JPH11275995A - 光独立栄養培養による木本性植物の生産方法 - Google Patents

光独立栄養培養による木本性植物の生産方法

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JPH11275995A
JPH11275995A JP7978998A JP7978998A JPH11275995A JP H11275995 A JPH11275995 A JP H11275995A JP 7978998 A JP7978998 A JP 7978998A JP 7978998 A JP7978998 A JP 7978998A JP H11275995 A JPH11275995 A JP H11275995A
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Japan
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plant
culture
plantlets
μmol
concentration
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JP7978998A
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Toyoki Kozai
豊樹 古在
Chieri Kubota
智惠利 久保田
Osamu Hasegawa
修 長谷川
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Nisshinbo Holdings Inc
Original Assignee
Nisshinbo Industries Inc
Nisshin Spinning Co Ltd
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  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝的に均質な木本性植物、特にアカシア
属、コーヒー属、ガルシニア属に属する植物の小植物体
を効率的に生産する方法を提供することを課題とする。 【解決手段】 木本性植物として産業的価値の高いアカ
シア、コーヒー、マンゴスティンを選択し、光独立栄養
培養によるこれら植物の小植物体の生産の検討を行った
結果、これら植物から得た外植片を糖分を含まない培地
に移植し、光照射下において培養器内の二酸化炭素濃度
を高濃度に維持しつつ培養を行うことにより、従来の光
混合栄養培養に比して、極めて良好に小植物体を発根、
生育させることが可能であることを見出した。また、培
養の際、培地において繊維性および／または多孔性の支
持体を用い、培養器内の換気を高めることにより、小植
物体の生育をさらに高めることが可能であることを見出
した。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、木本性植物、特に
アカシア属、コーヒー属、およびガルシニア属に属する
植物の小植物体の光独立栄養培養による生産方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】木本性植物を生産する方法としては、従
来から、種子繁殖による有性生殖法と、挿し木、接ぎ
木、取り木、株分けなどによる無性生殖法が用いられて
きた。しかしながら、これらの方法のうち有性生殖によ
る方法には、他家受粉植物の場合には遺伝的に不均一
であり、生産した苗の形質や生長にばらつきを生じて安
定的に収穫を行うことができない、種子の発芽率が低
く歩留まりが悪い、生長が遅く種の雑種性が高いため
に苗の形質を判定するのに時間を要する、苗の生産に
少なくとも２年を必要とする、といった問題点が存在し
た。また、挿し木などの無性繁殖による方法では、採
穂木（親株）１本から採取できる本数に限りがある、
挿し木などによる栄養繁殖自体が困難な樹種が多い、
苗の生産に少なくとも２年を要する、といった問題点が
存在した。
【０００３】例えば、東南アジアにおける代表的な植林
用樹種であるアカシア（Acacia mangium）では、従来そ
の増殖に種子繁殖が一般的に用いられてきたが、種子苗
は遺伝的なばらつきが大きいという問題点を有してい
た。このため、遺伝的に優秀な形質を有するクローンを
大量に増殖する有効な方法の確立が望まれている。
【０００４】また、コーヒーにおいては、コーヒー豆生
産の70％を占めるアラビカコーヒー（Coffea arabica）
においては、アラビカ種が自家受粉を行うことにより遺
伝的に安定であるため種子繁殖が用いられている。しか
しながら、コーヒー豆生産の残りの30％は多くの種から
なっており、これら種の大部分は種子繁殖を行うことが
できても他家受粉でありその雑種が遺伝的に不安定であ
る。そこで、主として挿し木による増殖が行われている
が、この挿し木による増殖においても、多くの樹木種の
挿し木増殖と同様に、発根が困難である、増殖率が低い
などの問題点を有している。
【０００５】また、ガルシニア属に属する熱帯性の果物
であるマンゴスティン（Garcinia mangostana L.）にお
いては、単為生殖のため従来から種子による増殖が行わ
れてきた。しかしながら、種子の数が限定されるため、
種子繁殖に代わる苗の生産方法の確立が望まれていた。
【０００６】そこで、近年、種子繁殖や挿し木などによ
る栄養繁殖が困難である種、または実用的でない種にお
いては組織培養によるクローン苗生産が行われている。
組織培養技術を使用したクローン苗生産は、大きく、繁
殖用の植物を選択し準備するステージ（ステージ０）、
無菌培養を確立するステージ（ステージ１）、繁殖させ
るステージ（ステージ２）、インビトロで発根させ、コ
ンディショニングを行うステージ（ステージ３）、エク
スビトロ環境で順化するステージ（ステージ４）からな
る（Hartmann,H.T.et al.,1990.Principles of tissue
culture for micropropagation.pp459-495.Plant propa
gation:principles and practices(5thed.)）。この方
法は、植物の各器官を培養することで得た組織を継代し
増殖させて、これを植物体に再生させるため、遺伝的に
均一な苗を短期間に大量生産するのに特に適した方法で
あるといえる。現に、この手法を利用して、カーネーシ
ョンやランなど多くの草本性植物において、組織培養に
よるクローン苗生産の実用化に成功している。
【０００７】しかしながら、木本性植物については、そ
の生育の遅さや、発根率、増殖率の低さなど技術的確立
の困難性から草本性植物に比して実用化の例が非常に少
ないのが現状である。上記した、アカシア、コーヒー、
マンゴスティンにおいてもその産業的価値にもかかわら
ず、従来の組織培養法（ゲル培地を用いた光混合栄養培
養法）ではクローン苗生産の実用化には成功していな
い。このため、アカシア、コーヒー、マンゴスティンな
どの木本性植物において、遺伝的に均質なクローン苗を
大量に生産しうる方法の確立が望まれていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝的に均
質な木本性植物、特にアカシア属、コーヒー属、および
ガルシニア属に属する植物の小植物体を効率的に生産す
る方法を提供することを課題とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】従来の植物の組織培養技
術（光混合栄養培養法）の問題点の一つに、糖を含む培
地を使用することによる雑菌混入と、培養器内で生育し
た小植物体の葉及び根の不十分な発達がある。特に、ゲ
ル化した寒天中では根の伸長は多くの場合困難であり、
ゲル化した寒天中で生育した根は新環境への順化中に枯
死する傾向にある（Smith and Spomer,1995,Vessels,ge
ls,liquid media, and support systems,p371-404,Auto
mation and Environmental Control in Plant Tissue C
ulture(ed.:Kozai and Smith),Kluwer Academic Publis
hers)）。
【００１０】本発明者らは、アカシア、コーヒー、マン
ゴスティンなどの木本性植物の小植物体の生産を、従来
の光混合栄養培養により行う場合には上記問題点が存在
し、効率的なクローン苗生産が困難であることから、こ
れら小植物体を明所において糖分を含まない培地におい
て培養を行う光独立栄養培養により生産することを考え
た。そこで、本発明者らは、木本性植物として産業的価
値の高いアカシア、コーヒー、およびマンゴスティンを
選択し、光独立栄養培養によるこれら植物の小植物体の
生産の検討を行った。その結果、これら植物から得た外
植片を糖分を含まない培地に移植し、光照射下において
培養器内の二酸化炭素濃度を高濃度に維持しつつ培養を
行うことにより、従来の光混合栄養培養に比して、極め
て良好に小植物体を発根、生育させることが可能である
ことを見出した。また、培養の際、培地において空隙率
の高い支持体を用い、培養器内の換気を高めることによ
り、小植物体の生育をさらに高めることが可能であるこ
とを見出した。
【００１１】即ち、本発明は、光独立栄養培養による木
本性植物、特にアカシア属、コーヒー属、およびガルシ
ニア属に属する植物の生産方法に関し、より具体的に
は、（１） 木本性植物の組織を糖分を含まない培地に
移植し、照明下において二酸化炭素ガスを施用して培養
を行うことを特徴とする、木本性植物の小植物体の生産
方法、（２） 木本性植物がアカシア属に属する植物で
ある、（１）に記載の方法、（３） 木本性植物がコー
ヒー属に属する植物である、（１）に記載の方法、
（４） 木本性植物がガルシニア属に属する植物であ
る、（１）に記載の方法、（５） 培養器内の二酸化炭
素ガス濃度を350から500μmol/molに維持して培養を行
う、（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法、（６）
光合成有効光量子束密度が150から300μmol/m2/sの照
明下で培養を行う、（１）乃至（４）のいずれかに記載
の方法、（７） 培地に繊維性の支持体、多孔性の支持
体、またはそれらの混合物を用いる、（１）乃至（６）
のいずれかに記載の方法、（８） 培地の支持体がセル
ロース性繊維とバーミキュライトとの混合物からなる、
（１）乃至（６）のいずれかに記載の方法、（９） ガ
ス透過性の高い培養器内で培養を行う、（１）乃至
（８）のいずれかに記載の方法、に関する。
【００１２】なお、本発明において「木本性植物」と
は、茎や根に木部を形成し、その細胞壁は多く木化して
強固になる植物を指す。木部があまり発達しない草質ま
たは多肉質の草本性植物の対する意である。
【００１３】
【発明の実施の形態】本発明は、光独立栄養培養による
木本性植物の小植物体の生産方法に関する。本発明の生
産方法においては、木本性植物の組織を糖分を含まない
培地に移植して、照明下において二酸化炭素ガスを施用
して培養を行うことを特徴とする。
【００１４】培養に用いられる植物の材料組織（外植
片）としては、例えば、アカシア属に属する植物の場合
には、葉を有するシュートを用いることができる。用い
られるシュートは、通常、複数の葉と一つの茎からなる
シュートである。葉を有するシュートは、植物生長調節
物質を含む培地上で形成されたマルティプルシュートか
ら得ることができる。また、コーヒー属に属する植物の
場合には、葉を有する単節を外植片として用いることが
できる。単節における葉の枚数は、通常、１枚もしくは
２枚のものが用いられる。葉を有する単節は、培養容器
内で伸長させたシュートを節間で切り分けることにより
採取することが可能である。また、ガルシニア属に属す
る植物においては、例えば、無菌的に発芽させた実生か
らシュートを切除して、これを外植片として用いること
ができる。
【００１５】本発明の生産方法においては、これにより
得られた外植片を糖分を含まない培地に移植して、照明
下において二酸化炭素ガスを施用して培養を行う。植物
組織の培養物は、完全な植物体と異なり光合成により糖
を作り出す能力がないため、培地に糖分を添加すること
が不可欠であると考えられていたが、本発明の培養方法
においては、照明下において二酸化炭素ガスを施用して
培養物に光合成を行わせるため、培地に炭素源としての
糖分は添加しない。糖分を添加すると雑菌の混入が生じ
易く、それにより植物体に悪影響が及ぼされるため糖分
が含まれていると好ましくない。培養には、糖を含ま
ず、窒素、リン、カリウム、マグネシウム、カルシウム
などの多量元素や、鉄、マンガン、銅、亜鉛などの微量
元素などの無機栄養素などの成分を含む培地が用いられ
る。さらに、ニコチン酸、チアミン塩酸などのビタミン
類やアミノ酸などの有機栄養素、成長調節物質を含んで
いてもよいが、これらは必ずしも必須ではない。具体的
な培地としては、例えば、1/2濃度のMS培地などが好適
である。
【００１６】培養においては、培養している外植片の発
根および成長を促進するために、培地に繊維性、多孔
性、またはそれらの混合物からなる支持体を用いると特
に好ましい。従来から用いられている寒天などで固化し
た培地を用いると、発根や小植物体の成長において好ま
しくない結果を生ずる。繊維性や多孔性の支持体は、空
隙率が高いため、これに加える培養液の溶存酸素濃度を
高めると考えられ、これにより発根および成長が促進さ
れると考えられる。また、これら支持体を用いた場合に
は、培養液のpH、ECなどの制御を行いやすいという利点
も有する。支持体の具体例としては、これらに制限され
ないが、バーミキュライト、パーライト、セルロース繊
維、ポリエステル繊維、セラミック繊維、ロックウー
ル、およびこれらの混合物が挙げられる。但し、ポリエ
ステル繊維、セラミック繊維、ロックウールにおいて
は、培養土に移植しようとする際に支持体自体が分解せ
ずに残存し、支持体を根から分離する場合に根を傷める
などの問題点が有り、また、バーミキュライトやパーラ
イト単独の場合には、粒状であるため植物体の固定が悪
いなどの問題点を有するため、このような問題点を有し
ないバーミキュライトとセルロース繊維の混合物（例え
ば、フロリアライト(日清紡社製)）が特に好ましい。
【００１７】培養条件としては、例えば、アカシア属に
属する植物においては、光条件は、通常、光合成有効光
量子束密度（以下、単に「PPF」と称することがある）1
50〜300μmol/m2/sである。低すぎる光条件では小植物
体の光合成の効率が低下する一方、高すぎる光条件では
植物の生育阻害を引き起こすことがあり、またコストも
高まることから好ましくない。また、培養室内におけ
る、CO2条件としては、通常、1000〜2000μmol/molであ
る。CO2濃度が低いと効率的に光合成が行われないため
好ましくない。一方、飽和点以上のCO2濃度を与えても
光合成速度は上昇しないため好ましくない。その他、温
度条件としては、通常、25〜30℃であり、湿度条件とし
ては、通常、50〜70％である。また、培養器における換
気条件としては、通常、換気回数3〜6/hで行われる。こ
れらの諸条件の範囲のうち、培養器内のCO2濃度が350〜
500μmol/molになるような組み合わせの条件が特に好ま
しい。培養器内のCO2濃度は培養器内の小植物体の光合
成速度によっても影響されるため、培養期間中、培養器
内CO2濃度が好ましい範囲内に維持されるように、培養
器外のCO2濃度を適宜変化させるとよい。コーヒー属に
属する植物においても、上記条件において培養すること
が可能であるが、コーヒー属に属する植物の光合成速度
のCO2飽和点はアカシア属の場合に比して高いため、培
養室内CO2条件としては5000μmol/molまで高めることが
可能である。また、ガルシニア属に属する植物の場合に
も、上記アカシア属に属する植物の場合と同様の条件で
培養することが可能であるが、光条件のPPFは100〜300
μmol/m2/sで培養することが可能である。小植物体の培
養期間において、光条件は、1日当たり、通常、明期と
暗期をそれぞれ12から16時間、12から8時間で行う。な
お、培養に用いる培養器は、換気率を高めるために、気
体透過性であることが好ましい。例えば、培養器の蓋に
ガス透過性フィルム（例えば、ミシリール(ミリポア社
製)）を用いて、通気性を高めることができる。また、
培養器は小植物体に光合成を行わせるために少なくとも
一部が光透過性であることが好ましい。例えば、透明な
蓋を有する培養器を用いることができる。
【００１８】
【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものでは
ない。
【００１９】[実施例１] 光独立栄養培養によるアカシ
ア小植物体の大量増殖 アカシア・マンギウムに対して、光独立栄養培養による
マイクロプロパゲーションが適用できるか否かを試験す
るために、光独立栄養培養および従来の光混合栄養的培
養された小植物体の成長および純光合成速度を異なる培
養条件下で比較した。
【００２０】具体的には、従来法により継代培養（ショ
糖20g/l、BAP1mg/l、寒天8g/lを添加したMS培養液で培
養）されたアカシア・マンギウムを外植片（50-100ｍｇ
生体重量/シュート）として用いた。４つの外植片を60m
lのMS培地を含む370ml容器に移植した。９つの処理を表
１に示すように設定した。
【００２１】
【表１】 なお、表中の「n.e.」は低CO2濃度（500-600μmol/mo
l）を示す。また、「V+CF」は容器当たり10gのバーミキ
ュライトとセルロースの混合物（フロリアライト、日清
紡社製）を示す。また、寒天は、8g/lの濃度で使用し
た。
【００２２】対照区は、従来の一般的に用いられてきた
光混合的培養条件として設定した。培養室における気温
は、16時間の光条件および8時間の暗条件の間、26-27℃
であった。培養室における相対湿度は、60％に維持し
た。白色蛍光灯を光源として用いた。光条件下での培養
器内の小植物体の純光合成速度を富士原らの方法（農業
気象,43(1):21-30(1987)）に従い、毎週測定した。培養
期間の最後（28日目）に、生体重量および乾重量を測定
し、発根率を記録した。
【００２３】その結果、表２に示すように、高換気性の
容器と培養室におけるCO2濃度の組み合わせにより、小
植物体の生体重量および乾重量が有意に増加した。その
一方、培地におけるショ糖および成長調節物質の存在の
有無は、有意な影響を示さなかった。対照処理の小植物
体は、生体重量および乾重量が最も低く、発根しなかっ
た。なお、表中の「NS」および「**」はそれぞれ「有意
でない」および「p<0.01において有意である」を示す。
【００２４】
【表２】 光条件下における純光合成速度は、培養期間を通じて、
無糖、高換気、およびCO2施用区において高かった（S0-
GR-CE区およびS0-NR-CE区）（図１）。以上の結果は、
光独立栄養によるマイクロプロパゲーションがアカシア
マンギウム小植物体において成長、光合成、および発根
を促進することを示した。
【００２５】[実施例２] 光独立栄養培養によるコーヒ
ー小植物体の大量増殖 （１）培養器内で生育したコーヒー（Coffea arabust
a）小植物体の光合成能力の検定 培養器内で生育したコーヒー（Coffea arabusta）小植
物体の光合成の能力を、培養容器内の異なるCO2濃度お
よびPPFレベルへの応答において検討した。光合成速度
（以下、単に「Pn」と称することがある）の測定は、具
体的には、３つの方法、即ち、１）45日間にわたる培養
容器の内外におけるCO2濃度の測定に基づく、コーヒー
小植物体の光合成速度の経日変化の測定、２）Niuらの
システム（Niu,et al.,1997.J.Japanese Soc.Hort.Sc
i.,Suppl.2.300-301）を使用した、培養期間の10日目お
よび30日目における培養器内の小植物体のPnの評価、
３）「Portable photosynthesis(PP) System」を使用し
た、45日目の培養器内のコーヒー小植物体のPnの評価、
により検討した。
【００２６】１）CO2濃度測定に基づくコーヒー小植物
体の純光合成速度（Pn）の経日変化コーヒー小植物体の
培養は次のように行った。まず、培養器内のコーヒー小
植物体の葉を有する単節３つを480cm3のプラスチックの
ポット型容器にて培養した。それぞれの容器には、成長
調節物質および糖を含まない1/2濃度のMS（Murashige,T
and F.Skoog.1962.Physiol.Plant,15:473-497）培養液
75mlを入れ、支持体としてフロリアライト（日清紡社
製）を用いた。培地のpHはオートクレーブ前に5.70に調
節した。0.5μmのポアサイズを有するガス透過膜（ミリ
シール，ミリポア社製）を培養容器の透明な蓋の２つの
穴の部分にそれぞれ着用した。容器の換気回数は、古在
らの方法（Kozai,T. et al.,1986.J.Agr.Meterol.,42
(2):119-127）に従い、2.34／時間と評価した。実験
は、培養室において２段階のCO2濃度（Cou t）（400-500
（周囲）および1400-1500μmol/mol）で行った。外植片
は、白色蛍光灯（National社製）を用いて、最初の３日
間は50μmol/m2/sの光を与えた。次の７日間は光強度を
100μmol/m2/sまで増加させ、その後10日間は150μmol/
m2/sとした。最後の25日間は150μmol/m2/s、250μmol/
m2/sと350μmol/m2/sの３段階の光強度を適用した（表
３）。培養容器は気温28℃±2℃、相対湿度70から80
％、1日当たり16時間の光条件で行った。
【００２７】
【表３】 なお、表中の各処理の表記の左側の「Ｌ」、「Ｍ」およ
び「Ｈ」はそれぞれ21日目からのPPFが150、250、350μ
mol/m2/sであることを示し、右側の「Ｎ」および「Ｅ」
は低濃度または高濃度のCO2条件を示す。
【００２８】10、20、30、および45日目の定常状態の小
植物体のPnを富士原ら（農業気象,43(1):21-30,1987）
による次の方程式により計算した。なお、CO2濃度はガ
スクロマトグラフ（GC-12A、Shimazu）を用いて測定し
た。
【００２９】
【数１】Pn＝K・E・V・（Cout−Cin） （この方程式において「Ｋ」は体積から分子量への変換
係数（40.5mol/m3）、「Ｅ」は培養容器における時間当
たりの換気回数（h-1）、「Ｖ」は培養容器の空気量（c
m3）、「Cin」および「Cout」は定常状態条件下におけ
る培養容器内外のCO2濃度（mol/mol）を示す） コーヒー小植物体の45日間の培養における小植物体のPn
の経日変化の実験結果を図２に示す。すべての評価は、
5回の測定の平均値を示す。どのレベルのPPFにおいても
Coutの増加とともにCinが増加した。純光合成速度は、
最初の20日間の培養の間わずかに増加した。次の25日間
においては、高いCO2濃度がコーヒー（coffea arabust
a）小植物体の光合成能力に大きく影響した。45日目に
おいて、Pnは高CO2条件下（「LE」および「HE」）の方
が低CO2条件下（「LN」および「HN」）と比較して3倍高
かった。しかしながら、コーヒー小植物体の純光合成速
度の増加に対する光強度の影響は少なかった。150μmol
/m2/sと350μmol/m2/sの条件下ではPnは大きく異ならな
かった。
【００３０】また、培養45日目における生体重量、乾重
量、シュート長、および根の長さの計測を行った（図
３）。その結果、高いCO2濃度がコーヒー小植物体の生
体重量、乾重量、シュート長、および根の長さの全てを
促進した。特に、150μmol/m2/sの光条件（LE）におい
て促進効果が高かった。
【００３１】２）培養器内のコーヒー小植物体のPnの評
価 培養器内のコーヒー小植物体の光合成速度を培養環境条
件を変えずに評価するために、Niuらによるシステムを
用い、各々の葉を有する単節を、1/2濃度のMS培地（有
糖（20g/l）または無糖）10mlを含むプラスチックカッ
プ（直径25mm、高さ30mm）を用いて最初に育成した（図
４）。3つのカップを2つのミリポアフィルターを有する
480cm3容器内に無菌的に置き、その容器をPPFが150μmo
l/m2/sのCO2無施用の部屋に移した。10日目と30日目
に、それぞれの培地処理区の3つのカップを取り出し、C
inおよびCoutを測定するために、4つミリポアフィルタ
ーを有するポリカーボネート製マジェンタ型容器（図
４）内に移した。容器の換気の回数は、6.5／時間と評
価した。それぞれの条件のセット（CoutおよびPPF）の
下で、CinおよびCoutを定常状態で測定し、Pnは富士原
らによる方程式(1)を用いて計算した。グロースチャン
バーの温度は、28±1℃に維持した。10日目の小植物体
のPnを測定するために2段階の光強度（Ｌ：120μmol/m2
/s、Ｈ：247μmol/m2/s）を用いた。30日目に、小植物
体のPnを評価するために320μmol/m2/sのPPFを適用し
た。測定直後に、それぞれの処理を行ったすべての小植
物体の乾重量および葉面積を測定した。なお、CO2濃度
はガスクロマトグラフ（GC-12A、Shimazu）を用いて測
定した。
【００３２】Niuらによるシステム（図４）を用いて葉
面積当たりのPnを評価した結果を図５に示す。この測定
の結果から、コーヒー小植物体が光独立栄養条件下で良
好な発育を行う高度な能力を有することが証明された。
10日目と30日目において得られたデーターにより、容器
内のCO2濃度は小型グロースチャンバーにおけるCO2濃度
の増加と共に増加した。10日目において、光強度が増加
したとき、純光合成速度に対しCO2濃度が有意な影響を
与えた（図５a）。30日目における結果においては、培
養器内のコーヒー小植物体のCO2飽和点はとても高かっ
た（光強度が320μmolm-2s-1のとき約4500-5000μmolmo
l-1）（図5b）。
【００３３】３）「Portable photosynthesis(PP) Syst
em」、モデル「CIRAS-1」（PP system社製）を用いた葉
のPnの評価 PPFが150μmol/m2/sの条件下において無糖で1/2濃度のM
S培地を用いフロリアライト（日清紡社製）を使用して4
5日間培養したコーヒー小植物体の第三番目に展開した
葉をPn測定のために用いた。それぞれの葉をPPシステム
のリーフチェンバー（葉面積：2.5cm2）に入れた。チェ
ンバー内の温度を28℃に設定した。3段階のCO2濃度（46
2、951、および1754μmol/mol）を試験した。各CO2濃度
処理で、光強度をPPFセンサーにより10、50、100、20
0、300、500、700および1000μmol/m2/sに設定した。光
源には、ハロゲンランプを用いた。
【００３４】図６に、PPシステムを使用した際の、コー
ヒーの葉面積当たりの純光合成速度の評価を示した。Pn
はCO2濃度および光強度の増加とともに増加した。200μ
mol/m2/sのPPFでは、1754μmol/molのCO2濃度（図中の
三角）でのPnは462μmol/molの場合（図中の四角）より
1.8倍高く、951μmol/molでの場合（図中の黒丸）より
1.4倍高かった。また、1000μmol/m2/sまでPPFを増加さ
せた場合では、1754μmol/molのCO2濃度でのPnは、462
μmol/molのそれより2.1倍高く、951μmol/molでのそれ
より1.7倍高かった。
【００３５】以上の結果は、インビトロでのコーヒー小
植物体が、光独立栄養条件下で増殖し、成長する大きな
能力を有していることを証明した。 （２）光独立栄養によるコーヒー（Coffea arabusta）
小植物体のマイクロプロパゲーションにおける糖、CO2
濃度、および光強度の影響 最初の実験で、葉を有する単節２つを、300mlのポリカ
ーボネート製の柱状のポット型容器（高さ70mmで、直径
80mm）を用いて、ショ糖添加（20g/l）または無添加の7
0mlの1/2濃度のMS寒天（9g/l）培地上で培養した。成長
調節物質は用いなかった。オートクレーブ前にpHを5.7
に調節した。無糖培地の場合には、容器の蓋に0.5μmの
ポアサイズを有するガス透過膜（ミリシール、ミリポア
社製）を装着し、有糖培地の場合には装着しなかった。
60日間の培養期間中、小植物体は、1日当たり10時間70
μmol/m2/sの光条件で、26±2℃、55-65％の相対湿度で
成長させた。小植物体当たりの生体重量、乾重量、シュ
ート長、および葉面積は、分散分析を用いて統計学的に
計算した。第二の実験では、３個体の葉を有する単節を
480mlのポリカーボネート製の柱状のポット型容器を用
い、75mlのショ糖を含まない1/2濃度のMS培養液で培養
した。支持体として、フロリアライト（日清紡社製）を
用いた。容器の蓋には、0.5μmのポアサイズを有するガ
ス透過膜（ミリシール,ミリポア社製）を２枚装着し
た。小植物体は、45日の間、1日16時間の光条件下で、2
段階のCO2濃度（500および1500μmol/mol）、2段階のPP
F（150および250μmol/m2/s）で成長させた。pHはオー
トクレーブ前に5.7に調節した。45日目に、小植物体の
増加した生体重量、乾重量、葉面積、およびシュート長
のデーターを集計し、各試験区を3回反復して得られた9
つの植物体の結果に関して分散分析を行った。
【００３６】ショ糖濃度がコーヒー小植物体の成長へ及
ぼす影響を培養60日目に測定した結果を表４に示す。な
お、表中の試験区において「S20」は20g/lのショ糖を含
む培地で培養したもの、「S0」は無糖培養したものを示
す。また、「NS」および「*」はそれぞれ「有意でな
い」および「p=0.01において有意である」を示す。
【００３７】
【表４】 表４の結果から、コーヒー植物体が無糖培地で良好に成
長することが示された。各処理の間で生体重量および乾
重量において有意な差異は認められなかったが、無糖条
件で培養した小植物体のシュート長および葉面積は、有
糖培地の場合に比して有意に増加した。有糖培地では、
すべてのシュートの基部にカルスが生じた。一方、無糖
培地では、カルスは生じなかった。
【００３８】また、インビトロでのコーヒー小植物体の
成長においてPPFレベルおよびCO2濃度の影響を検討した
結果を表５に示す。なお、表中の試験区における「L」
および「H」はそれぞれ低PPF（150μmol/m2/s）および
高PPF（250μmol/m2/s）を示し、「N」および「E」はそ
れぞれ低CO2濃度（500μmol/mol）および高CO2濃度（15
00μmol/mol）を示す。また、「NS」、「*」および「*
*」はそれぞれ「有意でない」、「p=0.05で有意であ
る」、「p=0.01で有意である」を示す。
【００３９】
【表５】 表５に示されるように高CO2条件下では、小植物体は光
強度に関係なく、顕著に良好に成長した。低CO2条件下
では、PPFが高くなれば成長が促進された。しかしなが
ら、高CO2条件下では、小植物体は、250μmol/m2/sのPP
F（HE）よりも150μmol/m2/sのPPFの場合（LE）のほう
が成長が良好であった。150μmol/m2/sのPPFおよび1500
μmol/molのCO2濃度の条件下（LE）では、小植物体の生
体重量、乾重量、シュート長、および葉面積の増加が他
の処理と比較して最大であった。このことからコーヒー
小植物体の成長が高CO2条件下で促進されることが示さ
れた。 （３） 光独立栄養培養によるコーヒー（Coffea arabu
sta）小植物体のマイクロプロパゲーションにおける支
持体、および換気の影響 培養器内のコーヒー（Coffea arabusta）小植物体（一
対の葉を有する単節）を、480mlの透明な容器中に1/2濃
度のMS培養液（ショ糖濃度20g/l、または無糖、どちら
も成長調節物質なし）75mlを加え、支持体としてフロリ
アライト（セルロース繊維とバーミキュライトの混合
物、本容器当たり10g使用、日清紡社製）とバクトアガ
ー（上記培養液に8g/lの濃度で加え、ゲル化させたも
の）を用いたものに各3個体づつ着床して40日間培養し
た。容器の蓋には、穴がないかまたは2つの穴（直径10m
m）を設けており、2つの穴にはそれぞれ0.5μmのポアサ
イズを有するガス透過膜（ミリシール、ミリポア社製）
を装着した。それらの容器の換気の回数は、それぞれ1
時間に0.24回と2.34回であった。全ての容器は、気温28
℃、湿度75％、CO2濃度400-500μmol/mol、白色蛍光灯
により1日当たり16時間の光条件で維持した。PPFは、培
養最初の3日間、次の7日間、次の10日間、最後の20日間
はそれぞれ，50，100，150，200μmol/m2/ s であっ
た。純光合成速度（NPR）は、富士原ら（農業気象,43
(1):21-30,1987）の方法によって測定した。容器内及び
外のCO2濃度は、ガスクロマトグラフにより測定した。
実験は、2水準3要因の要因実験を3回繰り返して行っ
た。これにより得られた生体重量、乾重量、シュート
長、および葉面積の増加データーを分散分析した。各試
験区間の有意性を調べるために、p=0.05でのLSD（最小
有意差）検定を行った。なお、行った処理の種類を表６
に示す。なお、表中の試験区左における「S」および
「F」はそれぞれ有糖および無糖を示し、中央の「A」お
よび「F」はそれぞれ寒天およびセルロース／バーミキ
ュライト（フロリアライト）を示し、「L」および「H」
はそれぞれ低換気回数および高換気回数を示す。
【００４０】
【表６】 また、各処理の結果を表７に示す。なお、表中の「N
S」、「*」および「**」はそれぞれ「有意でない」、
「p=0.05で有意である」、「p=0.01で有意である」を示
す。
【００４１】
【表７】 支持体中の糖の存在／非存在は、40日間の培養で、乾重
量と葉面積の増加には影響しなかったが、生体重量とシ
ュート長の増加には影響した。支持体は、上記の成長パ
ラメーター全てに影響した。換気の回数は、生体重量、
シュート長、葉面積の全てに影響した。これら3つのフ
ァクターは、シュート長に影響を与えていることが判明
した。生体重量、乾重量、シュート長及び葉面積の増加
はFFH（糖を含まない、繊維状支持体、多い換気回数）
において最大であった。根の成長及び発達もFFH処理に
おいて最大であった。根の伸長はSFL（糖を含む、繊維
状支持体、少ない換気回数）試験区をのぞく繊維状支持
体試験区（FFL，SFH及びFFH）において誘発された。シ
ョ糖を含む寒天の試験区（SAL，SAH）では、茎の基部に
カルスが生成し、根の伸長および生育が見られなかっ
た。光合成速度はFFH試験区が最大となり、10日目、20
日目、30日目、40日目はそれぞれ小植物体当たり1時間
に0.7、1.0、2.1、3.9μmol/hであった。以上の結果か
ら、培養器内でのコーヒー植物体の成長および発根は、
高い換気回数下における無糖培養において空隙率の高い
支持体を用いることにより促進されることが示された。
【００４２】[実施例３] 光独立栄養によるマンゴステ
ィン小植物体の大量増殖 無菌的に発芽させたマンゴスティンの実生からシュート
を切除し、これを外植片（生体重量で640-870mg/シュー
ト）として用いた。100mlのMS培地を含む、ポリカーボ
ネート製の370ml容器に、外植片を移植した。培地の支
持材としてはバーミキュライト（培養器当たり25-35g）
を用いた。5つの試験区を表８に示すように設定した。
なお、表中の「Z」は培地における初期ショ糖濃度を示
し、「Y」は10mg/lの2-ipおよび1mg/lのIBAを示し、
「X」は古在ら（Kozai,T. et al.,1986.J.Agr.Metero
l.,42(2):119-127）の方法により求めた培養器内の換気
回数を示す。
【００４３】
【表８】 対照区におけるシュートは、支持材を除いては従来の培
養条件と同様の培養条件下で培養を行った。培養器内の
気温は、光条件下では27.5℃、暗期では25℃であった。
培養室における相対湿度は60％に維持した。光源として
蛍光灯を用い、110μmol/m2/sのPPFを照射した。培養室
内のCO2濃度は1300μmol/molであった。培養器において
高い換気回数を得るために、培養器上に2つのガス透過
性膜（ミリシール、ミリポア社製）を装着した。30日目
に、各試験区につき6つの小植物体の生体重量および乾
重量を測定した。また、葉の枚数、および発根率を測定
した。光条件期間における培養器内の純光合成速度を富
士原らの方法に従って求めた。それらの結果を表９に示
す。なお、表中の「NS」、「*」および「**」はそれぞ
れ対照区（S30-GR-LV）に対して「有意でない」、「p=
0.05で有意である」、「p=0.01で有意である」を示す。
また、分散分析における「NS」および「**」はそれぞれ
「有意でない」、「p=0.01で有意である」を示す。
【００４４】
【表９】 その結果、30日目における小植物体の生体重量および乾
重量は、各試験区の間で有意な相違はなかった。培地へ
の成長調節物質の添加は、葉の枚数を増加させた。対照
区においては発根は認められなかったが、支持材にバー
ミキュライトを用いて高換気条件で培養を行うと、培地
におけるショ糖や成長調節物質の有無に関係なく、20〜
40％のシュートにおいて根の誘導が認められた。対照区
における培養器内のCO2濃度は最も低く、対照区におけ
る葉面積当たりの純光合成速度は、高換気処理を行った
試験区の1/12〜1/7であった。以上から、マンゴスティ
ン小植物体が、バーミキュライトを支持材として、高換
気条件下でCO2を施用することで、光独立栄養的に栄養
繁殖し、小植物体の成長速度を減少させずに発根率と純
光合成速度を増加させることができることが示された。
【００４５】
【発明の効果】本発明により、木本性植物、特にアカシ
ア属、コーヒー属、およびガルシニア属に属する植物の
小植物体の光独立栄養による生産方法が提供された。本
発明の方法によれば、遺伝的に均質な木本性植物の小植
物体を短期間で大量に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】光条件下におけるアカシア小植物体の純光合成
速度の経日変化を示す。平均±SDが示してある。
【図２】コーヒー小植物体の45日間の培養における小植
物体の光合成速度の経日変化を示す。
【図３】光独立栄養培養におけるコーヒー小植物体の成
長に及ぼす光強度とCO2濃度の影響を示す。
【図４】Niuらにより開発されたシステムを示す。
【図５】Niuらによるシステム（図４）を用いてコーヒ
ー小植物体の葉面積当たりの光合成速度を評価した結果
を示す。
【図６】PPシステムを使用した際の、コーヒー小植物体
の葉面積当たりの純光合成速度の評価を示す。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 木本性植物の組織を糖分を含まない培地
    に移植し、照明下において二酸化炭素ガスを施用して培
    養を行うことを特徴とする、木本性植物の小植物体の生
    産方法。
  2. 【請求項２】 木本性植物がアカシア属に属する植物で
    ある、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 木本性植物がコーヒー属に属する植物で
    ある、請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】 木本性植物がガルシニア属に属する植物
    である、請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】 培養器内の二酸化炭素ガス濃度を350か
    ら500μmol/molに維持して培養を行う、請求項１乃至４
    のいずれかに記載の方法。
  6. 【請求項６】 光合成有効光量子束密度が150から300μ
    mol/m2/sの照明下で培養を行う、請求項１乃至４のいず
    れかに記載の方法。
  7. 【請求項７】 培地に繊維性の支持体、多孔性の支持
    体、またはそれらの混合物を用いる、請求項１乃至６の
    いずれかに記載の方法。
  8. 【請求項８】 培地の支持体がセルロース性繊維とバー
    ミキュライトとの混合物からなる、請求項１乃至６のい
    ずれかに記載の方法。
  9. 【請求項９】 ガス透過性の高い培養器内で培養を行
    う、請求項１乃至８のいずれかに記載の方法。
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