JPH11262393A - 腫瘍壊死関連レセプターｔｒ１、ｔｒ３およびｔｒ５についてのアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法 - Google Patents

腫瘍壊死関連レセプターｔｒ１、ｔｒ３およびｔｒ５についてのアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法

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JPH11262393A JP32434798A JP32434798A JPH11262393A JP H11262393 A JPH11262393 A JP H11262393A JP 32434798 A JP32434798 A JP 32434798A JP 32434798 A JP32434798 A JP 32434798A JP H11262393 A JPH11262393 A JP H11262393A
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ピーター・アール・ヤング
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ジュン・ゾウ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ
−Ｒ）関連ポリペプチドおよびそれらのリガンド（以
下、ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、およびＴＬ３という）に
関する。また本発明は、ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、およ
びＴＬ３のアゴニストおよびアンタゴニストの同定方法
にも関する。 【解決手段】 （ａ）標識または未標識のリガンドＴＬ
３の存在下で候補化合物をＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５
それぞれと接触させ；次いで（ｂ）該候補化合物がＴＬ
３と競争してＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５それぞれに結
合する能力を評価することを含む、ＴＲ１、ＴＲ３また
はＴＲ５に対するアゴニストまたはアンタゴニストを同
定する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、腫瘍壊死因子レセ
プター（ＴＮＦ−Ｒ）関連ポリペプチド（蛋白）および
それらのリガンド（以下、ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、お
よびＴＬ３という）に関する。また本発明は、本明細書
記載のスクリーニング方法によるアゴニストまたはアン
タゴニストを用いる、かかるポリペプチドの作用の阻害
または活性化にも関する。
【０００２】
【従来の技術】多くの生物学的作用は特定の刺激および
天然の生物学的プロセスに対する応答であり、サイトカ
インのごとき因子により制御されている。これらのサイ
トカインは、レセプターを用いて細胞内応答を引き起こ
すことにより、標的細胞レセプターを介して作用する。
例えば、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファおよびベータ
は、ＴＮＦレセプターを介して作用して多くの生物学的
プロセス（感染に対する防御およびショックや炎症性疾
病の誘起を包含）を調節するサイトカインである。ＴＮ
Ｆ分子は「ＴＨＦ−リガンド」スーパーファミリーに属
し、それらのレセプターまたは逆リガンド「ＴＮＦ−レ
セプター」スーパーファミリーと一緒になって作用す
る。今までのところ、ＴＮＦリガンドスーパーファミリ
ーの１０種のメンバーが同定されており、ＴＨＦ−レセ
プタースーパーファミリーの１３種のメンバーが特徴づ
けられている。ＴＮＦ−ａ、リンホトキシン−ａ（ＬＴ
−ａ、ＴＮＦ−ｂとしても知られる）、ＬＴ−ｂ（複合
体ヘテロダイマーＬＴ−ａ２−ｂ中に見いだされる）、
ＦａｓＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−
１ＢＢＬ、ＯＸ４０ＬおよびＴＲＡＩＬがリガンドに包
含される（Wiley et al. Immunity 3:673-682 (199
5)）。１種（ＬＴａ）を除いてこれらはすべてタイプＩ
Ｉの膜蛋白として発現される。ＴＮＦレセプターのスー
パーファミリーは、ｐ５５ＴＮＦレセプター、ｐ７５Ｔ
ＮＦレセプター、ＴＮＦレセプター−関連蛋白、ＦＡＳ
抗原またはＡＰＯ−１、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＣＤ３
０、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、低親和性ｐ７５、ＮＧＦ−
レセプターを包含する（Meager, A., Biologicals, 22:
291-295 (1994)）。
【０００３】ＴＮＦ−リガンドスーパーファミリーの多
くのメンバーは活性化Ｔ細胞により発現され、そのこと
は、それらが細胞個体発生および機能に関連している他
の細胞タイプとＴ細胞との相互作用に必要であることを
意味する（Maeger, A.,上記文献）。ＴＮＦレセプター
ファミリーのいくつかのメンバーの必須機能についての
相当数の考察が、これらの蛋白の発現を停止させる変異
体の同定および作成により得られている。例えば、ＦＡ
Ｓ抗原およびそのリガンドにおける自然発生的変異はリ
ンパ増殖性疾病を引き起こし（Watanabe-Fukunaga, R.,
et al., Nature 356:314 (1992)）、おそらく、このこ
とはプログラムされた細胞死の欠陥を反映しているので
あろう。ＣＤ４０リガンドの変異は、血漿中の高レベル
の免疫グロブリンＭおよび低レベルの免疫グロブリンＧ
により特徴づけられるＸ−リンクした免疫不全状態を引
き起こし、そのことはＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化の欠陥
を示すものである（Allen, R. C. et al., Science 25
9:990 (1993)）。低親和性神経増殖因子レセプターの標
的となる変異は、末梢構造の感覚イノベーションの欠陥
により特徴づけられる疾病を引き起こす（Lee, K. F. e
t al., Cell 69:737 (1992)）。
【０００４】ＴＮＦおよびＬＴ−ａは２種のＴＮＦレセ
プター（５５−および７５−ｋｄＴＮＦレセプター）に
結合しうる。レセプターに作用するＴＮＦおよびＬＴ−
ａにより誘発される生物学的効果の大部分は、移植腫瘍
の出血性壊死、細胞毒性、エンドトキシンショックにお
ける役割、炎症、免疫調節、増殖および抗−ウイルス応
答、ならびにイオン化照射の有害な効果に対する防御を
包含する。ＴＮＦおよびＬＴ−ａは、エンドトキシンシ
ョック、脳マラリア、腫瘍、自己免疫疾患、ＡＩＤＳお
よび移植片−宿主拒絶反応を包含する広範な疾病の発病
に関与している（Beutler, B. and Von Huffel, C., Sc
ience 264:67-668 (1994)）。ｐ５５レセプターにおけ
る変異は微生物感染に対する感受性上昇を引き起こす。
そのうえ、ＴＮＦＲ１（ｐ５５）およびＦａｓのＣ末端
付近の約８０個のアミノ酸からなるドメインは「デスド
メイン（death domain）」として報告されており、プロ
グラムされた細胞死に関するシグナルをトランスダクシ
ョンすることに関与している（Tartaglia et al., Cell
74: 845 (1993)）。ＴＮＦレセプター細胞内ドメイン
の他の領域はＮＦ−ｋＢによる転写活性化に関与してい
る（Cheng and Baltimore Genes and Development 10:
963-973 (1996)）。より最近の証拠は、細胞においてレ
セプターがシグナルを誘導し、「逆シグナリング（reve
rse signaling）」として知られる膜結合ＴＮＦファミ
リーのリガンドを発現させることを示唆している（Wile
y et al., J. Immunol. 157: 3635-3639 ）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】ＴＮＦファミリーのリ
ガンドおよびＴＮＦファミリーのレセプターの影響は様
々であり、哺乳動物系の生物学的プロセスにおいて正常
ならびに異常な多くの機能に影響する。それゆえ、正常
状態および疾病状態両方の生物学的活性に影響を及ぼす
かかるレセプターおよびリガンドの同定および特徴づけ
に対する必要性が明かに存在する。詳細には、ＴＮＦレ
セプターファミリーおよびそれらのリガンドの新規メン
バーを単離し、特徴づけすることが必要である。
【０００６】このことは、これらの腫瘍壊死因子レセプ
ター（ＴＮＦ−Ｒ）が治療薬を目的とした確立され証明
された歴史を有することを示す。慢性および急性炎症、
関節炎、敗血症、自己免疫疾患（例えば、炎症性腸疾
患、乾癬）、移植拒絶反応、対宿主移植片疾患、感染、
卒中、虚血、急性呼吸困難症候群、再狭窄、脳の傷害、
ＡＩＤＳ、骨の疾患、癌（例えば、リンパ増殖性疾
患）、アテローム性動脈硬化、およびアルツハイマー病
（これらに限らない）を包含する機能不全または疾病の
予防、改善または修正において役割を果たしうる腫瘍壊
死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）ファミリーのさらなる
メンバーの同定および特徴づけに対する必要性が明かに
存在する。
【０００７】
【課題を解決するための手段および発明の実施の形態】
本発明は、腫瘍壊死因子レセプター（ＴＮＦ−Ｒ）関連
ポリペプチドならびにそれらのリガンド（以下、ＴＲ
１、ＴＲ３、ＴＲ５およびＴＬ３という）に関する。ま
た本発明は、ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５およびＴＬ３のア
ゴニストおよびアンタゴニストの同定方法にも関する。
かくして同定されたアゴニストおよびアンタゴニストを
用いて、ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５およびＴＬ３のバラン
ス不良により引き起こされる、とりわけ慢性および急性
炎症、関節炎、敗血症、自己免疫疾患（例えば、炎症性
腸疾患、乾癬）、移植拒絶反応、対宿主移植片疾患、感
染、卒中、虚血、急性呼吸困難症候群、再狭窄、脳の傷
害、ＡＩＤＳ、骨の疾患、癌（例えば、リンパ増殖性疾
患）、アテローム性動脈硬化、およびアルツハイマー病
を治療することができる。
【０００８】「ＴＲ１またはＴＲ１ポリペプチドまたは
ＴＲ１蛋白」は、一般的には、とりわけ、配列番号：１
に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドならびに配列
番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
全長にわたって配列番号：１のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをいう。さらにそのうえ、ＴＲ１は、配列番
号：１のフラグメントに対して７０％の同一性を有する
配列を含むポリペプチドもいう。また「ＴＲ１またはＴ
Ｒ１ポリペプチドまたはＴＲ１蛋白」は、上記ポリペプ
チドの融合蛋白のごとき誘導体もいい、これらの誘導体
のいくつかをさらに後で説明する。
【０００９】「ＴＲ３またはＴＲ３ポリペプチドまたは
ＴＲ３蛋白」は、一般的には、とりわけ、配列番号：２
に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドならびに配列
番号：２のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
全長にわたって配列番号：２のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをいう。さらにそのうえ、ＴＲ３は、配列番
号：２のフラグメントにつぃして７０％の同一性を有す
る配列を含むポリペプチドもいう。また「ＴＲ３または
ＴＲ３ポリペプチドまたはＴＲ３蛋白」は、上記ポリペ
プチドの融合蛋白のごとき誘導体もいい、これらの誘導
体のいくつかをさらに後で説明する。
【００１０】「ＴＲ５またはＴＲ５ポリペプチドまたは
ＴＲ５蛋白」は、一般的には、とりわけ、配列番号：３
に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドならびに配列
番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
全長にわたって配列番号：３のアミノ酸配列に対して少
なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポ
リペプチドをいう。さらにそのうえ、ＴＲ５は、配列番
号：３のフラグメントにつぃして７０％の同一性を有す
る配列を含むポリペプチドもいう。また「ＴＲ５または
ＴＲ５ポリペプチドまたはＴＲ５蛋白」は、上記ポリペ
プチドの融合蛋白のごとき誘導体もいい、これらの誘導
体のいくつかをさらに後で説明する。
【００１１】「ＴＬ３またはＴＬ３ポリペプチドまたは
ＴＬ３蛋白」は、一般的には、とりわけ、配列番号：４
に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドならびに配列
番号：４のアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
全長にわたって配列番号：４のにアミノ酸配列に対して
少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む
ポリペプチドをいう。さらにそのうえ、ＴＬ３は、配列
番号：４のフラグメントに対して７０％の同一性を有す
る配列を含むポリペプチドもいう。また「ＴＬ３または
ＴＬ３ポリペプチドまたはＴＬ３蛋白」は、上記ポリペ
プチドの融合蛋白のごとき誘導体もいい、これらの誘導
体のいくつかをさらに後で説明する。
【００１２】配列番号：４のポリペプチドをコードして
いるｃＤＮＡは配列番号：１１に含まれる。
【００１３】「ポリペプチド」は、ペプチド結合または
修飾したペプチド結合（この場合、ペプチド同等物とな
る）により互いに結合している２個またはそれ以上のア
ミノ酸を含むペプチドまたは蛋白を意味する。「ポリペ
プチド」は、通常、例えばペプチド、オリゴペプチドお
よびオリゴマーとも称される短鎖のもの、および一般的
に蛋白と称される長鎖のものの両方を意味する。ポリペ
プチドは遺伝子によりコードされた２０種のアミノ酸と
は異なるアミノ酸を含有していてもよい。「ポリペプチ
ド」には、プロセッシングおよびその他の翻訳後修飾の
ような天然プロセスにより修飾されたものが含まれる
が、当業者に周知の化学修飾技術によっても修飾され
る。かかる修飾は基礎的な参考書およびさらに詳細な論
文ならびに多数の研究文献にも詳しく記載されており、
これらは当業者に周知である。修飾は、ペプチド骨格、
アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端等の
ポリペプチドの任意の部位で起こりうる。同一の型の修
飾はポリペプチドのいくつかの部位で、同一または異な
る程度で存在し得ることが理解されよう。また、ポリペ
プチドは多くの型の修飾をも含み得る。ポリペプチド
は、ユビキチネーションの結果として分枝状となったも
のであってもよく、ポリペプチドは分枝ありまたはなし
の環状のものであってもよい。環状、分枝状および分枝
状かつ環状のポリペプチドは翻訳後の天然プロセスによ
り生じたものであってもよく、あるいは合成的方法によ
り製造されたものであってもよい。修飾には、アセチル
化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビ
ンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまた
はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導
体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、
交差架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、
交差架橋共有結合形成、シスチン形成、ピログルタメー
ト形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコ
シル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチ
ル化、ミリストイル化、酸化、蛋白加水分解プロセッシ
ング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、グリコシル
化、脂質結合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カ
ルボキシル化、水酸化およびＡＤＰリボシル化、セレノ
イル化、硫酸化、アルギニル化のごときトランスファー
ＲＮＡにより媒介される蛋白へのアミノ酸の添加、なら
びにユビキチネーションなどがある。例えばProteins-S
tructure and Molecular Properties、第２版、T.E.Cre
ighton、W.H.Freeman and Company、ニューヨーク（199
3）およびPosttranslational Covalent Modification o
f Proteins、B.C.Johnson編、アカデミックプレス、ニ
ューヨーク（1983）のWold,F.,Posttranslational Prot
ein Modifications ：Perspective and Prospects、1〜
12頁；Seifterら、Meth.Enzymol.182:626-646（1990）
およびRattanら、Protein Synthesis：Posttranslation
al Modificationsand Aging，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48
-62（1992）を参照されたい。
【００１４】「同一性」とは、ヌクレオチド配列または
アミノ酸配列の同一性の尺度である。一般的には、最高
の合致が得られるように配列を並置する。「同一性」は
それ自体当該分野で認識されている意味を有し、公表さ
れた手法を用いて計算できる。例えば、Computational
Molecular Biology，Lesk,A.M.編、オックスフォード・
ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、1988年；Bi
ocomputing：Informatics and Genome Projects，Smit
h,D.W.編、アカデミック・プレス、ニューヨーク、1993
年；Computer Analysis of Sequence Data，パートＩ，
Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、ヒューマン・プレ
ス、ニュージャージー、1994年；Sequence Analysis in
Molecular Biology，von Heinje,G.、アカデミック・
プレス、1987年；およびSequence Analysis Primer，Gr
ibskov,M.およびDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレ
ス、ニューヨーク、1991年参照。二つのポリヌクレオチ
ド配列またはポリペプチド配列の間の同一性を測定する
方法は多くあるが、用語「同一性」は当業者に周知であ
る（Carillo,H.およびLipman,D.，SIAM J.AppliedMat
h.，48:1073（1988））。配列間の同一性または類似性
を測定するために通常用いられる方法は、Guide to Hug
e Computers,Martin J.Bishop,ed.,Academic Press,San
Diego,1994およびCarilo,H.,and Lipton,D.,SIAM J.Ap
plied Math.，48:1073（1988）等に開示されているが、
これらに限定するものではない。同一性を決定するため
の好ましい方法は、試験する配列間で最も良く適合する
ように設計される。同一性および類似性を決定する方法
は、公に入手できるコンピュータープログラムに集成さ
れている。二つの配列間の同一性および類似性を測定す
る好ましいコンピュータープログラム法には、ＧＣＧプ
ログラムパッケージ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids R
esearch 12(1):387（1984）、BLASTP、BLASTN、およびF
ASTA（Atschul,S.F.ら、J.Molec.Biol（1990） 215:40
3））等があるが、これらに限定するものではない。一
例として、配列番号：２の対照アミノ酸配列に対して少
なくとも例えば７０％の同一性を有するアミノ酸配列を
有するポリペプチドを例に挙げると、そのポリペプチド
配列が配列番号：２の対照アミノ酸配列のアミノ酸１０
０個ごとに３０個までのアミノ酸の変化を含みうること
を除き、そのポリペプチドのアミノ酸配列は対照配列と
同一である。言い換えると、対照アミノ酸配列に対して
少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドを得るためには、対照配列中のアミノ酸の３０
％までが欠失または他のアミノ酸と置換していてもよ
く、あるいは対照配列中の全アミノ酸のうち３０％まで
の数のアミノ酸が対照配列中に挿入されたものであって
もよい。対照配列におけるこれらの変化は、対照アミノ
酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置に存在しても
よく、あるいはそれらの末端間のいずれかの位置に存在
してもよく、対照配列中に散在していてもよく、あるい
は対照配列内で１個またはそれ以上の一連の群をなして
いてもよい。
【００１５】今回我々は、配列番号：４のＴＬ３が配列
番号：１のＴＲ１（オステオプロテグリン（ＯＰＧ）と
しても知られる（W. S. Simonet, et al., Cell, Vol 8
9, pp 309-319, 1997））のリガンドであることを見い
だした。さらに、我々は、配列番号：４のＴＬ３が配列
番号：２のＴＲ３（ＤＲ３としても知られる）のリガン
ドであることも見いだした。さらに我々は、配列番号：
４のＴＬ３が配列番号：３のＴＲ５のリガンドであるこ
とも見いだした。よって、本発明ＲＴ１、ＲＴ３および
ＴＲ５ポリペプチドならびにそれらのそれぞれのリガン
ドＴＬ３をレセプターまたはそれらのリガンドに結合し
て、本発明ＴＲ１、ＴＲ３およびＴＲ５レセプターポリ
ペプチドまたはそれらのそれぞれのリガンドＴＬ３を活
性化する化合物（アゴニスト）、あるいはそれらの活性
化を阻害する化合物（アンタゴニスト）のスクリーニン
グプロセスにおいて用いることができる。よって、本発
明ポリペプチドを用いて、細胞、無細胞調合物、化学ラ
イブラリー、および天然産物の混合物中における小型分
子基質、レセプターおよびリガンドの結合を評価するこ
とができる。これらの基質、レセプターおよびリガンド
は天然基質およびリガンドであってもよく、また、構造
または機能の模倣物であってもよい。Coligan et al.,
Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (19
91)参照。
【００１６】ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５およびＴＬ３ポリ
ペプチドは多くの病理を包含する多くの生物学的機能に
関与している。したがって、一方では、ＴＲ１、ＴＲ
３、ＴＲ５、またはＴＬ３を刺激し、他方では、ＴＲ
１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３の機能を阻害し、あ
るいはＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３発現細胞
を除去しうる化合物および薬剤を見いだすことが望まし
い。ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、およびＴＬ３に対するア
ンタゴニスト（ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３
発現細胞を除去する作用剤を包含）を、慢性および急性
炎症、関節炎、敗血症、自己免疫疾患（例えば、炎症性
腸疾患、乾癬）、移植拒絶反応、対宿主移植片疾患、感
染、卒中、虚血、急性呼吸困難症候群、再狭窄、脳の傷
害、ＡＩＤＳ、骨の疾患、癌（例えば、リンパ増殖性疾
患）、アテローム性動脈硬化、およびアルツハイマー病
のごとき症状の種々の治療および予防目的に用いてもよ
い。アゴニストを、Ｔ細胞および免疫系の他の成分の活
性化に応答する症状、例えば癌およびＡＩＤＳの治療に
ついて治療および予防目的で用いることができる。しか
しながら、免疫活性の下方転調を導くＴ細胞および免疫
系の他の成分の不適当な刺激にアゴニストを使用して、
慢性および急性炎症、関節炎、敗血症、自己免疫疾患
（例えば、炎症性腸疾患、乾癬）、移植拒絶反応、対宿
主移植片疾患、感染、卒中、虚血、急性呼吸困難症候
群、再狭窄、脳の傷害、ＡＩＤＳ、骨の疾患、癌（例え
ば、リンパ増殖性疾患）、アテローム性動脈硬化、およ
びアルツハイマー病のごとき症状についての治療的また
は予防的適用としてもよい。
【００１７】無細胞アッセイまたは細胞を用いるアッセ
イのいずれかにおいて、ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５に
対するＴＬ３の結合を阻害する化合物を検出するための
アッセイを用いてアンタゴニストを同定してもよい。例
えば、精製ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５、あるいはＴＲ
１、ＴＲ３またはＴＲ５の細胞外ドメインを含む融合蛋
白のごときＴＲ１、ＴＲ３，またはＴＲ５の精製誘導体
を安定な表面に直接または間接的に固定化して（例え
ば、抗体を介してＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５あるいは
融合エピトープまたは蛋白ドメインに結合する）、次い
で、ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５に対するＴＬ３の精製
可溶性細胞外ドメインの結合をブロックする能力により
候補化合物を同定する、ＥＬＩＳＡフォーマットを用い
てもよい。ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５に対するＴＬ３
の結合を、ＴＬ２（またはＴＬ４）に直接または間接的
に結合した標識を用いることにより検出することができ
る。適当な検出系は、ストレプトアビジンセイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ抱合体、またはタグ、例えばフルオ
レセインによる直接抱合体化を包含する。逆に、精製可
溶性ＴＬ３を適当な表面上に固定化し、次いで、ＴＬ３
に対する精製ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５の結合をブロ
ックする能力により候補化合物を同定してもよい。ＴＬ
３に対するＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５の結合を、ＴＲ
１、ＴＲ３またはＴＲ５に直接または間接的に結合した
標識を用いることにより検出することができる。ＴＲ
１、ＴＲ３またあＴＲ５蛋白およびそのリガンドを用い
る他の多くのアッセイフォーマットが可能である。
【００１８】細胞を用いる適当なアッセイ当業者により
容易に決定されうる。一般的には、かかるスクリーニン
グ法は、本発明レセプターポリペプチド（またはそのリ
ガンド）を表面に発現する適当な細胞を得ることを包含
する。かかる細胞は、哺乳動物、酵母、ショウジョウバ
エまたは大腸菌由来の細胞を包含する。次いで、ＴＲ
１、ＴＲ３またはＴＲ５のごときレセプターを発現する
細胞（または発現レセプターを含む細胞膜）を試験化合
物と接触させて、結合、または機能的応答の刺激もしく
は阻害を観察する。アッセイは、単に候補化合物の結合
を試験するものであってもよく、その場合、候補化合物
に直接または間接的に結合した標識を用いることによ
り、あるいはリガンドＴＬ３のごとき標識競争物質との
競争を含むアッセイにおいて、レセプターを有する細胞
への付着を検出する。別法として、ＴＬ３のごときリガ
ンドを発現する細胞（または発現リガンドを含む細胞
膜）をＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５のごときレセプター
あるいは試験化合物と接触させて、結合、または機能的
応答の刺激もしくは阻害を観察してもよい。同様に、ア
ッセイは、単に候補化合物の結合を試験するものであっ
てもよく、その場合、リガンドを有する細胞への付着
を、候補化合物に直接または間接的に結合した標識を用
いることにより、あるいはレセプターＴＲ１、ＴＲ３お
よびＴＲ５のごとき標識競争物質との競争を包含するア
ッセイにおいて検出する。さらに、これらのアッセイ
は、レセプター（例えばＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５）
あるいはそのそれぞれのリガンド（例えばＴＬ３）の活
性化により発生するシグナルを候補化合物が生じさせる
かどうかを、レセプターまたはそのリガンドおよびその
融合蛋白を表面上に有する細胞に適した検出系を用いて
試験するものであってもよい。典型的な融合パートナー
は、レセプターまたはリガンドの細胞外ドメインを第２
のレセプターの細胞内チロシンキナーゼドメインに融合
させたものを包含する。一般的には、活性化の阻害剤
は、ＴＲ１、ＴＲ３およびＴＲ５レセプターまたはレセ
プター融合物をそれぞれ発現する細胞についてはリガン
ドＴＬ３のごときアゴニストの存在下で、あるいはＴＬ
３リガンドならびにリガンド融合物を発現する細胞につ
いてはレセプターＴＲ１およびＴＲ２の存在下でアッセ
イされ、候補化合物の存在による、アゴニストによる活
性化に対する影響を観察する。かかるスクリーニングア
ッセイを行うための標準的方法は当業者によく理解され
ている。
【００１９】潜在的なＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５のア
ンタゴニストの例は抗体を包含し、あるいはいくつかの
場合にはＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５のリガンドに密接
に関連した蛋白、例えばそれぞれのリガンドＴＬ３のフ
ラグメント、あるいはレセプターまたはそのリガンドに
結合するが応答を誘導せず、その結果レセプターの活性
が妨害されることとなる小型分子を包含する。潜在的な
ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５のアゴニストの例は、ＴＲ
１、ＴＲ３またはＴＲ５に結合する抗体、ＴＬ３のごと
きそのそれぞれのレセプター、またはそれらの誘導体、
およびＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５に結合する小型分子
を包含する。これらのアゴニストは、本来のリガンドと
の接触により誘導される応答のすべてまたは一部を模倣
する応答を誘導するであろう。
【００２０】レセプターは、膜ＴＬ３を発現する細胞に
おいてシグナルを発生させうるので、これらのスクリー
ニングにより、膜ＴＬ３に関してＴＲ１、ＴＲ３または
ＴＲ５のアゴニスト活性を模倣するアゴニストを得るこ
とができる。潜在的なＴＬ３アゴニストの例は、ＴＬ３
に結合する抗体、ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５のごとき
そのそれぞれのレセプター、それらの誘導体、およびＴ
Ｌ３に結合する小型分子を包含する。これらのアゴニス
トは、本来のリガンドとの接触により誘導される応答の
すべてまたは一部を模倣する応答を誘導するであろう。
別法として、ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５を、検出試薬
が利用できる便利なパートナーペプチドとＴＲ１、ＴＲ
３またはＴＲ５の全体または一部分との融合バージョン
（例えば、ＴＲ１−ＩｇＧ、ＴＲ３−ＩｇＧまたはＴＲ
５−ＩｇＧ融合物）を包含する可溶性蛋白として発現さ
せてもよく、固体状態または溶液相の結合アッセイに使
用してもよい。例えば、可溶性ＴＲ１、ＴＲ３またはＴ
Ｒ５を用いて、実験的に検出可能な変化（例えば、表面
プラズモン共鳴、核磁気共鳴スペクトル法、沈降法、カ
ロリメトリー）により直接的にアゴニストまたはアンタ
ゴニストの結合を検出することができる。可溶性ＴＲ
１、ＴＲ３またはＴＲ５を用いて、ＴＬ３のごときリガ
ンド（それらの結合は検出可能なものである）と候補ア
ゴニストまたはアンタゴニストとの競争を探索すること
により間接的にアゴニストまたはアンタゴニストの結合
を検出することができる。リガンド検出法は、抗体認
識、放射性標識によるリガンド修飾、化学修飾（例えば
ビオチン化）、エピトープタグとの融合を包含する。方
法は、ＥＬＩＳＡを用いるアッセイ、免疫沈降およびシ
ンチレーション近接法を包含する。
【００２１】可溶性または膜結合ＴＲ１、ＴＲ３または
ＴＲ５を用いる、上記アッセイと同様のアッセイを用い
てＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５のさらなる天然リガンド
を同定し精製してもよい。これらのリガンドはレセプタ
ーのアゴニストまたはアンタゴニストであってもよい。
【００２２】よって、本発明は、 Ｉ． ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５に対するアゴニスト
またはアンタゴニストを同定する方法であって、（ａ）
標識または未標識のリガンドＴＬ３の存在下で候補化合
物をＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５それぞれと接触させ；
次いで（ｂ）該候補化合物がＴＬ３と競争してＴＲ１、
ＴＲ３またはＴＲ５それぞれに結合する能力を評価する
ことを含む方法。
【００２３】ＩＩ． ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５が宿
主細胞表面上、細胞膜上または固体支持体上にあるＩの
方法。
【００２４】ＩＩＩ． アゴニストを同定するためのＩ
Ｉの方法であって、候補化合物が細胞表面にあるＴＲ
１、ＴＲ３またはＴＲ５ポリペプチドにより発生したシ
グナルに影響するかどうかを決定することをさらに含
み、該シグナルの発生を促進する候補化合物がアゴニス
トであると同定される方法。
【００２５】ＩＶ． Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの方法によ
り同定されるアゴニスト。
【００２６】Ｖ． アンタゴニストを同定するためのＩ
Ｉの方法であって、候補化合物が細胞表面にあるＴＲ
１、ＴＲ３またはＴＲ５ポリペプチドにより発生したシ
グナルに影響するかどうかを決定することをさらに含
み、該シグナルの発生を抑制する候補化合物がアンタゴ
ニストであると同定される方法。
【００２７】ＶＩ． Ｉ、ＩＩまたはＶの方法により同
定されるアンタゴニスト。
【００２８】ＶＩＩ． ＴＬ３に対するアゴニストまた
はアンタゴニストを同定する方法であって、（ａ）標識
または未標識のＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５それぞれの
存在下で候補化合物をＴＬ３と接触させ；次いで（ｂ）
該候補化合物がＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５それぞれと
競争してＴＬ３に結合する能力を評価することを含む方
法。
【００２９】ＶＩＩＩ． ＴＬ３が宿主細胞表面上、細
胞膜上または固体支持体上にある請求項ＶＩＩの方法。
【００３０】ＩＸ アゴニストを同定するための請求項
ＶＩＩＩの方法であって、候補化合物が細胞表面にある
ＴＬ３ポリペプチドにより発生したシグナルに影響する
かどうかを決定することをさらに含み、該シグナルの発
生を促進する候補化合物がアゴニストであると同定され
る方法。
【００３１】Ｘ． 請求項ＩＸの方法により同定される
アゴニスト。
【００３２】ＸＩ アンタゴニストを同定するための請
求項ＶＩＩＩの方法であって、候補化合物が細胞表面に
あるＴＬ３ポリペプチドにより発生したシグナルに影響
するかどうかを決定することをさらに含み、該シグナル
の発生を抑制する候補化合物がアンタゴニストであると
同定される方法。
【００３３】ＸＩＩ 請求項ＸＩの方法により同定され
るアンタゴニスト。
【００３４】よって、もう１つの態様において、本発明
は、ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３ポリペプチ
ドに関するアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド、レ
セプター、基質、酵素等を同定するためのスクリーニン
グキットであって、 （ａ）ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３ポリペプ
チド、好ましくは配列番号：１、２、３または４のポリ
ペプチド； （ｂ）ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３ポリペプ
チド、好ましくは配列番号：１、２、３または４のポリ
ペプチドを発現する組み換え細胞； （ｃ）ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３ポリペプ
チド、好ましくは配列番号：１、２、３または４のポリ
ペプチドを発現する細胞膜；または （ｄ）ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３ポリペプ
チド、好ましくは配列番号：１、２、３または４のポリ
ペプチドに対する抗体 を含むキットに関する。かかるキットにおいて（ａ）、
（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が重要成分を含んでいても
よいことが理解されよう。
【００３５】予防および治療方法 本発明は、過剰または不十分な量のＴＲ１、ＴＲ３、Ｔ
Ｒ５、またはＴＬ３ポリペプチド活性に関連する異常な
状態の治療方法を提供する。ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、
またはＴＬ３ポリペプチド活性が過剰な場合、いくつか
の方法を用いることができる。１の方法は、有効量の上
記阻害剤化合物（アンタゴニスト）を医薬上許容される
担体とともに対象に投与して、ＴＲ１、ＴＲ３またはＴ
Ｒ５ポリペプチドへのリガンドの結合をブロックするこ
とあるいは第２のシグナルを阻害することにより活性化
を阻害し、そのことにより異常な状態を改善することを
含む。
【００３６】もう１つのアプローチにおいて、内在性Ｔ
Ｒ１、ＴＲ３またはＴＲ５ポリペプチドと競争してリガ
ンドに結合する能力をやはり有している可溶性形態のＴ
Ｒ１、ＴＲ３またはＴＲ５ポリペプチドを投与してもよ
い。かかる競争物質の典型的な具体例はＴＲ１、ＴＲ３
またはＴＲ５ポリペプチドのフラグメントを含む。
【００３７】ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３お
よびその活性の発現不足に関連する異常な症状の治療に
は、いくつかの方法が用いられる。１のアプローチは、
ＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３を活性化する治
療上有効量の化合物（すなわち上記アゴニスト）を医薬
上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常
な状態を改善することを含む。
【００３８】処方および投与 可溶性形態のＴＲ１、ＴＲ３、ＴＲ５、またはＴＬ３ポ
リペプチドのごときペプチド、ならびにアゴニストおよ
びアンタゴニストペプチドまたは小型分子を、適当な医
薬担体と組み合わせて処方してもよい。かかる処方は、
治療上有効量のポリペプチドまたは化合物、および医薬
上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体とし
ては、セイライン、緩衝化セイライン、デキストロー
ス、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混
合物が挙げられるが、これらに限らない。処方は投与経
路に適したものとすべきであり、当業者によく知られて
いる。さらに本発明は、上記本発明成分の１種またはそ
れ以上を充填した、１個またはそれ以上の容器を含む医
薬パックおよびキットにも関する。
【００３９】本発明ポリペプチドおよび他の化合物を単
独で使用してもよく、あるいは治療化合物のごとき他の
化合物と一緒に使用してもよい。医薬組成物の全身投与
の好ましい形態は、注射、典型的には静脈注射を包含す
る。皮下、筋肉内または腹腔内のごとき他の注射経路を
用いることもできる。全身投与のための別の手段は、胆
汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のごとき
浸透剤を用いる経粘膜または経皮投与を包含する。さら
に、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるな
らば、経口投与も可能である。これらの化合物の投与は
局所的なものであってもよく、膏薬、パスタ、ゲル等の
形態であってもよい。
【００４０】必要な用量範囲は、ペプチド、投与経路、
処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断
による。しかしながら、適当な用量は対象の体重１ｋｇ
あたり０．１ないし１００μｇの範囲である。しかしな
がら、種々の使用化合物および種々の投与経路のさまざ
まな有効性を考慮すれば、必要な用量は広範囲なものと
思われる。例えば、経口投与には静脈注射よりも多い用
量が必要であると考えられる。当該分野においてよく知
られた最適化のための標準的な常套的実験を用いてこれ
らの用量の変更を行うことができる。
【００４１】特記しないかぎり、当業者によく知られた
標準的方法を用いて下記実施例を行う。実施例は本発明
を例示説明するものであり、本発明を限定するものでは
ない。
【００４２】
【実施例】ＴＬ３、ＴＲ１、ＴＲ３およびＴＲ５の発現
ならびにこれらに関するレセプターリガント対合の測定
を以下に説明する。ＴＲ１はオステオプロテゲリンとし
ても知られている（Simonet et al., Cell 89: 309-319
(1997)）。ＴＲ３はＤＲ３、Ａｐｏ３またはＷＳＬ−
１またはＬＡＲＤとしても知られている（Chinnaiyan,
A. M. et al., Science 274: 990-992 (1996); Marster
s, S. A. et al., Curr. Biol. 6: 1669-1676 (1996);
Kitson, J. et al. Nature 384: 372-375 (1996); Scre
aton, G. R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 815-818
(1997); Sheridan et al., Science 277: 818-820 (19
97)）。
【００４３】発現 いずれかのレセプターの細胞外ドメインがそのアミノ末
端においてヒトＩｇＧ１のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３領域
と融合している融合蛋白としてＴＲ１、ＴＲ３およびＴ
Ｒ５を発現させた。２つの蛋白ドメインのジャンクショ
ンを加工して因子Ｘａにより蛋白分解されるアミノ酸配
列を含むようにした。哺乳動物細胞においてこの形態で
発現される場合、ＴＲ融合蛋白（それぞれＴＲ１Ｆｃ、
ＴＲ３ＦｃおよびＴＲ５Ｆｃ）は二量体蛋白として分泌
され、これをプロテインＡセファロースにより精製し
た。ウシ因子ＸａとのインキュベーションによりＴＲ１
Ｆｃ、ＴＲ３ＦｃまたはＴＲ５Ｆｃ融合物から未融合可
溶性レセプターを得て、プロテインＡセファロースに通
し、素通り画分をプールすることによりＦｃ部分から精
製した。ＴＬ３はタイプＩＩの膜蛋白であり、そのＣ末
端が細胞外にある。カルボキシ末端領域の重要部分をコ
ードしているＤＮＡであって成熟ＴＮＦに対して相同的
な残基のすべてを含んでいるＤＮＡが分泌、検出および
精製のためにアミノ末端エピトープタグ配列ならびにア
ミノ末端疎水性シグナル配列に融合している発現ＤＮＡ
構築物を加工することにより、これらを分泌融合蛋白と
して発現させた。哺乳動物細胞中にトランスフェクショ
ンする場合、これらのＤＮＡ構築物は可溶性かつエピト
ープタグを付された融合蛋白（ｓＴＬ３）を生じた。各
発現ベクターの構築物の個々の詳細を以下に述べる。
【００４４】ＴＲ１ 疎水性度プロットによれば、ＴＲ１の配列は膜貫通領域
を示さなかった（Goldmanら、上記ＴＲ２参照）。それ
ゆえ、ＴＲ１の全コーディング領域からターミネーター
コドンを除いたものを用いてＦｃ融合構築物を製造し
た。ＴＲ２Ｆｃｌｉｎｋ中のＴＲ２インサートをＴＲ１
で置換した。ＴＲ２ＦｃＬｉｎｋはＴＲ２のアミノ酸１
〜１９２、その後にある因子Ｘａ開裂に関するアミノ酸
ＲＳＩＥＧＲＧＴ、その後にあるヒトＩｇＧ１の残基２
２６〜４５８（最後）をコードしている。さらにＩｇＧ
１領域はＣｙｓ２３０のＡｌａへの変異を有している。
下記プライマーを用いてＴＲ１の３’末端をＴＲ１ ｃ
ＤＮＡから増幅した。５’cgccccttgccctgaccacta ３’
（配列番号：５）（ＨｉｎｄＩＩＩ部位の上流）および
５’gccatttcagatcttaagcagcttatttttactga ３’（配列
番号：６）（ＢｇｌＩＩ部位を伴うストップコドンを置
換）。ＰＣＲ生成物をｐＣＲ２（Invitrogen;ｐＣＲ２
ＴＲ１）中にクローン化し、配列決定した。ＴＲ２Ｆｃ
ｌｉｎｋをＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩおよび子ウシ腸ホス
ファターゼで消化し、次いで、ＴＲ１ｃＤＮＡのＥｃｏ
ＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントおよびｐＣＲ２ＴＲ
１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢｇｌＩＩフラグメントと連結し
てＴＲ１Ｆｃｌｉｎｋを得た。ＴＲ１Ｆｃｌｉｎｋを用
いてＣＯＳ細胞を一時的にトランスフェクションし、得
られた上清をプロテインＡアガロースを用いて免疫沈降
させた。ヤギ抗−ヒトＦｃ抗体を用いる免疫沈降物のウ
ェスタンブロット分析により、糖鎖付加されたＴＲ１Ｆ
ｃの予想サイズと矛盾しない強いバンドが得られた。Ｔ
Ｒ２Ｆｃｌｉｎｋを用いてＣＨＯ細胞をトランスフェク
ションして安定な細胞系を得た。エクスパンジョン（ex
pansion）に関するドットブロット分析により５つの細
胞系を選択し、フラスコに入れて振盪した。最高レベル
でＴＲ２Ｆｃ蛋白を発現する細胞系をウェスタンブロッ
ト分析により選択した。
【００４５】ＴＲ３ 下記の２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用い
て、ＴＲ３の細胞外ドメインを全長ＴＲ３ ｃＤＮＡか
らＰＣＲ増幅した：５’gccaccatggaacaacgccctagaggat
gtgctgccgtggccgccgcgctcctcctggtgctgct ３’（配列番
号：７）； ５’tggacccaagatctctgcctccatccacag
３’（配列番号：８）。ＰＣＲ生成物をｐＣＲ２．１
（Invitrogen）中にクローンし、配列決定により確認し
た。このプラスミドのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメ
ントをＴＲ２ＦｃｌｉｎｋのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩベ
クターフラグメント中にサブクローンし、ＴＲ２フラグ
メントを置換して（このプラスミドの説明については上
記ＴＲ１のところ参照）ＴＲ３Ｆｃｌｉｎｋを得た。Ｔ
Ｒ３Ｆｃｌｉｎｋクローンを制限酵素消化により確認し
た。クローンＴＲ３ＦｃｌｉｎｋＣＯＳ細胞中に一時的
にトランスフェクションし、ついで、得られた上清の免
疫沈降およびウェスタン分析を行って約５５ｋＤの単一
バンドを得た。ＣＨＯ細胞のトランスフェクションによ
り類似の蛋白が発現され、プロテインＧセファロースク
ロマトグラフィーにより精製した。
【００４６】ＴＲ５ ２つの合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＴＲ
５の細胞外ドメインをＰＣＲ増幅した：５’gccgccgaga
tgcaaggggt ３’（配列番号：９）および５’atggtgcaa
gatctgtaatgagaagagg ３’（配列番号：１０）。予想配
列を有するクローンのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメ
ントをＴＲ２ＦｃｌｉｎｋのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフ
ラグメント中にサブクローンし、ＴＲ２インサートを置
換し、生成物をＴＲ５Ｆｃｌｉｎｋと呼んだ。ＴＲ５Ｆ
ｃｌｉｎｋクローンを制限酵素消化により確認した。ク
ローンＴＲ５ＦｃｌｉｎｋのＣＯＳ細胞中への一時的ト
ランスフェクション、ついで、得られた上清の免疫沈降
およびウェスタンブロット分析を行ったところ、予想サ
イズ５６．６ｋＤよりも大きいバンドが得られ、蛋白が
おそらく糖鎖付加されていることが示された。同じプラ
スミドをＣＨＯ細胞中にトランスフェクションして同様
の生成物を得た。
【００４７】ＴＬ３ 可溶性形態のＴ３蛋白をＣＨＯ細胞から発現させるため
に哺乳動物発現ベクターを構築した。推定上の膜貫通領
域の直後から開始しＣ末端で終わるＰＣＲにより、ＴＬ
３蛋白のｃＤＮＡフラグメントを得た。これはアミノ酸
残基５１から（ＱＱＴＥＬＱから）２５０まで（ＧＦＶ
ＫＬまで）に対応する。検出および精製、ならびに成熟
タグなし蛋白の生成に容易なように６個のＨｉｓ残基お
よび因子Ｘａ開裂部位が後に続いている抗−ｇｐ１２０
ｍＡｂエピトープにより、その遺伝子のアミノ末端に
タグを付した。このＴＬ３融合蛋白遺伝子をコードする
ＰＣＲフラグメントの両末端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏ
ＲＶ部位を作成して、ｔＰＡリーダーペプチドおよびＣ
ＭＶプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターｐＣＤＴ
Ｎ中へのサブクローニングを容易ならしめた。ベクター
をＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞の両方の中にトランスフ
ェクションし、Ｎｉ−ＮＴＡによる細胞培地からの沈
殿、ついでＴＬ３に結合したｇｐ１２０エピトープペプ
チドに対するモノクローナル抗体を用いる免疫ブロッテ
ングにより分泌ＴＬ３蛋白の発現を確認した。ＴＬ３の
蛋白バンドは〜３２ｋＤａと思われ、ＴＬ３蛋白につい
て計算された分子量は２５ｋＤａである。ＴＬ３蛋白の
観察された分子量と計算された分子量との間の相違は蛋
白の糖鎖付加による可能性がある。ＣＨＯ細胞における
大規模なＴＬ３発現の間に、ＴＬ３は開裂されて１８ｋ
Ｄａの蛋白になることがわかった。アミノ末端配列決定
により、この蛋白が両方のエピトープタグおよび７９個
のＮ末端アミノ酸を失って、アミノ酸残基ＡＶＬＴＱＫ
から開始する蛋白になったことが示された。この１８ｋ
Ｄａの蛋白をＴＬ３機能の特徴づけに使用した。
【００４８】結合の研究 レセプター沈降 我々は、溶液中でＴＬ３を沈降させるＴＲ１Ｆｃおよび
ＴＲ２Ｆｃの能力を試験し、次いで、融合エピトープタ
グ、リガンドまたはリガンド自身に対する抗体を用いる
ウェスタンブロットにおいてリガンドの検出を行った。
典型的な実験において、２μｇのＴＲ１ＦｃまたはＴＲ
２Ｆｃレセプターを、結合バッファー（ＲＰＭＩ１６４
０中２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、０．１％ ＢＳ
Ａ、０．０１％ツイン）中で２５０ｎｇの精製ＴＬ３と
ともにインキュベーションした。４時間結合後、レセプ
ター複合体をプロテインＡセファロース上に捕捉し、遠
心分離し、結合バッファーで洗浄し、１５％ ＳＤＳ Ｐ
ＡＧＥで電気泳動し、次いで、ウェスタンブロッティン
グに移した。発現されたＴＬ３に対して生成したマウス
ポリクローナル抗血清の１：５０００希釈物によりＴＬ
３を検出し、ＣＨＯ細胞上清から上記のごとく精製し、
これがＴＲ１Ｆｃ、ＴＲ３ＦｃおよびＴＲ５Ｆｃに結合
するが、他のＴＮＦＲ関連Ｆｃ融合蛋白には結合しない
ことを見いだした。別法として、精製ＴＬ３蛋白をＩ−
１２５により標識し、１．５ｘ１０5ｃｐｍの標識ＴＬ
３（最終濃度＝〜１ｎＭ）を２μｇの各精製蛋白（ＴＲ
１−Ｆｃ、ＴＲ１−Ｆｃ（１０μｇのＴＲ１を伴う）、
ＴＲ２−Ｆｃ、ＴＲ３−ＦｃおよびＴＲ６−Ｆｃ）また
はＴＲ５−Ｆｃ含有ＣＯＳ培地とともに０℃で一晩イン
キュベーションし、ついでプロテインＡ−セファロース
沈殿を行った。ペレットを洗浄し、１４％ ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで泳動した。乾燥ゲルをＸ線フィルムにさらし
た。Ｉ−１２５標識ＴＬ３蛋白はＴＲ１−Ｆｃにより沈
殿し、Ｆｃのない過剰のＴＲ１により競争されることが
わかった。
【００４９】この実施例セクションにおいて引用した文
献は以下のものである。 １．Engelman-DM; Steitz-TA; Goldman-A. Identifying
nonpolar transbilayerhelices in amino acid sequen
ces of membrane proteins. Annu-Rev-Biophys-Chem. 1
986; 15: 321-53. ２．Johanson-K; Appelbaum-E; Doyle-M; Hensley-P; Z
hao-B; Abdel-Meguid-SS; Young-P;Cook-R; Carr-SMati
co-R et-al. Binding interactions of human interleu
kin 5 with its receptor alpha subunit. Large scale
production, structural, and functional studies of
Drosophila-expressed recombinant proteins. J-Biol
-Chem. 1995 Apr 21; 270(16): 9459-71. ３．Kumar-S; Minnich-MD; Young-PR. ST2/T1 protein
functionally binds totwo secreted proteins from Ba
lb/c 3T3 and human umbilical vein endothelial cell
s but does not bind interleukin 1. J-Biol-Chem. 19
95 Nov 17; 270(46): 27905-13. ４．Johnsson,B., Lofas,S. and Lindquist,G. (1991).
Immobilization of proteins to a karboxymethyldext
ran-modified gold surface for biospecific interact
ion analysis in surface plasmon resonance sensors.
Anal. Biochem.198: 268-277.
【００５０】
【配列表】<110> McDonnell, Peter Young, Peter Zou, Jun <120> 腫瘍壊死関連レセプターＴＲ１、ＴＲ３およびＴ
Ｒ５についてのアゴニストおよびアンタゴニストを同定
する方法 <130> GH50031 <140> 未定 <141> これと一緒 <150> 60/061,334 <151> 1997-10-08 <160> 11 <170> Windows用FastSEQ バージョン3.0
【００５１】<210> 1 <211> 401 <212> PRT <213> 不明 <400> 1 Met Asn Lys Leu Leu Cys Cys Ala Leu Val Phe Leu Asp Ile Ser Ile 1 5 10 15 Lys Trp Thr Thr Gln Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp 20 25 30 Glu Glu Thr Ser His Gln Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr 35 40 45 Tyr Leu Lys Gln His Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Val Cys Ala Pro 50 55 60 Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys 65 70 75 80 Leu Tyr Cys Ser Pro Val Cys Lys Glu Leu Gln Tyr Val Lys Gln Glu 85 90 95 Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Val Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr 100 105 110 Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe 115 120 125 Gly Val Val Gln Ala Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Val Cys Lys Arg 130 135 140 Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys 145 150 155 160 Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Val Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gln Lys 165 170 175 Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr 180 185 190 Gln Lys Cys Gly Ile Asp Val Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg 195 200 205 Phe Ala Val Pro Thr Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Val Leu Val 210 215 220 Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Val Asn Ala Glu Ser Val Glu Arg Ile 225 230 235 240 Lys Arg Gln His Ser Ser Gln Glu Gln Thr Phe Gln Leu Leu Lys Leu 245 250 255 Trp Lys His Gln Asn Lys Asp Gln Asp Ile Val Lys Lys Ile Ile Gln 260 265 270 Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser Val Gln Arg His Ile Gly His Ala 275 280 285 Asn Leu Thr Phe Glu Gln Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly 290 295 300 Lys Lys Val Gly Ala Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys 305 310 315 320 Pro Ser Asp Gln Ile Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn 325 330 335 Gly Asp Gln Asp Thr Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser 340 345 350 Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr Val Thr Gln Ser Leu Lys Lys Thr 355 360 365 Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gln Lys Leu 370 375 380 Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gln Val Gln Ser Val Lys Ile Ser Cys 385 390 395 400 Leu
【００５２】<210> 2 <211> 417 <212> PRT <213> 不明 <400> 2 Met Glu Gln Arg Pro Arg Gly Cys Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Leu Leu Gly Ala Arg Ala Gln Gly Gly Thr Arg Ser Pro Arg 20 25 30 Cys Asp Cys Ala Gly Asp Phe His Lys Lys Ile Gly Leu Phe Cys Cys 35 40 45 Arg Gly Cys Pro Ala Gly His Tyr Leu Lys Ala Pro Cys Thr Glu Pro 50 55 60 Cys Gly Asn Ser Thr Cys Leu Val Cys Pro Gln Asp Thr Phe Leu Ala 65 70 75 80 Trp Glu Asn His His Asn Ser Glu Cys Ala Arg Cys Gln Ala Cys Asp 85 90 95 Glu Gln Ala Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Cys Ser Ala Val Ala Asp 100 105 110 Thr Arg Cys Gly Cys Lys Pro Gly Trp Phe Val Glu Cys Gln Val Ser 115 120 125 Gln Cys Val Ser Ser Ser Pro Phe Tyr Cys Gln Pro Cys Leu Asp Cys 130 135 140 Gly Ala Leu His Arg His Thr Arg Leu Leu Cys Ser Arg Arg Asp Thr 145 150 155 160 Asp Cys Gly Thr Cys Leu Pro Gly Phe Tyr Glu His Gly Asp Gly Cys 165 170 175 Val Ser Cys Pro Thr Ser Thr Leu Gly Ser Cys Pro Glu Arg Cys Ala 180 185 190 Ala Val Cys Gly Trp Arg Gln Met Phe Trp Val Gln Val Leu Leu Ala 195 200 205 Gly Leu Val Val Pro Leu Leu Leu Gly Ala Thr Leu Thr Tyr Thr Tyr 210 215 220 Arg His Cys Trp Pro His Lys Pro Leu Val Thr Ala Asp Glu Ala Gly 225 230 235 240 Met Glu Ala Leu Thr Pro Pro Pro Ala Thr His Leu Ser Pro Leu Asp 245 250 255 Ser Ala His Thr Leu Leu Ala Pro Pro Asp Ser Ser Glu Lys Ile Cys 260 265 270 Thr Val Gln Leu Val Gly Asn Ser Trp Thr Pro Gly Tyr Pro Glu Thr 275 280 285 Gln Glu Ala Leu Cys Pro Gln Val Thr Trp Ser Trp Asp Gln Leu Pro 290 295 300 Ser Arg Ala Leu Gly Pro Ala Ala Ala Pro Thr Leu Ser Pro Glu Ser 305 310 315 320 Pro Ala Gly Ser Pro Ala Met Met Leu Gln Pro Gly Pro Gln Leu Tyr 325 330 335 Asp Val Met Asp Ala Val Pro Ala Arg Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg 340 345 350 Thr Leu Gly Leu Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Val Glu Val Glu Ile 355 360 365 Gly Arg Phe Arg Asp Gln Gln Tyr Glu Met Leu Lys Arg Trp Arg Gln 370 375 380 Gln Gln Pro Ala Gly Leu Gly Ala Val Tyr Ala Ala Leu Glu Arg Met 385 390 395 400 Gly Leu Asp Gly Cys Val Glu Asp Leu Arg Ser Arg Leu Gln Arg Gly 405 410 415 Pro
【００５３】<210> 3 <211> 299 <212> PRT <213> 不明 <400> 3 Met Gln Gly Val Lys Glu Arg Phe Leu Pro Leu Gly Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 Arg Ala Pro Arg Pro Pro Asp Gly Arg Gly Arg Val Arg Pro Arg Thr 20 25 30 Gln Asp Gly Val Gly Asn His Thr Met Ala Arg Ile Pro Lys Thr Leu 35 40 45 Lys Phe Val Val Val Ile Val Ala Val Leu Leu Pro Val Leu Ala Tyr 50 55 60 Ser Ala Thr Thr Ala Arg Gln Glu Glu Val Pro Gln Gln Thr Val Ala 65 70 75 80 Pro Gln Gln Gln Arg His Ser Phe Lys Gly Glu Glu Cys Pro Ala Gly 85 90 95 Ser His Arg Ser Glu His Thr Gly Ala Cys Asn Pro Cys Thr Glu Gly 100 105 110 Val Asp Tyr Thr Asn Ala Ser Asn Asn Glu Pro Ser Cys Phe Pro Cys 115 120 125 Thr Val Cys Lys Ser Asp Gln Lys His Lys Ser Ser Cys Thr Met Thr 130 135 140 Arg Asp Thr Val Cys Gln Cys Lys Glu Gly Thr Phe Arg Asn Glu Asn 145 150 155 160 Ser Pro Glu Met Cys Arg Lys Cys Ser Arg Cys Pro Ser Gly Glu Val 165 170 175 Gln Val Ser Asn Cys Thr Ser Trp Asp Asp Ile Gln Cys Val Glu Glu 180 185 190 Phe Gly Ala Asn Ala Thr Val Glu Thr Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met 195 200 205 Asn Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Asn 210 215 220 Thr Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr 225 230 235 240 Ser Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr Ser 245 250 255 Pro Gly Thr Pro Ala Pro Ala Ala Glu Glu Thr Met Thr Thr Ser Pro 260 265 270 Gly Thr Pro Ala Ser Ser His Tyr Leu Ser Cys Thr Ile Val Gly Ile 275 280 285 Ile Val Leu Ile Val Leu Leu Ile Val Phe Val 290 295
【００５４】<210> 4 <211> 250 <212> PRT <213> 不明 <400> 4 Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly 1 5 10 15 Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu 35 40 45 Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg 50 55 60 Leu Gln Arg Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp 65 70 75 80 Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn 85 90 95 Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys 100 105 110 Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys 115 120 125 Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg 130 135 140 Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala 145 150 155 160 Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe 165 170 175 Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr 180 185 190 Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr 195 200 205 Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile 210 215 220 Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro 225 230 235 240 His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu 245 250
【００５５】<210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> 不明 <400> 5 cgccccttgc cctgaccact a 21
【００５６】<210> 6 <211> 35 <212> RNA <213> 不明 <400> 6 gccatttcag atcttaagca gcttattttt actga 35
【００５７】<210> 7 <211> 65 <212> RNA <213> 不明 <400> 7 gccaccatgg aacaacgccc tagaggatgt gctgccgtgg ccgccgcgct cctcctggtg 60 ctgct 65
【００５８】<210> 8 <211> 35 <212> RNA <213> 不明 <400> 8 tggacccaag atctctgcct ccatccacag acagc 35
【００５９】<210> 9 <211> 27 <212> RNA <213> 不明 <400> 9 gccgccgaga tgcaaggggt gaaggag 27
【００６０】<210> 10 <211> 28 <212> RNA <213> 不明 <400> 10 atggtgcaag atctgtaatg agaagagg 28
【００６１】<210> 11 <211> 1717 <212> DNA <213> 不明 <400> 11 acctctgtcc ttagagggga ctggaaccta attctcctga gcctgaggga gggtggaggg 60 tctcaagaca acgctgtccc cacgacggag tgccaggagc actaacagta cccttagatt 120 gctttcctcc tccctccttt tttattttca agttcctttt tatttctcct tgcgtaacaa 180 ccttcttccc ttctgcacca ctgcccgtac ccttacccgc gccgccacct ccttgctaca 240 ccactcttga aaccacagct gttggcaggg tcccccagct catgccagcc tcatctcctt 300 tcttgctagc ccccaaaggg cctccaggca acatgggggg cccagtcaga gagccggcac 360 tctcagttgc cctctggttg agttgggggg cagctctggg ggccgtggct tgtgccatgg 420 ctctgctgac ccaacaaaca gagctgcaga gcctcaggag agaggtgagc cggctgcaga 480 ggacaggagg cccctcccag aatggggaag ggtatccctg gcagagtctc ccggagcaga 540 gttccgatgc cctggaagcc tgggagaatg gggagagatc ccggaaaagg agagcagtgc 600 tcacccaaaa acagaagaag cagcactctg tcctgcacct ggttcccatt aacgccacct 660 ccaaggatga ctccgatgtg acagaggtga tgtggcaacc agctcttagg cgtgggagag 720 gcctacaggc ccaaggatat ggtgtccgaa tccaggatgc tggagtttat ctgctgtata 780 gccaggtcct gtttcaagac gtgactttca ccatgggtca ggtggtgtct cgagaaggcc 840 aaggaaggca ggagactcta ttccgatgta taagaagtat gccctcccac ccggaccggg 900 cctacaacag ctgctatagc gcaggtgtct tccatttaca ccaaggggat attctgagtg 960 tcataattcc ccgggcaagg gcgaaactta acctctctcc acatggaacc ttcctggggt 1020 ttgtgaaact gtgattgtgt tataaaaagt ggctcccagc ttggaagacc agggtgggta 1080 catactggag acagccaaga gctgagtata taaaggagag ggaatgtgca ggaacagagg 1140 cgtcttcctg ggtttggctc cccgttcctc acttttccct tttcattccc accccctaga 1200 ctttgatttt acggatatct tgcttctgtt ccccatggag ctccgaattc ttgcgtgtgt 1260 gtagatgagg ggcgggggac gggcgccagg cattgtccag acctggtcgg ggcccactgg 1320 aagcatccag aacagcacca ccatctagcg gccgctctag aggatccctc gaggggccca 1380 agcttacgcg tgcatgcgac gtcatagctc tctccctata gtgagtcgta ttataagcta 1440 gcttgggatc tttgtgaagg aaccttactt ctgtggtgtg acataattgg acaaactacc 1500 tacagagatt taaagctcta aggtaaatat aaaattttta agtgtataat gtgttaaact 1560 agctgcatat gcttgctgct tgagagtttg gcttactgag tatgattatg aaaatattat 1620 acacaggagc tagtgatcta tgttggtttt agatcaagcc aaggtcattc aggcctcagc 1680 tcaagctgtc atgatcatat cagcatacaa ttgtgag 1717
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ａ６１Ｋ 31/00 ６０１ Ａ６１Ｋ 31/00 ６０１ ６０９ ６０９ ６０９Ｆ ６１１ ６１１ ６１７ ６１７Ｅ ６１９ ６１９Ａ ６１９ ６２５ ６２５Ｂ ６２６ ６２６Ｎ ６２９ ６２９ ６３１ ６３１Ｂ ６３１ ６３５ ６３５ ６３７ ６３７Ｄ ６３７Ｃ 38/00 39/395 Ｄ 39/395 Ｎ 45/00 45/00 37/02 (72)発明者 ピーター・アール・ヤング アメリカ合衆国08648ニュージャージー州 ローレンスビル、ヘンドリクソン・ロード 32番 (72)発明者 ジュン・ゾウ アメリカ合衆国19002ペンシルベニア州メ イプル・グレン、ソーンベリー・ドライブ 1833番

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５に対するア
    ゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法であっ
    て、 （ａ）標識または未標識のリガンドＴＬ３の存在下で候
    補化合物をＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５それぞれと接触
    させ；次いで（ｂ）該候補化合物がＴＬ３と競争してＴ
    Ｒ１、ＴＲ３またはＴＲ５それぞれに結合する能力を評
    価することを含む方法。
  2. 【請求項２】 ＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５が宿主細胞
    表面上、細胞膜上または固体支持体上にある請求項１の
    方法。
  3. 【請求項３】 アゴニストを同定するための請求項２の
    方法であって、候補化合物が細胞表面にあるＴＲ１、Ｔ
    Ｒ３またはＴＲ５ポリペプチドにより発生したシグナル
    に影響を及ぼすかどうかを決定することをさらに含み、
    該シグナルの発生を促進する候補化合物がアゴニストで
    あると同定される方法。
  4. 【請求項４】 請求項１、２または３の方法により同定
    されるアゴニスト。
  5. 【請求項５】 アンタゴニストを同定するための請求項
    ２の方法であって、候補化合物が細胞表面にあるＴＲ
    １、ＴＲ３またはＴＲ５ポリペプチドにより発生したシ
    グナルに影響するかどうかを決定することをさらに含
    み、該シグナルの発生を抑制する候補化合物がアンタゴ
    ニストであると同定される方法。
  6. 【請求項６】 請求項１、２または５の方法により同定
    されるアンタゴニスト。
  7. 【請求項７】 ＴＬ３に対するアゴニストまたはアンタ
    ゴニストを同定する方法であって、 （ａ）標識または未標識のＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５
    の存在下で候補化合物をＴＬ３と接触させ；次いで
    （ｂ）該候補化合物がＴＲ１、ＴＲ３またはＴＲ５と競
    争してＴＬ３に結合する能力を評価することを含む方
    法。
  8. 【請求項８】 ＴＬ３が宿主細胞表面上、細胞膜上また
    は固体支持体上にある請求項７の方法。
  9. 【請求項９】 アゴニストを同定するための請求項８の
    方法であって、候補化合物が細胞表面にあるＴＬ３ポリ
    ペプチドにより発生したシグナルに影響するかどうかを
    決定することをさらに含み、該シグナルの発生を促進す
    る候補化合物がアゴニストであると同定される方法。
  10. 【請求項１０】 請求項７、８、および９の方法により
    同定されるアゴニスト。
  11. 【請求項１１】 アンタゴニストを同定するための請求
    項８の方法であって、候補化合物が細胞表面にあるＴＬ
    ３ポリペプチドにより発生したシグナルに影響するかど
    うかを決定することをさらに含み、該シグナルの発生を
    抑制する候補化合物がアンタゴニストであると同定され
    る方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１１の方法により同定されるア
    ンタゴニスト。
  13. 【請求項１３】 ＴＲ１に対するアゴニストまたはアン
    タゴニストの同定のための請求項１の方法であって、 （ａ）標識または未標識のリガンドＴＬ３の存在下で候
    補化合物をＴＲ１と接触させ；ついで（ｂ）ＴＬ３のＴ
    Ｒ１への結合と競争する該候補化合物の能力を評価する
    ことを含む方法。
  14. 【請求項１４】 ＴＲ１が宿主細胞の表面上、細胞膜上
    または固体支持体上にある請求項１３の方法。
  15. 【請求項１５】 候補化合物が細胞表面にあるＴＲ１ポ
    リペプチドにより生じたシグナルに影響するかどうかを
    決定することをさらに含むアゴニスト同定のための請求
    項１４の方法であって、該シグナルの発生を促進する候
    補化合物がアゴニストであると同定される方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１３、１４または１５の方法に
    より同定されるアゴニスト。
  17. 【請求項１７】 候補化合物が細胞表面にあるＴＲ１ポ
    リペプチドにより生じたシグナルに影響するかどうかを
    決定することをさらに含むアンタゴニスト同定のための
    請求項１４の方法であって、該シグナルの発生を抑制す
    る候補化合物がアンタゴニストであると同定される方
    法。
  18. 【請求項１８】 請求項１３、１４または１７の方法に
    より同定されるアンタゴニスト。
  19. 【請求項１９】 ＴＬ３に対するアゴニストまたはアン
    タゴニストの同定のための請求項７の方法であって、 （ａ）標識または未標識ＴＲ１の存在下で候補化合物を
    ＬＴ３と接触させ；ついで（ｂ）ＴＲ１のＴＬ３への結
    合と競争する該候補化合物の能力を評価することを含む
    方法。
  20. 【請求項２０】 ＴＬ３が宿主細胞の表面、細胞膜上ま
    たは固体支持体上にある請求項１９の方法。
  21. 【請求項２１】 候補化合物が細胞表面にあるＴＬ３ポ
    リペプチドにより生じたシグナルに影響するかどうかを
    決定することをさらに含むアゴニスト同定のための請求
    項２０の方法であって、該シグナルの発生を促進する候
    補化合物がアゴニストであると同定される方法。
  22. 【請求項２２】 請求項１９、２０、または２１の方法
    により同定されるアゴニスト。
  23. 【請求項２３】 候補化合物が細胞表面にあるＴＬ３ポ
    リペプチドにより生じたシグナルに影響するかどうかを
    決定することをさらに含むアンタゴニスト同定のための
    請求項２０の方法であって、該シグナルの発生を抑制す
    る候補化合物がアンタゴニストであると同定される方
    法。
  24. 【請求項２４】 請求項１９、２０、または２３の方法
    により同定されるアンタゴニスト。
JP32434798A 1997-10-08 1998-10-08 腫瘍壊死関連レセプターｔｒ１、ｔｒ３およびｔｒ５についてのアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法 Pending JPH11262393A (ja)

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