリダイゼーション活性を有する
    ヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列を含
    む、請求項１又は３５のいずれかに記載の突然変異Ｂ型
    肝炎表面抗原タンパク質をコードする核酸配列を検出す
    るためのヌクレオチドプローブ。
96. 【請求項９６】 検出可能なラベルをさらに含む、請求
    項９５記載のヌクレオチドプローブ。
97. 【請求項９７】 プローブが上記配列のいずれか１つか
    ら本質的に成る、請求項９５記載のヌクレオチドプロー
    ブ。
98. 【請求項９８】 請求項１又は３５のいずれかに記載の
    突然変異Ｂ型肝炎表面抗原タンパク質をコードする核酸
    配列の検出キットであって、Ｂ型肝炎表面抗原に特徴的
    な核酸にアニーリングして、Ｂ型肝炎表面抗原に特徴的
    な核酸による増幅をプライミングすることができるヌク
    レオチドプライマーを含む、少なくとも１種の試薬；お
    よび増幅した突然変異Ｂ型肝炎表面抗原核酸とハイブリ
    ダイズすることができるヌクレオチドプローブを含む、
    少なくとも１種の試薬を含む上記キット。
99. 【請求項９９】 ヌクレオチドプローブが、５’−ＧＧ
    ＡＹＴＭＴＣＧＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡＣＧＧＧＡＧＣＡ
    ＴＡＣＣＡＡＣＣＣ−３’；５’−ＧＧＧＴＴＧＧＴＡ
    ＴＧＣＴＣＣＣＧＴＧＣＫＧＡＴＧＧＴＣＧＡＫＡＲＴ
    ＣＣ−３’；５’−ＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡＣＧＧＧＡＧ
    ＣＡＴＡＣＣＡＡ−３’；５’−ＴＴＧＧＴＡＴＧＣＴ
    ＣＣＣＧＴＧＣＫＧＡＴＧＧＴ−３’；５’−ＣＣＡＧ
    ＧＡＹＴＭＴＣＧＡＣＣＡＴＣＭＧＣＡＣＧ−３’；
    ５’−ＴＣＣＣＧＴＧＣＫＧＡＴＧＧＴＣＧＡＫＡＲＴ
    ＣＣ−３’；５’−ＧＣＡＴＡＣＣＡＡＣＣＣＴＧＣＡ
    ＣＧＡＣＴＡＴＴＧ−３’；５’−ＣＡＡＴＡＧＴＣＧ
    ＴＧＣＡＧＧＧＴＴＧＧＴＡＴＧＣ−３’；５’−ＧＴ
    ＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＣＧＧＡＣＧＧＡＡＡＴＴＡＣＡ
    ＣＣＴＡＴＡ−３’；５’−ＴＣＧＧＡＣＧＧＡＡＡＴ
    ＴＡＣＡＣＣＴＡＴＡ−３’；５’−ＴＧＧＧＡＴＧＧ
    ＧＡＡＴＡＴＡＧＧＴＧＴＡＡ−３’；又は上記ヌクレ
    オチド配列のいずれかと実質的に同じヌクレオチド配列
    を有し、実質的に同じハイブリダイゼーション活性を有
    するヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列
    を含む、請求項９８記載のキット。