JPH11264824A - ヒトヘモグロビンの検出方法、ヒトヘモグロビン検出用物質の製造方法、ヒトヘモグロビン検出装置、トイレ装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒトヘモグロビンの溶液中での変性による抗
原性の低下を抑制し得るヒトヘモグロビンの安定化を利
用した、高感度且つ高精度なヒトヘモグロビンキャリブ
レーター溶液及びそれを利用した測定方法を提供する。 【解決手段】 ヒトヘモグロビンを特異的架橋試薬にて
α鎖同士、若しくはβ鎖同士を架橋したものをヘモグロ
ビン測定用のキャリブレーターとして利用する。未架橋
のヘモグロビンに対し、架橋ヘモグロビンはサブユニッ
トへの解離が起こらず、又、ヘムの酸化速度が減少し、
ヘムの酸化により引き起こされる変性速度が低下し、長
期に渡って安定な抗原抗体反応が持続する為、高感度、
高精度な抗原抗体反応が安定して得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトヘモグロビン
の検出方法、ヒトヘモグロビン検出用物質の製造方法、
ヒトヘモグロビン検出装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】潜血反応検査は、様々な疾病の診断や、
治療効果の判定に於いて利用されており、糞便や尿、或
は血液、胃液等の体液を対象として行われるが、近年、
大腸癌などの下部消化器疾病の検査法として、消化管出
血に起因する糞便中の潜血成分、特にヒトヘモグロビン
の検出が広く行われている。

【０００３】従来この潜血の測定には、便中のヘモグロ
ビンを抗ヘモグロビン抗体の結合した試薬を用い免疫反
応を利用して検出する方法が、迅速性及び簡便性で優れ
ていることから広く行われていた。そして、この検出に
用いる試薬にはヒトヘモグロビンを含む対象試薬が添付
され、この抗体結合試薬の活性の確認に用いられてい
た。

【０００４】ここで、ヒトヘモグロビンは、α鎖及びβ
鎖からなるヘムを含むポリペプチドが各々２個会合して
形成されるため、温度等の環境要因により容易に解離が
おこり、変性することが知られている。また、凍結乾燥
時であっても、ヘム鉄の酸化が起こって変成し、抗原活
性が低下することが知られている。

【０００５】特に、ヘモグロビンを標準品やコントロー
ル試薬に製剤化する場合、１包装単位当たりのヘモグロ
ビン含量は極めて微少であり、変成によるヘモグロビン
含量の変動が大きく、変成したヘモグロビンを含む標準
品やコントロール試薬を用いると測定値の誤差が大きく
なり、測定精度に欠けるという問題があった。

【０００６】このような問題を解決するためのヘモグロ
ビンの安定化方法として、特開平９ー６１４３１等で
は、アミノ酸類を含有させ、ヘム鉄の酸化を防止するこ
とにより、ヘム鉄酸化に基づくヘモグロビンの変成を抑
制している。

【０００７】また、特開平５ー２８１２２７、特開平８
ー２６２０２０等では鉄プロトポルフィリンまたはヒト
ヘモグロビン以外の鉄蛋白質を含有させ、同様にヘム鉄
の酸化に起因するヘモグロビンの変成を防止している。

【０００８】さらに、特開平８ー２４５４２１ではアル
ブミンとアミノ酸を含有させることにより同様の効果が
得られることを示している。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】以上の方法は、何れも
薬剤等の他成分の添加によってもたらされる効果であ
り、ヘモグロビン自身の安定化に起因するものではな
い。

【００１０】また、以上説明したのは、潜血反応検査に
おけるヒトヘモグロビンの検出についてであったが、糖
尿病検査におけるヒトヘモグロビンの検出についても同
様のことが言える。

【００１１】すなわち、糖尿病検査方法として、近年、
ヒトヘモグロビンとグルコースの非酵素的な結合物であ
るヒト糖化型ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ，ＨｂＡ１）量
を検出して、尿糖量を推定することが知られている。

【００１２】具体的には、血中でのヒトヘモグロビン
（ＨｂＡ、ＨｂＡ１、ＨｂＡ２、ＨｂＦ）に対するヒト
糖化型ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ，ＨｂＡ１）の割合を
測定するのであるが、このヒト糖化型ヘモグロビン（Ｈ
ｂＡ１ｃ，ＨｂＡ１）も経時的に変成して抗原活性が低
下するからである。

【００１３】本発明は、薬剤等の他成分の添加を行うこ
となく、測定精度に優れたヒトヘモグロビン検出方法、
ヒトヘモグロビン検出用物質、及びその製造方法を提供
することを第１の目的とする。

【００１４】また、ヒトヘモグロビン検出方法として、
溶液中のヒトヘモグロビン量を検出するセンサを用いる
ことも考えられるが、温度等の環境要因によりセンサ感
度の変動する場合があった。

【００１５】本発明は、溶液中のヒトヘモグロビン量を
検出するセンサを用いたヒトヘモグロビン検出方法、検
出装置において、センサ感度変動の影響を低減すること
を第２の目的とする。

【００１６】さらに本発明は、ヒトヘモグロビン等の尿
中に含まれる成分を、検査室以外でも簡単に検出できる
検出装置を提供することを第３の目的とする。

【００１７】

【課題を解決するための手段およびその作用・効果】本
発明では、ヒトヘモグロビンのサブユニット間を結合さ
せた物質を準備する第１の工程と、この物質量を検出す
る第２の工程と、を備えてなるヒトヘモグロビンの検出
方法を提供する。

【００１８】すなわち、ヒトヘモグロビンの経時的な変
性は、α鎖、β鎖からなるサブユニットの解離が一つの
原因であることが知られているが、本発明では、その原
因となるサブユニットを結合させるため、ヒトヘモグロ
ビン検出値の経時的な変化を可及的に低減できるのであ
る。

【００１９】尚、本発明のようにサブユニットを結合さ
せた物質を用いた場合、ヒトヘモグロビン自体の特性が
失われることが懸念されるが、代用血液の分野にて、β
１４２ーβ１４２をジブロモサリシルフマレート等の架
橋試薬により共有結合させた、いわゆる架橋ヘモグロビ
ンが用いられることからして、ヒトヘモグロビン自体の
特性が失われることはない。

【００２０】ちなみに、代用血液として架橋ヘモグロビ
ンが用いられるのは、４量体から２量体へ解離したヒト
ヘモグロビンが腎臓に問題をもたらすからであり、ま
た、このような代用血液では、特に温度に対する安定化
効果が認められている。

【００２１】本発明の実施形態としては、サブユニット
間を結合させるのはβ鎖間を結合させることが望まし
い。なぜならば、α鎖ーβ鎖間、α鎖ーα鎖間に比べ
て、β鎖ーβ鎖間が解離しやすいからである。

【００２２】また、サブユニット間の結合は、架橋によ
り結合すれば容易に実現できるが、架橋の位置として
は、α１ｌｙｓー９９ーα２ｌｙｓー９９、β１ｖａｌ
ー１ーβ２ｌｙｓー８２、β１ｌｙｓー８２ーβ２ｌｙ
ｓー８２、β１ｖａｌー１４６ーβ２ｖａｌー１４６等
を含み、反応はサブユニット間において高次構造上近接
した部位を特異的な試薬、若しくは遺伝子工学的にシス
テイン残基の導入等を導入することにより共有結合を形
成させたものである。

【００２３】具体的には架橋試薬としては、２−ｎｏｒ
−２−ｆｏｒｍｙｌｐｙｒｉｄｏｘａｌ−５’−ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ（ＮＦＰＬＦ），ｂｉｓ（３，５−ｄｉｂ
ｒｏｍｏｓａｌｉｃｙｌ）ｆｕｍａｒａｔｅ，ｆｕｍａ
ｒｙｌｂｉｓ（ｄｉｂｒｏｍｏａｓｐｉｒｉｎ），４，
４’−ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏｓｔｉｌｂｅｎｅ
−２，２’−ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ，ｂｉｓ（ｐｙｒ
ｉｄｏｘａｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ），ｂｉｓ（ｐｙｒｉ
ｄｏｘａｌｔｅｔｒａｐｈｏｓｐｈａｔｅ）等が含まれ
る。

【００２４】以上のヒトヘモグロビンの検出方法につい
て、具体的には、抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫
学的な手法を用いることが好適であるが、その他とし
て、蛋白質の紫外吸収に基づく蛋白質定量法による検
出、蛋白質への色素類の吸着に基づく吸光度変化による
検出、ヒトヘモグロビンに特有な波長に基づく定量法に
よる検出、ヒトヘモグロビンの有するパーオキシダーゼ
様活性に基づく定量法による検出であっても良い。

【００２５】また、本発明は、ヒトヘモグロビンを準備
する第１の工程と、このヒトヘモグロビンの分子構造を
変化させて、ヒトヘモグロビンと異なる物質を生成する
第２の工程と、を備えるとともに、この物質は、ヒトヘ
モグロビンに比べて経時的に変成しにくい性質を有する
ヒトヘモグロビン検出用物質の製造方法を提供する。そ
して、このヒトヘモグロビン検出用物質を検出するよう
にすれば、ヒトヘモグロビン検出値の経時的な変化を可
及的に低減できるのである。

【００２６】尚、ヒトヘモグロビン検出用物質として
は、ヒトヘモグロビンのサブユニット間を結合させた物
質、特にヒトヘモグロビンのβ鎖間を結合させた物質が
好適である。

【００２７】また、以上説明してきたヒトヘモグロビン
の具体的形態としては、ヒト糖化型ヘモグロビン（Ｈｂ
Ａ１）等の化合物を用いても良い。この場合、上記ヒト
ヘモグロビン検出用物質の製造方法では、第１の工程
に、ヒトヘモグロビン（ＨｂＡ）と糖を準備する工程
と、このヒトヘモグロビン（ＨｂＡ）と糖を結合させて
ヒト糖化型ヘモグロビン（ＨｂＡ１）を製造する工程と
を含むことが好ましい。

【００２８】本発明の第２の側面では、ヒトヘモグロビ
ンを含む溶液を準備する第１の工程と、ヒトヘモグロビ
ン検出用センサの検出値に基づき、溶液中のヒトヘモグ
ロビン量を検出する第２の工程と、を有するヒトヘモグ
ロビンの検出方法であって、センサの検出値を校正する
ための標準物質を含む溶液を準備する第３の工程を備
え、この標準物質を含む溶液に対する前記センサの検出
値を標準検出値とし、この標準検出値に基づき第２の工
程における検出値を校正することを特徴とする。

【００２９】すなわち、温度等の環境要因によりセンサ
感度の変動する場合があっても、第３の工程にてセンサ
の検出値を校正するため、センサ感度変動の影響を低減
できる。ここで、ヒトヘモグロビンＨｂは、ＨｂＡ、Ｈ
ｂＡ２、ＨｂＦと、ＨｂＡが糖と結合してできるＨｂＡ
１よりなるが、第２の工程における検出対象は、これら
全てのＨｂでも良く、ＨｂＡ１等の一部のＨｂでも良
い。

【００３０】また、第２の工程におけるヒトヘモグロビ
ンを含む溶液が便や尿を含む場合は、潜血の検出に有効
であり、血液を含む溶液の場合は、例えば、Ｈｂ全体に
対するＨｂＡ１の割合を検出することにより、糖尿病の
判定等に用いることができる。この場合、例えばＨｂ全
てに対する抗体と、ＨｂＡ１のみに対する抗体の両方を
備えた抗原・抗体反応センサを準備することにより、溶
液を１回準備するだけで、Ｈｂ全体とＨｂＡ１を同時に
認知することができる。

【００３１】センサとしては、抗ヒトヘモグロビン抗体
を有するセンサ、特に表面プラズモン共鳴を利用したセ
ンサを用いることができる。

【００３２】標準物質としては、ヒトヘモグロビン自体
を用いても良いが、ヒトヘモグロビンよりも経時的に変
成しにくい既知量のヒトヘモグロビン代替物質を用いれ
ば標準物質の長期保存が可能であり、特に、前述したヒ
トヘモグロビンの分子構造を変化させた物質、ヒトヘモ
グロビンのサブユニット間を結合させた物質、ヒトヘモ
グロビンのβ鎖間を結合させた物質が好適である。

【００３３】標準物質を保存する場合には、必要に応じ
て種々の添加剤を含有することが出来る。そのような添
加剤としては、ＨＥＰＳやりん酸塩のような緩衝剤、塩
化ナトリウム等の無機塩、ＳＤＳ、Ｔｒｉｏｎ Ｘ−１
００のような界面活性剤などが例示できる。標準物質
は、また、凍結乾燥製剤にも適用され、使用時に精製水
により溶解して使用される事もできる。

【００３４】さらに、ヒトヘモグロビンを含む複数の溶
液に対して、標準検出値を繰り返し用いるようにすれ
ば、ヒトヘモグロビン量の検出毎に第３の工程を行う必
要がない。

【００３５】また、標準物質を含む溶液を、複数回の第
３の工程に繰り返し用いるようにすれば、第３の工程を
行う毎に新たな標準物質を用いる必要がない。尚、この
場合は、標準物質を長期保存する必要があるため、標準
物質としては、ヒトヘモグロビンよりも経時的に変成し
にくい既知量のヒトヘモグロビン代替物質を用いること
が望ましい。

【００３６】本発明は、また、ヒトヘモグロビン検出用
センサと、このセンサの検出値を校正するための標準物
質を含む溶液に対する、センサの検出値を記憶する記憶
手段と、ヒトヘモグロビンを含む溶液に対するセンサの
検出結果を報知する際に、記憶手段の記憶内容を加味し
て報知する報知手段と、を備えてなるヒトヘモグロビン
検出装置を提供する。

【００３７】すなわち、センサの検出値を記憶する記憶
手段を備えることにより、複数種のヒトヘモグロビンを
含む溶液に対して、標準検出値を繰り返し用いることが
可能になる。

【００３８】センサとしては、抗ヒトヘモグロビン抗体
を有するセンサ、特に表面プラズモン共鳴を利用したセ
ンサを用いることができる。

【００３９】標準物質としては、ヒトヘモグロビン自体
を用いても良いが、ヒトヘモグロビンよりも経時的に変
成しにくい既知量のヒトヘモグロビン代替物質を用いれ
ば標準物質の長期保存が可能であり、特に、前述したヒ
トヘモグロビンの分子構造を変化させた物質、ヒトヘモ
グロビンのサブユニット間を結合させた物質、ヒトヘモ
グロビンのβ鎖間を結合させた物質が好適である。

【００４０】また、標準物質を、複数回の記憶内容の更
新に繰り返し用いるようにすれば、センサの検出値を記
憶する毎に新たな標準物質を用いる必要がない。尚、こ
の場合は、標準物質を長期保存する必要があるため、標
準物質としては、ヒトヘモグロビンよりも経時的に変成
しにくい既知量のヒトヘモグロビン代替物質を用いるこ
とが望ましい。

【００４１】ヒトヘモグロビンを含む溶液の実施形態と
して、便や尿を含む溶液の場合は、ヒトヘモグロビン検
出装置がトイレに備えられていれば、検査室等によらず
に便や尿の潜血が検出できる。また、以上説明してきた
ヒトヘモグロビンの具体的形態としては、ヒト糖化型ヘ
モグロビン（ＨｂＡ１）等の化合物を用いても良い。

【００４２】本発明の第３の側面では、尿を貯留する貯
留部と、ヒトヘモグロビン検出用センサと、このセンサ
を用いて貯留された尿中のヒトヘモグロビン量を検出す
る検出手段と、を備えてなるトイレ装置を提供する。本
発明によれば、検査室等によらずに尿潜血を検出するこ
とができる。

【００４３】好適な実施形態として、検出手段の検出結
果を報知する報知手段をトイレ装置に備えれば、検出結
果を簡単に知ることができる。

【００４４】センサとして、表面プラズモン共鳴を利用
したものを用いれば、微量のヒトヘモグロビンであって
も正確に検出することができる。

【００４５】本発明は、また、尿を貯留する貯留部と、
尿中に含まれる抗原に対する抗体を具備するセンサと、
このセンサを用いて貯留された尿中の抗原量を検出する
検出手段と、を備えてなるトイレ装置を提供する。

【００４６】本発明によれば、検査室等によらずに、尿
中に含まれる各種成分を抗原・抗体反応を用いて検出す
ることができる。

【００４７】センサとして、表面プラズモン共鳴を利用
したものを用いれば、微量の抗原であっても正確に検出
することができる。また、抗原が尿中に含まれる糖と結
びついたものの場合は、検出した尿中の抗原量に基づ
き、尿中の糖の量を報知できる。

【００４８】本発明は、さらには、尿を貯留する貯留部
と、表面プラズモン共鳴を利用したセンサと、このセン
サを用いて前記貯留された尿中の被検出物質量を検出す
る検出手段と、を備えてなるトイレ装置を提供する。

【００４９】本発明によれば、尿中の糖等の微量の被検
出物であっても正確に検出することができる。

【００５０】

【発明の実施の形態】［架橋ヘモグロビンの作成］架橋
ヘモグロビン作成の基本的な方法はＷｈｉｔｅとＯｌｓ
ｅｎの方法により行った（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ
ｓ １９８７ ２５８ ５１−５７）。反応のスキーム
を図１に示す。新鮮な１．７ｍＭ（モノマーとして）ヒ
トヘモグロビンと３．０ｍＭ ｂｉｓ（３，５−ｄｉｂ
ｒｏｍｏｓａｌｉｃｙｌ ｆｕｍａｒａｔｅと１０ｍＭ
シアン酸ナトリウムを含む１ｍｌの５０ｍＭりん酸バッ
ファー（ｐＨ７．２）を３７℃で２時間恒温放置し架橋
反応を行った。反応終了後、サンプルを脱塩カラムを通
すことにより反応副生成物である（３，５−ｄｉｂｒｏ
ｍｏｓａｌｉｃｙｌ）ｆｕｍａｒａｔｅを除去し、架橋
ヘモグロビンとした。なお架橋ヘモグロビンの確認には
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって行っ
た。

【００５１】［ＳＰＲセンサによる計測］市販ヘモグロ
ビン（シグマ社）及び図１に示した架橋ヘモグロビンを
５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００を含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ
７．４）にて調整した１０μｇ／ｍｌの標準液とし、
４℃，２５℃，３５℃で恒温放置し、一定時間毎に抗ヘ
モグロビンモノクローナル抗体により表面プラスモン共
鳴（ＳＰＲ）を測定し、使用開始からの残存率を求め、
ヘモグロビンの安定化効果の指標とした。その結果を図
２に示した。図２に示されるように標準液として架橋体
を用いたものは、３５℃で一ヶ月経過後も９０％以上の
抗原性を保持しており安定化効果が大きいことが判明し
た。

【００５２】［ラテックス凝集法による計測］ラテック
ス凝集法による測定には基本的に自動分析装置用試薬Ｈ
ｂＡ０測定用（栄研科学）を用いた。標準希釈液自動分
析用試薬HｂA０にて調整した標準ヘモグロビン（栄研ヘ
モグロビンＡ０標準品）及び図１に示した架橋ヘモグロ
ビンを濃度５００ｎｇ／ｍｌに調整し、３７℃で恒温放
置した。時間毎に２００μｌを分取し、ヘモグロビンラ
テックス乳液１５０μｌと混和させ、３７℃にて１５分
恒温放置の後、紫外可視吸光光度計にて６６０ｎｍの波
長で定量した。開始からの残存率を求め、ヘモグロビン
の安定化効果の指標とした。その結果を図３に示した。
図３に示されるように標準液として架橋ヘモグロビンを
用いた場合には、３７℃、１０日経過後も約９０％の抗
原性を保持しており、安定化効果が大きいことが判明し
た。

【００５３】［トイレ装置への応用］図４は、尿潜血が
測定可能な家庭用検査機器１の構成を示しており、家庭
用検査機器１は、便器２内の採尿機構３と、計測装置本
体４を有している。計測装置本体４内部には、尿貯留部
（図示せず）と、図１に示したβ鎖架橋ヘモグロビンの
貯留部（図示せず）と、［ＳＰＲセンサによる計測］で
示したＳＰＲセンサ（図示せず）が備えられており、計
測装置本体４表面にはＳＰＲセンサの検出値（ヘモグロ
ビン濃度検出値）を表示する表示部５が備えられてい
る。

【００５４】上記尿貯留部に採尿機構３により尿試料を
採取し、尿中の赤血球を界面活性剤と混合することで溶
血させ、放出されたヘモグロビンを本体内に装備した免
疫センサによって検出した。

【００５５】実験は、［ＳＰＲセンサによる計測］と同
様の条件で行い、但し温度制御は行わず、室温にて放置
した。この場合、センサの校正用標準物質として上記β
鎖架橋ヘモグロビンを使用すると、室温でも数ヶ月に渡
って標準ヘモグロビンの抗原性が安定であることが確認
され（図５）、標準液の交換を頻繁に行う必要がないこ
とが示された。

【００５６】従来のヘモグロビン標準物質では校正を行
う直前に、凍結乾燥されたヘモグロビン標準物質を一定
量の水（蒸留水あるいは超純水が好ましい）に均質に溶
解させる操作が必要になり、臨床検査に関する知識のな
い使用者では測定の信頼性が期待できなかった。またそ
の煩雑さゆえに継続的な検査に対する意欲を減少させる
ものであった。

【００５７】図４に示した家庭用検査機器１の制御フロ
ーを図６に示す。まず、図示しない貯留部に貯留された
β鎖架橋ヘモグロビンにより、ＳＰＲセンサ値を検出
し、その値を初期値として記憶する（ステップＳ１）。

【００５８】そして、尿中ヘモグロビンの検出タイミン
グがくると（ステップＳ２）、図示しない貯留部に貯留
された尿中ヘモグロビンにより、ＳＰＲセンサ値を検出
し（ステップＳ３）、この検出値をステップ１で記憶し
た初期値により校正して、この校正した値を表示部５に
表示する。

【００５９】ここで、尿中ヘモグロビンの検出タイミン
グは、排尿ごとに自動的に行ってもよく、便器２の使用
者の操作で行っても良い。

【００６０】その後は、初期値の更新タイミングがくる
までは、ステップＳ２に戻って処理を繰り返す。したが
って初期値は、複数回の尿中ヘモグロビンの検出タイミ
ングで使用されることになり、尿中ヘモグロビンの検出
タイミング毎に初期値を更新する必要がない。

【００６１】また、初期値の更新タイミングがくると
（ステップＳ５）、ステップＳ１に戻って処理を繰り返
す。この際、β鎖架橋ヘモグロビンは交換されないた
め、β鎖架橋ヘモグロビンは、複数回の初期値の更新タ
イミングで使用されることになり、初期値の更新タイミ
ング毎にβ鎖架橋ヘモグロビンを交換する必要がない。

【００６２】ここで、初期値の更新タイミングは、季節
等により水温や気温が変動する毎に自動的に行っても良
いが、要は、ＳＰＲセンサ検出値の外乱要因が変動する
のに対応して行えばよい。

【００６３】以上の実施形態は、尿中ヘモグロビン量を
検出するものであったが、ヒトヘモグロビン（ＨｂＡ、
ＨｂＡ１、ＨｂＡ２、ＨｂＦ）に対するヒト糖化型ヘモ
グロビン（ＨｂＡ１ｃ，ＨｂＡ１）の割合を測定すれ
ば、尿中の糖量を推定することができる。これを以下に
示す。

【００６４】糖尿病はその名前が示すとおり、尿中に糖
（グルコース）が排泄されるという病態がある。しか
し、尿中に排泄されるレベルに達しなくても血中の糖濃
度の上昇が認められたり、食後などには一過性に高血糖
値を示したりする。血糖値のこのような変動をモニター
するためには頻繁な血糖検査が、それも在宅で必要とな
る。

【００６５】しかしながら、毎日、複数回の血糖測定は
患者にとって負担であり、また、適切なタイミングで測
定しなければ臨床的な意義も薄れてしまうため、このよ
うに血糖コントロールのモニターを日常的に行うのは困
難が伴うものであった。

【００６６】そこで、血中でのヘモグロビンとグルコー
スの非酵素的な結合物である糖化型ヘモグロビン（Ｈｂ
Ａ１ｃ，ＨｂＡ１）の割合を測定することが広く用いら
れるようになっている。これは、ヘモグロビンβ鎖末端
のバリンのアミノ基にグルコースが結合したもので、ヘ
モグロビン全体に対する糖化型の割合は、過去１カ月程
度の血糖コントロール状況の把握に有用であることが示
されている。この方法では、日常の食事などに伴う短周
期の血糖値変動がすべて総合的に判断されうる。

【００６７】ヘモグロビンの糖化は図７に示したよう
に、２段階の反応を経て進行する。この時、ヘモグロビ
ンβ鎖末端のバリンにグルコースが結合した状態は、可
逆的なシッフ塩基形成であり、不安定なアルジミンを生
成する（不安定型ＨｂＡ１ｃ）。これよりさらに非可逆
的なアマドリ転位を受けて安定なケトアミン型が生成さ
れる（安定型ＨｂＡ１ｃ）。このような不安定型の存在
は、特に血糖値が急激に変動する場合や、ケトアシドー
シスを伴う重症糖尿病ではＨｂＡ１ｃ測定値に大きく影
響することが知られている。そのため、不安定型を除去
する解離物質あるいは方法として、燐酸縮合体など（特
許１９７８８９４号）、高濃度ホウ酸で短時間加熱処理
（特開平４‐１０９１６３）、マレイン酸、マロン酸な
どの有機酸混合物（特開平６‐３４６３４）などが開発
されている。

【００６８】このようにして不安定型を取り除いた後の
糖化型ヘモグロビンの測定にはイオン交換クロマト法、
電気泳動法、比色法などがあるが、臨床検査としてはイ
オン交換クロマト法を応用したＨＰＬＣ法が標準的に用
いられている。しかし、ＨＰＬＣ法の場合には専用の装
置で高精度ポンプ、分光光度計、高精度流路系などを必
要とし、装置が高価になったり、そのメンテナンスが煩
雑になるという点が短所としてあげられる。

【００６９】ここで、糖化型ヘモグロビンはβ鎖末端に
グルコースが結合したものであり、その結合部位をエピ
トープとするモノクローナル抗体を用いた測定も可能で
ある。国外では酵素免疫法に基づく測定キットも市販さ
れている。この場合は、すべてのヘモグロビンと結合す
る抗体を用いて測定した総ヘモグロビン濃度と、糖化型
ヘモグロビンと結合する抗体を用いて測定した濃度より
糖化型ヘモグロビン濃度の割合を求める。

【００７０】また、安定型ＨｂＡ１ｃのみに結合可能な
モノクローナル抗体を用いることで、上述したような不
安定型ＨｂＡ１ｃ除去が不要になるという利点も考えら
れる。このような酵素免疫法は、臨床検査に頻用されて
いる他の酵素免疫法の測定項目と測定装置の共有が可能
であるため、糖化型ヘモグロビン測定のための特別な装
置を必要としない利点がある。また、表面プラズモン共
鳴（ＳＰＲ）センサなどの適当なセンサと組み合わせた
免疫センサとして簡便な測定装置を構築できる。

【００７１】尚、このような免疫法による糖化型ヘモグ
ロビン測定には、ヘモグロビンと糖化型ヘモグロビンの
標準液による校正が必要である。便潜血などの測定でも
ヘモグロビンが標準物質として用いられているが、ヘモ
グロビンはα鎖およびβ鎖からなるヘムを含むポリペプ
チドが各々２個会合して形成されるため、温度などの環
境要因により容易に解離が起こり、変性することが知ら
れている。また、凍結乾燥時であっても、ヘム鉄の酸化
が起こって変成し、抗原活性が低下することが知られて
いる。このようなことは糖化型ヘモグロビンにも同様に
起こりうる。

【００７２】以下、詳細を説明する。

【００７３】［ヘモグロビンＡ１ｃの精製］２０ ｍＭ
２‐（Ｎ‐モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）
緩衝液中に、オクチルフェノキシ‐ポリエトキシ‐エタ
ノールを０．３３％（Ｖ／Ｖ）および０．６Ｍホウ酸塩
を含む溶血試薬でヒト全血を１５倍に希釈し、混合後５
分以上放置して溶血液を作製した。この溶血液をカラム
（ヘモグロビンＡ１ｃカラムテストマイクロ；バイオラ
ッド社製）に加え、第一緩衝液（５０ ｍＭほう酸 ５
０ｍＭりん酸バッファー ｐＨ７．０）で洗浄し、完全
に廃液させた後、第二緩衝液（５０ｍＭりん酸バッファ
ー ｐＨ６．７）を添加し、溶出液をヘモグロビンＡ１
ｃとした。

【００７４】［架橋ヘモグロビンＡ１ｃの作製］前述し
た架橋ヘモグロビンと同様に作製できる。

【００７５】［架橋糖化型ヘモグロビンＡ１ｃの安定性
‐ＳＰＲセンサによる計測］市販ヘモグロビンＡ１ｃ
（バイオラッド社）及び架橋ヘモグロビンＡ１ｃを５０
ｍＭＮａＣｌ、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ‐１００を
含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ ７．
４）にて調製した１０ μｇ／ｍｌの標準液とし、室温
放置し、一定時間毎に抗ヒトヘモグロビンＡ１ｃ抗体
（エクソセル社）を固定したセンサチップを用いて表面
プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を測定し、使用開始からの残
存率を求め、ヘモグロビンの安定化効果の指標とした。
その結果を図８に示した。図に示されるように標準液と
して架橋体を用いたものは、１カ月経過後も９０％以上
の抗原性を保持しており、安定化効果が大きいことが判
明した。

【００７６】［血中総ヘモグロビンに対する糖化型ヘモ
グロビンの割合‐ＳＰＲセンサによる計測］ヒト血液を
オクチルフェノキシ‐ポリエトキシ‐エタノールなどの
界面活性剤を含有する緩衝液で希釈し、溶血させる。こ
の希釈液を、それぞれ架橋糖化型ヒトヘモグロビンＡ１
ｃおよび架橋ヒトヘモグロビン標準液で校正した、抗安
定型ヒト糖化型ヘモグロビン抗体を用いたＳＰＲセンサ
および抗ヒトヘモグロビン抗体を用いたＳＰＲセンサ
（図９参照）によって測定し、それぞれの濃度を算出し
た。血中のヘモグロビン濃度に対する安定型ヒト糖化型
ヘモグロビンの割合（％）を算出した。健常者３名の血
液で測定を行ったところ、安定型ヒト糖化型ヘモグロビ
ンの割合はそれぞれ、４．３％、４．５％、４．８％で
あった。

【００７７】尚、図９は、図４に示した計測装置本体４
の詳細例であり、標準液貯留部１１、図４の採尿機構３
に連通するサンプル貯留部１２、溶血用バッファー１
３、バッファー１４、再生液貯留部１５、バルブ１６、
ミキシングチャンバー１７、抗ヒトヘモグロビン抗体を
用いたＳＰＲセンサ１８、抗安定型ヒト糖化型ヘモグロ
ビン抗体を用いたＳＰＲセンサ１９、処理装置２０を具
備している。その使用状態を以下に説明する。

【００７８】［ＳＰＲセンサ１８、１９の校正］標準液
貯留部１１に貯留された既知の濃度の架橋糖化型ヒトヘ
モグロビン、架橋糖化型ヒトヘモグロビンＡ１ｃを、バ
ルブ１６、ミキシングチャンバー１７を介してバッファ
１４に貯留された緩衝液と混合し、ＳＰＲセンサ１８、
１９に供給する。

【００７９】ＳＰＲセンサ１８、１９からヒトヘモグロ
ビン濃度、ヒトヘモグロビンＡ１ｃ濃度の検出信号が各
々処理装置２０に送信され、所定の操作を行うと処理装
置２０は各検出信号を初期値として記憶する。（図６の
ステップＳ１に対応）

【００８０】続いて、再生液貯留部１５に貯留された洗
浄液を、バルブ１６、ミキシングチャンバー１７を介し
てＳＰＲセンサ１８、１９に供給し、ＳＰＲセンサ１
８、１９を洗浄する。

【００８１】［ＳＰＲセンサ値の検出］サンプル貯留部
１２に貯留された尿を、バルブ１６、ミキシングチャン
バー１７を介して溶血バッファ１３に貯留された緩衝液
と混合して溶血させ、ＳＰＲセンサ１８、１９に供給す
る。

【００８２】ＳＰＲセンサ１８、１９からヒトヘモグロ
ビン濃度、ヒトヘモグロビンＡ１ｃ濃度の検出信号が各
々処理装置２０に送信され（図６のステップＳ３に対
応）、処理装置２０は各々記憶された初期値に基づき、
ヒトヘモグロビン濃度、ヒトヘモグロビンＡ１ｃ濃度の
検出信号を校正する。

【００８３】そして、処理装置２０は、校正された各検
出信号に基づき、ヒトヘモグロビン濃度と、ヒトヘモグ
ロビンに対するヒトヘモグロビンＡ１ｃの割合を各々数
値化し、表示部５に表示させる。（図６のステップＳ４
に対応）

【００８４】続いて、再生液貯留部１５に貯留された洗
浄液を、バルブ１６、ミキシングチャンバー１７を介し
てＳＰＲセンサ１８、１９に供給し、ＳＰＲセンサ１
８、１９を洗浄する。

【図面の簡単な説明】

【図１】架橋ヘモグロビン作成の説明図

【図２】市販ヘモグロビンと架橋ヘモグロビンのＳＰＲ
センサ測定結果

【図３】市販ヘモグロビンと架橋ヘモグロビンのラテッ
クス凝集法による測定結果

【図４】尿潜血が測定可能な家庭用検査機器１の構成図

【図５】家庭用検査機器１の使用環境における架橋ヘモ
グロビンのＳＰＲセンサ測定結果

【図６】家庭用検査機器１の制御フロー

【図７】ヘモグロビンの糖化を示す図

【図８】架橋ヘモグロビンの安定化効果を示す図

【図９】計測装置本体４の詳細を示す図

【符号の説明】

１…家庭用検査機器、２…便器、３…採尿機構、４…計
測装置本体、５…表示部、１１…標準液貯留部、１２…
サンプル貯留部、１３…溶血用バッファー、１４…バッ
ファー、１５…再生液貯留部、１６…バルブ、１７…ミ
キシングチャンバー、１８…抗ヒトヘモグロビン抗体を
用いたＳＰＲセンサ、１９…抗安定型ヒト糖化型ヘモグ
ロビン抗体を用いたＳＰＲセンサ、２０…処理装置

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ 33/72 33/72 Ａ // Ｇ０１Ｎ 33/50 33/50 Ｎ

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトヘモグロビンのサブユニット間を結
   合させた物質を準備する第１の工程と、この物質量を検
   出する第２の工程と、を備えてなるヒトヘモグロビンの
   検出方法。
2. 【請求項２】 ヒトヘモグロビンのβ鎖間を結合させた
   物質を用いてなる請求項１記載のヒトヘモグロビンの検
   出方法。
3. 【請求項３】 前記サブユニット間又はβ鎖間は、架橋
   により結合されている請求項１又は２記載のヒトヘモグ
   ロビンの検出方法。
4. 【請求項４】 抗ヒトヘモグロビン抗体を用いた免疫学
   的な手法による検出であることを特徴とする請求項１〜
   ３の何れか記載のヒトヘモグロビンの検出方法。
5. 【請求項５】 蛋白質の紫外吸収に基づく蛋白質定量法
   による検出であることを特徴とする請求項１〜３の何れ
   か記載のヒトヘモグロビンの検出方法。
6. 【請求項６】 蛋白質への色素類の吸着に基づく吸光度
   変化による検出であることを特徴とする請求項１〜３の
   何れか記載のヒトヘモグロビンの検出方法。
7. 【請求項７】 ヒトヘモグロビンに特有な波長に基づく
   定量法による検出であることを特徴とする請求項１〜３
   の何れか記載のヒトヘモグロビンの検出方法。
8. 【請求項８】 ヒトヘモグロビンの有するパーオキシダ
   ーゼ様活性に基づく定量法による検出であることを特徴
   とする請求項１〜３の何れか記載のヒトヘモグロビンの
   検出方法。
9. 【請求項９】 前記ヒトヘモグロビンは、ヒト糖化型ヘ
   モグロビン（ＨｂＡ１）であることを特徴とする請求項
   １〜８の何れか記載のヒトヘモグロビンの検出方法。
10. 【請求項１０】 ヒトヘモグロビンを準備する第１の工
    程と、 このヒトヘモグロビンの分子構造を変化させて、ヒトヘ
    モグロビンと異なる物質を生成する第２の工程と、を備
    えるとともに、 この物質は、ヒトヘモグロビンに比べて経時的に変成し
    にくい性質を有するヒトヘモグロビン検出用物質の製造
    方法。
11. 【請求項１１】 前記第２の工程では、ヒトヘモグロビ
    ンのサブユニット間を結合させた物質を生成してなる請
    求項１０記載のヒトヘモグロビン検出用物質の製造方
    法。
12. 【請求項１２】 前記第２の工程では、ヒトヘモグロビ
    ンのβ鎖を結合させた物質を生成してなる請求項１１記
    載のヒトヘモグロビン検出用物質の製造方法。
13. 【請求項１３】 前記ヒトヘモグロビンは、ヒト糖化型
    ヘモグロビン（ＨｂＡ１）であることを特徴とする請求
    項１０〜１２の何れか記載のヒトヘモグロビンの検出方
    法。
14. 【請求項１４】 前記第１の工程は、ヒトヘモグロビン
    （ＨｂＡ）と糖を準備する工程と、このヒトヘモグロビ
    ン（ＨｂＡ）と糖を結合させてヒト糖化型ヘモグロビン
    （ＨｂＡ１）を製造する工程と、を含むことを特徴とす
    る請求項１３記載のヒトヘモグロビンの検出方法。
15. 【請求項１５】 請求項１０〜１４の何れか記載の製造
    方法を経て製造されたヒトヘモグロビン検出用物質。
16. 【請求項１６】 ヒトヘモグロビンを含む溶液を準備す
    る第１の工程と、 ヒトヘモグロビン検出用センサの検出値に基づき、溶液
    中のヒトヘモグロビン量を検出する第２の工程と、を有
    するヒトヘモグロビンの検出方法であって、 前記センサの検出値を校正するための標準物質を含む溶
    液を準備する第３の工程を備え、 この標準物質を含む溶液に対する前記センサの検出値を
    標準検出値とし、この標準検出値に基づき前記第２の工
    程における検出値を校正してなるヒトヘモグロビンの検
    出方法。
17. 【請求項１７】 前記センサが、抗ヒトヘモグロビン抗
    体を有してなる請求項１６記載のヒトヘモグロビンの検
    出方法。
18. 【請求項１８】 前記センサが、表面プラズモン共鳴を
    利用したものである請求項１７記載のヒトヘモグロビン
    の検出方法。
19. 【請求項１９】 前記標準物質が、ヒトヘモグロビンよ
    りも経時的に変成しにくい既知量のヒトヘモグロビン代
    替物質である請求項１６〜１８の何れか記載のヒトヘモ
    グロビンの検出方法。
20. 【請求項２０】 前記標準物質が、請求項１５記載のヒ
    トヘモグロビン検出用物質である請求項１９記載のヒト
    ヘモグロビンの検出方法。
21. 【請求項２１】 前記標準検出値は、前記ヒトヘモグロ
    ビンを含む複数の溶液に対して、繰り返し用いられる請
    求項１６〜２０の何れか記載のヒトヘモグロビンの検出
    方法。
22. 【請求項２２】 前記標準物質を含む溶液は、複数回の
    前記第３の工程に繰り返し用いられる請求項１６〜２１
    記載のヒトヘモグロビンの検出方法。
23. 【請求項２３】 前記第２の工程におけるヒトヘモグロ
    ビンを含む溶液が、血液、便、尿の何れかを含む請求項
    １６〜２２の何れか記載のヒトヘモグロビンの検出方
    法。
24. 【請求項２４】 前記ヒトヘモグロビンは、ヒト糖化型
    ヘモグロビン（ＨｂＡ１）であることを特徴とする請求
    項１６〜２３の何れか記載のヒトヘモグロビンの検出方
    法。
25. 【請求項２５】 ヒトヘモグロビン検出用センサと、 このセンサの検出値を校正するための標準物質を含む溶
    液に対する、前記センサの検出値を記憶する記憶手段
    と、 ヒトヘモグロビンを含む溶液に対する前記センサの検出
    結果を報知する際に、前記記憶手段の記憶内容を加味し
    て報知する報知手段と、を備えてなるヒトヘモグロビン
    検出装置。
26. 【請求項２６】 前記センサが、抗ヒトヘモグロビン抗
    体を有してなる請求項２５記載のヒトヘモグロビン検出
    装置。
27. 【請求項２７】 前記センサが、表面プラズモン共鳴を
    利用したものである請求項２６記載のヒトヘモグロビン
    の検出方法。
28. 【請求項２８】 前記標準物質が、ヒトヘモグロビンよ
    りも経時的に変成しにくい既知量のヒトヘモグロビン代
    替物質である請求項２５〜２８の何れか記載のヒトヘモ
    グロビン検出装置。
29. 【請求項２９】 前記標準物質が、請求項１５記載のヒ
    トヘモグロビン検出用物質である請求項２８記載のヒト
    ヘモグロビン検出装置。
30. 【請求項３０】 前記記憶内容を所定の条件で更新させ
    る更新手段を備えるとともに、 前記標準物質は、複数回の前記更新に繰り返し用いられ
    る請求項２５〜２９の何れか記載のヒトヘモグロビン検
    出装置。
31. 【請求項３１】 前記ヒトヘモグロビンを含む溶液が、
    血液を含む請求項２５〜３０の何れか記載のヒトヘモグ
    ロビン検出装置。
32. 【請求項３２】 前記ヒトヘモグロビンを含む溶液が、
    便、尿の何れかを含む請求項２５〜３０の何れか記載の
    ヒトヘモグロビン検出装置。
33. 【請求項３３】 トイレに備えられてなる請求項３２記
    載のヒトヘモグロビン検出装置。
34. 【請求項３４】 前記ヒトヘモグロビンは、ヒト糖化型
    ヘモグロビン（ＨｂＡ１）であることを特徴とする請求
    項２５〜３３の何れか記載のヒトヘモグロビン検出装
    置。
35. 【請求項３５】 尿を貯留する貯留部と、 ヒトヘモグロビン検出用センサと、 このセンサを用いて前記貯留された尿中のヒトヘモグロ
    ビン量を検出する検出手段と、を備えてなるトイレ装
    置。
36. 【請求項３６】 前記検出手段の検出結果を報知する報
    知手段を備えてなる請求項３５記載のトイレ装置
37. 【請求項３７】 前記センサが、表面プラズモン共鳴を
    利用したものである請求項３５又は３６記載のトイレ装
    置。
38. 【請求項３８】 尿を貯留する貯留部と、 尿中に含まれる抗原に対する抗体を具備するセンサと、 このセンサを用いて前記貯留された尿中の抗原量を検出
    する検出手段と、を備えてなるトイレ装置。
39. 【請求項３９】 前記センサが、表面プラズモン共鳴を
    利用したものである請求項３８記載のトイレ装置。
40. 【請求項４０】 前記抗原が、尿中に含まれる糖と結び
    ついたものであって、 前記検出手段が検出した前記尿中の抗原量に基づき、尿
    中の糖の量を報知する報知手段を備えてなる請求項３８
    または３９記載のトイレ装置。
41. 【請求項４１】 尿を貯留する貯留部と、 表面プラズモン共鳴を利用したセンサと、 このセンサを用いて前記貯留された尿中の被検出物質量
    を検出する検出手段と、を備えてなるトイレ装置。
42. 【請求項４２】 前記被検出物質が、糖である請求項４
    １記載のトイレ装置。