JPH11253190A

JPH11253190A - 細菌培養用ボトルおよび細菌検出方法

Info

Publication number: JPH11253190A
Application number: JP5719198A
Authority: JP
Inventors: Yuji Murakami; 村上　　祐児; Mikako Fujiike; 美加子藤池; Akihiko Maeda; 彰彦前田
Original assignee: Japan Oxygen Co Ltd; Nippon Sanso Corp
Current assignee: Japan Oxygen Co Ltd; Taiyo Nippon Sanso Corp
Priority date: 1998-03-09
Filing date: 1998-03-09
Publication date: 1999-09-21

Abstract

(57)【要約】【課題】安定同位体を含有する培地で細菌を培養し、
代謝により生成される物質の核磁気共鳴吸収を測定し
て、菌の検出同定を効率良くかつ精度よく実施するため
の手段の提供。【解決手段】本発明の細菌培養用ボトル１Ａは、大径
円筒部２と小径円筒部３とが連結された異径管の、いず
れか一方の端部が封じられ、他方の端部に着脱自在なキ
ャップ４を装着したものである。本発明の細菌検出方法
は、上述した本発明の細菌培養用ボトルに、重水素，¹³
Ｃ，¹⁵Ｎからなる群から選択される少なくとも一種の安
定同位体を含む培地と、検体とを入れて培養し、前記ボ
トルの小径円筒部に磁場をかけ、核磁気共鳴吸収を測定
し、前記安定同位体を含む代謝生成物の存在から細菌を
検出することを特徴としている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、細菌を培養して検
査する際に使用される細菌培養用ボトルおよび細菌検出
方法に関し、特に安定同位体を含む培地で細菌を培養
し、代謝物の核磁気共鳴吸収を測定することで細菌の検
出同定を効率良く行うためのものである。

【０００２】

【従来の技術】安定同位体を含有する培地で血液等の検
体を培養し、そのときの代謝により生成した物質の核磁
気共鳴吸収を測定して、検体中の細菌を検出同定する方
法（以下、ＳＩ−ＮＭＲ法と言う）がある。そしてこの
方法を実施するための細菌の培養方法としては、従来、
下記の（Ａ）と（Ｂ）の二法がある。

【０００３】（Ａ）カルチャーボトルで培養する方法。
カルチャーボトルは、細菌培養用ボトルとして、もっと
も普及している。このボトルは有底円筒形であり、瓶口
部にスクリューキャップが螺着嵌合されるようになって
いる。普通に市販されているものは太さが２０〜３０ｍ
ｍ、深さが５０〜７０ｍｍ程度である。本ボトルは低価
格であり、取り扱いが容易な長所があるが、このボトル
の径は太いので、これを直接核磁気共鳴吸収装置の測定
室にロードして分析することはできない。そのためＳＩ
−ＮＭＲ法を行う場合には、カルチャーボトルは培養に
のみ使用し、核磁気共鳴吸収を測定するためには、培養
物質を専用の核磁気共鳴吸収管（以下、ＮＭＲ管とい
う）に移し替える作業が必要であった。その結果、必要
な操作が一つ増える上、作業者が細菌と接触する機会が
増えるため、二次感染の危険性が高くなる欠点がある。

【０００４】（Ｂ）ＮＭＲ管で培養する方法。ＮＭＲ管
は、サンプル（培養液）に均一な磁場がかかるようにし
たガラス細管である。普通、外径は約５ｍｍ、長さは１
３０〜１５０ｍｍである。底部は封じ切りになってお
り、上部はテフロン栓にて密栓するようになっている。
このＮＭＲ管中で直接細菌を培養すれば、そのまま核磁
気共鳴吸収装置の測定室にロードして分析することがで
きる。そのため、上記（Ａ）のカルチャーボトルを使用
する方法に比べ、培養液の移し替え操作が不要となり、
測定が簡略化でき、且つ作業者は細菌と接触することが
なくなり、二次感染の危険性を回避できる。しかし、Ｎ
ＭＲ管は前記の如き細管であるため、管内に入れられる
培地の量が限られ、それに伴い培地中の栄養源の量も限
られる。しかも管内の空気と培地との接触面積が小さく
ならざるを得ない。一般の好気性菌の増殖は、溶存酸素
と栄養源に依存するから、ＮＭＲ管を培養ボトルとして
使用すると、菌の増殖速度が遅くなる。したがって、Ｓ
Ｉ−ＮＭＲ法による細菌の検出同定までに長い時間がか
かることになる。また、ＮＭＲ管内の容量が小さいた
め、血液などの検体サンプルの注入可能な量も制限され
る。検体サンプル中に存在する菌が極低濃度である場合
には、検体サンプル中の菌注入確率が低下することによ
り、検出率が低下する。または、検出までの時間が長く
なるなどの欠点を生じる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、安定同位体
を含有する培地で細菌を培養し、代謝により生成される
物質の核磁気共鳴吸収を測定して、菌の検出同定を効率
良くかつ精度よく実施するための手段の提供を課題とし
ている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明の細菌培養用ボト
ルは、大径円筒部と小径円筒部とが連結された異径管
の、いずれか一方の端部が封じられ、他方の端部に着脱
自在なキャップを装着したものである。このボトルにお
いて、キャップの少なくとも一部を通気性として良い。
また、小径円筒部が核磁気共鳴吸収管となり、前記大径
円筒部が核磁気共鳴吸収装置の試料管保持部に係合する
ホルダーとなっていることが望ましい。本発明の細菌検
出方法は、上述した本発明の細菌培養用ボトルに、重水
素，¹³Ｃ，¹⁵Ｎからなる群から選択される少なくとも一
種の安定同位体を含む培地と、検体とを入れて培養し、
前記ボトルの小径円筒部に磁場をかけ、核磁気共鳴吸収
を測定し、前記安定同位体を含む代謝生成物の存在から
細菌を検出することを特徴としている。この方法におい
て、細菌培養用ボトルの大径円筒部で前記培養を行った
後、培養液を小径円筒部に移して核磁気共鳴吸収を測定
しても良い。

【０００７】

【発明の実施の形態】図１は本発明による細菌培養用ボ
トル（以下、ボトルという）の第１の実施形態を示すも
のである。このボトル１Ａは、上部の大径円筒部２と下
部の小径円筒部３とを連結してなる異径管である。小径
円筒部３の下端は封じ切られている。大径円筒部２の上
端は開口しており、上端部外周には図示しないネジ部が
形成されている。このネジ部には、スクリューキャップ
４が螺着嵌合されている。

【０００８】また図２は本発明によるボトルの第２の実
施形態を示すものである。このボトル１Ｂも大径円筒部
２と小径円筒部３とを連結した異径管であるが、先の第
１の実施形態によるボトル１Ａとは逆に、大径円筒部２
の端部を封じ切って底部とし、小径円筒部３の端部を上
部開口とし、この小径円筒部３の上端部にネジ部を設
け、小径のスクリューキャップ４を螺着嵌合した構成に
なっている。

【０００９】これらのボトル１Ａ，１Ｂにおいて、大径
円筒部２と小径円筒部３との接続部分は、内容物である
培地や検体が両部分の間を円滑に移動できる形状であれ
ば良く、特に限定されない。またボトル１Ａ，１Ｂの材
質は限定されることはなく、ＮＭＲ管で通常使用される
ものであれば良く、例えば石英ガラスが好適に用いられ
る。肉厚は、０．１〜１．０ｍｍ程度で良い。

【００１０】大径円筒部２の内径寸法（Ｘ）は特に限定
されないが、通常は内径が１０〜５０ｍｍ程度であり、
好ましくは２０〜４０ｍｍ程度である。長さ（Ｙ１）は
３０〜１００ｍｍ程度であり、好ましくは５０〜７０ｍ
ｍ程度である。この大径円筒部２の内径と長さが大き過
ぎるものは、細菌の培養に必要がないばかりでなく、作
業性を損なうことになる。小さ過ぎると、培地や検体の
収容量が少なくなり、かつ空気との接触面積が不足する
ために細菌の増殖が遅くなる欠点がある。

【００１１】小径円筒部３は、核磁気共鳴吸収分析にお
いて用いられるＮＭＲ管として機能するものであり、の
内径寸法（Ｚ）も特に限定されないが、内径は１〜３０
ｍｍ程度であり、好ましくは２〜２０ｍｍ程度である。
長さ（Ｙ２）は５０〜２５０ｍｍ程度であり、好ましく
は１００〜２００ｍｍ程度である。内径が太過ぎたり、
長さが長過ぎると、通常使用される核磁気共鳴吸収装置
にセットすることに支障を生じる。また、細過ぎたり、
短か過ぎると、分析に必要な検体の収容量が不足する
他、細過ぎる場合には培地や検体の内容物が細管内を移
動することが困難になる。

【００１２】図３は、これらのボトル１Ａ，１Ｂに装着
されるスクリューキャップ４を例示するものである。こ
のキャップ４は、円板状の天面部とその周縁から垂下し
た筒部とを備え、筒部の内周面にはボトル１Ａ，１Ｂの
瓶口に設けられたネジ部に螺合するネジが形成されてい
る。キャップ４の本体７は合成樹脂からなり、その材質
は特に限定されないが、フッ素樹脂やシリコーン樹脂な
どが好適である。キャップ４の天面部中央は、内容物は
漏れ出さないが、通気性のある膜からなる通気性部分６
になっている。この通気性部分６はシリコーン樹脂など
の通気性樹脂フィルムや発泡体からなっている。なお、
本例示では、スクリューキャップ４をボトル１Ａ，１Ｂ
の瓶口に螺着嵌合する構成としたが、内容物が漏出しな
いように瓶口を閉止できれば他の閉止手段、例えば押し
込み式の栓や無理嵌め式のキャップと瓶口との組み合わ
せを用いても良い。また、検出すべき細菌が嫌気性菌で
ある場合は、通気性部分６ではなく、完全気密性のある
キャップを使用するか、ボトル１Ａ，１Ｂごと嫌気性雰
囲気中に置いて培養を行う。

【００１３】これらのボトル１Ａ，１Ｂを用いて、検体
中の細菌を検出、同定するには、まず滅菌処理したボト
ル１Ａ，１Ｂに、培地と検体（培養液５）を注入し、瓶
口にキャップ４を装着してボトル１Ａ，１Ｂを密封し、
細菌を培養する。ここで、培地としては、検出するべき
細菌の種類に応じて、適宜な基本培地を選択使用し、そ
の栄養成分のうちの一種、例えば炭素源のグルコースと
してＤ−グルコース−１−¹³Ｃを添加した安定同位体含
有培地を用いる。なお、使用する安定同位体は¹³Ｃに限
らず、重水素、¹⁵Ｎを含んだ栄養成分を加え、分析に供
しても良い。培養液５の量は、各ボトル１Ａ，１Ｂと
も、気相空間が残るように定める。培養温度は検出する
べき細菌の種類に応じて適宜設定し得るが、通常は３０
〜４０℃程度とする。

【００１４】培養したのち、ボトル１Ａ，１Ｂの上下
（天地）を逆転して培養液を攪拌し、均一な培養液を小
径円筒部３に移し、ボトル１Ａ，１Ｂを核磁気共鳴吸収
分析装置にロードし、ＮＭＲ管として機能する小径円筒
部３の部分に磁場をかけて核磁気共鳴吸収を測定する。
検体中に細菌が存在すれば、その増殖に伴い、安定同位
体を含む栄養成分を細菌が取り込み代謝し、細菌の種類
に応じて安定同位体を含む各種の代謝産物、例えば乳
酸、エチルアルコール、酢酸などの有機酸類、二酸化炭
素などが生成している。核磁気共鳴吸収分析によって、
各種の代謝生成物を分析することにより、検体中の細菌
の検出、同定が可能となる。

【００１５】このボトル１Ａ，１Ｂは、十分な量の培地
と検体とを収容可能な大径円筒部２と、ＮＭＲ管として
使用可能な小径円筒部３とを備えているので、微量な菌
を短い時間で培養することができるとともに、培養後の
液を小径円筒部３に入れた状態で培養液の核磁気共鳴吸
収装置の測定室にロードすることができ、安定同位体を
含む代謝生成物の吸収ピークから菌種の検出と同定をす
ることができるので、細菌検出操作を効率良く行うこと
ができる。また培養液５をＮＭＲ管に移し替える操作が
不要であるから、作業が二次感染する危険性を回避する
ことができる。さらに、ＮＭＲ管を核磁気共鳴吸収分析
装置にロードする場合、直径がＮＭＲ管よりも太い専用
のホルダーにＮＭＲ管を差し込んで測定室にロードしな
ければならないが、本発明のボトル１Ａ，１Ｂであれ
ば、大径円筒部２にホルダーとしての機能を持たせるこ
とができるので、管をホルダーに差し込む操作が不要と
なり、分析操作を一層簡便にできる。

【００１６】図４と図５は本発明のボトルの第３の実施
形態を示すものである。このボトル１Ｃは、図１に示す
第１の実施形態によるボトル１Ａと同様の構成要素を備
えている他、大径円筒部２の下部（小径円筒部３の上
部）に複数の羽根８を設けたことを特徴としている。こ
の羽根８は、ボトル１Ｃの成形の際に一体に設けても良
いし、小径円筒部３の外周に嵌合される大きさのリング
に放射状に羽根８を形成した合成樹脂からなる部材を、
小径円筒部３に装着しても良い。この羽根８を設けたこ
とにより、核磁気共鳴吸収を測定する際に、この羽根に
空気流を吹き付けることにより、ボトルを高速で回転さ
せ、磁場が均一にかかるようにすることができる。

【００１７】この機能は、従来は径が太いＮＭＲ管専用
のホルダーが所持していたものであり、ＮＭＲ測定を行
う際にＮＭＲ管をこのホルダーの中心に差し込んでＮＭ
Ｒ分析装置にロードする必要があったものを、このボト
ル１Ｃでは大径円筒部２にその機能を付加したものであ
る。これによって、ＮＭＲ管を専用のホルダーに差し込
むという操作が省けるため、分析操作を簡便化すること
ができる。

【００１８】

【実施例】（実施例１）菌の培養速度大腸菌（Escherichia coli, ATCC29522）と、黄色ブド
ウ球菌（Staphylococcus aureus, ATCC29213）の２種
類の好気性菌を、各種形状のボトルで培養した。菌の増
殖に伴う濁度を、波長６６０ｎｍにおける吸光度（Ｏ
Ｄ）として測定し、増殖速度を比較した。なお、この場
合、吸光度（ＯＤ）は濁度を示す指標であり、ＯＤ値の
増加は菌が増殖し、かつそれに伴い栄養源であるグルコ
ースを消費し、代謝物をより多く生産したことを指し示
す。

【００１９】使用したボトルは、比較例として従来型の
カルチャーボトルとＮＭＲ管、本発明ボトルとして図１
（本発明ボトル（ａ）という）及び図２（本発明ボトル
（ｂ）という）に示すものを用いた。各ボトルの寸法と
培養液（培地と菌の合計）の注入量は表１の通りとし
た。なお、表１で「大径」、「小径」とあるのは、それ
ぞれ大径円筒部、小径円筒部の内径、深さ、内容積を表
している。また接触面積は培養液と気相（空気）とが接
する面積である。

【００２０】

【表１】

【００２１】培地は、ブレインハートインフージョン
（栄研化学社製）を５．８重量％含む培養液に、Ｄ−グ
ルコース−１−¹³Ｃ（米国ＩＳＯＴＥＣ社製）を１重量
％添加したものを用いた。滅菌処理した培地に菌を接種
した。菌の濃度は、１０⁵cells/mlにした。この培養液
を各ボトルに、表１に示した液量で注入し、３７℃で振
とう培養（毎分２０回程度）した。適宜時間後に培養液
を分光セルに取り、波長６６０ｎｍの吸光度（ＯＤ）を
測定した。分光計は日本分光（株）製、Ubest-30を用い
た。

【００２２】大腸菌のＯＤの経時変化を図６に、黄色ブ
ドウ球菌のＯＤの経時変化を図７に示す。大腸菌、黄色
ブドウ球菌とも、本発明のボトル（ａ），（ｂ）による
培養は従来のカルチャーボトルによる培養と同程度の菌
体増殖速度を示し、ＮＭＲ管による培養はこれらよりも
遅いことがわかる。すなわち、空気との接触面積が大き
く、培地量が多く栄養豊富な条件で培養する方が、菌の
増殖が速いことを示している。したがって、ＳＩ−ＮＭ
Ｒ法において、ＮＭＲ管を培養ボトルとして使用するよ
りも、本発明のボトル（ａ），（ｂ）を使用する方が、
菌の培養が早くできることがわかった。

【００２３】（実施例２）菌による生成物の核磁気共鳴
吸収の測定大腸菌を、実施例１と同じ条件で同じ４種類のボトルに
より、８時間培養した。培養後、内部標準としてジオキ
サンを１μｌ／ｍｌ培養液の割合で添加した。本発明の
ボトル（ａ），（ｂ）とＮＭＲ管については、上下を逆
転し、内容物を攪拌して細管部分にも培養液が均一に分
布するようにした。本発明の培養用ボトルとＮＭＲ管で
培養した場合は、直接核磁気共鳴吸収装置（日本電子
（株）製、GSX-270）の測定室にロードした。

【００２４】本発明のボトル（ａ）で培養し、核磁気共
鳴吸収を測定した結果を図８に示す。代謝物ピークのう
ち、約１７ｐｐｍはエタノール、約２１ｐｐｍは乳酸、
約２３ｐｐｍは酢酸のピークであり、これらは大腸菌の
増殖に伴って生成された物質である。６７ｐｐｍは内部
標準のジオキサンのピークである。約９３ｐｐｍと約９
７ｐｐｍはグルコースのピークである。本発明のボトル
（ａ）で培養した場合のピークの高さを１とした場合
の、その他のボトルで培養した各ピークの高さの比を表
２に示す（ジオキサンのピークは省略）。

【００２５】

【表２】

【００２６】図８と表２から、本発明のボトル（ａ），
（ｂ）による培養では、カルチャーボトルによる培養と
ほぼ同じ高さの、生成物のピークが得られることが分か
る。それに対して、ＮＭＲ管で培養した場合には、同じ
代謝生成物のピークは得られるものの、ピークの高さは
低い。すなわち、最初の菌濃度が同じであっても、ＮＭ
Ｒ管による培養では、菌の増殖が少ないので検出精度が
低くなる。ピークを高くしようとすると、培養に長い時
間を必要として作業効率が悪くなる。あるいは、最初の
菌濃度、したがって、検体中の菌が少ない場合には、実
質的に菌の培養と検出が不可能になる。換言すると、本
発明の培養用ボトルによればＮＭＲ管による培養に比較
して、微量の菌を含む検体から菌を検出することが可能
である。

【００２７】以上説明した通り、実施例１では、本発明
の培養用ボトルは従来から常用されるカルチャーボトル
と同じ速さで菌を培養できることが明らかとなった。実
施例２では、培養液を移し替える作業をすることなく、
小径円筒部をＮＭＲ管としてそのまま核磁気共鳴吸収を
測定できることが実証された。また実施例２によれば、
培養液の移し替えが不要なＮＭＲ管を用いた培養に比較
して、微量の菌の培養と検出が可能であること、及び、
短い培養時間で検出が可能であることが明らかになっ
た。

【００２８】実施例２では大腸菌の代謝生成物の核磁気
共鳴吸収を測定したが、菌による代謝生成物質は菌ごと
に特有であるから、安定同位体を含む本発明の培養用ボ
トルを使用して菌を培養し、代謝により生成する物質の
核磁気共鳴吸収を測定すれば、菌の検出とともに菌種の
同定が可能である。

【００２９】

【発明の効果】本発明による細菌培養用ボトルは、十分
な量の培地と検体とを収容可能な大径円筒部と、ＮＭＲ
管として使用可能な小径円筒部とを備えているので、微
量な菌を短い時間で培養することができるとともに、培
養後の液を小径円筒部に入れた状態で培養液の核磁気共
鳴吸収装置の測定室にロードすることができ、安定同位
体を含む代謝生成物の吸収ピークから菌種の検出と同定
をすることができるので、細菌検出操作を効率良く行う
ことができる。また培養液をＮＭＲ管に移し替える操作
が不要であるから、作業者が二次感染する危険性を回避
することができる。さらに、ＮＭＲ管を核磁気共鳴吸収
分析装置にロードする場合、直径がＮＭＲ管よりも太い
専用のホルダーにＮＭＲ管を差し込んで測定室にロード
しなければならないが、本発明のボトルであれば、大径
円筒部にホルダーとしての機能を持たせることができる
ので、管をホルダーに差し込む操作が不要となり、分析
操作を一層簡便にできる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の細菌培養用ボトルの第１の実施形態
を示す正面図。

【図２】本発明の細菌培養用ボトルの第２の実施形態
を示す正面図。

【図３】同じボトルに装着されるキャップの斜視図。

【図４】本発明の細菌培養用ボトルの第３の実施形態
を示す断面図。

【図５】同じボトルの底面図。

【図６】本発明に係る実施例１の増殖試験の結果を示
すグラフ。

【図７】本発明に係る実施例１の別な結果を示すグラ
フ。

【図８】本発明に係る実施例２の結果を示すグラフ。

【符号の説明】

１Ａ，１Ｂ，１Ｃボトル（細菌培養用ボトル）２大径円筒部３小径円筒部４キャップ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】大径円筒部と小径円筒部とが連結された
異径管の、いずれか一方の端部が封じられ、他方の端部
に着脱自在なキャップを装着した細菌培養用ボトル。
【請求項２】前記キャップの少なくとも一部に通気性
部分を設けたことを特徴とする請求項１記載の細菌培養
用ボトル。
【請求項３】前記小径円筒部が核磁気共鳴吸収管とな
り、前記大径円筒部が核磁気共鳴吸収装置の試料管保持
部に係合するホルダーとなる寸法と形状に構成されたこ
とを特徴とする請求項１記載の細菌培養用ボトル。
【請求項４】請求項１から３のいずれか１項に記載さ
れた細菌培養用ボトルに、重水素，¹³Ｃ，¹⁵Ｎからなる
群から選択される少なくとも一種の安定同位体を含む培
地と、検体とを入れて培養し、前記ボトルの小径円筒部
に磁場をかけ、核磁気共鳴吸収を測定し、前記安定同位
体を含む代謝生成物の存在から細菌を検出することを特
徴とする細菌検出方法。
【請求項５】前記細菌培養用ボトルの大径円筒部で前
記培養を行った後、培養液を小径円筒部に移して核磁気
共鳴吸収を測定することを特徴とする請求項４記載の細
菌検出方法。