JPH11266885A - ベクタ―成分の配列を含有するキメラポックスウイルス - Google Patents
ベクタ―成分の配列を含有するキメラポックスウイルスInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子治療および腫瘍の治療において使用す
るためのキメラポックスウイルスの提供。 【解決手段】 レトロウイルスベクター粒子のベクター
成分および場合により欠損レトロウイルス粒子のパッケ
ージング成分の配列を含むキメラポックスウイルス。
るためのキメラポックスウイルスの提供。 【解決手段】 レトロウイルスベクター粒子のベクター
成分および場合により欠損レトロウイルス粒子のパッケ
ージング成分の配列を含むキメラポックスウイルス。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はレトロウイルス（欠
損）ゲノムのベクター成分を含むキメラポックスウイル
スに関する。さらに本発明はレトロウイルスの欠損ウイ
ルスを産生するためのベクター成分およびパッケージン
グ成分を含むキメラポックスウイルス、ならびに本発明
のキメラポックスウイルスの遺伝子治療または腫瘍治療
への使用に関する。
損）ゲノムのベクター成分を含むキメラポックスウイル
スに関する。さらに本発明はレトロウイルスの欠損ウイ
ルスを産生するためのベクター成分およびパッケージン
グ成分を含むキメラポックスウイルス、ならびに本発明
のキメラポックスウイルスの遺伝子治療または腫瘍治療
への使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子治療の主要な目的は標的細胞の安
定な遺伝子修飾であり、従来は遺伝子治療用に、複製能
欠損アデノウイルスおよびレトロウイルスに基づく基本
的なウイルスベクターが構築されていた。特にアデノウ
イルスベクターを用いると多数の異なる細胞に形質導入
できるため、アデノウイルスベクターによるインビボ遺
伝子転移は非常に効率的である。しかし、アデノウイル
ス感染では、ＤＮＡは宿主ゲノムに組込まれず、エピソ
ーム形態で存在する。さらに外来遺伝子発現を制限する
細胞免疫反応を引き起こし得る（Liら、1993、Hum．Gen
e Ther. 4：403-409)。アデノウイルスＥ３領域が欠失
していないベクターを用いてこの反応を弱めることが可
能である（Ilanら、1997．Proc．Natl．Acad．Sci．USA
94：2587-2592)。これらの修飾は治療遺伝子の一時的
な発現を何ヶ月間か持続させる。しかし、上記のように
アデノウイルスベクターは宿主細胞のゲノムに安定に組
込まれないため、恒久的な効果は得られない。
定な遺伝子修飾であり、従来は遺伝子治療用に、複製能
欠損アデノウイルスおよびレトロウイルスに基づく基本
的なウイルスベクターが構築されていた。特にアデノウ
イルスベクターを用いると多数の異なる細胞に形質導入
できるため、アデノウイルスベクターによるインビボ遺
伝子転移は非常に効率的である。しかし、アデノウイル
ス感染では、ＤＮＡは宿主ゲノムに組込まれず、エピソ
ーム形態で存在する。さらに外来遺伝子発現を制限する
細胞免疫反応を引き起こし得る（Liら、1993、Hum．Gen
e Ther. 4：403-409)。アデノウイルスＥ３領域が欠失
していないベクターを用いてこの反応を弱めることが可
能である（Ilanら、1997．Proc．Natl．Acad．Sci．USA
94：2587-2592)。これらの修飾は治療遺伝子の一時的
な発現を何ヶ月間か持続させる。しかし、上記のように
アデノウイルスベクターは宿主細胞のゲノムに安定に組
込まれないため、恒久的な効果は得られない。
【０００３】これとは対照的に、レトロウイルスベクタ
ーは外来遺伝子を宿主細胞のゲノムに安定に組込むこと
ができる。レトロウイルスは外来ＤＮＡを宿主細胞のゲ
ノムに組込む機構を有している少数の現在既知のウイル
スに属するため、宿主細胞を恒久的に形質転換できる。
この性質のため、レトロウイルスは遺伝子治療アプロー
チに頻繁に用いられる。この目的のためにこれまで用い
られていた技術では、外来遺伝子をレトロウイルス中の
プロウイルスＤＮＡにクローン化していたが、これで
は、パッケージング機能をコードする少なくとも１つの
レトロウイルス遺伝子（gag-polまたはenv）が不活性
化、あるいは欠失されている複製欠陥レトロウイルス遺
伝子を用いていることになる。これらの構築体はプロウ
イルスのパッケージングシグナルpsiおよびフランキン
グ長末端繰り返し（ＬＴＲ）配列を含む。これらの転写
単位は通常のトランスフェクション技術によりプラスミ
ドベクターを用いて細胞に導入され、一般にＬＴＲプロ
モーターの制御下に核内でＲＮＡに転写される。パッケ
ージングシグナルpsiのため、これらのＲＮＡはゲノム
ウイルスＲＮＡとして受け入れられ、レトロウイルス粒
子にパッケージングされる。
ーは外来遺伝子を宿主細胞のゲノムに安定に組込むこと
ができる。レトロウイルスは外来ＤＮＡを宿主細胞のゲ
ノムに組込む機構を有している少数の現在既知のウイル
スに属するため、宿主細胞を恒久的に形質転換できる。
この性質のため、レトロウイルスは遺伝子治療アプロー
チに頻繁に用いられる。この目的のためにこれまで用い
られていた技術では、外来遺伝子をレトロウイルス中の
プロウイルスＤＮＡにクローン化していたが、これで
は、パッケージング機能をコードする少なくとも１つの
レトロウイルス遺伝子（gag-polまたはenv）が不活性
化、あるいは欠失されている複製欠陥レトロウイルス遺
伝子を用いていることになる。これらの構築体はプロウ
イルスのパッケージングシグナルpsiおよびフランキン
グ長末端繰り返し（ＬＴＲ）配列を含む。これらの転写
単位は通常のトランスフェクション技術によりプラスミ
ドベクターを用いて細胞に導入され、一般にＬＴＲプロ
モーターの制御下に核内でＲＮＡに転写される。パッケ
ージングシグナルpsiのため、これらのＲＮＡはゲノム
ウイルスＲＮＡとして受け入れられ、レトロウイルス粒
子にパッケージングされる。
【０００４】最も単純な場合、感染性レトロウイルス粒
子が形成されるためには、遺伝子産物gag-polおよびenv
が存在しなければならない。これらの遺伝子はプラスミ
ドトランスフェクションを介して、パッケージングシグ
ナルを伴わなくても細胞に挿入され、あるいはヘルパー
ウイルスを介して提供され得る。またレトロウイルス粒
子の調製のためには、パッケージング成分gag、polおよ
び／またはenvのウイルス遺伝子が安定に組込まれてお
り、該遺伝子を発現するセルラインを形質導入できる。
このようなセルラインは「パッケージング」ラインとい
う用語で表され、例えばＷＯ９７／３５９９６に記載さ
れている。非複製レトロウイルス粒子の形成に必要なす
べての成分をコードするプラスミド構築物はいわゆる
「プラスモウイルス」として記載されている（Noguiez-
Hellinら、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：417
5-4180)。しかし、複製欠陥レトロウイルスの使用は、
レトロウイルスＤＮＡがヘルパー遺伝子と組換えし、そ
れにより腫瘍を発生させる可能性を有する複製可能ウイ
ルスが産生されることになるかもしれない危険性を完全
には排除できない。
子が形成されるためには、遺伝子産物gag-polおよびenv
が存在しなければならない。これらの遺伝子はプラスミ
ドトランスフェクションを介して、パッケージングシグ
ナルを伴わなくても細胞に挿入され、あるいはヘルパー
ウイルスを介して提供され得る。またレトロウイルス粒
子の調製のためには、パッケージング成分gag、polおよ
び／またはenvのウイルス遺伝子が安定に組込まれてお
り、該遺伝子を発現するセルラインを形質導入できる。
このようなセルラインは「パッケージング」ラインとい
う用語で表され、例えばＷＯ９７／３５９９６に記載さ
れている。非複製レトロウイルス粒子の形成に必要なす
べての成分をコードするプラスミド構築物はいわゆる
「プラスモウイルス」として記載されている（Noguiez-
Hellinら、1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：417
5-4180)。しかし、複製欠陥レトロウイルスの使用は、
レトロウイルスＤＮＡがヘルパー遺伝子と組換えし、そ
れにより腫瘍を発生させる可能性を有する複製可能ウイ
ルスが産生されることになるかもしれない危険性を完全
には排除できない。
【０００５】レトロウイルスベクターを用いた細胞の形
質転換はインビトロで非常に効率的であるが、遺伝子治
療への適用において現在、困難に遭遇している。即ち、
プラスミド構築物を介するレトロウイルスベクターの産
生に必要とされるトランスフェクション技術はインビト
ロで行うことができるのみである。欠損レトロウイルス
粒子の産生に用いるプラスミド構築物を体内に直接投与
することは非常に非効率的である。同様にインビトロの
レトロウイルス粒子は比較的低い力価までしか産生でき
ない。これらの粒子は不安定であるため、粒子の濃縮も
また、限られた程度でしか実行できない。レトロウイル
スの低い力価および不安定性はしばしばインビボでの効
率的な形質転換を妨げる。これゆえ、粒子の標的器官へ
の直接注射、または組織を取り出した後のエクスビボ
（ex vivo）形質転換および形質転換細胞の移植のよう
な方法が現在試みられている。またレトロウイルスベク
ターの場合、ある標的器官への目標を定めた形質導入、
いわゆる「ターゲティング」は、非常に困難である。異
種エンベロープタンパク質によって粒子の向性を変化さ
せること（擬似タイピング、pseudotyping）が試みられ
ている。単純レトロウイルス、たとえばモロニーマウス
白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づく広く用いられるレト
ロウイルスベクターは分裂期の細胞のみを形質導入する
ことができる。しかし、多くの完全に成長した器官での
細胞成長は非常に低い。肝臓遺伝子治療の試験では腹腔
内処理が試みられ、肝臓の部分的取り出しにより、成長
しているがゆえに形質転換が可能な組織を得ている。同
様に例えば、ＨＩＶ（レンチウイルスベクター）のよう
な複合レトロウイルスは非分裂細胞を形質転換すること
もできるので、そのようなウイルスに基づくレトロウイ
ルスベクターが構築されている（Reiserら、1996．Pro
c．Natl．Acad．Sci．USA 93：15266-15271)。
質転換はインビトロで非常に効率的であるが、遺伝子治
療への適用において現在、困難に遭遇している。即ち、
プラスミド構築物を介するレトロウイルスベクターの産
生に必要とされるトランスフェクション技術はインビト
ロで行うことができるのみである。欠損レトロウイルス
粒子の産生に用いるプラスミド構築物を体内に直接投与
することは非常に非効率的である。同様にインビトロの
レトロウイルス粒子は比較的低い力価までしか産生でき
ない。これらの粒子は不安定であるため、粒子の濃縮も
また、限られた程度でしか実行できない。レトロウイル
スの低い力価および不安定性はしばしばインビボでの効
率的な形質転換を妨げる。これゆえ、粒子の標的器官へ
の直接注射、または組織を取り出した後のエクスビボ
（ex vivo）形質転換および形質転換細胞の移植のよう
な方法が現在試みられている。またレトロウイルスベク
ターの場合、ある標的器官への目標を定めた形質導入、
いわゆる「ターゲティング」は、非常に困難である。異
種エンベロープタンパク質によって粒子の向性を変化さ
せること（擬似タイピング、pseudotyping）が試みられ
ている。単純レトロウイルス、たとえばモロニーマウス
白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づく広く用いられるレト
ロウイルスベクターは分裂期の細胞のみを形質導入する
ことができる。しかし、多くの完全に成長した器官での
細胞成長は非常に低い。肝臓遺伝子治療の試験では腹腔
内処理が試みられ、肝臓の部分的取り出しにより、成長
しているがゆえに形質転換が可能な組織を得ている。同
様に例えば、ＨＩＶ（レンチウイルスベクター）のよう
な複合レトロウイルスは非分裂細胞を形質転換すること
もできるので、そのようなウイルスに基づくレトロウイ
ルスベクターが構築されている（Reiserら、1996．Pro
c．Natl．Acad．Sci．USA 93：15266-15271)。
【０００６】遺伝子治療において欠損遺伝子を矯正する
ためには、対応する遺伝子の効率的な挿入およびその遺
伝子の長期間の発現が特に重要である。これゆえ安定な
インビボ形質導入のためのベクターを調製する新たなア
プローチでは、レトロウイルス欠損粒子の担体としてウ
イルスを用いるという原理を利用する。そのようにする
場合、特にＤＮＡウイルス、例えばヘルペスウイルスお
よびアデノウイルスの大きな挿入潜在能力を利用する。
キメラウイルス系のはるかに発達したアプローチは、そ
れぞれレトロウイルスベクターおよびパッケージング機
能をコードする２つの組換えアデノウイルスの同時感染
による欠損レトロウイルス粒子の調製であり、核レトロ
ウイルスベクターおよびパッケージングタンパク質はア
デノベクター系を介して導入され、これにより導入細胞
は一時的なレトロウイルス産生細胞になり、その方法で
形成されるレトロウイルスベクター粒子は近隣の細胞に
感染できる（Fengら、1997. Nat. Biotechn. 15：866-8
70、Bilbaoら、1997. FASEB J. 11：624-634)。
ためには、対応する遺伝子の効率的な挿入およびその遺
伝子の長期間の発現が特に重要である。これゆえ安定な
インビボ形質導入のためのベクターを調製する新たなア
プローチでは、レトロウイルス欠損粒子の担体としてウ
イルスを用いるという原理を利用する。そのようにする
場合、特にＤＮＡウイルス、例えばヘルペスウイルスお
よびアデノウイルスの大きな挿入潜在能力を利用する。
キメラウイルス系のはるかに発達したアプローチは、そ
れぞれレトロウイルスベクターおよびパッケージング機
能をコードする２つの組換えアデノウイルスの同時感染
による欠損レトロウイルス粒子の調製であり、核レトロ
ウイルスベクターおよびパッケージングタンパク質はア
デノベクター系を介して導入され、これにより導入細胞
は一時的なレトロウイルス産生細胞になり、その方法で
形成されるレトロウイルスベクター粒子は近隣の細胞に
感染できる（Fengら、1997. Nat. Biotechn. 15：866-8
70、Bilbaoら、1997. FASEB J. 11：624-634)。
【０００７】しかしこの系はいくつかの決定的な不都合
を有する：アデノウイルスベクターの外来遺伝子の許容
量が数キロ塩基に限られているために、欠損レトロウイ
ルスを産生するためのすべての機能（パッケージング成
分およびレトロウイルスベクター成分）を１つのアデノ
ウイルス中に一体化することが困難である。しかし、こ
のような構築物は効率的なインビボ遺伝子治療の必要条
件である。さらに、アデノウイルスならびにレトロウイ
ルス遺伝子およびゲノムの両者はそれぞれ宿主細胞の核
内で転写され、複製される。このトポグラフィー上の近
接は野生型レトロウイルスの組換えを可能にする。原理
的に、この系では重要なレトロウイルス転写制御領域は
核内における転写に必要だから、欠失させることができ
ない。これゆえ、安全な技術の点から所望の程度にまで
アデノウイルス／レトロウイルス系を減弱させることが
できない。同じことがヘルペス単純アンプリコン系にも
当てはまる；従来、これはレトロウイルス構造タンパク
質の発現に関して記載されるのみであり、ここではパッ
ケージング成分を含むＨＳＶアンプリコンベクターでｌ
ａｃＺプロウイルスを含む細胞を感染させることによ
り、レトロウイルスｌａｃＺ粒子を得ている（Savard
ら、1997．J．Virol．71：4111-4117)。
を有する：アデノウイルスベクターの外来遺伝子の許容
量が数キロ塩基に限られているために、欠損レトロウイ
ルスを産生するためのすべての機能（パッケージング成
分およびレトロウイルスベクター成分）を１つのアデノ
ウイルス中に一体化することが困難である。しかし、こ
のような構築物は効率的なインビボ遺伝子治療の必要条
件である。さらに、アデノウイルスならびにレトロウイ
ルス遺伝子およびゲノムの両者はそれぞれ宿主細胞の核
内で転写され、複製される。このトポグラフィー上の近
接は野生型レトロウイルスの組換えを可能にする。原理
的に、この系では重要なレトロウイルス転写制御領域は
核内における転写に必要だから、欠失させることができ
ない。これゆえ、安全な技術の点から所望の程度にまで
アデノウイルス／レトロウイルス系を減弱させることが
できない。同じことがヘルペス単純アンプリコン系にも
当てはまる；従来、これはレトロウイルス構造タンパク
質の発現に関して記載されるのみであり、ここではパッ
ケージング成分を含むＨＳＶアンプリコンベクターでｌ
ａｃＺプロウイルスを含む細胞を感染させることによ
り、レトロウイルスｌａｃＺ粒子を得ている（Savard
ら、1997．J．Virol．71：4111-4117)。
【０００８】アデノウイルスおよびレトロウイルスベク
ターの両方に伴う不利益は特に、形質導入細胞における
外来遺伝子発現性の向上またはベクターＲＮＡの安定性
のためのイントロンが、ベクター産生の間に核特異的ス
プライシング機構によって除去されるため、利用できな
いことである。
ターの両方に伴う不利益は特に、形質導入細胞における
外来遺伝子発現性の向上またはベクターＲＮＡの安定性
のためのイントロンが、ベクター産生の間に核特異的ス
プライシング機構によって除去されるため、利用できな
いことである。
【０００９】キメラレトロウイルス担体としてのウイル
スのウイルスベクターについては、スプライシングおよ
びポリアデニル化シグナルをレトロウイルス欠損ウイル
スゲノムの正しい位置に存在させることで、形質導入さ
れるレトロウイルスゲノムの転写中にそれぞれ欠陥スプ
ライシングまたは時期尚早の鎖終結を誘導しないように
しなければならない。例えば核のポリアデニル化シグナ
ルが第２の下流のレトロウイルスＬＴＲプロモーターの
前に置かれたならば、これは核内における転写物の鎖終
結および、もはや形質導入能のないレトロウイルス欠損
ゲノムを誘導する。これらのシグナルが場違いな部位に
存在する場合、核内で複製するアデノまたはヘルペスウ
イルスは形質導入する欠損レトロウイルスを形成せず、
この態様では安全性を高めることができない。さらにヘ
ルペスウイルス内にレトロウイルスＬＴＲを挿入する
と、非発ガン性ヘルペスウイルスから発ガン性亜種が産
生されることがある（Isfortら、1992, Proc. Natl. Ac
ad. Sci.. USA 89：991-995)。ヘルペスウイルスの生活
環は核内で行われるので、このことは特に起こり得る。
またαウイルスはレトロウイルス産生用のベクターとし
て用いられている。インビトロ合成ＲＮＡによって得ら
れたいくつかのセムリキ森林熱ベクターの同時感染は、
結果として感染性レトロウイルスベクター粒子を生じさ
せた（Liら、1993．Hum．Gene．Ther．4：403-409)。担
体ウイルスの天然の向性をそれぞれの好ましい細胞タイ
プおよび組織への遺伝子転移に用いることができる。
スのウイルスベクターについては、スプライシングおよ
びポリアデニル化シグナルをレトロウイルス欠損ウイル
スゲノムの正しい位置に存在させることで、形質導入さ
れるレトロウイルスゲノムの転写中にそれぞれ欠陥スプ
ライシングまたは時期尚早の鎖終結を誘導しないように
しなければならない。例えば核のポリアデニル化シグナ
ルが第２の下流のレトロウイルスＬＴＲプロモーターの
前に置かれたならば、これは核内における転写物の鎖終
結および、もはや形質導入能のないレトロウイルス欠損
ゲノムを誘導する。これらのシグナルが場違いな部位に
存在する場合、核内で複製するアデノまたはヘルペスウ
イルスは形質導入する欠損レトロウイルスを形成せず、
この態様では安全性を高めることができない。さらにヘ
ルペスウイルス内にレトロウイルスＬＴＲを挿入する
と、非発ガン性ヘルペスウイルスから発ガン性亜種が産
生されることがある（Isfortら、1992, Proc. Natl. Ac
ad. Sci.. USA 89：991-995)。ヘルペスウイルスの生活
環は核内で行われるので、このことは特に起こり得る。
またαウイルスはレトロウイルス産生用のベクターとし
て用いられている。インビトロ合成ＲＮＡによって得ら
れたいくつかのセムリキ森林熱ベクターの同時感染は、
結果として感染性レトロウイルスベクター粒子を生じさ
せた（Liら、1993．Hum．Gene．Ther．4：403-409)。担
体ウイルスの天然の向性をそれぞれの好ましい細胞タイ
プおよび組織への遺伝子転移に用いることができる。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
不都合を有しないベクター系を提供することおよびレト
ロウイルス粒子を効率的に形成させることである。
不都合を有しないベクター系を提供することおよびレト
ロウイルス粒子を効率的に形成させることである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明では、レトロウイ
ルス粒子のベクター成分の配列を含むキメラポックスウ
イルスを提供することによってこの課題を達成した。本
明細書中では「ベクター成分」によって、パッケージン
グシグナルpsiを含むレトロウイルスゲノムの発現に必
要なすべての配列、および外来のタンパク質をコードす
る配列を含む欠損レトロウイルスベクターゲノムが理解
される。本発明のキメラポックスウイルス中では、ベク
ター成分の配列は特に、外来遺伝子、特に外来タンパク
質をコードする１つ（またはいくつか）の配列、アンチ
センスＤＮＡ、１つ（またはいくつか）のリボザイム
（群）が核−活性プロモーター、特にβ−アクチン、Ｃ
ＭＶまたはＳＶ４０初期プロモーターの転写制御下にあ
る修飾レトロウイルスゲノムを含む。外来タンパク質は
所望のいずれのタンパク質としてもよいが、置換治療ま
たは腫瘍治療用タンパク質が特に好ましい。置換治療に
適したタンパク質は血漿タンパク質、例えば第ＩＩ因
子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ
因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロテ
インＣ、プロテインＳ、フォンビルブラント因子または
エリトロポエチンであり得る。腫瘍治療に適したタンパ
ク質は腫瘍抑制タンパク質、例えばｐ５３またはｐ７
３、または「自殺遺伝子」、例えば ＨＳＶ ＴＫ、免疫
刺激物質、例えばＢ７である。
ルス粒子のベクター成分の配列を含むキメラポックスウ
イルスを提供することによってこの課題を達成した。本
明細書中では「ベクター成分」によって、パッケージン
グシグナルpsiを含むレトロウイルスゲノムの発現に必
要なすべての配列、および外来のタンパク質をコードす
る配列を含む欠損レトロウイルスベクターゲノムが理解
される。本発明のキメラポックスウイルス中では、ベク
ター成分の配列は特に、外来遺伝子、特に外来タンパク
質をコードする１つ（またはいくつか）の配列、アンチ
センスＤＮＡ、１つ（またはいくつか）のリボザイム
（群）が核−活性プロモーター、特にβ−アクチン、Ｃ
ＭＶまたはＳＶ４０初期プロモーターの転写制御下にあ
る修飾レトロウイルスゲノムを含む。外来タンパク質は
所望のいずれのタンパク質としてもよいが、置換治療ま
たは腫瘍治療用タンパク質が特に好ましい。置換治療に
適したタンパク質は血漿タンパク質、例えば第ＩＩ因
子、第Ｖ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ
因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、プロテ
インＣ、プロテインＳ、フォンビルブラント因子または
エリトロポエチンであり得る。腫瘍治療に適したタンパ
ク質は腫瘍抑制タンパク質、例えばｐ５３またはｐ７
３、または「自殺遺伝子」、例えば ＨＳＶ ＴＫ、免疫
刺激物質、例えばＢ７である。
【００１２】ポックスウイルス、特にワクシニアウイル
ス転写装置はレトロウイルスのプロウイルスＤＮＡのＬ
ＴＲプロモーターをプロモーターとして認識せず、また
プロウイルスＲＮＡプロセッシングシグナルも認識しな
い。これゆえ、本発明の特別な態様では、ベクター成分
の配列をポックスウイルス特異的プロモーターの転写制
御下に置く。ここに、特に好ましいプロモーターは初期
遺伝子の発現を制御するポックスウイルスプロモーター
である。本発明のキメラワクシニアウイルス（RetroVac
ベクター、RetroVac vector）では、これらは特に、例
えばDavisionら（1989，J．Mol．Bio．210：749-769）
およびPfleidererら（1995, Protein Expr. Purif. 6：
559-569）によって記載される天然および合成プロモー
ターの両者を含む初期プロモーターである。
ス転写装置はレトロウイルスのプロウイルスＤＮＡのＬ
ＴＲプロモーターをプロモーターとして認識せず、また
プロウイルスＲＮＡプロセッシングシグナルも認識しな
い。これゆえ、本発明の特別な態様では、ベクター成分
の配列をポックスウイルス特異的プロモーターの転写制
御下に置く。ここに、特に好ましいプロモーターは初期
遺伝子の発現を制御するポックスウイルスプロモーター
である。本発明のキメラワクシニアウイルス（RetroVac
ベクター、RetroVac vector）では、これらは特に、例
えばDavisionら（1989，J．Mol．Bio．210：749-769）
およびPfleidererら（1995, Protein Expr. Purif. 6：
559-569）によって記載される天然および合成プロモー
ターの両者を含む初期プロモーターである。
【００１３】このような構築物を調製するため、例えば
プロウイルスＤＮＡの５’末端由来のＵ３領域を欠失さ
せ、ポックスウイルス特異的プロモーターと置き換える
ことができる。同様に、プロウイルスＤＮＡの３’末端
由来のＵ５領域を欠失させることができ、「Ｒ」領域の
末端にＴＴＴＴＴＮＴシグナルを付加することができ
る。転写物末端の繰り返し領域「Ｒ」は逆転写に必須で
あり、これゆえベクター粒子の機能性に必須である。通
常の転写開始の上流での開始は非繰り返し５’末端を有
する転写物の合成を誘導し、これゆえ予想されるよう
に、ベクターの力価を減少させる。正しいＲＮＡの５’
末端を得る観点から、原型構築物に挿入されるポックス
ウイルスプロモーターの開始部位それぞれは個々のケー
スで最適にするべきである。このような構築物の最適化
は当業者の一般知識の範囲内にあり、大きな労力なしに
実行できる。
プロウイルスＤＮＡの５’末端由来のＵ３領域を欠失さ
せ、ポックスウイルス特異的プロモーターと置き換える
ことができる。同様に、プロウイルスＤＮＡの３’末端
由来のＵ５領域を欠失させることができ、「Ｒ」領域の
末端にＴＴＴＴＴＮＴシグナルを付加することができ
る。転写物末端の繰り返し領域「Ｒ」は逆転写に必須で
あり、これゆえベクター粒子の機能性に必須である。通
常の転写開始の上流での開始は非繰り返し５’末端を有
する転写物の合成を誘導し、これゆえ予想されるよう
に、ベクターの力価を減少させる。正しいＲＮＡの５’
末端を得る観点から、原型構築物に挿入されるポックス
ウイルスプロモーターの開始部位それぞれは個々のケー
スで最適にするべきである。このような構築物の最適化
は当業者の一般知識の範囲内にあり、大きな労力なしに
実行できる。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明のキメラポックスウイルス
を用いて、例えばＷＯ９７／３５９９６に記載の、パッ
ケージング成分を発現する適当なパッケージングセルラ
インを感染させることにより欠損レトロウイルス粒子を
簡単に製造できる。本発明の特別な態様として、キメラ
ポックスウイルスはベクター成分およびパッケージング
成分をコードする配列を含む。ベクター成分およびパッ
ケージング成分の両方を含む、本発明のキメラポックス
ウイルスは、標的細胞内でパッケージング成分の遺伝子
およびレトロウイルス欠損ゲノムをコードする転写単位
の両方を発現するため、インシトゥー（in situ）で組
換え欠損レトロウイルスを遊離させることができる。レ
トロウイルス複製シグナルおよびパッケージングシグナ
ルに加えて、レトロウイルス欠損ゲノムは好ましくは、
レトロウイルス長末端繰り返し（ＬＴＲ）プロモーター
自体か、あるいは別のプロモーターのどちらかによって
制御される、形質導入され発現される外来遺伝子をも含
む。
を用いて、例えばＷＯ９７／３５９９６に記載の、パッ
ケージング成分を発現する適当なパッケージングセルラ
インを感染させることにより欠損レトロウイルス粒子を
簡単に製造できる。本発明の特別な態様として、キメラ
ポックスウイルスはベクター成分およびパッケージング
成分をコードする配列を含む。ベクター成分およびパッ
ケージング成分の両方を含む、本発明のキメラポックス
ウイルスは、標的細胞内でパッケージング成分の遺伝子
およびレトロウイルス欠損ゲノムをコードする転写単位
の両方を発現するため、インシトゥー（in situ）で組
換え欠損レトロウイルスを遊離させることができる。レ
トロウイルス複製シグナルおよびパッケージングシグナ
ルに加えて、レトロウイルス欠損ゲノムは好ましくは、
レトロウイルス長末端繰り返し（ＬＴＲ）プロモーター
自体か、あるいは別のプロモーターのどちらかによって
制御される、形質導入され発現される外来遺伝子をも含
む。
【００１５】本発明の範囲内では「パッケージング成
分」は、レトロウイルスベクターの形成に必要なレトロ
ウイルスのあらゆる遺伝子、例えばgag-polおよびenvを
意味する。本発明のキメラポックスウイルス（いわゆる
RetroVacベクター）を構築するため、単純レトロウイル
ス、例えばＭＬＶ、および複合レトロウイルス、例えば
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をも用いることができ
る。同様に、宿主スペクトルを変化させるため、すでに
レトロウイルスベクターについて記載したように、形質
転換するレトロウイルス粒子に対して異種エンベロープ
タンパク質（例えばＶＳＶ−Ｇ）を発現させることがで
きる。概して、レトロウイルスベクターのさらなる開発
のほとんどは、RetroVacベクターにも適用することがで
きる。これには、組織特異的プロモーターおよび外来Ｄ
ＮＡの部位特異的組込みのためのベクターの制御下にお
ける外来遺伝子の発現が含まれる。
分」は、レトロウイルスベクターの形成に必要なレトロ
ウイルスのあらゆる遺伝子、例えばgag-polおよびenvを
意味する。本発明のキメラポックスウイルス（いわゆる
RetroVacベクター）を構築するため、単純レトロウイル
ス、例えばＭＬＶ、および複合レトロウイルス、例えば
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をも用いることができ
る。同様に、宿主スペクトルを変化させるため、すでに
レトロウイルスベクターについて記載したように、形質
転換するレトロウイルス粒子に対して異種エンベロープ
タンパク質（例えばＶＳＶ−Ｇ）を発現させることがで
きる。概して、レトロウイルスベクターのさらなる開発
のほとんどは、RetroVacベクターにも適用することがで
きる。これには、組織特異的プロモーターおよび外来Ｄ
ＮＡの部位特異的組込みのためのベクターの制御下にお
ける外来遺伝子の発現が含まれる。
【００１６】本発明では、gag、polおよびenv遺伝子は
ポックスウイルスプロモーターの制御下にあることが好
ましい。ポックスウイルスの発現特性にしたがって、大
きな初期部分を有するプロモーターが好ましい。パッケ
ージング成分をコードする配列gag／polおよびenvは、
ポックスウイルス／ワクシニアウイルス特異的プロモー
ターの制御下、ポックスウイルスゲノムの必須領域また
は必須でない領域に組込むことができる１つの転写単位
で、あるいは複数の異なる転写単位で発現させることが
できる。
ポックスウイルスプロモーターの制御下にあることが好
ましい。ポックスウイルスの発現特性にしたがって、大
きな初期部分を有するプロモーターが好ましい。パッケ
ージング成分をコードする配列gag／polおよびenvは、
ポックスウイルス／ワクシニアウイルス特異的プロモー
ターの制御下、ポックスウイルスゲノムの必須領域また
は必須でない領域に組込むことができる１つの転写単位
で、あるいは複数の異なる転写単位で発現させることが
できる。
【００１７】ポックスウイルス転写物にはスプライシン
グが起きない。したがって発現にスプライシングを含む
レトロウイルス遺伝子は、本発明のさらなる態様では、
イントロンを伴わない読み枠としてキメラポックスウイ
ルス中にクローン化する。選択するレトロウイルス系に
応じて、このことを遺伝子env、tat、refまたは他の遺
伝子に適用する。
グが起きない。したがって発現にスプライシングを含む
レトロウイルス遺伝子は、本発明のさらなる態様では、
イントロンを伴わない読み枠としてキメラポックスウイ
ルス中にクローン化する。選択するレトロウイルス系に
応じて、このことを遺伝子env、tat、refまたは他の遺
伝子に適用する。
【００１８】本発明に記載のキメラウイルスを用いて、
欠損レトロウイルス粒子をインビトロおよびインビボの
両方で簡単に産生できる。従来、欠損レトロウイルス粒
子に関するすべての成分がコードされ、１つの単一の担
体ウイルス上に組合されている系は開示されていない。
このことは上記ベクターをインビボにおいて効率的に適
用するための必須の必要条件である。キメラポックスウ
イルスに基づく形質導入欠損レトロウイルスのパッケー
ジングベクターおよび分配／増幅系の開発は、従来記載
されていなかった。しかし、記載されていたことは、ポ
ックスウイルスベクター中のレトロウイルス成分、特に
ＨＩＶのgag-polおよびenvの発現にポックスウイルスベ
クターを用いることである（Moss、1996，Proc．Natl．
Acad．Sci.，USA 93：11341-11348、Paoletti、1996, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 93：11349-11353)。しか
し、これらの研究の目的は基礎的なウイルス学的研究お
よびワクチン開発である。これゆえ、例えばＶＶ（ワク
シニアウイルス）におけるＨＩＶ−１ gag-pol読み枠の
発現は擬似粒子の形成を導くことが知られている（Kara
costasら、1989，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 86：89
64-8967)。同様にgagおよびenvの同時発現は、ワクチン
開発に特に適したＨＩＶ様粒子の形成を誘導する（Haff
arら、1990，J．Virol．64：2653-2659)。また、ＳＩＶ
候補ワクチンとしてポックスウイルスベクターにおける
gag-polおよびenvの二重発現物が記載されている（Hirs
chら、1996，J．Virol．70：3741-3752)。
欠損レトロウイルス粒子をインビトロおよびインビボの
両方で簡単に産生できる。従来、欠損レトロウイルス粒
子に関するすべての成分がコードされ、１つの単一の担
体ウイルス上に組合されている系は開示されていない。
このことは上記ベクターをインビボにおいて効率的に適
用するための必須の必要条件である。キメラポックスウ
イルスに基づく形質導入欠損レトロウイルスのパッケー
ジングベクターおよび分配／増幅系の開発は、従来記載
されていなかった。しかし、記載されていたことは、ポ
ックスウイルスベクター中のレトロウイルス成分、特に
ＨＩＶのgag-polおよびenvの発現にポックスウイルスベ
クターを用いることである（Moss、1996，Proc．Natl．
Acad．Sci.，USA 93：11341-11348、Paoletti、1996, P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 93：11349-11353)。しか
し、これらの研究の目的は基礎的なウイルス学的研究お
よびワクチン開発である。これゆえ、例えばＶＶ（ワク
シニアウイルス）におけるＨＩＶ−１ gag-pol読み枠の
発現は擬似粒子の形成を導くことが知られている（Kara
costasら、1989，Proc．Natl．Acad．Sci.，USA 86：89
64-8967)。同様にgagおよびenvの同時発現は、ワクチン
開発に特に適したＨＩＶ様粒子の形成を誘導する（Haff
arら、1990，J．Virol．64：2653-2659)。また、ＳＩＶ
候補ワクチンとしてポックスウイルスベクターにおける
gag-polおよびenvの二重発現物が記載されている（Hirs
chら、1996，J．Virol．70：3741-3752)。
【００１９】本発明のキメラポックスウイルス用ベクタ
ーとしては、特にコルドポックスウイルスが使用され、
また、オルトポックスウイルス群およびアビポックス
（avipox）ウイルス群由来のウイルスが使用される（Mo
ss、1996，Poxviridae：the viruses and their replic
ation. In：Fieldsら、(ed.) Fields Virolory. ThirdE
dition (3rd. Ed.) Vol. 2. Lippincott-Raven, Philad
elphia, 2637-2671)。しかし、哺乳類細胞に感染する
が、その中で増殖しないポックスウイルス（非複製ベク
ター）を用いるのが好ましい。これゆえ、このようなベ
クターとしてワクシニアウイルス、特に、弱毒ワクシニ
アウイルス（Paoletti，1996，Proc．Natl．Acad．Sc
i.，USA 93：11349-11353)、修飾ワクシニアアンカラ
（Modified Vaccinia Ankara、ＭＶＡ)またはＷＯ９５
／３００１８およびHolzerら（1997，J．Virol，71：49
97-5002）に記載の欠損ワクシニアウイルスを用いるの
が好ましい。最後に述べた欠損ウイルスベクターは容易
に、１０8プラーク形成単位（ＰＵＦ)／ｍＬの力価まで
増殖させることができ、１０11ＰＵＦ／ｍＬの力価まで
濃縮することができる。さらに、例えばＤ４欠失欠損ウ
イルスは複製の初期に残存し、初期ＲＮＡの持続した合
成を誘導する。初期ワクシニアウイルス（ＶＶ)−ＲＮ
Ａのみが５’および３’末端の規定を行い、これが機能
的レトロウイルスゲノム合成の基礎的な必要条件であ
る。レトロウイルスベクターに関するすべての遺伝情報
を発現するワクシニアウイルス欠損粒子は、感染細胞内
で非複製レトロウイルス粒子を形成させ、この粒子が形
質転換潜在能を示す。上記のように特にワクシニアウイ
ルスは１０11ＰＵＦ／ｍＬの力価まで濃縮することがで
きるため、形質転換に基づく力価（これはＣＦＵ／ｍＬ
で表される）は通常のレトロウイルス力価（＞１０6−
１０7）より高い。さらに、レトロウイルス粒子のイン
シトゥー発現によって経時的に放出されるすべての形質
転換用粒子は形質導入に適しており、レトロウイルスの
インビトロ産生におけるような、細胞培養物上清の容量
当たりの形質導入用粒子には適切でない。
ーとしては、特にコルドポックスウイルスが使用され、
また、オルトポックスウイルス群およびアビポックス
（avipox）ウイルス群由来のウイルスが使用される（Mo
ss、1996，Poxviridae：the viruses and their replic
ation. In：Fieldsら、(ed.) Fields Virolory. ThirdE
dition (3rd. Ed.) Vol. 2. Lippincott-Raven, Philad
elphia, 2637-2671)。しかし、哺乳類細胞に感染する
が、その中で増殖しないポックスウイルス（非複製ベク
ター）を用いるのが好ましい。これゆえ、このようなベ
クターとしてワクシニアウイルス、特に、弱毒ワクシニ
アウイルス（Paoletti，1996，Proc．Natl．Acad．Sc
i.，USA 93：11349-11353)、修飾ワクシニアアンカラ
（Modified Vaccinia Ankara、ＭＶＡ)またはＷＯ９５
／３００１８およびHolzerら（1997，J．Virol，71：49
97-5002）に記載の欠損ワクシニアウイルスを用いるの
が好ましい。最後に述べた欠損ウイルスベクターは容易
に、１０8プラーク形成単位（ＰＵＦ)／ｍＬの力価まで
増殖させることができ、１０11ＰＵＦ／ｍＬの力価まで
濃縮することができる。さらに、例えばＤ４欠失欠損ウ
イルスは複製の初期に残存し、初期ＲＮＡの持続した合
成を誘導する。初期ワクシニアウイルス（ＶＶ)−ＲＮ
Ａのみが５’および３’末端の規定を行い、これが機能
的レトロウイルスゲノム合成の基礎的な必要条件であ
る。レトロウイルスベクターに関するすべての遺伝情報
を発現するワクシニアウイルス欠損粒子は、感染細胞内
で非複製レトロウイルス粒子を形成させ、この粒子が形
質転換潜在能を示す。上記のように特にワクシニアウイ
ルスは１０11ＰＵＦ／ｍＬの力価まで濃縮することがで
きるため、形質転換に基づく力価（これはＣＦＵ／ｍＬ
で表される）は通常のレトロウイルス力価（＞１０6−
１０7）より高い。さらに、レトロウイルス粒子のイン
シトゥー発現によって経時的に放出されるすべての形質
転換用粒子は形質導入に適しており、レトロウイルスの
インビトロ産生におけるような、細胞培養物上清の容量
当たりの形質導入用粒子には適切でない。
【００２０】本発明の特別な態様では、ＷＯ９５／３０
０１８に記載されるような非複製ワクシニアウイルスを
非複製欠陥レトロウイルスに関する遺伝情報の担体とし
て用いる。外来遺伝子およびパッケージングシグナルps
iを含む修飾レトロウイルスゲノムならびにレトロウイ
ルス遺伝子gag-polおよびenvの両者は欠損ワクシニアウ
イルスのゲノムにコードされる。パッケージング成分を
コードする配列gag/polおよびenvは、ポックスウイルス
／ワクシニアウイルス特異的プロモーターの制御下、１
つの転写単位で、あるいはいくつかの転写単位で発現さ
せることができ、ポックスウイルスゲノムの必須領域ま
たは必須でない領域に組込むことができる。ベクター成
分の配列は、ポックスウイルス、好ましくは初期ポック
スウイルスプロモーターの制御下、組換えウイルスの必
須領域または必須でない領域に自律転写単位として挿入
することができる。必須領域に挿入するのが好ましい。
０１８に記載されるような非複製ワクシニアウイルスを
非複製欠陥レトロウイルスに関する遺伝情報の担体とし
て用いる。外来遺伝子およびパッケージングシグナルps
iを含む修飾レトロウイルスゲノムならびにレトロウイ
ルス遺伝子gag-polおよびenvの両者は欠損ワクシニアウ
イルスのゲノムにコードされる。パッケージング成分を
コードする配列gag/polおよびenvは、ポックスウイルス
／ワクシニアウイルス特異的プロモーターの制御下、１
つの転写単位で、あるいはいくつかの転写単位で発現さ
せることができ、ポックスウイルスゲノムの必須領域ま
たは必須でない領域に組込むことができる。ベクター成
分の配列は、ポックスウイルス、好ましくは初期ポック
スウイルスプロモーターの制御下、組換えウイルスの必
須領域または必須でない領域に自律転写単位として挿入
することができる。必須領域に挿入するのが好ましい。
【００２１】ＤＮＡ配列ＴＴＴＴＴＮＴは初期ポックス
ウイルス／ワクシニア転写の終結を導く。効率的にレト
ロウイルス配列を発現するために、レトロウイルス配列
内または外来遺伝子内に存在することもあるＴＴＴＴＴ
ＮＴシグナルはそれぞれ、レトロウイルスタンパク質の
アミノ酸配列を変化させず、あるいは欠損レトロウイル
スのＲＮＡゲノム上の制御シグナル、例えばpsi、およ
び組込み領域「att」を崩壊させずに点突然変異によっ
て修飾すべきである。
ウイルス／ワクシニア転写の終結を導く。効率的にレト
ロウイルス配列を発現するために、レトロウイルス配列
内または外来遺伝子内に存在することもあるＴＴＴＴＴ
ＮＴシグナルはそれぞれ、レトロウイルスタンパク質の
アミノ酸配列を変化させず、あるいは欠損レトロウイル
スのＲＮＡゲノム上の制御シグナル、例えばpsi、およ
び組込み領域「att」を崩壊させずに点突然変異によっ
て修飾すべきである。
【００２２】本発明の特別な態様では、パッケージング
成分およびベクター成分をコードする配列はそれぞれ、
いかなるポックスウイルス／ワクシニアウイルス特異的
終止シグナルも含まない。ベクター成分配列の発現に関
するかぎりでは、本発明のキメラポックスウイルス−Re
troVac系において、ベクター成分配列をポックスウイル
ス特異的プロモーターの転写制御下に置くことが好まし
い。本発明の好ましいキメラ欠損ワクシニアウイルス構
築物では、初期ワクシニアウイルス転写物の終結用シグ
ナルは３’領域の下流に挿入され、これゆえ生じるｍＲ
ＮＡの３’末端は前記レトロウイルスベクターゲノムの
３’末端と異なる。いわゆる初期ワクシニアｍＲＮＡに
ついては、ほとんどが規定の３’末端を有する。ウイル
ス転写物の大部分を構成する後期ワクシニアｍＲＮＡは
具体的なシグナルで終結せず、異なる長さを有し、それ
ゆえレトロウイルスベクターゲノムとして適当でない。
Ｄ４−欠損ＶＶは複製の後期には入らない。このことは
タンパク質の35Ｓ標識実験およびノザンブロット実験に
おいて初期発現が予想外に長く持続することによって証
明された（Holzerら、1997, J. Virol. 71：4997-500
2)。即ち、これらは規定のレトロウイルスゲノムの合成
のための、ポックスウイルス間に特有なツールであるこ
とが証明された。
成分およびベクター成分をコードする配列はそれぞれ、
いかなるポックスウイルス／ワクシニアウイルス特異的
終止シグナルも含まない。ベクター成分配列の発現に関
するかぎりでは、本発明のキメラポックスウイルス−Re
troVac系において、ベクター成分配列をポックスウイル
ス特異的プロモーターの転写制御下に置くことが好まし
い。本発明の好ましいキメラ欠損ワクシニアウイルス構
築物では、初期ワクシニアウイルス転写物の終結用シグ
ナルは３’領域の下流に挿入され、これゆえ生じるｍＲ
ＮＡの３’末端は前記レトロウイルスベクターゲノムの
３’末端と異なる。いわゆる初期ワクシニアｍＲＮＡに
ついては、ほとんどが規定の３’末端を有する。ウイル
ス転写物の大部分を構成する後期ワクシニアｍＲＮＡは
具体的なシグナルで終結せず、異なる長さを有し、それ
ゆえレトロウイルスベクターゲノムとして適当でない。
Ｄ４−欠損ＶＶは複製の後期には入らない。このことは
タンパク質の35Ｓ標識実験およびノザンブロット実験に
おいて初期発現が予想外に長く持続することによって証
明された（Holzerら、1997, J. Virol. 71：4997-500
2)。即ち、これらは規定のレトロウイルスゲノムの合成
のための、ポックスウイルス間に特有なツールであるこ
とが証明された。
【００２３】本発明のキメラポックスウイルスの１つの
利点は、これらを非常に高いウイルス力価にまで増殖さ
せ、濃縮することができることである。さらにポックス
ウイルス、特にワクシニアウイルスから派生したベクタ
ーは非常に安定であり、肝臓または脾臓のような器官に
効率的に感染し、そして複製しない形質転換レトロウイ
ルス粒子を直接標的器官において産生する（レトロウイ
ルス粒子のインビボ増幅)。ポックスウイルスは組織特
異的（最初に結合した器官に特異的）であるから、本発
明のキメラポックスウイルス、特にキメラワクシニアウ
イルスによって組織特異的に形質転換が行われる。例え
ばキメラワクシニアウイルス（RetroVacハイブリッドベ
クター）による感染は、ワクシニアウイルスの向性に対
応し、また用いるレトロウイルスエンベロープタンパク
質に対するレセプターを発現している組織で優先的に起
こる。用いるワクシニアウイルス株および擬似タイピン
グの適当な組合せを介して、治療遺伝子およびレトロウ
イルスベクターの両者のより厳密なターゲティングが達
成できる。
利点は、これらを非常に高いウイルス力価にまで増殖さ
せ、濃縮することができることである。さらにポックス
ウイルス、特にワクシニアウイルスから派生したベクタ
ーは非常に安定であり、肝臓または脾臓のような器官に
効率的に感染し、そして複製しない形質転換レトロウイ
ルス粒子を直接標的器官において産生する（レトロウイ
ルス粒子のインビボ増幅)。ポックスウイルスは組織特
異的（最初に結合した器官に特異的）であるから、本発
明のキメラポックスウイルス、特にキメラワクシニアウ
イルスによって組織特異的に形質転換が行われる。例え
ばキメラワクシニアウイルス（RetroVacハイブリッドベ
クター）による感染は、ワクシニアウイルスの向性に対
応し、また用いるレトロウイルスエンベロープタンパク
質に対するレセプターを発現している組織で優先的に起
こる。用いるワクシニアウイルス株および擬似タイピン
グの適当な組合せを介して、治療遺伝子およびレトロウ
イルスベクターの両者のより厳密なターゲティングが達
成できる。
【００２４】キメラポックスウイルスベクター、特に欠
損ワクシニアウイルスに基づくRetroVacベクターは、外
来ＤＮＡを標的細胞に安定に組込むレトロウイルスの能
力とポックスウイルス／ワクシニアベクターの技術的利
点とを合わせ持つ。この系の主な特徴は宿主細胞にキメ
ラポックスウイルス、特にワクシニアウイルスベクター
に基づくRetroVacベクターが感染するときに、機能的レ
トロウイルス粒子の形成に必要なタンパク質が発現さ
れ、外来遺伝子を含むｍＲＮＡがゲノムＲＮＡとして転
写されてレトロウイルス粒子にパッケージングされるこ
とである。これらの粒子は増殖できない（複製欠陥性）
が、形質転換潜在能力は有している。最初にキメラポッ
クスウイルス、特にキメラワクシニアウイルスによって
感染された細胞は死ぬが、形成されるレトロウイルス粒
子による二次レトロウイルス感染の細胞では、レトロウ
イルス配列、およびしたがって外来遺伝子が細胞ゲノム
中に恒久的に組込まれる。
損ワクシニアウイルスに基づくRetroVacベクターは、外
来ＤＮＡを標的細胞に安定に組込むレトロウイルスの能
力とポックスウイルス／ワクシニアベクターの技術的利
点とを合わせ持つ。この系の主な特徴は宿主細胞にキメ
ラポックスウイルス、特にワクシニアウイルスベクター
に基づくRetroVacベクターが感染するときに、機能的レ
トロウイルス粒子の形成に必要なタンパク質が発現さ
れ、外来遺伝子を含むｍＲＮＡがゲノムＲＮＡとして転
写されてレトロウイルス粒子にパッケージングされるこ
とである。これらの粒子は増殖できない（複製欠陥性）
が、形質転換潜在能力は有している。最初にキメラポッ
クスウイルス、特にキメラワクシニアウイルスによって
感染された細胞は死ぬが、形成されるレトロウイルス粒
子による二次レトロウイルス感染の細胞では、レトロウ
イルス配列、およびしたがって外来遺伝子が細胞ゲノム
中に恒久的に組込まれる。
【００２５】本発明のキメラポックスウイルスによる欠
損レトロウイルス粒子の遊離は、レトロウイルスの転写
およびゲノムＲＮＡのキャッピングが通常、核で生じる
ことを考えると驚くべきことである（Coffin、1996，Re
troviridae：the viruses and their replication. I
n：Fieldsら、(ed.) Fields Virology. Third Edition
(3rd Ed.) Vol. 2, Lippincott-Raven, Philadelphia,
1767-1847)。示したキメラポックスウイルス系では、転
写およびキャッピングが細胞質で生じる。これゆえワク
シニアウイルス特異的キャップ構造はレトロウイルスパ
ッケージングを妨げない。驚くべきことに、細胞質性ポ
ックスウイルス／ワクシニア転写系によって産生される
転写物がレトロウイルス転写および複製系と両立可能で
あることがわかった。核で認識されるポリアデニル化シ
グナルがプロウイルスのＵ３およびＲ領域内に局在する
ことを考えるかぎりでは、このことは予想できないこと
であった。
損レトロウイルス粒子の遊離は、レトロウイルスの転写
およびゲノムＲＮＡのキャッピングが通常、核で生じる
ことを考えると驚くべきことである（Coffin、1996，Re
troviridae：the viruses and their replication. I
n：Fieldsら、(ed.) Fields Virology. Third Edition
(3rd Ed.) Vol. 2, Lippincott-Raven, Philadelphia,
1767-1847)。示したキメラポックスウイルス系では、転
写およびキャッピングが細胞質で生じる。これゆえワク
シニアウイルス特異的キャップ構造はレトロウイルスパ
ッケージングを妨げない。驚くべきことに、細胞質性ポ
ックスウイルス／ワクシニア転写系によって産生される
転写物がレトロウイルス転写および複製系と両立可能で
あることがわかった。核で認識されるポリアデニル化シ
グナルがプロウイルスのＵ３およびＲ領域内に局在する
ことを考えるかぎりでは、このことは予想できないこと
であった。
【００２６】概してポックスウイルスは細胞溶解性のウ
イルスであり、これによりキメラポックスウイルスによ
って感染された細胞は多くの場合死ぬ。組織中に生じる
障害のため、近隣の細胞の分裂が引き起こされ、これゆ
え形成されるレトロウイルス粒子によるレトロウイルス
性形質転換をさらにより受けやすくなる。外胚葉細胞の
場合には、ポックスウイルス自身の成長因子によってこ
の増殖作用が増加する。したがって特別な態様では、本
発明のキメラポックスウイルスは成長因子または有糸分
裂促進物質をコードする配列を含む。これにより、ポッ
クスウイルス感染細胞の近隣の細胞の増殖作用はキメラ
ポックスウイルスの発現によって増加され得る。さらな
る特別な態様では、レンチウイルスに基づいてRetroVac
ベクターを構築することが可能であるが、系に所望の性
質を与える付随レンチウイルス遺伝子（accessory lent
ivirus gene）はＶＶ担体内に発現されなければならな
い。
イルスであり、これによりキメラポックスウイルスによ
って感染された細胞は多くの場合死ぬ。組織中に生じる
障害のため、近隣の細胞の分裂が引き起こされ、これゆ
え形成されるレトロウイルス粒子によるレトロウイルス
性形質転換をさらにより受けやすくなる。外胚葉細胞の
場合には、ポックスウイルス自身の成長因子によってこ
の増殖作用が増加する。したがって特別な態様では、本
発明のキメラポックスウイルスは成長因子または有糸分
裂促進物質をコードする配列を含む。これにより、ポッ
クスウイルス感染細胞の近隣の細胞の増殖作用はキメラ
ポックスウイルスの発現によって増加され得る。さらな
る特別な態様では、レンチウイルスに基づいてRetroVac
ベクターを構築することが可能であるが、系に所望の性
質を与える付随レンチウイルス遺伝子（accessory lent
ivirus gene）はＶＶ担体内に発現されなければならな
い。
【００２７】プラスミドトランスフェクション、キメラ
アデノウイルス／レトロウイルスベクターまたはキメラ
ヘルペスウイルス／レトロウイルスベクターとは対照的
に、ワクシニアウイルスによる発現は宿主細胞の細胞質
で生じる。プラスミドトランスフェクションの後、ある
いはアデノウイルス／レトロウイルス感染の場合、細胞
質の転写装置の援助により外来遺伝子の転写が核内で生
じるが、ワクシニアウイルスの遺伝子発現は、細胞の転
写装置とは異なるウイルスの転写装置を用いて、もっぱ
ら細胞質内（サイトソル）で起こる。これにより複製レ
トロウイルスが発生する可能性が非常に低いかぎり、こ
のことは本発明のポックスウイルスベクターの利点であ
る決定的な安全性に寄与する。ワクシニアウイルスによ
るゲノムレトロウイルスＲＮＡの転写は標的細胞の核か
ら独立して起こるので、このアプローチはもっぱら最適
な外来遺伝子発現および形質導入標的細胞の安全性の観
点から、レトロウイルスゲノム上での核転写シグナルの
配置を初めて可能にする。同様に、イントロンはワクシ
ニアウイルス系におけるベクターＲＮＡの発現に影響し
ないので、治療遺伝子の発現を高めるのにイントロンを
用いることができる。
アデノウイルス／レトロウイルスベクターまたはキメラ
ヘルペスウイルス／レトロウイルスベクターとは対照的
に、ワクシニアウイルスによる発現は宿主細胞の細胞質
で生じる。プラスミドトランスフェクションの後、ある
いはアデノウイルス／レトロウイルス感染の場合、細胞
質の転写装置の援助により外来遺伝子の転写が核内で生
じるが、ワクシニアウイルスの遺伝子発現は、細胞の転
写装置とは異なるウイルスの転写装置を用いて、もっぱ
ら細胞質内（サイトソル）で起こる。これにより複製レ
トロウイルスが発生する可能性が非常に低いかぎり、こ
のことは本発明のポックスウイルスベクターの利点であ
る決定的な安全性に寄与する。ワクシニアウイルスによ
るゲノムレトロウイルスＲＮＡの転写は標的細胞の核か
ら独立して起こるので、このアプローチはもっぱら最適
な外来遺伝子発現および形質導入標的細胞の安全性の観
点から、レトロウイルスゲノム上での核転写シグナルの
配置を初めて可能にする。同様に、イントロンはワクシ
ニアウイルス系におけるベクターＲＮＡの発現に影響し
ないので、治療遺伝子の発現を高めるのにイントロンを
用いることができる。
【００２８】細胞質で複製するＤＮＡウイルスに基づく
本発明のウイルスベクター系のさらに特別な利点は、核
内でのウイルス増殖とは異なり、細胞質で転写されるウ
イルスベクターの生活環ではスプライシングが生じない
ので、レトロウイルス転写単位が、通常は核と共にある
ことが許容されず、あるいは可能でない転写シグナルを
含むことができることである。これゆえRetroVac系で
は、例えばレトロウイルスのパッケージングシグナルps
iをスプライシングシグナルの横に置くことができ、こ
れにより、パッケージングシグナルを有さないためにレ
トロウイルスゲノムの本質的性質を喪失したＲＮＡが宿
主細胞におけるレトロウイルス欠損ゲノムの形質導入お
よび同ゲノムの転写後に誘導される（図２Ｃ参照)。こ
の可能性はポックスウイルス系で産生されるレトロウイ
ルス欠損ゲノムの系の安全性を実質的に増加させる。野
生型状況と異なるパッケージングシグナルの機能性はす
でに示した。
本発明のウイルスベクター系のさらに特別な利点は、核
内でのウイルス増殖とは異なり、細胞質で転写されるウ
イルスベクターの生活環ではスプライシングが生じない
ので、レトロウイルス転写単位が、通常は核と共にある
ことが許容されず、あるいは可能でない転写シグナルを
含むことができることである。これゆえRetroVac系で
は、例えばレトロウイルスのパッケージングシグナルps
iをスプライシングシグナルの横に置くことができ、こ
れにより、パッケージングシグナルを有さないためにレ
トロウイルスゲノムの本質的性質を喪失したＲＮＡが宿
主細胞におけるレトロウイルス欠損ゲノムの形質導入お
よび同ゲノムの転写後に誘導される（図２Ｃ参照)。こ
の可能性はポックスウイルス系で産生されるレトロウイ
ルス欠損ゲノムの系の安全性を実質的に増加させる。野
生型状況と異なるパッケージングシグナルの機能性はす
でに示した。
【００２９】本発明のさらなる態様は、レトロウイルス
欠損ＲＮＡを細胞質で転写する場合、レトロウイルス性
形質導入を介してイントロン−エキソン構造を有する確
立した転写単位を損傷なしに（スプライシングなしに）
宿主細胞のゲノムに組込むことができることである（図
２Ａ参照)。恒久的に発現するセルラインを確立する場
合には、概して、プロモーター、外来遺伝子のオープン
読み枠（ＯＲＦ)、イントロンおよびポリアデニル化シ
グナルを含む遺伝子カセットを転移させ、細菌プラスミ
ドにクローン化する。最適なｍＲＮＡ産生のためには、
イントロンが転写単位内にあることが必要とされ、この
ことは特にトランスジェニック動物において観察されて
いる。市販の高等細胞用発現ベクターのほとんどはその
発現カセット内に経験的に定められたプロモーター−イ
ントロンの組合せを含む：例えばベクターｐＣＭＶβ上
のＣＭＶプロモーター／エンハンサーＳＶ４０イントロ
ンの組合せ（Clontech Laboratories, Palo Alto）は首
尾よいことが証明されている。従来既知のレトロウイル
スまたはキメラ遺伝子転移ベクターそれぞれによって、
このようなイントロン−エキソン構造を有する最適化単
位を形質導入することはできない。
欠損ＲＮＡを細胞質で転写する場合、レトロウイルス性
形質導入を介してイントロン−エキソン構造を有する確
立した転写単位を損傷なしに（スプライシングなしに）
宿主細胞のゲノムに組込むことができることである（図
２Ａ参照)。恒久的に発現するセルラインを確立する場
合には、概して、プロモーター、外来遺伝子のオープン
読み枠（ＯＲＦ)、イントロンおよびポリアデニル化シ
グナルを含む遺伝子カセットを転移させ、細菌プラスミ
ドにクローン化する。最適なｍＲＮＡ産生のためには、
イントロンが転写単位内にあることが必要とされ、この
ことは特にトランスジェニック動物において観察されて
いる。市販の高等細胞用発現ベクターのほとんどはその
発現カセット内に経験的に定められたプロモーター−イ
ントロンの組合せを含む：例えばベクターｐＣＭＶβ上
のＣＭＶプロモーター／エンハンサーＳＶ４０イントロ
ンの組合せ（Clontech Laboratories, Palo Alto）は首
尾よいことが証明されている。従来既知のレトロウイル
スまたはキメラ遺伝子転移ベクターそれぞれによって、
このようなイントロン−エキソン構造を有する最適化単
位を形質導入することはできない。
【００３０】本発明に記載のRetroVac系はこの問題を解
決する。これは、スプライシング装置が存在しないた
め、転写中にワクシニアウイルス中のイントロンは除去
されないからである。したがって、RetroVac系で産生さ
れるレトロウイルス欠損ゲノムの転写後、完全な転写単
位を標的細胞に組込むことができる（図２Ａ参照)。凝
固第ＶＩＩＩ因子のような遺伝子治療のために発現させ
ることが困難なｃＤＮＡを転移する点でこれは特に重要
であり、最適化プロモーター／イントロンの組合せの転
移を可能にする。本発明の特別な態様として、本発明に
記載の系によりイントロン含有ゲノムを含む欠損レトロ
ウイルス粒子を提供する。
決する。これは、スプライシング装置が存在しないた
め、転写中にワクシニアウイルス中のイントロンは除去
されないからである。したがって、RetroVac系で産生さ
れるレトロウイルス欠損ゲノムの転写後、完全な転写単
位を標的細胞に組込むことができる（図２Ａ参照)。凝
固第ＶＩＩＩ因子のような遺伝子治療のために発現させ
ることが困難なｃＤＮＡを転移する点でこれは特に重要
であり、最適化プロモーター／イントロンの組合せの転
移を可能にする。本発明の特別な態様として、本発明に
記載の系によりイントロン含有ゲノムを含む欠損レトロ
ウイルス粒子を提供する。
【００３１】細胞質性の転写系によってのみ標的細胞の
定められた部位に転移され得るＲＮＡプロセッシングシ
グナルは、核内において転写物の定められた終結を生じ
させる内部ポリアデニル化シグナルである（図２Ｂ)。
核内における完全レトロウイルス欠損ゲノムの完成前
の、例えばRetroVac系で産生されるレトロウイルス欠損
ゲノムの形質導入による転写物の終結は、いったん組込
まれた外来遺伝子は、その転写物が成熟前に終結するた
め、さらに形質導入させることができないので、特に安
全な遺伝子治療を可能にする。同様に、スプライシング
シグナル間のパッケージングシグナルの局在（図２Ｃ）
は、RetroVac系でのみ可能であり、宿主細胞内でパッケ
ージングシグナルを欠いたレトロウイルス欠損ゲノムの
転写を誘導する。これゆえ、内部ポリアデニル化シグナ
ルと組合せて、特に安全な遺伝子カセットを転移させる
ことができる。
定められた部位に転移され得るＲＮＡプロセッシングシ
グナルは、核内において転写物の定められた終結を生じ
させる内部ポリアデニル化シグナルである（図２Ｂ)。
核内における完全レトロウイルス欠損ゲノムの完成前
の、例えばRetroVac系で産生されるレトロウイルス欠損
ゲノムの形質導入による転写物の終結は、いったん組込
まれた外来遺伝子は、その転写物が成熟前に終結するた
め、さらに形質導入させることができないので、特に安
全な遺伝子治療を可能にする。同様に、スプライシング
シグナル間のパッケージングシグナルの局在（図２Ｃ）
は、RetroVac系でのみ可能であり、宿主細胞内でパッケ
ージングシグナルを欠いたレトロウイルス欠損ゲノムの
転写を誘導する。これゆえ、内部ポリアデニル化シグナ
ルと組合せて、特に安全な遺伝子カセットを転移させる
ことができる。
【００３２】本発明のさらなる態様は、上記明確にした
タイプのキメラポックスウイルスおよび製薬的担体を含
む組成物に関する。本発明に記載のRetroVac系は、レト
ロウイルスで遺伝子治療する意義のあるすべての適用に
おいて利用することができる。これは血漿タンパク質欠
損、特に血友病（第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子欠
損）およびエリトロポエチン欠損を処置するためのイン
ビボ遺伝子治療に適している。投与は静脈内または筋肉
内が可能である。適当に製剤化すれば、本発明に記載の
キメラポックスウイルスの安定性は、ベクターをスプレ
ー剤として経口投与することを可能にし、これにより嚢
胞性繊維症の吸入処置が可能となる。
タイプのキメラポックスウイルスおよび製薬的担体を含
む組成物に関する。本発明に記載のRetroVac系は、レト
ロウイルスで遺伝子治療する意義のあるすべての適用に
おいて利用することができる。これは血漿タンパク質欠
損、特に血友病（第ＩＸ因子および第ＶＩＩＩ因子欠
損）およびエリトロポエチン欠損を処置するためのイン
ビボ遺伝子治療に適している。投与は静脈内または筋肉
内が可能である。適当に製剤化すれば、本発明に記載の
キメラポックスウイルスの安定性は、ベクターをスプレ
ー剤として経口投与することを可能にし、これにより嚢
胞性繊維症の吸入処置が可能となる。
【００３３】RetroVacベクターのさらなる適用は腫瘍治
療である。例えば、いわゆる自殺遺伝子が腫瘍またはそ
の転移物に転移することは動物実験モデルにおいて裏付
け証明されたことが示されている（Carusoら、1993，Pr
oc．Natl．Acad．Sci.，USA90：7024-7028. Culverら、
1992，Science 256：1550-1552)。このような実験で
は、無毒性ヌクレオシド類似体（例えばガンシクロビ
ル）を有毒なものに変換するＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を、欠
損レトロウイルス粒子をインシトゥーで遊離するパッケ
ージングセルラインを腫瘍内注射することによって形質
導入させ、次いでガンシクロビルでの化学療法を実行す
る。これにより本発明のRetroVacベクターを用いて、自
殺遺伝子を安全に、そしてより効率的に投与できる。
療である。例えば、いわゆる自殺遺伝子が腫瘍またはそ
の転移物に転移することは動物実験モデルにおいて裏付
け証明されたことが示されている（Carusoら、1993，Pr
oc．Natl．Acad．Sci.，USA90：7024-7028. Culverら、
1992，Science 256：1550-1552)。このような実験で
は、無毒性ヌクレオシド類似体（例えばガンシクロビ
ル）を有毒なものに変換するＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を、欠
損レトロウイルス粒子をインシトゥーで遊離するパッケ
ージングセルラインを腫瘍内注射することによって形質
導入させ、次いでガンシクロビルでの化学療法を実行す
る。これにより本発明のRetroVacベクターを用いて、自
殺遺伝子を安全に、そしてより効率的に投与できる。
【００３４】同様にアポトーシス誘導性腫瘍抑制遺伝
子、例えば腫瘍の５０％以上を変化させるｐ５３遺伝子
は外来遺伝子として本発明のRetroVacベクターに挿入で
きる。これらの腫瘍抑制遺伝子を遺伝子治療的に転移さ
せると、腫瘍細胞は内発性制御のために成長をやめる。
腫瘍治療（例えば白血病の治療）のためのエクスビボ細
胞形質導入も同様に可能であり；さらにガン治療のため
に直接腫瘍内注射することができる。系の安全性を増加
させるために、インビボにおいて形質導入手順のせいで
腫瘍形成の活性化が生じた場合に、化学治療を可能にす
るいわゆる自殺遺伝子を運搬するベクター、例えば挿入
チミジンキナーゼ遺伝子を有するヘルペス単純ウイルス
（ＨＳＶ）を用いることができる。
子、例えば腫瘍の５０％以上を変化させるｐ５３遺伝子
は外来遺伝子として本発明のRetroVacベクターに挿入で
きる。これらの腫瘍抑制遺伝子を遺伝子治療的に転移さ
せると、腫瘍細胞は内発性制御のために成長をやめる。
腫瘍治療（例えば白血病の治療）のためのエクスビボ細
胞形質導入も同様に可能であり；さらにガン治療のため
に直接腫瘍内注射することができる。系の安全性を増加
させるために、インビボにおいて形質導入手順のせいで
腫瘍形成の活性化が生じた場合に、化学治療を可能にす
るいわゆる自殺遺伝子を運搬するベクター、例えば挿入
チミジンキナーゼ遺伝子を有するヘルペス単純ウイルス
（ＨＳＶ）を用いることができる。
【００３５】また、レトロウイルス粒子は特に効率的な
形質導入を可能とし、ＲＮＡプロセッシングシグナル
（イントロン、ポリアデニル化部位）の転移により、最
適な遺伝子カセットを転移させることができるため、こ
の系は恒久的セルラインを産生するために用いることが
できる。このように遺伝子カセットを非常に効率的に転
移させることを初めて可能にし、これによりスクリーニ
ング技術と組合せて高度に発現する細胞クローンの迅速
な同定が可能となる。これゆえ、本発明の特別な態様
は、特に遺伝子治療および腫瘍治療に用いることができ
る医薬を製造するための、本発明に記載のキメラポック
スウイルスの使用に関する。本発明の範囲内では、特に
イントロン含有ゲノムを含んだままである点に特徴があ
る上記キメラポックスウイルスによって欠損レトロウイ
ルス粒子を得る。以下に実施例および図面を挙げ、本発
明をより詳細に説明するが、これらに限定されない。
形質導入を可能とし、ＲＮＡプロセッシングシグナル
（イントロン、ポリアデニル化部位）の転移により、最
適な遺伝子カセットを転移させることができるため、こ
の系は恒久的セルラインを産生するために用いることが
できる。このように遺伝子カセットを非常に効率的に転
移させることを初めて可能にし、これによりスクリーニ
ング技術と組合せて高度に発現する細胞クローンの迅速
な同定が可能となる。これゆえ、本発明の特別な態様
は、特に遺伝子治療および腫瘍治療に用いることができ
る医薬を製造するための、本発明に記載のキメラポック
スウイルスの使用に関する。本発明の範囲内では、特に
イントロン含有ゲノムを含んだままである点に特徴があ
る上記キメラポックスウイルスによって欠損レトロウイ
ルス粒子を得る。以下に実施例および図面を挙げ、本発
明をより詳細に説明するが、これらに限定されない。
【００３６】
【実施例】実施例１：ワクシニアウイルス（ＶＶ）欠損
ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮの構築 プロウイルスベクタープラスミドｐＬＸＳＮ（Miller
ら,1989, Riotechniques. 7: 980-990）のレトロウイル
ス欠損ウイルスゲノムにおいて、初期ワクシニアウイル
ス（ＶＶ）転写終止シグナルを除去し、このように除去
されたゲノムを強力なＶＶ初期プロモーターの後ろにク
ローニングした後、ＶＶ欠損ウイルス種ｖＤ４−ｖＡ
（Holzerら, 1997, J. Virol. 71: 4997-5002）のチミ
ジンキナ−ゼ（ｔｋ）座へ挿入した。これにより、レト
ロウイルス欠損ゲノムは、生じたＶＶ欠損ウイルスｖｄ
−ＬＸＳＮにおいて、初期ＶＶ感染サイクルにおいて転
写された。
ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮの構築 プロウイルスベクタープラスミドｐＬＸＳＮ（Miller
ら,1989, Riotechniques. 7: 980-990）のレトロウイル
ス欠損ウイルスゲノムにおいて、初期ワクシニアウイル
ス（ＶＶ）転写終止シグナルを除去し、このように除去
されたゲノムを強力なＶＶ初期プロモーターの後ろにク
ローニングした後、ＶＶ欠損ウイルス種ｖＤ４−ｖＡ
（Holzerら, 1997, J. Virol. 71: 4997-5002）のチミ
ジンキナ−ゼ（ｔｋ）座へ挿入した。これにより、レト
ロウイルス欠損ゲノムは、生じたＶＶ欠損ウイルスｖｄ
−ＬＸＳＮにおいて、初期ＶＶ感染サイクルにおいて転
写された。
【００３７】プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮの構築 プラスミドｐＬＸＳＮ（Clontech Laboratories, Inc.,
Palo Alto, CA）におけるレトロウイルス欠損ゲノム
は、以下のような順序の遺伝エレメントを有してｓてい
る：ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＭＣＳ／ＳＶ４０−ｎｅｏ−遺伝
子カセット−ＬＴＲ（ＬＴＲ、長末端反復配列；ｐｓ
ｉ、レトロウイルスＲＮＡのためのパッケージングシグ
ナル；ＭＣＳ、多重クローニング部位（multiple cloni
ng site）；ＳＶ４０−ｎｅｏ、ＳＶ４０プロモーター
ネオマイシン耐性遺伝子カセット）。この構築物のＭＣ
Ｓに、適当な外来遺伝子を挿入し得る。ＳＶ４０−ｎｅ
ｏ遺伝子カセットは、その助けによりレトロウイルス形
質導入細胞が選択され得る選択マーカーとしてはたら
く。
Palo Alto, CA）におけるレトロウイルス欠損ゲノム
は、以下のような順序の遺伝エレメントを有してｓてい
る：ＬＴＲ−ｐｓｉ−ＭＣＳ／ＳＶ４０−ｎｅｏ−遺伝
子カセット−ＬＴＲ（ＬＴＲ、長末端反復配列；ｐｓ
ｉ、レトロウイルスＲＮＡのためのパッケージングシグ
ナル；ＭＣＳ、多重クローニング部位（multiple cloni
ng site）；ＳＶ４０−ｎｅｏ、ＳＶ４０プロモーター
ネオマイシン耐性遺伝子カセット）。この構築物のＭＣ
Ｓに、適当な外来遺伝子を挿入し得る。ＳＶ４０−ｎｅ
ｏ遺伝子カセットは、その助けによりレトロウイルス形
質導入細胞が選択され得る選択マーカーとしてはたら
く。
【００３８】ｐＬＸＳＮのプロウイルスレトロウイルス
ＤＮＡは、初期転写の部分的な終止を導く３つのＴＴＴ
ＴＴＮＴシグナルを有している。個々のフラグメントを
ＰＣＲによってクローニングし、突然変異誘発によって
修飾した（図３）。このために、テンプレートとしてプ
ラスミドｐＬＸＳＮを用い、異なるオリゴヌクレオチド
によって以下の３つのＰＣＲフラグメントを増幅した。
これにより、存在するＴＴＴＴＴＮＴシグナルを修飾す
る点変異を導入した。フラグメントＬＸ１、ＬＸ２およ
びＬＸ３の調製を以下に記載するように行った。
ＤＮＡは、初期転写の部分的な終止を導く３つのＴＴＴ
ＴＴＮＴシグナルを有している。個々のフラグメントを
ＰＣＲによってクローニングし、突然変異誘発によって
修飾した（図３）。このために、テンプレートとしてプ
ラスミドｐＬＸＳＮを用い、異なるオリゴヌクレオチド
によって以下の３つのＰＣＲフラグメントを増幅した。
これにより、存在するＴＴＴＴＴＮＴシグナルを修飾す
る点変異を導入した。フラグメントＬＸ１、ＬＸ２およ
びＬＸ３の調製を以下に記載するように行った。
【００３９】ＬＸ１：オリゴヌクレオチドプライマーｏ
ＲＶ−５（５'−ＴＡＣＧＴＡＣＧＧＣ ＧＣＧＣＣＡ
ＧＴＣＴ ＴＣＣＧＡＴＡＧ−３'）およびｏＲＶ−６
（５'−ＧＡＡＣＣＧＧＴＣＧ ＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴ
ＧＡＣ−３'）によって、ｏＲＶ−５によりＳｎａＢ
Ｉ開裂部位が導入され、ｏＲＶ−６によりＡｇｅＩ開裂
部位が導入されている１．６ｋｂのフラグメントを作成
した。
ＲＶ−５（５'−ＴＡＣＧＴＡＣＧＧＣ ＧＣＧＣＣＡ
ＧＴＣＴ ＴＣＣＧＡＴＡＧ−３'）およびｏＲＶ−６
（５'−ＧＡＡＣＣＧＧＴＣＧ ＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴ
ＧＡＣ−３'）によって、ｏＲＶ−５によりＳｎａＢ
Ｉ開裂部位が導入され、ｏＲＶ−６によりＡｇｅＩ開裂
部位が導入されている１．６ｋｂのフラグメントを作成
した。
【００４０】ＬＸ２：オリゴヌクレオチドプライマーｏ
ＲＶ−７（５'−ＡＧＡＣＧＴＣＣＣＡ ＧＧＧＡＣＴ
ＴＴＧＧ ＧＧＧＣＣＧＴＡＴＴ ＴＧＴＧＧＣ−
３'）およびｏＲＶ−８（５'−ＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣ
ＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣ ＴＣＴＧＣＡＴＡＡＡ ＴＡＡ
ＡＴＡＡＡＡＴ ＴＡＧ−３'）によって１ｋｂのフラ
グメントを作成し、ＴＴＴＴＴＮＴモチーフをこの２つ
のプライマーによって点変異により修飾した。ｏＲＶ−
７はＡａｔＩＩ開裂部位の領域に結合し、ｏＲＶ−８は
ＳｆｉＩ開裂部位の領域に結合する。
ＲＶ−７（５'−ＡＧＡＣＧＴＣＣＣＡ ＧＧＧＡＣＴ
ＴＴＧＧ ＧＧＧＣＣＧＴＡＴＴ ＴＧＴＧＧＣ−
３'）およびｏＲＶ−８（５'−ＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣ
ＧＧＣＣＴＣＧＧＣＣ ＴＣＴＧＣＡＴＡＡＡ ＴＡＡ
ＡＴＡＡＡＡＴ ＴＡＧ−３'）によって１ｋｂのフラ
グメントを作成し、ＴＴＴＴＴＮＴモチーフをこの２つ
のプライマーによって点変異により修飾した。ｏＲＶ−
７はＡａｔＩＩ開裂部位の領域に結合し、ｏＲＶ−８は
ＳｆｉＩ開裂部位の領域に結合する。
【００４１】ＬＸ３：オリゴヌクレオチドプライマーｏ
ＲＶ−９（５'−ＣＧＡＣＣＧＧＴＴＣＴＡＴＴＴＧＴ
ＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＴ−３'）およびｏＲＶ−１０
（５'−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧ
ＴＴＴＡＴＴＧＧＡ−３'）によって、設計したベクタ
ー構築物の３'末端を１．２ｋｂのＰＣＲフラグメント
として作成した。ｏＲＶ−１０は“Ｒ”配列の３'末端
に結合してＮｏｔＩ開裂部位を導入する。
ＲＶ−９（５'−ＣＧＡＣＣＧＧＴＴＣＴＡＴＴＴＧＴ
ＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＴ−３'）およびｏＲＶ−１０
（５'−ＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＧ
ＴＴＴＡＴＴＧＧＡ−３'）によって、設計したベクタ
ー構築物の３'末端を１．２ｋｂのＰＣＲフラグメント
として作成した。ｏＲＶ−１０は“Ｒ”配列の３'末端
に結合してＮｏｔＩ開裂部位を導入する。
【００４２】ｎｅｏ読み取り枠のＴＴＴＴＴＮＴシグナ
ルを修飾するために、プラスミドｐＬＸＳＮにおいて突
然変異誘発を行った。突然変異誘発は、Stratagene 社
の QuickChange(登録商標)突然変異誘発キットおよびプ
ライマーｏＲＶ−３５（５'−ＡＡＡＴＡＧＡＡＣＣＧ
ＧＴＣＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧＡＣ−３'）およびｏ
ＲＶ−９によって行った。得られたプラスミドをｐＬＸ
ＳＮｍｕｔ（図４）と命名し、これは突然変異誘発した
部位においてＰｉｎＡＩ開裂部位を含んでいる。
ルを修飾するために、プラスミドｐＬＸＳＮにおいて突
然変異誘発を行った。突然変異誘発は、Stratagene 社
の QuickChange(登録商標)突然変異誘発キットおよびプ
ライマーｏＲＶ−３５（５'−ＡＡＡＴＡＧＡＡＣＣＧ
ＧＴＣＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧＡＣ−３'）およびｏ
ＲＶ−９によって行った。得られたプラスミドをｐＬＸ
ＳＮｍｕｔ（図４）と命名し、これは突然変異誘発した
部位においてＰｉｎＡＩ開裂部位を含んでいる。
【００４３】ＬＸ１ ＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲＩ
Ｉ（Invitrogen）へクローニングし、所望の方向でＰＣ
Ｒ生成物を含むプラスミドを選択し、ｐＣＲ−ＬＸ１
（ｂ）と命名した。ＬＸ２ ＰＣＲ生成物を酵素Ａａｔ
ＩＩおよびＳｆｉＩで開裂し、ＡａｔＩＩおよびＳｆｉ
Ｉで開裂したｐＣＲ−ＬＸ１（ｂ）へ挿入した。得られ
たプラスミドは、修飾されたＴＴＴＴＴＮＴシグナル以
外はｐＣＲ−ＬＸ１（ｂ）と同一であり、ｐＣＲ−ＬＸ
４と命名した。プラスミドｐＬＸＳＮｍｕｔ由来の１．
４ｋｂのＳｆｉＩ／ＳａｃＩフラグメントをＳｆｉＩ／
ＳａｃＩで開裂したｐＣＲ−ＬＸ４にライゲーションし
てｐＣＲ−ＬＸ４＋を得た。このプラスミドは、一番外
側の３'末端を除いて、ベクターの転写された領域全体
を含んでいる。
Ｉ（Invitrogen）へクローニングし、所望の方向でＰＣ
Ｒ生成物を含むプラスミドを選択し、ｐＣＲ−ＬＸ１
（ｂ）と命名した。ＬＸ２ ＰＣＲ生成物を酵素Ａａｔ
ＩＩおよびＳｆｉＩで開裂し、ＡａｔＩＩおよびＳｆｉ
Ｉで開裂したｐＣＲ−ＬＸ１（ｂ）へ挿入した。得られ
たプラスミドは、修飾されたＴＴＴＴＴＮＴシグナル以
外はｐＣＲ−ＬＸ１（ｂ）と同一であり、ｐＣＲ−ＬＸ
４と命名した。プラスミドｐＬＸＳＮｍｕｔ由来の１．
４ｋｂのＳｆｉＩ／ＳａｃＩフラグメントをＳｆｉＩ／
ＳａｃＩで開裂したｐＣＲ−ＬＸ４にライゲーションし
てｐＣＲ−ＬＸ４＋を得た。このプラスミドは、一番外
側の３'末端を除いて、ベクターの転写された領域全体
を含んでいる。
【００４４】正確な３'末端を、ｐＣＲ−ＬＸ３から
０．８ｋｂフラグメントとして、ＶＶ組換えベクターｐ
ＴＫｇｐｔ−ｓｅｌＰ（Pfleidererら, 1995, Protein
Expr.Purif. 6: 559-69）へ挿入した。得られたプラス
ミドをｐＴＫｇｐｔ−ＬＸ３（図３）と命名した。ｐＣ
Ｒ−ＬＸ４から２．７ｋｂのＳａｃＩ／ＳｎａＢＩフラ
グメントとして切り出し、ＳａｃＩおよびＳｔｕＩで開
裂したｐＴＫｇｐｔ−ＬＸ３へクローニングすることに
よりプラスミドベクターｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮが得ら
れた。これは、強力なＶＶプロモーターの制御下で、
５'ＬＴＲの“Ｒ”配列（Coffin, J. M., 1996, Retrov
iridae: The viruses and their replication, p. 1767
-1847. In: Fieldsら（編）Fields, Virology, 第３版
Vol.2, Lippincott-Raven, Philadelphia）の始めか
ら３'ＬＴＲの“Ｒ”配列の終わりまでベクターｐＬＸ
ＳＮの転写された領域全体を含んでいた（図４）。その
中では、始めに存在していた３つのＴＴＴＴＴＮＴモチ
ーフが修飾されている。
０．８ｋｂフラグメントとして、ＶＶ組換えベクターｐ
ＴＫｇｐｔ−ｓｅｌＰ（Pfleidererら, 1995, Protein
Expr.Purif. 6: 559-69）へ挿入した。得られたプラス
ミドをｐＴＫｇｐｔ−ＬＸ３（図３）と命名した。ｐＣ
Ｒ−ＬＸ４から２．７ｋｂのＳａｃＩ／ＳｎａＢＩフラ
グメントとして切り出し、ＳａｃＩおよびＳｔｕＩで開
裂したｐＴＫｇｐｔ−ＬＸ３へクローニングすることに
よりプラスミドベクターｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮが得ら
れた。これは、強力なＶＶプロモーターの制御下で、
５'ＬＴＲの“Ｒ”配列（Coffin, J. M., 1996, Retrov
iridae: The viruses and their replication, p. 1767
-1847. In: Fieldsら（編）Fields, Virology, 第３版
Vol.2, Lippincott-Raven, Philadelphia）の始めか
ら３'ＬＴＲの“Ｒ”配列の終わりまでベクターｐＬＸ
ＳＮの転写された領域全体を含んでいた（図４）。その
中では、始めに存在していた３つのＴＴＴＴＴＮＴモチ
ーフが修飾されている。
【００４５】ＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮの構築 ＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮを構築するため、ＲＫ
−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞を、欠損ＶＶ ｖＤ４−ｖＡ
についての標準的なプロトコル（Holzerら, 1997, J. V
irol. 71: 4997-5002）にしたがって感染させ、プラス
ミドｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮによりトランスフェクトし
た。ＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞においてウイルス単
離物をｇｐｔ選択下でプラーク精製した（Falknerら, 1
998, J. Virol. 62: 1849-1854）。このようにして得ら
れたＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮは、ｐＬＸＳＮの
欠損レトロウイルスＲＮＡゲノム全体を発現する。ｖｄ
−ＬＸＳＮの正確なゲノム構造は、サザンブロッティン
グおよびＰＣＲによって証明された。
−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞を、欠損ＶＶ ｖＤ４−ｖＡ
についての標準的なプロトコル（Holzerら, 1997, J. V
irol. 71: 4997-5002）にしたがって感染させ、プラス
ミドｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮによりトランスフェクトし
た。ＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞においてウイルス単
離物をｇｐｔ選択下でプラーク精製した（Falknerら, 1
998, J. Virol. 62: 1849-1854）。このようにして得ら
れたＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮは、ｐＬＸＳＮの
欠損レトロウイルスＲＮＡゲノム全体を発現する。ｖｄ
−ＬＸＳＮの正確なゲノム構造は、サザンブロッティン
グおよびＰＣＲによって証明された。
【００４６】実施例２：パッケージング細胞系ＰＴ６７
におけるＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮによる欠損レ
トロウイルス粒子の製造。欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮ
はレトロウイルスの欠損ゲノムを含み、転写する（実施
例１参照）。細胞系ＰＴ６７（Clontech Laboratories,
Inc., Palo Alto, CA より入手）は、レトロウイルス
欠損ゲノムのパッケージングに必要な、ネスミ白血病ウ
イルス（ＭＬＶ）のｇａｇ−ｐｏｌおよび ｅｎｖ遺伝
子を発現する（MIllerら, 1996, J. Virol. 70: 5564-7
1）。欠損ＶＶがｇａｇ−ｐｏｌタンパク質およびｅｎ
ｖタンパク質の存在下で欠損レトロウイルス粒子を形成
し得るという仮説を確かめるために、ＰＴ６７細胞をｖ
ｄ−ＬＸＳＮで感染させた。ＰＴ６７細胞の培養は、Re
troXpress System User Manual. Clontech Laboratorie
s, Inc. Palo Alto, CA, 1997 に記載されているように
標準的な条件にしたがって行った。ｖｄ−ＬＸＳＮによ
る感染は、１細胞あたり０．０５または０．５ＰＦＵ
（プラーク形成単位）で行った。種々の時点（感染後３
時間から７２時間）で、５００μｇ／ｍLのＧ４１８（M
illerら, 1996, J. Virol. 70: 5564-71）の存在下、Ｎ
ＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）の上
清中のレトロウイルスベクター粒子の力価を測定した。
レトロウイルス力価は、ＶＶ感染後６時間で最大に達
し、この範囲ではそれぞれ vｄ−ＬＸＳＮ感染用量に対
して無関係であった。典型的な実験では、１細胞あたり
０．５ＰＦＵｖｄ−ＬＸＳＮでの一次感染について、培
養上清１ｍLあたり、３時間後で１０2ＣＦＵ（コロニー
形成単位）、そして６時間後で２×１０2ＣＦＵである
と計測された。プラスミドｐＬＸＳＮでの対照実験は、
感染４８時間後で１０2ＣＦＵ〜１０3ＣＦＵであった。
ｖｄ−ＬＸＳＮ感染によって誘導されたレトロウイルス
力価は、感染１２時間後で２０ＣＦＵ／ｍLに減少し、
感染後４８〜７２時間後で最大２×１０2ＣＦＵ／ｍLに
上昇した。この２回目の上昇は最初の感染用量とは無関
係であり、ＶＶ非感染ＰＴ６７のレトロウイルスが介在
する形質転換に帰すものである。ＰＴ６７におけるプラ
スミドｐＴＫｇｐＬ−ＬＸＳＮのトランスフェクション
後にレトロウイルス粒子は得られなかった。このこと
は、それ以外では、例えば、アデノウイルスキャリヤー
によるこの構築物の発現は、ウイルスの状況（contex
t）においてのみ可能であるということを証明してい
る。この例は、欠損ＶＶが、レトロウイルス欠損ゲノム
を形質導入するキャリヤーとして適当であることを示し
ている。結果は、核においてゲノムＲＮＡのキャッピン
グおよびレトロウイルスの転写が正常に起こっている限
りにおいて驚くべきものである（Coffinら、前掲）。示
したRetroVac系では、細胞質において転写とキャッピン
グがワクシニアがコードした酵素によって起こってい
る。ＶＶ特異的キャップ構造は明らかに、レトロウイル
スパッケージングにとって障害とはならない。
におけるＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮによる欠損レ
トロウイルス粒子の製造。欠損ウイルスｖｄ−ＬＸＳＮ
はレトロウイルスの欠損ゲノムを含み、転写する（実施
例１参照）。細胞系ＰＴ６７（Clontech Laboratories,
Inc., Palo Alto, CA より入手）は、レトロウイルス
欠損ゲノムのパッケージングに必要な、ネスミ白血病ウ
イルス（ＭＬＶ）のｇａｇ−ｐｏｌおよび ｅｎｖ遺伝
子を発現する（MIllerら, 1996, J. Virol. 70: 5564-7
1）。欠損ＶＶがｇａｇ−ｐｏｌタンパク質およびｅｎ
ｖタンパク質の存在下で欠損レトロウイルス粒子を形成
し得るという仮説を確かめるために、ＰＴ６７細胞をｖ
ｄ−ＬＸＳＮで感染させた。ＰＴ６７細胞の培養は、Re
troXpress System User Manual. Clontech Laboratorie
s, Inc. Palo Alto, CA, 1997 に記載されているように
標準的な条件にしたがって行った。ｖｄ−ＬＸＳＮによ
る感染は、１細胞あたり０．０５または０．５ＰＦＵ
（プラーク形成単位）で行った。種々の時点（感染後３
時間から７２時間）で、５００μｇ／ｍLのＧ４１８（M
illerら, 1996, J. Virol. 70: 5564-71）の存在下、Ｎ
ＩＨ−３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）の上
清中のレトロウイルスベクター粒子の力価を測定した。
レトロウイルス力価は、ＶＶ感染後６時間で最大に達
し、この範囲ではそれぞれ vｄ−ＬＸＳＮ感染用量に対
して無関係であった。典型的な実験では、１細胞あたり
０．５ＰＦＵｖｄ−ＬＸＳＮでの一次感染について、培
養上清１ｍLあたり、３時間後で１０2ＣＦＵ（コロニー
形成単位）、そして６時間後で２×１０2ＣＦＵである
と計測された。プラスミドｐＬＸＳＮでの対照実験は、
感染４８時間後で１０2ＣＦＵ〜１０3ＣＦＵであった。
ｖｄ−ＬＸＳＮ感染によって誘導されたレトロウイルス
力価は、感染１２時間後で２０ＣＦＵ／ｍLに減少し、
感染後４８〜７２時間後で最大２×１０2ＣＦＵ／ｍLに
上昇した。この２回目の上昇は最初の感染用量とは無関
係であり、ＶＶ非感染ＰＴ６７のレトロウイルスが介在
する形質転換に帰すものである。ＰＴ６７におけるプラ
スミドｐＴＫｇｐＬ−ＬＸＳＮのトランスフェクション
後にレトロウイルス粒子は得られなかった。このこと
は、それ以外では、例えば、アデノウイルスキャリヤー
によるこの構築物の発現は、ウイルスの状況（contex
t）においてのみ可能であるということを証明してい
る。この例は、欠損ＶＶが、レトロウイルス欠損ゲノム
を形質導入するキャリヤーとして適当であることを示し
ている。結果は、核においてゲノムＲＮＡのキャッピン
グおよびレトロウイルスの転写が正常に起こっている限
りにおいて驚くべきものである（Coffinら、前掲）。示
したRetroVac系では、細胞質において転写とキャッピン
グがワクシニアがコードした酵素によって起こってい
る。ＶＶ特異的キャップ構造は明らかに、レトロウイル
スパッケージングにとって障害とはならない。
【００４７】実施例３：ＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ｅ１０
Ａ１の構築 実施例１および２において、レトロウイルスゲノムを転
写する欠損ＶＶは、パッケージング細胞系において機能
的な欠損レトロウイルスを形成することが示された。以
下において、欠損ＲＶ粒子の形成のための成分のすべて
を１つの欠損ＶＶにおいて一緒にするための更なる工程
として、ＶＶのＤ４座で１０Ａ１ ｅｎｖ遺伝子を発現
させた。ｅｎｖ領域のＴＴＴＴＴＮＴモチーフを削除し
なければならないため、クローニングは途中の工程で行
った（図５）。
Ａ１の構築 実施例１および２において、レトロウイルスゲノムを転
写する欠損ＶＶは、パッケージング細胞系において機能
的な欠損レトロウイルスを形成することが示された。以
下において、欠損ＲＶ粒子の形成のための成分のすべて
を１つの欠損ＶＶにおいて一緒にするための更なる工程
として、ＶＶのＤ４座で１０Ａ１ ｅｎｖ遺伝子を発現
させた。ｅｎｖ領域のＴＴＴＴＴＮＴモチーフを削除し
なければならないため、クローニングは途中の工程で行
った（図５）。
【００４８】プラスミドｐＤ４−ＳＸの構築 プラスミドｐＣＲ−ＳＸ３ｍｕｔ：ＭＬＶｅｎｖ遺伝子
（ｅｎｖ ＳＸ：４７０４Ａおよび１０Ａ１種に由来す
るハイブリッド）を、ｏＲＶ−３７（５'−ＴＣＡＧＧ
ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＡＧＣＧＴＴＣＴ
Ｃ−３'）およびｏＲＶ−３８（５'−ＧＡＣＴＴＴＣＡ
ＴＧＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＡＴＡＧＧＣ
ＴＴＣ−３'）により、ＰＴ６７細胞系（Millerら, 199
6, J.Virol. 70: 5564-5571）から２ｋｂのＰＣＲ生成
物として増幅し、プラスミドベクターｐＣＲＩＩへクロ
ーニングした。ｅｎｖ読み取り枠のＴＴＴＴＴＮＴシグ
ナルを、突然変異誘発によりこのプラスミド上で修飾し
た。突然変異誘発は、Stratagene社の QuickChange（登
録商標）突然変異誘発キット、およびプライマーｏＲＶ
−４１（５'−ＧＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＡ
ＧＡＣＣＡＣＡＣＧＧＧＡＣＴＡＧＴＧＡＧＡＧ−
３'）およびｏＲＶ−４２（５'−ＣＴＣＴＣＡＣＴＡＧ
ＴＣＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡ
ＣＡＴＴＣ−３'）により行った。得られたプラスミド
をｐＣＲ−ＳＸ３ｍｕｔと命名した。
（ｅｎｖ ＳＸ：４７０４Ａおよび１０Ａ１種に由来す
るハイブリッド）を、ｏＲＶ−３７（５'−ＴＣＡＧＧ
ＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＡＧＣＧＴＴＣＴ
Ｃ−３'）およびｏＲＶ−３８（５'−ＧＡＣＴＴＴＣＡ
ＴＧＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＧＴＡＣＴＣＴＡＴＡＧＧＣ
ＴＴＣ−３'）により、ＰＴ６７細胞系（Millerら, 199
6, J.Virol. 70: 5564-5571）から２ｋｂのＰＣＲ生成
物として増幅し、プラスミドベクターｐＣＲＩＩへクロ
ーニングした。ｅｎｖ読み取り枠のＴＴＴＴＴＮＴシグ
ナルを、突然変異誘発によりこのプラスミド上で修飾し
た。突然変異誘発は、Stratagene社の QuickChange（登
録商標）突然変異誘発キット、およびプライマーｏＲＶ
−４１（５'−ＧＡＡＴＧＴＴＧＴＴＴＣＴＡＴＧＣＡ
ＧＡＣＣＡＣＡＣＧＧＧＡＣＴＡＧＴＧＡＧＡＧ−
３'）およびｏＲＶ−４２（５'−ＣＴＣＴＣＡＣＴＡＧ
ＴＣＣＣＧＴＧＴＧＧＴＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＡＣＡＡ
ＣＡＴＴＣ−３'）により行った。得られたプラスミド
をｐＣＲ−ＳＸ３ｍｕｔと命名した。
【００４９】プラスミドｐＴＫ−ＳＸｍｕｔ：ｐＣＲ−
ＳＸ３ｍｕｔから、酵素ＢｓｐＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ
により、ｅｎｖ読み取り枠を２ｋｂのフラグメントとし
て切り出し、ＮｃｏＩおよびＳｔｕＩで開裂したプラス
ミドｐＴＫＬ−ｓｅｌＰへライゲーションし、プラスミ
ドｐＴＫ−ＳＸｍｕｔを得た。
ＳＸ３ｍｕｔから、酵素ＢｓｐＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ
により、ｅｎｖ読み取り枠を２ｋｂのフラグメントとし
て切り出し、ＮｃｏＩおよびＳｔｕＩで開裂したプラス
ミドｐＴＫＬ−ｓｅｌＰへライゲーションし、プラスミ
ドｐＴＫ−ＳＸｍｕｔを得た。
【００５０】プラスミドｐＴＫＬ−ｓｅｌＰ：プラスミ
ドｐＴＫｇｐｔ−ｓｅｌＰ（実施例１）において、開裂
部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩにより、オリゴヌク
レオチドｏＲＶ−２２（５'−ＡＧＣＴＣＧＣＡＡＴＴ
ＧＡＴＧＣＡＴＣＡＣＡ−３'）およびｏＲＶ−２３
（５'−ＴＡＴＧＴＧＡＴＧＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＧ−
３'）を有する合成リンカーで０．３ｋｂフラグメント
を置換し、さらに開裂部位ＮｓｉＩおよびＭｕｎＩを挿
入した。
ドｐＴＫｇｐｔ−ｓｅｌＰ（実施例１）において、開裂
部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｄｅＩにより、オリゴヌク
レオチドｏＲＶ−２２（５'−ＡＧＣＴＣＧＣＡＡＴＴ
ＧＡＴＧＣＡＴＣＡＣＡ−３'）およびｏＲＶ−２３
（５'−ＴＡＴＧＴＧＡＴＧＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＧ−
３'）を有する合成リンカーで０．３ｋｂフラグメント
を置換し、さらに開裂部位ＮｓｉＩおよびＭｕｎＩを挿
入した。
【００５１】プラスミドｐＤ４−ＳＸ：強力なＶＶプロ
モーターｓｅｌＰおよびｅｎｖ読み取り枠からなる発現
カセットを、酵素ＭｕｎＩおよびＮｏｔＩによりプラス
ミドｐＴＫ−ＳＸｍｕｔから切り出し、ＭｕｎＩ／Ｎｏ
ｔＩ開裂させたｐＤ４−ｖＡへライゲーションした（２
１）。このようにして得られたベクターｐＤ４−ＳＸ
（図５）は、記載した発現カセットをＶＶ−Ｄ４座のフ
ランキング配列の間に含んでいる。ＶＶにおけるこのＤ
ＮＡの組込みによって、ｅｎｖ遺伝子を発現する欠損、
非複製変異体が得られる。
モーターｓｅｌＰおよびｅｎｖ読み取り枠からなる発現
カセットを、酵素ＭｕｎＩおよびＮｏｔＩによりプラス
ミドｐＴＫ−ＳＸｍｕｔから切り出し、ＭｕｎＩ／Ｎｏ
ｔＩ開裂させたｐＤ４−ｖＡへライゲーションした（２
１）。このようにして得られたベクターｐＤ４−ＳＸ
（図５）は、記載した発現カセットをＶＶ−Ｄ４座のフ
ランキング配列の間に含んでいる。ＶＶにおけるこのＤ
ＮＡの組込みによって、ｅｎｖ遺伝子を発現する欠損、
非複製変異体が得られる。
【００５２】ＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ｅ１０Ａ１の構築 ＶＶ野生型ウエスタンリザーブ（ＷＲ）種によるｐＤ４
−ＳＸの相同的組換えを、標準的な技術にしたがってＲ
Ｋ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞において行った。プラーク
精製をＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞において行い、ｇ
ｐｔ選択およびｌａｃＺ陽性プラークのスクリーニング
について２回、選択なしおよびｌａｃＺ陰性プラークの
スクリーニングについて２回行った（Holzerら, 1997,
J. Virol. 71: 4997-5002）。得られた単離物をｖｄ−
ｅ１０Ａ１と命名した。ｅｎｖ発現の対照をウェスタン
ブロッティングにおいて行った。ＭｏＭＬＶ特異的抗血
清は、Quality Biotech/Camden, NJから入手した（血清
番号：８１Ｓ００００４４“破壊されたウイルス”）。
−ＳＸの相同的組換えを、標準的な技術にしたがってＲ
Ｋ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞において行った。プラーク
精製をＲＫ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞において行い、ｇ
ｐｔ選択およびｌａｃＺ陽性プラークのスクリーニング
について２回、選択なしおよびｌａｃＺ陰性プラークの
スクリーニングについて２回行った（Holzerら, 1997,
J. Virol. 71: 4997-5002）。得られた単離物をｖｄ−
ｅ１０Ａ１と命名した。ｅｎｖ発現の対照をウェスタン
ブロッティングにおいて行った。ＭｏＭＬＶ特異的抗血
清は、Quality Biotech/Camden, NJから入手した（血清
番号：８１Ｓ００００４４“破壊されたウイルス”）。
【００５３】実施例４：ＶＶ欠損ウイルスｖｄ−ｅｇの
構築 ＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌ読み取り枠を、ＶＶベクターｖ
ｄ−ｅ１０Ａ１（実施例３）のヘマグルチニン遺伝子座
に挿入した。したがって、ｇａｇ−ｐｏｌMLVとｅｎｖ
10-A1の両方を発現し、偽粒子（pseudoparticle）を形
成することが可能な欠損ＶＶが生じる。このＭＬＶパッ
ケージングベクターは、遺伝子治療に適当な外来遺伝子
を含むレトロウイルスの欠損ゲノムをそこに挿入し得
る、フリーのチミジンキナ−ゼ遺伝子座を依然として含
んでいる（実施例５および６に記載）。
構築 ＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌ読み取り枠を、ＶＶベクターｖ
ｄ−ｅ１０Ａ１（実施例３）のヘマグルチニン遺伝子座
に挿入した。したがって、ｇａｇ−ｐｏｌMLVとｅｎｖ
10-A1の両方を発現し、偽粒子（pseudoparticle）を形
成することが可能な欠損ＶＶが生じる。このＭＬＶパッ
ケージングベクターは、遺伝子治療に適当な外来遺伝子
を含むレトロウイルスの欠損ゲノムをそこに挿入し得
る、フリーのチミジンキナ−ゼ遺伝子座を依然として含
んでいる（実施例５および６に記載）。
【００５４】ｇａｇ−ｐｏｌ領域の３つのＴＴＴＴＴＮ
Ｔモチーフを削除しなければならなかったので、クロー
ニングを中間の工程で行った（図６および図７）。ＭＬ
Ｖ ｇａｇ−ｐｏｌ読み取り枠（５．２ｋｂ）を、パッ
ケージング細胞系ＰＴ６７（Clontech Laboratories, I
nc., Palo Alto, CA）からＰＣＲによって増幅した。こ
のために、それらの末端が重複した４つのＰＣＲフラグ
メント（Ｇ１〜Ｇ４）を増幅した。プライマーにより、
存在していた３つのＴＴＴＴＴＮＴモチーフが修飾され
て、アミノ酸配列に影響を与えることなく適合性のある
開裂部位が生じた。
Ｔモチーフを削除しなければならなかったので、クロー
ニングを中間の工程で行った（図６および図７）。ＭＬ
Ｖ ｇａｇ−ｐｏｌ読み取り枠（５．２ｋｂ）を、パッ
ケージング細胞系ＰＴ６７（Clontech Laboratories, I
nc., Palo Alto, CA）からＰＣＲによって増幅した。こ
のために、それらの末端が重複した４つのＰＣＲフラグ
メント（Ｇ１〜Ｇ４）を増幅した。プライマーにより、
存在していた３つのＴＴＴＴＴＮＴモチーフが修飾され
て、アミノ酸配列に影響を与えることなく適合性のある
開裂部位が生じた。
【００５５】フラグメントＧ１の増幅：オリゴヌクレオ
チドプライマーｏＲＶ−１１（５’−ＣＣＡＴＧＧＧＣ
ＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＣＡＣＴ−３'）およびｏＲＶ
−１２（５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧ
ＡＡＧＧＧＴＴ−３'）によって、ｏＲＶ−１１により
ＮｃｏＩ開裂部位が生じており、ｏＲＶ−１２によりＴ
ＴＴＴＴＮＴシグナルが変異し、ＢａｍＨＩ開裂部位が
導入されている、０．８ｋｂのフラグメントをＭＬＶ
ｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
チドプライマーｏＲＶ−１１（５’−ＣＣＡＴＧＧＧＣ
ＣＡＧＡＣＴＧＴＴＡＣＣＡＣＴ−３'）およびｏＲＶ
−１２（５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧ
ＡＡＧＧＧＴＴ−３'）によって、ｏＲＶ−１１により
ＮｃｏＩ開裂部位が生じており、ｏＲＶ−１２によりＴ
ＴＴＴＴＮＴシグナルが変異し、ＢａｍＨＩ開裂部位が
導入されている、０．８ｋｂのフラグメントをＭＬＶ
ｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
【００５６】フラグメントＧ２の増幅：オリゴヌクレオ
チドｏＲＶ−１３（５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＴ ＣＴ
ＴＴＴＴＣＴＧＡ ＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴ−３'）およ
びｏＲＶ−１４（５’−ＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡ ＴＴＣ
ＡＡＧＣＡＣＡ ＧＴＧＴＡＣＣＡＣＴ Ｇ−３'）に
よって、ｏＲＶ−１３によりＢａｍＨＩ開裂部位ならび
にさらにそのフラグメントの３'末端にあるＳｓｐＩ開
裂部位が導入されており、ｏＲＶ−１４によりＥｃｏＲ
Ｉ開裂部位が導入されている、１．７ｋｂのフラグメン
トをＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
チドｏＲＶ−１３（５’−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＴ ＣＴ
ＴＴＴＴＣＴＧＡ ＧＧＡＴＣＣＡＧＧＴ−３'）およ
びｏＲＶ−１４（５’−ＣＡＴＣＣＴＴＧＡＡ ＴＴＣ
ＡＡＧＣＡＣＡ ＧＴＧＴＡＣＣＡＣＴ Ｇ−３'）に
よって、ｏＲＶ−１３によりＢａｍＨＩ開裂部位ならび
にさらにそのフラグメントの３'末端にあるＳｓｐＩ開
裂部位が導入されており、ｏＲＶ−１４によりＥｃｏＲ
Ｉ開裂部位が導入されている、１．７ｋｂのフラグメン
トをＭＬＶｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
【００５７】フラグメントＧ３の増幅：オリゴヌクレオ
チドｏＲＶ−１５（５’−ＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＴ
ＧＣＣＴＴＣＴ ＴＣＴＧＣＣＴＧＡ−３'）およびｏ
ＲＶ−１６（５’−ＡＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＡＴＴＴＡ
ＴＡＧＣ ＣＡＴＡＣ−３'）によって、ｏＲＶ−１５
によりＴＴＴＴＴＮＴシグナルが変異し、ＥｃｏＲＩ開
裂部位が導入されており、ｏＲＶ−１６によりＳｐｅＩ
開裂部位とさらにそのフラグメントの３'末端にあるＮ
ｏｔＩ開裂部位が導入されている、２ｋｂのフラグメン
トをＭＬＶ−ｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
チドｏＲＶ−１５（５’−ＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＴ
ＧＣＣＴＴＣＴ ＴＣＴＧＣＣＴＧＡ−３'）およびｏ
ＲＶ−１６（５’−ＡＡＣＴＡＧＴＡＧＡＴＡＴＴＴＡ
ＴＡＧＣ ＣＡＴＡＣ−３'）によって、ｏＲＶ−１５
によりＴＴＴＴＴＮＴシグナルが変異し、ＥｃｏＲＩ開
裂部位が導入されており、ｏＲＶ−１６によりＳｐｅＩ
開裂部位とさらにそのフラグメントの３'末端にあるＮ
ｏｔＩ開裂部位が導入されている、２ｋｂのフラグメン
トをＭＬＶ−ｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
【００５８】フラグメントＧ４の増幅：オリゴヌクレオ
チドｏＲＶ−１７（５’−ＡＴＡＴＣＴＡＣＴＡ ＧＴ
ＴＴＴＣＡＴＡＧ ＡＴＡＣＣＴ−３'）およびｏＲＶ
−１８（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴ ＡＧＧＧＧＧＣ
ＣＴＣ ＧＣＧＧＧＴＴＡ−３'）によって、ｏＲＶ−
１７によりＴＴＴＴＴＮＴモチーフが修飾されＳｐｅＩ
開裂部位が導入されており、ｏＲＶ−１８によりＮｏｔ
Ｉ開裂部位が導入されている、０．８ｋｂのフラグメン
トをＭＬＶ−ｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
チドｏＲＶ−１７（５’−ＡＴＡＴＣＴＡＣＴＡ ＧＴ
ＴＴＴＣＡＴＡＧ ＡＴＡＣＣＴ−３'）およびｏＲＶ
−１８（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴ ＡＧＧＧＧＧＣ
ＣＴＣ ＧＣＧＧＧＴＴＡ−３'）によって、ｏＲＶ−
１７によりＴＴＴＴＴＮＴモチーフが修飾されＳｐｅＩ
開裂部位が導入されており、ｏＲＶ−１８によりＮｏｔ
Ｉ開裂部位が導入されている、０．８ｋｂのフラグメン
トをＭＬＶ−ｇａｇ−ｐｏｌから作成した。
【００５９】プラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇおよびｐＨＡ
−ＭＬＶｇのクローニング Ｇ２ ＰＣＲフラグメントをベクターｐＣＲＩＩ（Invit
rogen, Inc）へクローニングし（ｐＣＲ−Ｇ２）、ここ
から酵素ＳｓｐＩおよびＮｏｔＩにより再び単離した
（図６）。ＢａｌＩおよびＮｏｔＩで開裂したベクター
ｐＴＫｇｐｔ−ｓｅｌＰにおけるライゲーションによ
り、プラスミドｐＴＫ−Ｇ２を得た（図７）。Ｇ１ Ｐ
ＣＲ生成物を、酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩによって
ｐＣＲ−Ｇ２から切り出し、単離し、ＮｃｏＩおよびＢ
ａｍＨＩで線状化したプラスミドｐＴＫ−Ｇ２へライゲ
ーションし、プラスミドｐＴＫ−Ｇ１２を得た（図
５）。
−ＭＬＶｇのクローニング Ｇ２ ＰＣＲフラグメントをベクターｐＣＲＩＩ（Invit
rogen, Inc）へクローニングし（ｐＣＲ−Ｇ２）、ここ
から酵素ＳｓｐＩおよびＮｏｔＩにより再び単離した
（図６）。ＢａｌＩおよびＮｏｔＩで開裂したベクター
ｐＴＫｇｐｔ−ｓｅｌＰにおけるライゲーションによ
り、プラスミドｐＴＫ−Ｇ２を得た（図７）。Ｇ１ Ｐ
ＣＲ生成物を、酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩによって
ｐＣＲ−Ｇ２から切り出し、単離し、ＮｃｏＩおよびＢ
ａｍＨＩで線状化したプラスミドｐＴＫ−Ｇ２へライゲ
ーションし、プラスミドｐＴＫ−Ｇ１２を得た（図
５）。
【００６０】Ｇ３ ＰＣＲ生成物をベクターｐＣＲＩＩ
へライゲーションしてｐＣＲ−Ｇ３を得た。酵素Ｂａｍ
ＨＩおよびＳｔｕＩによる消化、クレノウ処理と再ライ
ゲーションによって、１ｋｂの配列をｐＣＲ−Ｇ３から
削除し、このようにして生じたプラスミドｐＣＲ−Ｇ３
ｄへ、０．８ｋｂの大きさにしたＧ４ ＰＣＲ生成物
を、開裂部位ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで挿入した。得ら
れたプラスミドをｐＣＲ−Ｇ３ｄ４と命名した。酵素Ｓ
ａｃＩおよびＥｃｏＲＶによるｐＣＲ−Ｇ３の消化によ
って得られた１．１ｋｂのフラグメントを、ＳａｃＩお
よびＥｃｏＲＶで開裂したプラスミドｐＣＲ−Ｇ３ｄ４
へ挿入することにより、ＭＬＶ−ｇａｌ−ｐｏｌ読み取
り枠の３'側半分を含んでいるプラスミドｐＣＲ−Ｇ３
４を得た。ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ開裂部位で３ｋｂ
のフラグメントを消化し、ｐＣＲ−Ｇ３４の再ライゲー
ションによりプラスミドｐＴＫ−１２へ再クローニング
した。得られたプラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇには、強力
な初期後期（early-late）ＶＶプロモーターｓｅｌＰの
下流にＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌ読み取り枠全体が含まれ
ている（図７）。
へライゲーションしてｐＣＲ−Ｇ３を得た。酵素Ｂａｍ
ＨＩおよびＳｔｕＩによる消化、クレノウ処理と再ライ
ゲーションによって、１ｋｂの配列をｐＣＲ−Ｇ３から
削除し、このようにして生じたプラスミドｐＣＲ−Ｇ３
ｄへ、０．８ｋｂの大きさにしたＧ４ ＰＣＲ生成物
を、開裂部位ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで挿入した。得ら
れたプラスミドをｐＣＲ−Ｇ３ｄ４と命名した。酵素Ｓ
ａｃＩおよびＥｃｏＲＶによるｐＣＲ−Ｇ３の消化によ
って得られた１．１ｋｂのフラグメントを、ＳａｃＩお
よびＥｃｏＲＶで開裂したプラスミドｐＣＲ−Ｇ３ｄ４
へ挿入することにより、ＭＬＶ−ｇａｌ−ｐｏｌ読み取
り枠の３'側半分を含んでいるプラスミドｐＣＲ−Ｇ３
４を得た。ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ開裂部位で３ｋｂ
のフラグメントを消化し、ｐＣＲ−Ｇ３４の再ライゲー
ションによりプラスミドｐＴＫ−１２へ再クローニング
した。得られたプラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇには、強力
な初期後期（early-late）ＶＶプロモーターｓｅｌＰの
下流にＭＬＶ ｇａｇ−ｐｏｌ読み取り枠全体が含まれ
ている（図７）。
【００６１】プラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇをＮｄｅＩ
（部分的）およびＮｏｔＩにより開裂し、ｓｅｌＰ−ｇ
ａｇ−ｐｏｌカセットを５．３ｋｂフラグメントとして
単離した。フラグメントをクレノウ処理し、ＳｎａＢＩ
で線状化したＶＶ組込みプラスミドベクターｐＨＡ−ｖ
Ａへライゲーションした。得られたプラスミドをｐＨＡ
−ＭＬＶｇと命名した。
（部分的）およびＮｏｔＩにより開裂し、ｓｅｌＰ−ｇ
ａｇ−ｐｏｌカセットを５．３ｋｂフラグメントとして
単離した。フラグメントをクレノウ処理し、ＳｎａＢＩ
で線状化したＶＶ組込みプラスミドベクターｐＨＡ−ｖ
Ａへライゲーションした。得られたプラスミドをｐＨＡ
−ＭＬＶｇと命名した。
【００６２】パッケージングベクターｖｄ−ｅｇの構築
および機能性試験 プラスミドＤＮＡ ｐＨＡ−ＭＬＶｇおよび出発ウイル
スｖｄ−ｅ１０Ａ１（実施例３）の相同的組換え、並び
にプラーク精製を、標準的なプロトコルにしたがい、Ｒ
Ｋ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞（Holzerら, 1997, J. Vir
ol. 71: 4997-5002）において行った。ｇａｇ−ｐｏｌ
とｅｎｖを発現する単離物をｖｄ−ｅｇと命名した。さ
らに、発現したレトロウイルス遺伝子の機能性を、レト
ロウイルスベクターｐＬＸＳＮによる形質転換によって
得られた３Ｔ３細胞クローンで試験した。このために、
RetroXpress System User Manual, Clontech Laborator
ies, Inc., Palo Alto, CA (1997)に記載されているよ
うに、３Ｔ３細胞を欠損ＬＸＳＮレトロウイルスで形質
転換した。５つのＧ４１８耐性クローンを単離した。こ
れら培養細胞の上清は非感染であり、したがって天然の
３Ｔ３細胞の形質導入を引き起こすことができなかっ
た。これら細胞系を組換えウイルスｖｄ−ｅｇで感染さ
せた（ｍｏｉ＝１）。３日後、上清を回収し、３Ｔ３細
胞の形質転換に使用した。形質転換実験は、Millerら,
(1996. J. Virol. 70: 5564-5571)によって記載された
ように行った。このように形質転換された３Ｔ３細胞は
Ｇ４１８耐性であり、選択されたクローンの上清は形質
転換されていなかった。このように観察された形質転換
は、増殖可能なレトロウイルスの再活性化によっては起
こらなかった。この実験によって、パッケージングベク
ターｖｄ−ｅｇによるレトロウイルス遺伝子の発現が、
形質転換レトロウイルス欠損ゲノムのパッケージングを
可能にすることが証明される。
および機能性試験 プラスミドＤＮＡ ｐＨＡ−ＭＬＶｇおよび出発ウイル
スｖｄ−ｅ１０Ａ１（実施例３）の相同的組換え、並び
にプラーク精製を、標準的なプロトコルにしたがい、Ｒ
Ｋ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞（Holzerら, 1997, J. Vir
ol. 71: 4997-5002）において行った。ｇａｇ−ｐｏｌ
とｅｎｖを発現する単離物をｖｄ−ｅｇと命名した。さ
らに、発現したレトロウイルス遺伝子の機能性を、レト
ロウイルスベクターｐＬＸＳＮによる形質転換によって
得られた３Ｔ３細胞クローンで試験した。このために、
RetroXpress System User Manual, Clontech Laborator
ies, Inc., Palo Alto, CA (1997)に記載されているよ
うに、３Ｔ３細胞を欠損ＬＸＳＮレトロウイルスで形質
転換した。５つのＧ４１８耐性クローンを単離した。こ
れら培養細胞の上清は非感染であり、したがって天然の
３Ｔ３細胞の形質導入を引き起こすことができなかっ
た。これら細胞系を組換えウイルスｖｄ−ｅｇで感染さ
せた（ｍｏｉ＝１）。３日後、上清を回収し、３Ｔ３細
胞の形質転換に使用した。形質転換実験は、Millerら,
(1996. J. Virol. 70: 5564-5571)によって記載された
ように行った。このように形質転換された３Ｔ３細胞は
Ｇ４１８耐性であり、選択されたクローンの上清は形質
転換されていなかった。このように観察された形質転換
は、増殖可能なレトロウイルスの再活性化によっては起
こらなかった。この実験によって、パッケージングベク
ターｖｄ−ｅｇによるレトロウイルス遺伝子の発現が、
形質転換レトロウイルス欠損ゲノムのパッケージングを
可能にすることが証明される。
【００６３】実施例５： RetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＬＸＳＮの構築 出発ベクターとしてのｖｄ−ｅｇＬＸＳＮにより、形質
導入欠損レトロウイルス粒子の形成に必要な成分のすべ
てを発現するＶＶベクターを構築した。ｖｄ−ｅｇＬＸ
ＳＮの調製を、プラスミドＤＮＡ ｐＴＫｇｐｔ−ＬＸ
ＳＮ（実施例１）およびパッケージングウイルスｖｄ−
ｅｇ（実施例４）による相同的組換えにより、ＲＫ−Ｄ
４Ｒ−４４．２０細胞（実施例１参照）において標準的
なプロトコルにしたがって行った。ｇｐｔ選択下の、Ｒ
Ｋ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞における数ラウンドのプラ
ーク精製において単離物を精製して、ｖｄ−ｅｇＸＬＳ
Ｎと命名した。ｖｄ−ｅｇＬＸＳＮのスクロースグラジ
ェント精製したウイルスストックによって、３Ｔ３細胞
およびＲＫ１３細胞を感染させた（ｍｏｉ＝１）。６時
間後、上清を回収し、実施例１と同様にして３Ｔ３細胞
の形質転換について試験した。細胞系に依存して、１０
6細胞の上清は１０2〜１０3ＣＦＵのレトロウイルスベ
クターを含んでいた。この実施例により、野生型細胞の
RetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＬＸＳＮによる感染は、
形質転換レトロウイルスベクター粒子を発現するに十分
であることが証明される。
導入欠損レトロウイルス粒子の形成に必要な成分のすべ
てを発現するＶＶベクターを構築した。ｖｄ−ｅｇＬＸ
ＳＮの調製を、プラスミドＤＮＡ ｐＴＫｇｐｔ−ＬＸ
ＳＮ（実施例１）およびパッケージングウイルスｖｄ−
ｅｇ（実施例４）による相同的組換えにより、ＲＫ−Ｄ
４Ｒ−４４．２０細胞（実施例１参照）において標準的
なプロトコルにしたがって行った。ｇｐｔ選択下の、Ｒ
Ｋ−Ｄ４Ｒ−４４．２０細胞における数ラウンドのプラ
ーク精製において単離物を精製して、ｖｄ−ｅｇＸＬＳ
Ｎと命名した。ｖｄ−ｅｇＬＸＳＮのスクロースグラジ
ェント精製したウイルスストックによって、３Ｔ３細胞
およびＲＫ１３細胞を感染させた（ｍｏｉ＝１）。６時
間後、上清を回収し、実施例１と同様にして３Ｔ３細胞
の形質転換について試験した。細胞系に依存して、１０
6細胞の上清は１０2〜１０3ＣＦＵのレトロウイルスベ
クターを含んでいた。この実施例により、野生型細胞の
RetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＬＸＳＮによる感染は、
形質転換レトロウイルスベクター粒子を発現するに十分
であることが証明される。
【００６４】実施例６： 第ＩＸ因子ｃＤＮＡ挿入によってｄＲＶ粒子を発現する
RetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＣ９の構築 以下の実験では、ヒトの凝固因子 ＦＩＸを RetroVacベ
クターへクローニングし、血友病Ｂの遺伝子治療に適当
なレトロウイルス欠損粒子を製造する。この目的のため
に、ＲＮＡプロセシングを可能にするサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー（Boshart
ら, 1985, Cell. 41: 521-530）と凝固因子ＦＩＸ−ｃ
ＤＮＡおよび遺伝エレメントからなる遺伝子カセット
（ＥＰ ０ ７１１ ８３５に記載された“ＦＩＸ遺伝子
カセット”）を構築し、プラスミドｐＴＫ−ｇｐｔ−Ｖ
Ｐへ挿入した。得られたプラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ
−ＦＩＸを、パッケージングベクターｖｄ−ｅｇのｔｋ
座に再結合し、RetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＣ９を得
た。
RetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＣ９の構築 以下の実験では、ヒトの凝固因子 ＦＩＸを RetroVacベ
クターへクローニングし、血友病Ｂの遺伝子治療に適当
なレトロウイルス欠損粒子を製造する。この目的のため
に、ＲＮＡプロセシングを可能にするサイトメガロウイ
ルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー（Boshart
ら, 1985, Cell. 41: 521-530）と凝固因子ＦＩＸ−ｃ
ＤＮＡおよび遺伝エレメントからなる遺伝子カセット
（ＥＰ ０ ７１１ ８３５に記載された“ＦＩＸ遺伝子
カセット”）を構築し、プラスミドｐＴＫ−ｇｐｔ−Ｖ
Ｐへ挿入した。得られたプラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ
−ＦＩＸを、パッケージングベクターｖｄ−ｅｇのｔｋ
座に再結合し、RetroVacベクター ｖｄ−ｅｇＣ９を得
た。
【００６５】プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ−ＦＩＸの
構築 第ＩＸ因子−ｃＤＮＡ（Kurachiら, 1982, Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 79: 6461-6464）は、プライマーｏ
ｍｉｔ．ＦＩＸ−１およびｏｍｉｔ．ＦＩＸ−２（図
８）による突然変異誘発によって改変されたＴＴＴＴＴ
ＮＴモチーフを含んでなる。得られたプラスミドをｐＣ
ＭＶ−ＦＩＸｍｕｔと命名した。ｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ。
ｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮと同様、プラスミドベクターを
ＶＶ発現のためにｐＬＮＣＸに基づいて構築した。ｐＬ
ＮＣＸのネオマイシン耐性遺伝子におけるＴＴＴＴＴＮ
Ｔモチーフをこの目的のために突然変異させた（プライ
マーｏＲＶ-３５およびｏＲＶ-９）。レトロウイルスベ
クター配列の右半分を、開裂部位ＥｃｏＲＩおよびＸｂ
ａＩにより、この突然変異したプラスミドｐＬＮＣＸｍ
ｕｔからベクターｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮへトランスフ
ァーした。得られたプラスミドをｐＴＫｇｐｔ−ＶＰと
命名した。ｐＴＫｇｐｔ−ＶＰは、以下のエレメント、
ＶＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子フランク／ＶＶプ
ロモーターｓｅｌＰ／ＲＶ−‘Ｒ’／ＲＶ−ｕ５／ｐｓ
ｉ／Ｎｅｏ／ＣＭＶプロモーター／ＭＣＳ／ＲＶ Ｕ３
／ＲＶ−‘Ｒ’／ＴＴＴＴＴＮＴ／ＶＶ−ｔｋフランク
を含んでいる。
構築 第ＩＸ因子−ｃＤＮＡ（Kurachiら, 1982, Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 79: 6461-6464）は、プライマーｏ
ｍｉｔ．ＦＩＸ−１およびｏｍｉｔ．ＦＩＸ−２（図
８）による突然変異誘発によって改変されたＴＴＴＴＴ
ＮＴモチーフを含んでなる。得られたプラスミドをｐＣ
ＭＶ−ＦＩＸｍｕｔと命名した。ｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ。
ｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮと同様、プラスミドベクターを
ＶＶ発現のためにｐＬＮＣＸに基づいて構築した。ｐＬ
ＮＣＸのネオマイシン耐性遺伝子におけるＴＴＴＴＴＮ
Ｔモチーフをこの目的のために突然変異させた（プライ
マーｏＲＶ-３５およびｏＲＶ-９）。レトロウイルスベ
クター配列の右半分を、開裂部位ＥｃｏＲＩおよびＸｂ
ａＩにより、この突然変異したプラスミドｐＬＮＣＸｍ
ｕｔからベクターｐＴＫｇｐｔ−ＬＸＳＮへトランスフ
ァーした。得られたプラスミドをｐＴＫｇｐｔ−ＶＰと
命名した。ｐＴＫｇｐｔ−ＶＰは、以下のエレメント、
ＶＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子フランク／ＶＶプ
ロモーターｓｅｌＰ／ＲＶ−‘Ｒ’／ＲＶ−ｕ５／ｐｓ
ｉ／Ｎｅｏ／ＣＭＶプロモーター／ＭＣＳ／ＲＶ Ｕ３
／ＲＶ−‘Ｒ’／ＴＴＴＴＴＮＴ／ＶＶ−ｔｋフランク
を含んでいる。
【００６６】プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ−ＦＩＸを
構築するために、ＣＭＶプロモーターの一部とＦＩＸ−
ｃＤＮＡの全部を含んでなるＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉフラグメントを、ｐＣＭＶ−ＦＩＸｍｕｔからＳｎａ
ＢＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（部分消化）で開裂したｐＴＫｇ
ｐｔ−ＶＰへ挿入した。
構築するために、ＣＭＶプロモーターの一部とＦＩＸ−
ｃＤＮＡの全部を含んでなるＳｎａＢＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉフラグメントを、ｐＣＭＶ−ＦＩＸｍｕｔからＳｎａ
ＢＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ（部分消化）で開裂したｐＴＫｇ
ｐｔ−ＶＰへ挿入した。
【００６７】RetroVac ベクターｖｄ−ｅｇＣ９の構築
および試験 プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ−ＦＩＸを標準的な方法
にしたがってパッケージングベクターｖｄ−ｅｇに再結
合し、プラーク精製した（実施例５参照）。得られたウ
イルスをｖｄ−ｅｇＣ９と命名した。ｖｄ−ｅｇＣ９の
スクロースグラジェント精製したストックを調製して、
３Ｔ３およびＲＫ１３細胞を感染させた（ｍｏｉ＝
１）。３日後、上清を回収して、実施例４と同様に３Ｔ
３細胞の形質転換について試験した。細胞系に依存し
て、１０6細胞の上清は、１０2〜１０3ＣＦＵのレトロ
ウイルスベクターを含んでいた。レトロウイルスＦＩＸ
欠損粒子を含んでいる上清による半コンフルエントのＲ
Ｋ１３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３７）またはＳＫ−ＨＥＰ
−１細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−５２）の感染によって、
機能的な第ＩＸ因子（ＥＰ ０ ７１１ ３８５に記載さ
れたように測定）が発現した。
および試験 プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ−ＦＩＸを標準的な方法
にしたがってパッケージングベクターｖｄ−ｅｇに再結
合し、プラーク精製した（実施例５参照）。得られたウ
イルスをｖｄ−ｅｇＣ９と命名した。ｖｄ−ｅｇＣ９の
スクロースグラジェント精製したストックを調製して、
３Ｔ３およびＲＫ１３細胞を感染させた（ｍｏｉ＝
１）。３日後、上清を回収して、実施例４と同様に３Ｔ
３細胞の形質転換について試験した。細胞系に依存し
て、１０6細胞の上清は、１０2〜１０3ＣＦＵのレトロ
ウイルスベクターを含んでいた。レトロウイルスＦＩＸ
欠損粒子を含んでいる上清による半コンフルエントのＲ
Ｋ１３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３７）またはＳＫ−ＨＥＰ
−１細胞（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−５２）の感染によって、
機能的な第ＩＸ因子（ＥＰ ０ ７１１ ３８５に記載さ
れたように測定）が発現した。
【００６８】実施例７： ウサギにおける RetroVac ベクターｖｄ−ｅｇＣ９の注
入およびウサギ血漿におけるヒト第ＩＸ因子の検出 以下の実施例では、動物実験において RetroVac ベクタ
ーｖｄ−ｅｇＣ９が in vivo でヒト第ＩＸ因子の発現
を可能にすることが示された。ニュージーランドホワイ
トラビットに１０8および１０9ｐｆｕのｖｄ−ｅｇＣ９
を静脈投与し、１ヶ月間、２日毎に血液を採取し、ヒト
第ＩＸ因子をＥＬＩＳＡにより定量した。注入前の血清
を採取し、ＥＬＩＳＡがヒト第ＩＸ因子に特異的かどう
かについて測定した。ヒト第ＩＸ因子は、血友病Ｂの治
療に十分な濃度でウサギ血漿に存在した。４週間後、ウ
ェスタンブロッティングで抗ヒト血漿タンパク質抗体の
存在を測定した。対照実験（欠損ウイルスｖＤ４ｖＡに
よる感染）ではヒト第ＩＸ因子は検出されなかった。
入およびウサギ血漿におけるヒト第ＩＸ因子の検出 以下の実施例では、動物実験において RetroVac ベクタ
ーｖｄ−ｅｇＣ９が in vivo でヒト第ＩＸ因子の発現
を可能にすることが示された。ニュージーランドホワイ
トラビットに１０8および１０9ｐｆｕのｖｄ−ｅｇＣ９
を静脈投与し、１ヶ月間、２日毎に血液を採取し、ヒト
第ＩＸ因子をＥＬＩＳＡにより定量した。注入前の血清
を採取し、ＥＬＩＳＡがヒト第ＩＸ因子に特異的かどう
かについて測定した。ヒト第ＩＸ因子は、血友病Ｂの治
療に十分な濃度でウサギ血漿に存在した。４週間後、ウ
ェスタンブロッティングで抗ヒト血漿タンパク質抗体の
存在を測定した。対照実験（欠損ウイルスｖＤ４ｖＡに
よる感染）ではヒト第ＩＸ因子は検出されなかった。
【図１】 キメラワクシニアウイルスの構築の概略図で
ある。図１Ａは、パッケージング成分およびベクター成
分の可能な挿入位置を示している。パッケージング成分
およびベクター成分はポックスウイルスプロモーターの
転写制御下にあり、場合によりポックスウイルスゲノム
の異なる領域に組み込まれていてもよい。図１Ｂは、本
発明のポックスウイルスによる細胞の感染、および次い
で細胞を感染させて安全な様式で宿主ゲノムに組込まれ
る欠損レトロウイルス粒子の産生を示す図である。
ある。図１Ａは、パッケージング成分およびベクター成
分の可能な挿入位置を示している。パッケージング成分
およびベクター成分はポックスウイルスプロモーターの
転写制御下にあり、場合によりポックスウイルスゲノム
の異なる領域に組み込まれていてもよい。図１Ｂは、本
発明のポックスウイルスによる細胞の感染、および次い
で細胞を感染させて安全な様式で宿主ゲノムに組込まれ
る欠損レトロウイルス粒子の産生を示す図である。
【図２】 細胞質において複製するキメラポックスウイ
ルスと、特にスプライシング機構に関して核において複
製するアデノまたはヘルペスウイルスの系との比較をそ
れぞれ示す図である。
ルスと、特にスプライシング機構に関して核において複
製するアデノまたはヘルペスウイルスの系との比較をそ
れぞれ示す図である。
【図３】 プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＬＳＸＮの構築を
示す図である。
示す図である。
【図４】 プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＬＳＸＮの構築を
示す図である。
示す図である。
【図５】 プラスミドｐＤ４−ＳＸの構築を示す図であ
る。
る。
【図６】 プラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇの構築を示す図
である。
である。
【図７】 プラスミドｐＴＫ−ＭＬＶｇの構築を示す図
である。
である。
【図８】 プラスミドｐＴＫｇｐｔ−ＶＰ−ＦＩＸの構
築を示す図である。
築を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ゲオルク・ホルツァー オーストリア、アー−1180ヴィーン、ペー ター−ヨルダン−シュトラーセ145／１ ／４番 (72)発明者 フリードリッヒ・ドルナー オーストリア、アー−1230ヴィーン、ペー ターリニガッセ17番
Claims (16)
- 【請求項１】 レトロウイルスベクター粒子のベクター
成分の配列を含むことを特徴とするキメラポックスウイ
ルス。 - 【請求項２】 該ベクター成分が外来遺伝子をコードす
る配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のキメラ
ポックスウイルス。 - 【請求項３】 欠損レトロウイルス粒子のパッケージン
グ成分を含むことを特徴とする、請求項１または２に記
載のキメラポックスウイルス。 - 【請求項４】 該ポックスウイルスがコルドポックスウ
イルス、好ましくはオルトポックスウイルスであること
を特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のキメラ
ポックスウイルス。 - 【請求項５】 該オルトポックスウイルスがワクシニア
ウイルスであることを特徴とする、請求項４に記載のキ
メラポックスウイルス。 - 【請求項６】 欠損ワクシニアウイルスであることを特
徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載のキメラポッ
クスウイルス。 - 【請求項７】 ベクター成分の配列がポックスウイルス
プロモーターの転写制御下にあることを特徴とする、請
求項１〜６のいずれかに記載のキメラポックスウイル
ス。 - 【請求項８】 パッケージング成分の配列がポックスウ
イルスプロモーターの転写制御下にあることを特徴とす
る、請求項１〜６のいずれかに記載のキメラポックスウ
イルス。 - 【請求項９】 ポックスウイルスプロモーターが初期ポ
ックスウイルスプロモーターであることを特徴とする、
請求項７または８に記載のキメラポックスウイルス。 - 【請求項１０】 ベクター成分がイントロン配列を含む
ことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載のキ
メラポックスウイルス。 - 【請求項１１】 ベクター成分が内部ポリアデニル化配
列を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに
記載のキメラポックスウイルス。 - 【請求項１２】 欠損レトロウイルス粒子のベクター成
分とパッケージング成分の配列を含むキメラポックスウ
イルスと、製薬的に許容し得る担体とを含有する組成
物。 - 【請求項１３】 イントロン含有ゲノムを含む欠損レト
ロウイルス粒子。 - 【請求項１４】 医薬品を製造するための、請求項１〜
１１のいずれかに記載のキメラポックスウイルスの使
用。 - 【請求項１５】 遺伝子治療に適用する医薬品を製造す
るための、請求項１〜１１のいずれかに記載のキメラポ
ックスウイルスの使用。 - 【請求項１６】 腫瘍の治療に適用する医薬品を製造す
るための、請求項１〜１１のいずれかに記載のキメラポ
ックスウイルスの使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT56/98 | 1998-01-16 | ||
| AT0005698A AT406376B (de) | 1998-01-16 | 1998-01-16 | Chimäres poxvirus enthaltend eine retrovirale vektorkomponente |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11266885A true JPH11266885A (ja) | 1999-10-05 |
| JP4411468B2 JP4411468B2 (ja) | 2010-02-10 |
Family
ID=3480372
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00931699A Expired - Fee Related JP4411468B2 (ja) | 1998-01-16 | 1999-01-18 | ベクター成分の配列を含有するキメラポックスウイルス |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6352856B1 (ja) |
| EP (1) | EP0933429B1 (ja) |
| JP (1) | JP4411468B2 (ja) |
| AT (2) | AT406376B (ja) |
| AU (1) | AU769349B2 (ja) |
| CA (1) | CA2258948A1 (ja) |
| DE (1) | DE59907973D1 (ja) |
| DK (1) | DK0933429T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022551753A (ja) * | 2019-10-16 | 2022-12-13 | カリヴィル イムノセラピューティクス， インコーポレイテッド | レトロウイルスをｉｎ ｓｉｔｕで生成させるための生産者ウイルス |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2356200B (en) * | 1997-12-22 | 2002-05-01 | Oxford Biomedica Ltd | Retroviral vectors |
| JP2002260218A (ja) * | 2001-03-05 | 2002-09-13 | Anelva Corp | 磁気記録ディスク、磁気記録ディスク製造方法及び磁気記録ディスク製造装置 |
| WO2018031694A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | City Of Hope | Chimeric poxvirus compositions and uses thereof |
| JP7551496B2 (ja) | 2017-10-31 | 2024-09-17 | カリヴィル イムノセラピューティクス， インコーポレイテッド | 全身送達のためのプラットフォーム腫瘍溶解性ベクター |
| PE20231175A1 (es) | 2020-11-19 | 2023-08-01 | Kalivir Immunotherapeutics Inc | Inmunoterapia oncolitica por remodelacion del microambiente tumoral |
| IL316712B2 (en) | 2021-04-30 | 2025-12-01 | Kalivir Immunotherapeutics Inc | Oncolytic viruses for modified mhc expression |
| EP4460335A4 (en) * | 2022-01-07 | 2026-01-21 | Mayo Found Medical Education & Res | CYTOMEGALOVIRUS VECTORS AND METHODS OF USE |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992015672A1 (en) * | 1991-03-07 | 1992-09-17 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
| AU694519B2 (en) | 1994-04-29 | 1998-07-23 | Immuno Aktiengesellschaft | Recombinant poxviruses with foreign polynucleotides in essential regions |
| AT403167B (de) | 1994-11-14 | 1997-11-25 | Immuno Ag | Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems |
| WO1997035996A1 (en) | 1996-03-25 | 1997-10-02 | Transgene S.A. | Packaging cell line based on human 293 cells |
-
1998
- 1998-01-16 AT AT0005698A patent/AT406376B/de not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-01-12 US US09/228,625 patent/US6352856B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-01-14 CA CA002258948A patent/CA2258948A1/en not_active Abandoned
- 1999-01-15 EP EP99890004A patent/EP0933429B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-15 AU AU12114/99A patent/AU769349B2/en not_active Ceased
- 1999-01-15 AT AT99890004T patent/ATE256194T1/de active
- 1999-01-15 DK DK99890004T patent/DK0933429T3/da active
- 1999-01-15 DE DE59907973T patent/DE59907973D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-18 JP JP00931699A patent/JP4411468B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022551753A (ja) * | 2019-10-16 | 2022-12-13 | カリヴィル イムノセラピューティクス， インコーポレイテッド | レトロウイルスをｉｎ ｓｉｔｕで生成させるための生産者ウイルス |
Also Published As
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|---|---|
| EP0933429A1 (de) | 1999-08-04 |
| US6352856B1 (en) | 2002-03-05 |
| AU769349B2 (en) | 2004-01-22 |
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| DK0933429T3 (da) | 2004-04-13 |
| ATA5698A (de) | 1999-09-15 |
| ATE256194T1 (de) | 2003-12-15 |
| AT406376B (de) | 2000-04-25 |
| DE59907973D1 (de) | 2004-01-22 |
| AU1211499A (en) | 1999-08-05 |
| CA2258948A1 (en) | 1999-07-16 |
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