JPH11276175A

JPH11276175A - ビオチンの製造方法

Info

Publication number: JPH11276175A
Application number: JP10086972A
Authority: JP
Inventors: Tomoyasu Kawabe; 智康河辺; Fujio Mukumoto; 藤夫椋本; Masatoshi Shimizu; 将年清水
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-03-31
Filing date: 1998-03-31
Publication date: 1999-10-12

Abstract

(57)【要約】【課題】微生物を用いる醗酵法によるビオチンの製造過
程に於いて、培養液中に蓄積されたデスチオビオチンを
効率良く目的とするビオチンに変換する方法を提供する
こと。【解決手段】微生物を用いる醗酵法によるビオチンの製
造過程に於いて、ビオチンシンターゼ活性を有する酵素
をコードする遺伝子を含むプラスミドを有する大腸菌を
培養液中に添加することを特徴とするビオチンの製造方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ビオチンの製造法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】ビオチンはヒト、動植物やある種の微生
物に必要とされるビタミンの一つである。従来、微生物
を用いるビオチンの製造方法としては、ストレプトマイ
セス（Streptomyces ）属、ミクロモノスポラ（Micromo
nospora ）属に属する微生物を用いる方法（特公昭41-2
1756号）、スポロボロマイセス（Sporobolomyces ）属
に属する微生物を用いる方法（特公昭42-3074号）、バ
シルス（Bacillus ）属、クロモバクテリウム（Chromob
acterium ）属、シュードモナス(Pseudomonas )属に属
する微生物を用いる方法（特開昭56-160998号）、スフ
ィンゴモナス（Sphingomonas ）属に属する微生物を用
いる方法（特開平6-133790）などが知られている。ま
た、ビオチン生産能力を有する微生物から遺伝子工学的
技術を用いてビオチン生合成に関与する遺伝子を単離
し、単離した遺伝子を微生物に導入して該微生物におけ
るビオチン生合成に関与する遺伝子の発現量を増大させ
ることにより、ビオチン生合成反応を触媒する酵素の活
性を増大させ、ビオチンの生産性を向上させる微生物の
育種方法も提案されている（特開昭61-149091、特開昭6
1-202686、特開平2-27980、特開平7-231789等）。一般
に、前記のような微生物を用いた醗酵法によるビオチン
の製造方法においては、目的物であるビオチンとともに
その前駆体である7-ケト-8-アミノペラルゴン酸、7,8-
ジアミノペラルゴン酸、デスチオビオチンが蓄積、残存
する傾向があり、特にデスチオビオチンが蓄積、残存す
る傾向が報告されており（N.Sakuraiら、journal of bi
otechnology 36, 63（1994）、特開平7-236493）、目的
とするビオチンの収量が低下するばかりでなく、このよ
うな種々の夾雑物、殊に相当量のデスチオビオチンが残
存している系では、それらの分離、回収も煩雑になる。
このため、デスチオビオチンからビオチンへの変換方法
が検討され、大腸菌の休止菌体を用いる方法（Eisenber
g,M.A.ら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2
1, 5（1982））、ビオチンオペロン中のBioＢ遺伝子を
有する大腸菌から精製した無細胞抽出液を用いる方法
（特開平5-103682）、酵素反応系にフラボドキシンを添
加する方法、フラボドキシンを担持する大腸菌を培養系
または休止菌体系に用いる方法（特開平7-236493）が提
案されている。しかしながら、これらの方法でも培養過
程で培養液中に蓄積したデスチオビオチンからビオチン
への変換は充分ではなく、より変換率の高い方法の開発
が望まれている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、微生物を用
いる醗酵法によるビオチンの製造過程に於いて、培養液
中に蓄積されたデスチオビオチンを効率良く目的とする
ビオチンに変換する方法を提供する。

【０００４】

【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、微生物を用いる醗酵法
によるビオチンの製造過程で産生されその培養液中に蓄
積するデスチオビオチンが、当該培養液に、ビオチンシ
ンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を含むプ
ラスミドを有する大腸菌[エシャリヒエ・コリ（Escheri
chia coli）]を添加することにより、効率よくビオチン
に変換されることを見出し、本発明に至った。即ち、本
発明は微生物を用いる醗酵法によるビオチンの製造過程
に於いて、ビオチンシンターゼ活性を有する酵素をコー
ドする遺伝子を含むプラスミドを有する大腸菌を培養液
に添加することによるビオチンの製造方法（以下、本発
明方法と記す。）を提供するものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
醗酵法によるビオチンの製造に用いられる微生物として
は、例えばスフィンゴモナス属、バチルス属、シュード
モナス属等に属する微生物が挙げられ、スフィンゴモナ
ス属が好適に用いられる。本発明方法において用いられ
るスフィンゴモナス属に属する微生物としては、例えば
特開平6-133790号に記載されたスフィンゴモナス・ポウ
シモビルス JCM7511株やスフィンゴモナス・エスピー
（Sphingomonas sp.）SC42405株などの自然界から分離
された菌株、該分離菌株に変異が導入された菌株、さら
には、スフィンゴモナス属に属する微生物由来のビオチ
ン生合成に関与する遺伝子、即ち、7-ケト-8-アミノペ
ラルゴン酸シンテターゼ遺伝子（bioF）、7,8-ジアミノ
ペラルゴン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（bio
A）、デスチオビオチンシンテターゼ遺伝子（bioD）、
ビオチンシンターゼ遺伝子（bioC）およびビオチン生合
成経路の中でピメリルCo-Aより上流の生合成段階の反応
を触媒する活性を有する酵素の遺伝子（bioC）の中で、
デスチオビオチンより上流の生合成経路の反応を触媒す
る活性を有する酵素をコードする１以上の遺伝子を含む
プラスミドを持つスフィンゴモナス属細菌が好適に用い
られる。上記のようなプラスミドは、例えばスフィンゴ
モナス・ポウシモビルス JCM7511株やスフィンゴモナス
・エスピー（Sphingomonas sp.）SC42405株などのスフ
ィンゴモナス属に属する微生物から得られるビオチン生
合成に関与する遺伝子や該遺伝子に変異が導入された遺
伝子を、不和合性群Pに分類されるRK2やRK2由来のプラ
スミドベクター（Plasmids, vol.13, 149-153, (198
5)、Journal of Bacteriology, vol. 167 , 604-610(19
86)）、不和合性群Qに分類されるRSF1010やRSF1010由来
のプラスミドベクター（Gene, vol. 16, 237-247, (198
1)）等に挿入することにより構築することができ、構築
されたプラスミドは、エレクトロポーレーション法（Cu
rrent Protocols in Molecular Biology, vol.1, John
Wiley& Sons. Inc. ISBNO-471-50338-X(1987)）等の通
常の方法によりスフィンゴモナス属細菌に導入すること
ができる。プラスミドが導入され形質転換されたスフィ
ンゴモナス属細菌は、プラスミドに含まれ遺伝子と共に
導入された選択マーカー遺伝子の表現型等によって選択
でき、このようにしてスフィンゴモナス属に属する微生
物由来のビオチン生合成に関与する遺伝子の中で、デス
チオビオチンより上流の生合成経路の反応を触媒する活
性を有する酵素をコードする１以上の遺伝子を含むプラ
スミドを持つスフィンゴモナス属細菌を得ることができ
る。尚、これら本発明方法に使用可能なスフィンゴモナ
ス属細菌として、デスチオビオチン生産量が高いほど工
業的なビオチン生産に有利となる。

【０００６】このような微生物の培養には、一般細菌に
おける通常の培養に使用される炭素源、窒素源、有機な
いし無機塩等を適宜含む各種の培地を使用することがで
きる。炭素源としては、グルコース、グリセリン、マル
トース、デンプン、デキストリン、シュークロース、動
植物油、糖蜜等が挙げられる。窒素源としては、肉エキ
ス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コー
ンスティープリカー（corn steep liquor）、綿実粉、
乾燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、およびアン
モニア、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アン
モニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、尿素
等の有機または無機の窒素源等が挙げられる。なお、天
然有機窒素源は窒素源であるとともに炭素源にもなりう
る。有機ないし無機塩としては、カリウム、ナトリウ
ム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の
塩化物、硫酸塩類、酢酸塩類、炭酸塩類およびリン酸塩
類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバル
ト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウ
ム、炭酸ナトリウム、リン酸水素1カリウム、リン酸水
素2カリウム、リン酸水素1ナトリウム、リン酸水素2ナ
トリウム等をあげることができる。培地のpHを調節する
目的で有機または無機の酸、アルカリ等を加えてもよ
く、消泡の目的で油脂類、表面活性剤等の適量を使用す
ることもできる。また、その培養は、一般細菌における
通常の培養方法に準じて行われ、試験管振盪培養、往復
式振盪培養、回転振盪培養、ジャーファーメンター培
養、タンク培養等の種々の液体培養法が適用可能であ
る。培養は通常、好気的条件下で行われる。ジャーファ
ーメンター培養タンクを使用する場合は、通常、培養液
量の約0.1〜約2倍／分の通気条件で無菌空気を導入す
る。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更でき
るが、例えば、約20℃〜約40℃、好ましくは約25℃〜約
35℃、より好ましくは約28℃〜約33℃の範囲である。培
地のpHは、例えば、約6〜約8を好ましくあげることがで
きる。培養時間は、種々の条件によって異なるが、通
常、約2〜約10日間程度、好ましくは約4〜約6日間程度
がよい。培養方法としては公知の方法、例えばバッチ培
養、フィード培養などが挙げられる。

【０００７】上記のようにして微生物を培養することに
より得られるビオチンおよびデスチオビオチンを含む培
養液に、ビオチンシンターゼ活性を有する酵素をコード
する遺伝子を含むプラスミドを有する大腸菌が添加され
る。ここで用いられる大腸菌としては、ビオチン生合成
に関与する遺伝子、即ち、7-ケト-8-アミノペラルゴン
酸シンテターゼ遺伝子（bioF）、7,8-ジアミノペラルゴ
ン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子（bioA）、デスチ
オビオチンシンテターゼ遺伝子（bioD）、ビオチンシン
ターゼ遺伝子（bioC）およびビオチン生合成経路の中で
ピメリルCo-Aより上流の生合成段階の反応を触媒する活
性を有する酵素の遺伝子（bioC）からなる群の中のビオ
チンシンターゼ遺伝子、またはさらに該群の中の他の１
以上の遺伝子を含むプラスミドを持つ大腸菌を用いるこ
とができる。これらのビオチン生合成に関与する遺伝子
としては、大腸菌内で発現した際にそのコードする酵素
がビオチン生合成に関与する活性を発揮する遺伝子であ
ればよく、大腸菌由来のビオチン生合成に関与する遺伝
子（bioＦ、Ａ、Ｄ、Ｂ、Ｃ）（A.J.Otsukaら、 Journa
l of Biological Chemistry, 263 ,19577-19585（198
8））が好適に用いられ、かかる遺伝子はエシャリヒエ
・コリW3110株から既知の方法で単離できる。また、こ
れらの遺伝子は、誘導型のプロモーターの下流に結合さ
れて該プロモーターの転写調節を受ける形でプラスミド
に含まれ、宿主としての大腸菌に導入されていることが
好ましい。このようなプラスミドは、例えばlacプロモ
ーターやtacプロモーターなどの誘導型のプロモーター
を有する市販の誘導型プラスミドベクター（例えば、ta
cプロモーターを有するプラスミドベクターとしてファ
ルマシア社販売のpKK223−3などがあげられる）と上記
のようなビオチン生合成に関与する遺伝子から創製する
ことができる。得られたプラスミドを宿主細胞に導入す
る方法としては、通常の遺伝子工学的方法を用いること
ができる。例えば、宿主微生物に導入する方法として
は、塩化カルシウムで菌体を処理する方法（Molecular
Cloning, 2nd ed., Cold SpringHarbor Laboratory Pre
ss(1989)）や、エレクトロポーレーション法（Current
Protocols in Molecular Biology, vol.1, John Wiley
& Sons. Inc. ISBNO-471-50338-X(1987)）等の通常の方
法があげられる。上記のようにビオチンシンターゼ活性
を有する酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドが導
入された大腸菌は、該プラスミドに含まれ遺伝子と共に
導入された選択マーカー遺伝子の表現型等によって選択
できる。例えば、選択マーカー遺伝子がアンピシリン耐
性遺伝子であれば、遺伝子導入操作後、大腸菌をアンピ
シリンを含有する適当な栄養培地に塗布し生育してきた
コロニーを釣菌分離することにより、該プラスミドを有
する大腸菌を得ることができる。このようにしてよりビ
オチン生合成に優れる大腸菌を効率よく得ることができ
る。

【０００８】かかる大腸菌の培養には、一般細菌におけ
る通常の培養に使用される炭素源、窒素源、有機ないし
無機塩等を適宜含む各種の培地を使用することができ
る。炭素源としては、グルコース、グリセリン、マルト
ース、デンプン、デキストリン、シュークロース、動植
物油、糖蜜等が挙げられる。窒素源としては、肉エキ
ス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コー
ンスティープリカー（cornsteep liquor）、綿実粉、乾
燥酵母、カザミノ酸等の天然有機窒素源、およびアンモ
ニア、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、尿素等
の有機または無機の窒素源等が挙げられる。なお、天然
有機窒素源は窒素源であるとともに炭素源にもなりう
る。有機ないし無機塩としては、カリウム、ナトリウ
ム、マグネシウム、鉄、マンガン、コバルト、亜鉛等の
塩化物、硫酸塩類、酢酸塩類、炭酸塩類およびリン酸塩
類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウム、硫酸
マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化コバル
ト、硫酸亜鉛、硫酸銅、酢酸ナトリウム、炭酸カルシウ
ム、炭酸ナトリウム、リン酸水素1カリウム、リン酸水
素2カリウム、リン酸水素1ナトリウム、リン酸水素2ナ
トリウム等をあげることができる。また、培地のpHを調
節する目的で有機または無機の酸、アルカリ等を加えて
もよく、消泡の目的で油脂類、表面活性剤等を使用して
もよい。誘導型プロモーターによって発現が調節される
遺伝子を担持するプラスミドを有する大腸菌を用いる場
合、培養開始後の適当な時期に、適当な誘導剤、例えば
誘導型プロモーターとしてlacプロモーターやtacプロモ
ーターを使用した場合はＩＰＴＧ（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加し、目的の遺伝子
の発現を誘導した後、培養をさらに継続して行うことが
好ましい。また、このような大腸菌の培養は、一般細菌
における通常の培養方法に準じて行われ、試験管振盪培
養、往復式振盪培養、回転振盪培養、ジャーファーメン
ター培養、タンク培養等の種々の液体培養法が適用可能
である。培養は通常、好気的条件下で行われる。ジャー
ファーメンター培養タンクを使用する場合は、通常、培
養液量の約0.1〜約2倍／分の通気条件で無菌空気を導入
する。培養温度は、大腸菌が生育する範囲で適宜変更で
きるが、例えば、約15℃〜42℃、好ましくは約30℃〜37
℃の範囲である。培地のpHは、例えば、約4〜約10が好
ましく、特に約6〜約8が好ましい。培養時間は、種々の
条件によって異なるが、通常、約1〜約8日間程度、好ま
しくは1〜3日間程度がよい。培養方法としては公知の方
法、例えばバッチ培養、フィード培養などが挙げられ
る。

【０００９】このようにして得られる大腸菌を、前記の
ビオチンおよびデスチオビオチンを含む微生物の培養液
に添加することにより、該培養液中に蓄積されたデスチ
オビオチンからビオチンへの変換反応が進行する。上記
大腸菌を添加するに際しては、微生物の培養液そのまま
に大腸菌を添加することもできるが、予め微生物を遠心
分離によって分離除去した培養上清液に添加するのが、
目的とするビオチンの回収、精製工程を容易にするうえ
で好ましい。また、大腸菌は、培養液に懸濁されたまま
の状態で添加することも可能であるが、培養液から遠心
分離にて菌体集め、これを生理食塩水や適当な中性付近
の緩衝液などで洗浄した後、例えばトリス塩酸緩衝液等
の中性付近の緩衝液に高濃度に再懸濁した懸濁液を添加
するのが、目的とするビオチンの回収、精製工程を容易
にするうえで好ましい。ここで添加する大腸菌の菌体量
は、培養液中に含まれるデスチオビオチンの量により変
わり得るが、菌体が系に均一に懸濁され得る範囲で添加
するのがよい。また、添加方法としては、連続的または
半連続的に添加することが好ましい。

【００１０】この変換反応において用いられる炭素源と
しては、一般に培養に用いられる炭素源ならいずれでも
よく、例えば、グルコース、グリセリン、フルクトー
ス、キシロース、スクロース、マルトース、ラクトース
などが挙げられ、グリセリンがより好ましい。該反応系
における炭素源の濃度としては、反応系中のデスチオビ
オチンおよび大腸菌菌体濃度により変わり得るが、例え
ば約0.1%〜約10%、好ましくは約0.5%〜約2%の範囲であ
る。また、鉄イオンとしては、2価か3価のいずれかでも
よく、例えば硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、塩化第一鉄、塩
化第二鉄などが挙げられる。鉄イオン濃度としては、反
応系中のデスチオビオチンおよび菌体濃度により変わり
得るが、例えば約0.1mM〜約10mM、好ましくは約0.5mM〜
約2mMの範囲である。反応系での反応温度は、約25℃〜
約40℃、好ましくは約30℃〜約35℃、反応pHは、約6〜
約9、好ましくは約7〜約8を挙げることができる。反応
形態としては、試験管、三角フラスコ、小型反応槽いず
れも使用でき、デスチオビオチン濃度が高く反応に使用
する大腸菌菌体を連続的または半連続的に添加する場
合、小型反応槽を用いるのが好ましい。また、小型反応
槽を用いる場合、空気を導入するのが好ましく、反応液
量の約0.1〜約2倍／分の通気条件を用いる。反応中、消
泡の目的で油脂類、表面活性剤等の適量を使用すること
もできる。

【００１１】本発明方法に於いて、このようにして得ら
れるビオチンの回収は、例えば、反応液から遠心分離等
の方法により菌体を除去した後、上清液より常法に従い
ビオチンを抽出精製することにより達成される。例えば
該上清液を活性炭処理、イオン交換樹脂処理した後、再
結晶することにより精製ビオチンを得ることができる。

【００１２】

【実施例】次に、本発明の実施例を示すが、本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない。

【００１３】参考例１組換えプラスミドpSS304の作製（1-A）プラスミドベクター pJAβ2 の作製プラスミドベクターRK2由来のプラスミドベクターpJAJ7
（Journal of Bacteriology , vol. 162 , 604-614 (1
986) ）1μg を制限酵素Pst IとBam HIで切断し、その
切断末端についてDNAブランティングキット（宝酒造
(株)製）を用いて付属の説明書に従い平滑化を行った。
得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離
し、約10kbpのDNA断片を単離した。また、プラスミドベ
クター pBluescript SK(+)（ストラタジーンクローニン
グシステムズ製）2μg を制限酵素Hae IIIで切断し、そ
の切断末端についてDNAブランティングキット（宝酒造
(株)製）を用いて付属の説明書に従い平滑化を行った。
それらをアガロースゲル電気泳動により分離し、約0.7
kbpのDNA断片を単離した。こうして得られた約10kbpのD
NA断片と約0.7 kbpのDNA断片全量を混合し、ライゲーシ
ョンキット（宝酒造(株)製）を用いて付属の説明書に従
い、これらのDNA断片を結合させ、得られたプラスミド
をpJAβ2（図１）と命名した。

【００１４】（1-B）スフィンゴモナス・エスピーSC424
05株の染色体DNAの調製 LB培地（1 % トリプトン、0.5 % 酵母エキス、1 % NaC
l）200 mlに、スフィンゴモナス・エスピーSC42405株の
1白金耳を接種し、30℃で 15 時間振とう培養し、対数
増殖期の菌体を遠心分離（8000 rpm、10 分間）により
集めた。集められた菌体を 20 ml の A バッファー（25
% ショ糖、50 mM Tris-HCl(pH 8.0)）に懸濁し、2.5 m
l の塩化リゾチーム溶液（50 mg / ml）を加え、37℃
で 30 分間保温した後、2.5 ml の SDS 溶液（10 %(v /
v)）と 0.25 ml の EDTA 溶液（0.5 M）を加え、37℃
で 16 時間保温した。次に、等量の TE 飽和フェノール
を加え、ゆっくりとかき混ぜた後、遠心分離（10,000rp
m、10分間）し、上層を回収することにより除タンパク
を行い、さらに該除タンパク操作を 5 回行った。次に
回収された上層に 2 倍容量のエタノールを加えて、沈
殿したDNA をガラス棒に巻きつけて回収し、これを70 %
エタノールで洗浄した後、風乾し、20 ml のTE バッフ
ァーに溶解し、20μl の RNase（10 mg/ml）を加えて、
16 時間、37℃で保温した。こうして、スフィンゴモナ
ス・エスピーSC42405 の染色体 DNA 約21 mg を含む DN
A 溶液を得た。

【００１５】(1-C) 組換えプラスミドpSS305の作製参考例1（1-B）で得られた染色体DNAを鋳型に、表１に
示すプライマー F2 とF3 を用いてPCR[反応組成：1×Ex
pand HF バッファー, 1.5 mM MgCl₂ ,200μM各dNTP, 30
0nM 各プライマー, 0.5〜100 ng 染色体DNA , 2.6U Exp
and^TMhigh fidelity PCR System 酵素ミックス（ベーリ
ンガーマンハイム(株)製）/ 50 μl、反応サイクル：97
℃で2分間を 1 サイクル、97℃で15秒間、次いで60℃で
30秒間、さらに72℃で1.5 分間を10サイクル、97℃で15
秒間、次いで60℃で30秒間、さらに72℃で1.5分間（72
℃で1.5 分間のサイクルは1サイクルごとに20秒ずつ増
加させて実施した）を15 サイクル、72℃で7 分間を1
サイクル]を行ない、bio Fのコーディング領域の上流20
1 bpからコーディング領域の下流46 bpまでの合計1408
bpを含み、その上流側の末端にSpe I部位、その下流側
の末端にPst I部位が導入されたDNA断片を調製した。こ
のDNA断片を制限酵素Spe IとPst Iで切断した断片と、
プラスミドベクター pBluescript SK(+)（ストラタジー
ンクローニングシステムズ製）を制限酵素Spe IとPst I
で切断して得られたDNA断片を混合し、ライゲーション
キット（宝酒造(株)製）を用いて付属の説明書に従いこ
れらを結合させ、得られたプラスミドをpSS202と命名し
た。また、参考例1（1-B）で得られた染色体DNAを鋳型
に、表1に示すプライマー CDA1 と CDA6 を用いてPCR
[反応組成：1×Expand HF バッファー, 1.5 mM MgCl₂,
200 μM 各 dNTP , 300 nM 各プライマー , 0.5〜100 n
g 染色体DNA , 2.6U Expand^TMhigh fidelity PCR Syste
m 酵素ミックス（ベーリンガーマンハイム(株)製）/ 50
μl、反応サイクル：97℃で2分間を1 サイクル、97℃
で15秒間、次いで60℃で30秒間、さらに72℃で1.5 分間
(72℃で1.5 分間のサイクルは1サイクルごとに20秒ずつ
増加させて実施した)を15 サイクル、72℃で7 分間を1
サイクル]を行ない、bio C のコーディング領域の上流
の配列 209 bp と、bio C のコーディング領域762 bp
と、bio D のコーディング領域の前半約 300bpからな
る、合計 1287 bpを含み、その上流側の末端に Pst I
部位、その下流側の末端に Hind III 部位が導入された
DNA断片を調製した。これらの DNA断片を制限酵素 PstI
と Hind III で切断した断片と、プラスミドベクター
pBluescript SK(+)（ストラタジーンクローニングシス
テムズ製）を制限酵素Pst IとHind IIIで切断して得ら
れたDNA断片を混合し、ライゲーションキット（宝酒造
(株)製）を用いて付属の説明書に従いこれらを結合さ
せ、得られたプラスミドを pSS205 と命名した。また、
参考例1（1-B）で得られた染色体DNAを鋳型に、表１に
示すプライマーCDA3 と CDA7 を用いてPCR[反応組成：1
×Expand HF バッファー, 1.5 mM MgCl₂, 200 μM 各 d
NTP, 300 nM 各プライマー, 0.5〜100 ng 染色体DNA ,
2.6U Expand^TMhigh fidelity PCR System 酵素ミックス
（ベーリンガーマンハイム(株)製）/ 50 μl、反応サイ
クル：97℃で2分間を1 サイクル、97℃で15秒間、次い
で60℃で30秒間、さらに72℃で1.5 分間を10 サイク
ル、97℃で15秒間、ついで60℃で30秒間、さらに72℃で
1.5 分間(72℃で1.5 分間のサイクルは1サイクルごとに
20秒ずつ増加させて実施した)を15 サイクル、72℃で7
分間を1 サイクル]を行い、 bio D のコーディング領域
の後半約 400bp と、bio A のコーディング領域1251 bp
と、その下流の塩基配列 208 bpからなる、合計 1653
bpを含み、その上流側の末端に Hind III 部位、その下
流側の末端に Xho I 部位が導入されたDNA断片を調製し
た。これらの DNA断片を制限酵素 Hind III と Xho I
で切断した断片と、プラスミドベクター pBluescript S
K(+)（ストラタジーンクローニングシステムズ製）を制
限酵素 Hind III と Xho I で切断して得られたDNA断片
を混合し、ライゲーションキット（宝酒造(株)製）を用
いて付属の説明書に従いこれらを結合させ、得られたプ
ラスミドをpSS206と命名した。さらに、以上のようにし
て得られたプラスミド pSS205 を制限酵素 Pst I とHin
d III で切断し、得られたDNA断片をアガロースゲル電
気泳動で分離することにより、 bio C のコーディング
領域の上流の配列 209 bp と、bio C のコーディング領
域 762 bp と、bio D のコーディング領域の前半約 300
bpからなる、合計 1287 bpを含み、その上流側の末端に
Pst I 部位、その下流側の末端に HindIII 部位が導入
されたDNA断片を調製した。こうして得られたDNA 断片
と、制限酵素 Pst I と Hind III で切断した pSS206
を混合し、ライゲーションキット（宝酒造(株)製）を用
いて付属の説明書に従い、これらのDNA 断片を結合さ
せ、得られたプラスミドを pSS2071 と命名した。次に
pSS2071を制限酵素 Cla I で切断し、ライゲーションキ
ット（宝酒造(株)製）を用いて付属の説明書に従い、該
DNA 断片をセルフライゲーションさせ、得られたプラス
ミドを pSS207と命名した。さらに、プラスミド pSS202
を制限酵素 Spe I と Pst I で切断し、得られたDNA断
片をアガロースゲル電気泳動で分離することにより、 b
io F のコーディング領域の上流 201 bp からコーディ
ング領域の下流 46 bp まで合計 1408 bpを含み、その
上流側の末端に Spe I 部位、その下流側の末端に Pst
I 部位が導入された DNA 断片を調製した。こうして得
られた DNA 断片と、制限酵素 Spe Iと Pst Iで切断し
た pSS207 を混合し、ライゲーションキット（宝酒造
(株)製）を用いて付属の説明書に従い、これらのDNA断
片を結合させ、得られたプラスミドをpSS209と命名し
た。そして、プラスミド pSS209 を制限酵素 Spe I と
Xho I で切断し、得られたDNA断片をアガロースゲル電
気泳動で分離することにより、 bio F、bio C、bioD、b
io A を含み、その上流側の末端に Spe I 部位、その下
流側の末端に Xho I部位が導入されたDNA断片を調製し
た。bio Fの塩基配列を配列番号１に、bio Cの塩基配列
を配列番号２に、bio Dの塩基配列を配列番号３に、bio
Aの塩基配列を配列番号４に示す。こうして得られたDN
A 断片と、制限酵素 Spe I とXho Iで切断した pJAβ2
を混合し、ライゲーションキット（宝酒造(株)製）を用
いて付属の説明書に従い、これらのDNA断片を結合さ
せ、得られたプラスミドを pSS305（図2）と命名した。

【００１６】

【表１】

【００１７】（1-D）組換えプラスミド pSS304 の作
製参考例1（1-C）で得られたプラスミド pSS305を鋳型
に、M13プライマーRV（宝酒造(株）製）と表1に示すプ
ライマー R1を用いて、また、M13プライマーM4（宝酒造
(株）製）とMUTB1プライマー（宝酒造(株）製）を用い
てそれぞれPCR[反応組成：1×Expand HF バッファー,
1.5 mM MgCl₂ ,200 μM 各 dNTP , 300 nM各プライマー
, 0.5〜100 ng鋳型DNA , 2.6U Expand^TMhigh fidelity
PCR System 酵素ミックス（ベーリンガーマンハイム
(株)製）/ 50 μl、反応サイクル：97℃で2分間を1 サ
イクル、97℃で15秒間、次いで60℃で30秒間、さらに72
℃で1.5分間のサイクルを10 サイクル、97℃で15秒間、
ついで60℃で30秒間、さらに72℃で1.5 分間(72℃で1.5
分間のサイクルは1サイクルごとに20秒ずつ増加)のサ
イクルを15 サイクル、72℃で7 分間を1 サイクル]を行
なった。PCR後の反応液からセントリコン100（アミコン
Inc.製）によって余剰のプライマーやdNTP を除去後、T
Eバッファーを加えて50μlとし、そのうちの0.5μlずつ
を混合した。これに5μlの10×Expand HF バッファー、
4μlの各2.5mM dNTP、38.62μlの滅菌蒸留水、0.38μl
のExpand^TMhigh fidelity PCR System 酵素ミックス
（3.5U/μl）（ベーリンガーマンハイム(株)製）を加え
て、94℃で10分間加熱後、60分間かけて37℃まで冷却
し、37℃で15分間保温した。この反応液に0.5μlの20pm
ol M13プライマーRV（宝酒造(株）製）と0.5μlの20pmo
l M13プライマーM4（宝酒造(株）製）を加えてPCR[反応
サイクル：97℃で2分間を1 サイクル、97℃で15秒間、
次いで60℃で30秒間、さらに72℃で1.5 分間を10 サイ
クル、97℃で15秒間、次いで60℃で30秒間、さらに72℃
で1.5 分間(72℃で1.5 分間のサイクルは1サイクルごと
に20秒ずつ増加させて実施した)を15 サイクル、さらに
72℃で7 分間を1 サイクル]を行なった。得られたDNA断
片を制限酵素Not IとHind IIIで切断し、制限酵素Not I
とHind IIIで切断したプラスミドベクター pBluescript
SK(+)（ストラタジーンクローニングシステムズ製）を
混合し、ライゲーションキット（宝酒造(株)製）を用い
て付属の説明書に従い結合させた。得られたクローンの
中から、塩基配列を解析することにより、bio F の開始
コドン（ATG）のAを+1としたときに-11番目の C が G
に置換された変異型 bio Fの塩基配列（配列番号５）を
有するクローンを選び出し、これをプラスミドpSS201と
命名した。次にプラスミドpSS201を制限酵素Spe I とPs
t Iで切断し、得られたDNA断片をアガロースゲル電気泳
動で分離することにより、 bio F のコーディング領域
の上流 201 bpからコーディング領域の下流 46 bp まで
の合計 1408 bpを含み、その上流側の末端に Spe I 部
位、その下流側の末端に Pst I 部位が導入されたDNA断
片を調製した。こうして得られたDNA 断片と、制限酵素
Spe I と Pst Iで切断したpSS207を混合し、ライゲー
ションキット（宝酒造(株)製）を用いて付属の説明書に
従い、これらのDNA断片を結合させ、得られたプラスミ
ドをpSS208と命名した。さらに、プラスミド pSS208 を
制限酵素 Spe I と Xho I で切断し、得られたDNA断片
をアガロースゲル電気泳動で分離することにより、変異
型 bio F と bioC、bio D、bio A を含み、その上流側
の末端に Spe I 部位、その下流側の末端に Xho I 部位
が導入されたDNA断片を調製した。こうして得られたDNA
断片と制限酵素 Spe I とXho Iで切断した pJAβ2 を
混合し、ライゲーションキット（宝酒造(株)製）を用い
て付属の説明書に従い、これらのDNA断片を結合させ、
得られたプラスミドを pSS304（図３）と命名した。

【００１８】参考例２ pSS304を導入した形質転換体の
作製参考例１で得られたプラスミド pSS304 をジーンパルサ
ー（バイオラッドラボラトリーズ Inc.製）を用いてエ
レクトロポーレーション法（印加電圧 18 kV / cm、キ
ャパシタンス 25μF、抵抗 400 Ω）によりスフィンゴ
モナス・エスピーSC42405に導入し、スフィンゴモナス
・エスピーSC42405 / pSS304株を得た。

【００１９】参考例３組換えプラスミドpSB003 の作
製特開昭61-149091記載の方法に準じ、以下のようにして
プラスミドpSB003を作製した。

【００２０】（3-A）E. coli染色体DNAの調製 3mlのLB培地（1 % トリプトン、0.5 % 酵母エキス、1
% NaCl）に、エシャリヒエ・コリ W3110株の1白金耳を
接種し、37℃で一晩振とう培養し、1.5mlの培養液から
菌体を遠心分離（12000 rpm、1 分間）により集めた。
集められた菌体を567μl のTEバッファー（10 mM Tris-
HCl(pH 8.0)、1mM EDTA）に懸濁し、30μlの10% SDSと3
μlの20mg/ml プロテアーゼKを加えて混合した後、37℃
で1時間保温した。次に、100μlの5M NaClを加えて混合
し、80μlのCTAB/NaCl溶液（10% hexadecyltrimethyl a
mmonium bromide、0.7M NaCl）を加えて混合して65℃で
10分間保温した。その後、0.8mlのクロロホルム/イソア
ミルアルコール（クロロホルム：イソアミルアルコール
=24：1）で一回抽出し、さらに、フェノール/クロロホ
ルム/イソアミルアルコール（フェノール：クロロホル
ム：イソアミルアルコール=25：24：1）で一回抽出し
た。その後、480μlのイソプロパノールを加えて染色体
DNAを沈殿させ、70%エタノールで1回洗った後、100μl
のTEバッファーに溶解した。こうして、エシャリヒエ・
コリ W3110株の染色体 DNA 約150μg を含む DNA 溶液
を得た。

【００２１】（3-B）bioB、bioF遺伝子の単離染色体DNAを鋳型に、表２に示すプライマー Aと B を用
いてPCR[反応組成：1×Expand HF バッファー, 1.5 mM
MgCl₂ ,200 μM 各 dNTP , 300 nM 各プライマー , 1.
5 ng 染色体DNA , 2.6U Expand^TMhigh fidelity PCR Sy
stem 酵素ミックス（ベーリンガーマンハイム(株)製）/
50 μl、反応サイクル：97℃で2分間を 1 サイクル、9
7℃で15秒間、次いで60℃で30秒間、さらに72℃で2 分
間のサイクルを10 サイクル、97℃で15秒間、次いで60
℃で30秒間、さらに 72℃で2 分間( 72℃で2 分間のサ
イクルは1サイクルごとに20秒ずつ増加)のサイクルを15
サイクル、72℃で7 分間のサイクルを 1 サイクル]を行
ない、bioBとbioFを含み、bioBの5'非翻訳領域側にHind
IIIサイトを付加したDNA断片（詳しくは、bio Bの開始
コドン（ATG）と重なって存在するNco Iサイト（CCATG
G）から、bioFの下流に存在するbioC遺伝子中のBgl II
サイト(AGATCT）までに及ぶ2257bpのDNA断片のbioB側の
末端にHind IIIサイト（AAGCTT）が付加され、さらにこ
の断片の両末端に２bpずつ塩基が付加された、合計2267
bpのDNA断片)を増幅した。この断片を、制限酵素Hind I
IIとBgl IIで切断後、制限酵素Hind IIIとBamH Iで切断
したプラスミドベクターpBR322と混合し、ライゲーショ
ンキット（宝酒造(株)製）を用いて付属の説明書に従い
これらを結合させ、得られたプラスミドをpSB001（図
4）と命名した。

【００２２】

【表２】

【００２３】（3-C）pSB003の作製プラスミドpSB001を制限酵素Hind IIIとSal Iで切断し
て切り出される約2.6kbの断片を、制限酵素Hind IIIとS
al Iで切断したプラスミドベクターpINIIIOmpA3（約6.6
kbp）と混合し、ライゲーションキット（宝酒造(株)
製）を用いて付属の説明書に従いこれらを結合させ、得
られたプラスミドをpSB002（図5）と命名した。次に、
表３に示す合成オリゴヌクレオチドCとDを各1nmolず
つ、1mlのアニーリングバッファー（ 40mM Tris-HCl(pH
7.5)、900mM NaCl、1mM EDTA、0.2%SDS）中で、94℃、5
分間保温した後、2時間かけて37℃まで冷却し、37℃で2
時間保温した。その後、エタノール沈殿で精製し、制限
酵素Xba IとNco Iで切断後、制限酵素Xba IとNco Iで切
断したプラスミドpSB002（9.2kbp）と混合し、ライゲー
ションキット（宝酒造(株)製）を用いて付属の説明書に
従いこれらを結合させ、得られたプラスミドをpSB003
（図6）と命名した。

【００２４】

【表３】

【００２５】参考例４プラスミドpSB003を導入した
形質転換体の作製参考例３で得られたプラスミドpSB003をジーンパルサー
（バイオラッドラボラトリーズ Inc.製）を用いてエレ
クトロポーレーション法（印加電圧 20 kV / cm、キャ
パシタンス 25μF、抵抗 400 Ω）によりエシャリヒエ
・コリ JA221に導入し、エシャリヒエ・コリ JA221/pSB
003株を得た。

【００２６】参考例５エシャリヒエ・コリJA221/ pSB003株の１白金耳を、バ
ッフル付き三角フラスコ（500mL容）に入れた50 ml の
培地（2 % グリセロール、3 % ポリペプトン、0.5 % カ
ザミノ酸（ビタミンフリー）、0.1 % K₂HPO₄、0.05 % KC
l、0.05 % MgSO₄・7H₂O、0.01 % MgSO₄・4〜6H₂O、0.01 %
FeSO₄・7H₂O、0.01 %チアミン塩酸塩、0.005 % アンピ
シリン）に接種し、 30℃で１日間培養した（200 rp
m）。なお、培養開始時に0.2ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロ
ピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加した。
培養終了後、培養液を遠心分離（8000rpm×10分）によ
り菌体を回収し、生理食塩水で菌体を2回洗浄した。

【００２７】実施例１スフィンゴモナス・エスピー SC42405/ pSS304の１白金
耳を、大型試験管（22×220 mm）に入れた8 ml の培地
（6 % グリセロール、3 % 酵母エキス、0.5 %カザミノ
酸（ビタミンフリー）、0.1 % K₂HPO₄、0.05 % KCl、0.0
5 % MgSO₄・7H₂O、0.02 % FeSO₄・7H₂O、0.005 % テトラ
サイクリン）に接種し、 30℃で5日間振とう培養した
（250 rpm）。培養液から菌体を遠心分離（8000rpm×10
分）によってとり除き培養上清液を得た。該培養上清液
中に生成蓄積したビオチン濃度を、ラクトバシラス・プ
ランタルム（Lactobacillus plantarum）IFO 3070 株
を用いた微生物学的定量法（和泉と山田、ビタミン学実
験法II. 水溶性ビタミン. p.481-499、日本ビタミン学
会編、東京化学同人、1985）により定量したところ生成
したビオチンの濃度は3.2mg/Lであった。次いで、200ｍ
Ｌ容ミニジャーファーメンター（ABLE製）に上記で得た
培養上清液80mL、63mMグリセリン、1mMのFeSO₄・7H₂O、
参考例５で得た大腸菌菌体を反応開始時のOD₆₆₀が25に
なるように加え、反応開始時の液量を100mLとして反応
を開始した。反応温度は35℃、攪拌速度は950〜1200rp
m、通気量は0.1〜0.3L/min.とし、反応pHは7.0になるよ
うに2NのNaOHと2NのHClで制御した。60％グリセリン溶
液約40mLを間欠タイマーを用い自動添加した。反応中、
消泡の目的でアクトコールを自動添加した。また、反応
開始時に供したのと同じ量の大腸菌湿菌体を、反応開始
約5時間目、24時間目、28時間目、48時間目、52時間目
と計5回添加した。反応開始後70時間目の反応液中のビ
オチン濃度を上記と同様の方法により定量したところ、
ビオチン濃度は176 mg/Lとなった（前記培養上清中濃度
に換算すると370mg/L）。

【００２８】実施例２ 200ｍＬ容ミニジャーファーメンター（ABLE製）に実施
例１で得た培養上清液80mL、63mMグリセリン、1mMのFeS
O₄・7H₂O、参考例５で得た大腸菌菌体を反応開始時のOD
₆₆₀が25になるように加え、反応開始時の液量を100mLと
して反応を開始した。反応温度は35℃、攪拌速度は950
〜1200rpm、通気量は0.1〜0.3L/min.、反応pHは7.0にな
るように2NのNaOHと2NのHClで制御した。60％グリセリ
ン溶液、約30mLを間欠タイマーを用い自動添加した。反
応中、消泡の目的でアクトコールを自動添加した。反応
終了70時間目の反応液中のビオチン濃度を上記と同様の
方法により定量したところ、ビオチン濃度は49 mg/Lと
なった（実施例１の培養上清中濃度に換算すると82.2mg
/L）。

【００２９】

【発明の効果】本発明により、微生物を用いる醗酵法に
よるビオチンの製造過程に於いて、培養液中に蓄積され
たデスチオビオチンを効率良く目的とするビオチンに変
換する方法を提供可能とした。

【００３０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：1408 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：染色体DNA 起源生物名：スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas s
p.）株名：SC42405 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：202..1365 特徴を決定した方法：Ｓ配列 ACCGGAATGA CAGGCGGACA GCAGCAATAG GGCGGCAAGA GAGAGCGGCA GGGATCGCAT 60 CAGACGGGCA TCCTTCGGTT TTTCCTTTGC CGTTCCAACG CGCGAGGAAG GCGGCGGCTT 120 CACGTCCCGC CGCGAAATCG ATGCCCCTCC CGGCCAGCCA AGCATTGTGC CGGACGCCCG 180 CTTGCCATAC CGGCAGGGGC G ATG AGC AGG CTC GAT TCC TTC TTC GCA GCG 231 GCG CTC GAC CGG ATC GAC CGC GCC GGA CAA CGC CGC ACC TTG CGC CCC 279 GCC GCA CTC GAA AAG GGT GGC CGC GTC CAC CGC GAC GGG CAC GAA CTG 327 ATA GAT TTC TCC AGC AAC GAC TAT CTC GGC CTC GCC CGC CAC CCG CTG 375 CTG ATC GAG CGC GCC CGC GCC TGG ACG GAA GCC CAC GGC ACC GGC TCC 423 GGC GCC TCG CGA CTG GTG ACG GGA ACC AGC GCC ACC CAT CTC GCG ATC 471 GAG GCC CGC ATC GCC CGG TTC AAG CAT GCC GAA GCC GCG CTG GTC TTC 519 GCC AGC GGC TGG CAG GCC AAT GCC GCG GTG ATC CCC GCC CTG CTC GCC 567 GCC GTA CCC GGT TCA GCA GTC TTC ACC GAC CGG CTG ATC CAT GCC TCG 615 ATG CAC GCG GGC CTC GCG ATC TCG GGC ACC CGC CAG CAC CGC TTC CGC 663 CAT AAC GAC CTC GAT CAT CTG GAG GAA CTG CTG GCG AGC AAG GGC GCC 711 GAA GCC TCC GCC CGC CTG ATC CTC ACC GAG AGC GTG TTC TCG ATG GAC 759 GGC GAC CGC GCC GAC ATT GCC CGC CTG GCC GAG ATC GCC GCC CGC CAC 807 GAC GCA TTC CTG TTC GTG GAC GAA GCC CAT GCC ACC GGC GTG CTC GGC 855 CCC GGC GGC GCG GGC CTC TCG GCG GAA GTG CCC GGC GGG ATC GAC CTC 903 GTC ATG GGC ACC TTC AGC AAG GCG CTC GGC GGT TTC GGC GCC TAT GTC 951 GCC GGG TCA CAA GTG ATG ATC GAC TAC CTC GTC AAC GCG GCG AGC GGC 999 TTC ATC TTC ACC ACC GCC CCG CCG CCT GCC GTG CTG GGC GCC ATC GAC 1047 GCC GCG CTC GAC CTC GTG CCG GGC ATG GAT GCC GAG CGC GCC CAT CTT 1095 GCC GCG CTG GGT CAG CAG CTG CGC TCC GGC CTC GCC GCG CTC GGC ATC 1143 GAT CAC GGC GCA TCG AGC ACG CAG ATC GTC CCC GCC GTG ATC GGC GCG 1191 GAG GTC GCC GCG CTC GAC CTC TCC CGC AAG CTG GAA GAG CGC GGA CTG 1239 CTC GCT TCC GCG ATC CGC CCG CCC ACG GTG CCG CCC GGC ACC AGC CGC 1287 CTG CGC CTG GCG CTG CGC GCG ACC CAT GCG CCA AGC GAT ATC GAT GCC 1335 CTG CTG AAC GCG ATC GAG GCC TGC CGG TGA AGCTGCTTTT CGCCCATGGC 1385 TGGGGCTTCG ACCACACGTT CTG 1408

【００３１】配列番号：２配列の長さ：971 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：染色体DNA 起源生物名：スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas s
p.）株名：SC42405 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：210..971 特徴を決定した方法：Ｓ配列 TTGCGCGATG AGGAGGCCAC CTTGCCCGCC GTCCCCATCA TCTCGCTTCA AGGCGCGCGC 60 GACCCGCTTC TGCCCGAAGC GATGCGCGCA CATGTCTTCC GGAACGCCGC CGTGCGCCGG 120 ATCGAATGCG AGACCGGAGG GCACCTCCTC CCGCTCGAAG TGCCGGAATT CTGCGCGCAA 180 GCCGTGCGCG ACATGATCGA GACGCTGGC ATG AAC GCC CCC CGC GAG CGC GTC 233 AGC CGC GCC TTT GCC GCC GCG CCC GAC TAC GAC GGC CAT GCC CGC ATC 281 CAG CGT GAG GTC GCA CAA ACA CTC GCC GCC CGG ATC GCC GCG CTC GAC 329 CTG CCT CCA AAC CCG CGC GTG CTG GAG ATC GGC TGC GGC ACC GGT TTT 377 CTC ACG CAG GCG CTG GCC GGG CTG GAT GGC GAC TGG CTC GTC ACC GAT 425 CTT GCG CCC GAA ATG CTG GAG CGC TGT CGC AGC CGC CTG GGC GAA AGC 473 GCC CGG CAC CGC TTT GCC GTG CTC GAT GGC GAA TAT GGC GCA CCG GAC 521 GGC GCA CCG TTC GAC CTG ATC TGC TCC AGC CTC GCC GTG CAA TGG TTC 569 GAC GAT ACC CCG GCC GCC CTC GCC CGC ATG GCA GGC TGG CTG GCA CCG 617 GGC GGG CAC CTC ATG GTG ACG ACA CTC GGC CCC GGC AGC TTC GCC GAA 665 TGG CGC GCC GCG CAT GAA GCG GAG GGG CTG GAA CCC GGC ACG CCC CAC 713 TTC GCG GAC ATC GCC GCC TTC GGC GAC CTC GTC CAC GCG GTC GAG CAC 761 CCC GTC GAG CAT CAC GCC GAT CCG CTG GCC TTC CTC CAC GCC CTC AAG 809 GCC ATC GGC GCG CAG ACC GCC GAA GCC GGA CAC CGC CCC CTT TCC CCC 857 GGC CAG CTT CGC CGC GTC ATG GCA CGT TTC GCC CAA AGC GGA TGC CCC 905 CAA AAC GGA TGC AAA GTG ACT TAC GAA GTC GTG ACC TGC CAC CTA CAC 953 CGA GAA TCG AGC CTT TCA 971

【００３２】配列番号：３配列の長さ：62７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：染色体DNA 起源生物名：スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas s
p.）株名：SC42405 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..627 特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATG AGA CCG CTT ATC GTC ACC GGA ACC GAT ACC GAG ATC GGC AAG ACC 48 GTC TTC GCC GCC GCG CTC GCG GGC GCC CTC GGC TCA CAT TAC TGG AAG 96 CCG GTG CAG GCA GGC CTC GAA GAA GAC GGC GGC GAC GGC GAC CGC GTG 144 GCG CGC CTC TCC GGC CTG CCT GCC AGC CAT ATT CTG CCC GAA GCC TAT 192 CGC CTC GCC ACC CCC TGC TCG CCG CAC CTC GCC GCC GAG ATC GAC GGG 240 GTG GAA ATC GAT CCC GAG CGC CTC GCC TTG CCG CAA GTG GAC GGT CCG 288 CTG GTG GTC GAA GGC GCA GGC GGC GTC ATG GTC CCG CTC ACC CGG ACC 336 ACG ACT TAT GCC GAC CAG TTC GCG CGG TGG AAC GCC CCG GTC GTG CTG 384 GTG GCG CGC ACG ATG CTC GGC ACG ATC AAC CAT TCG CTG CTC TCC ATC 432 GAG GCC CTG CGC GCG CGC GGC GTC GAA GTG CTG GGC GTG GCC TTC GTC 480 GGC GAT CCG ATG GAA GAC AGC GAG GCG ACG ATC TGC GCC ATG GCC AAT 528 GTC CGC CGC CTC GGC CGC CTG CCC CGC CTC GCC TCG CTG ACC CCG GAG 576 AAC CTC GCC AAG GCC TTC GCC GAA AAC TTC CAT ATC GGA GAT TTC ACG 624 CAA 627

【００３３】配列番号：４配列の長さ：1459 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：染色体DNA 起源生物名：スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas s
p.）株名：SC42405 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..1253 特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATG ACG TCA TCG GTC TGG CAC CCC TTC ACC CAG CAC GGC CTG CAA GAG 48 CCG GTC CCG CTG GTC ACC CAT GCC GAG GGC GCG CTG CTC CAC ACG GCT 96 GAC GGC AAG GCA GTG GTG GAC GCG GTG TCC TCG TGG TGG GTG ACG ACC 144 CAC GGC CAC TCC CAT CCG CGC ATC AAG GCC GCC ATC GCG GAG CAG GCG 192 CAG AAG CTC GAC CAG ATC ATC TTC GCC GGA TGG ACC CAC GAA CCC GCC 240 GAG CAA GTC GCA GCA GGC CTG CGC GCG ATC ATG CCG GAA AGC CTG ACG 288 CGG GTG TTC TTC TCC GAT TCG GGT TCG ACC AGC GTG GAA GTC GCG CTG 336 AAG ATG GCG CTC GGC TAC TGG CAC TGG CGC GGC GAG AAC CGC CAC CGC 384 ATC GTC GTG ATG GAA AAC TCC TAC CAC GGC GAC ACC ATC GGC GCG ATG 432 TCG GTG GGC GAG CGC GGC GTG TTC AAC CAG CCC TAC GAA CCG CTG CTG 480 TTC GAC GTG GGC CGC ATT CCC TTC CCC GCC GCC GGG GCC GAG CAG GCA 528 ACG CTG GAC GCA CTC GAA GCG ATC TGC CGC CAG CCG GAC ACC GCC GCG 576 CTG ATC GTC GAG CCG CTG ATC CTC GGC GCC GGC GGC ATG CTG GTC TAT 624 TCG TCC GAG ACG CTC GCC GCG ATG CAG GCG ATC TGC GCC CGC CAC GGC 672 GTG CTC TTC ATC GCC GAC GAA GTG ATG ACC GCC TGG GGC CGC ACC GGC 720 ACC CTC CTC GCC TGC GAA CAG GCA AGC GTG GTC CCG GAC ATC CTC TGC 768 CTC TCC AAG GGC CTG ACC GGC GGT GCC GTC CCG CTC GCT GTC ACG ATG 816 GCC AGC GAA GCG ATC TTC GAG GCG CAC TAC TCC ACC GAC CGC GCG CGG 864 ATG TTC TTC CAC TCC TCC AGC TAC ACC GCG AAC CCG ATC GCC TGC GCC 912 GCC GCC GCC GCC AAC CTG GCT ATC TGG CGC GAG GAA CCG GTG CTG GAA 960 CGC ATC GCC GCG CTG GCC GGG AAA CAG GCG ACG TGG ATC GAG AAG CTC 1008 GGC CAG TTC TGC CAC TTC GAC AAT CCC CGC ACG ATC GGC ACC ATC GCC 1056 GCG CTC GAC CTC AGG ACC TCA GGC ACC AGC GGC TAC ATG AGC GAC CTC 1104 GCC CCG CGC CTG ATG GCG TTC TTC CGC GAG CGG GAC GTG CTG TTG CGG 1152 CCG CTG GGG AAC ACC GTC TAC GTC ATG CCG CCT TAC TGC ATT TCC GAT 1200 AAT CAG CTT GGG CAG GTT TGG GAG GCT GTC GGG GAA GCG GTG ATT TCG 1248 TTT TAA GAACGATTTT AAGATGAAGG ATGAAGAGCA GGGGTCAAAA CCCCTGCACC 1304 CCATTACTGT CGAGGTCAGG TACGACCTAT CCGTCTTGCG CCCATGGCAG CGTCGGGAGG 1364 CATATTGGCT GCGCCGCAAG GAGCGCACTA CGCATAGGGC GCGCGCGACG TCGACATTCC 1424 GAGGGTCTGG GGGATCATCC CCCAGGACTT CTCCC 1459

【００３４】配列番号：５配列の長さ：1408 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：染色体DNA 起源生物名：スフィンゴモナス・エスピー（Sphingomonas s
p.）株名：SC42405 配列の特徴特徴を表す記号：CDS 存在位置：202..1365 特徴を決定した方法：Ｓ配列 ACCGGAATGA CAGGCGGACA GCAGCAATAG GGCGGCAAGA GAGAGCGGCA GGGATCGCAT 60 CAGACGGGCA TCCTTCGGTT TTTCCTTTGC CGTTCCAACG CGCGAGGAAG GCGGCGGCTT 120 CACGTCCCGC CGCGAAATCG ATGCCCCTCC CGGCCAGCCA AGCATTGTGC CGGACGCCCG 180 CTTGCCATAC GGGCAGGGGC G ATG AGC AGG CTC GAT TCC TTC TTC GCA GCG 231 GCG CTC GAC CGG ATC GAC CGC GCC GGA CAA CGC CGC ACC TTG CGC CCC 279 GCC GCA CTC GAA AAG GGT GGC CGC GTC CAC CGC GAC GGG CAC GAA CTG 327 ATA GAT TTC TCC AGC AAC GAC TAT CTC GGC CTC GCC CGC CAC CCG CTG 375 CTG ATC GAG CGC GCC CGC GCC TGG ACG GAA GCC CAC GGC ACC GGC TCC 423 GGC GCC TCG CGA CTG GTG ACG GGA ACC AGC GCC ACC CAT CTC GCG ATC 471 GAG GCC CGC ATC GCC CGG TTC AAG CAT GCC GAA GCC GCG CTG GTC TTC 519 GCC AGC GGC TGG CAG GCC AAT GCC GCG GTG ATC CCC GCC CTG CTC GCC 567 GCC GTA CCC GGT TCA GCA GTC TTC ACC GAC CGG CTG ATC CAT GCC TCG 615 ATG CAC GCG GGC CTC GCG ATC TCG GGC ACC CGC CAG CAC CGC TTC CGC 663 CAT AAC GAC CTC GAT CAT CTG GAG GAA CTG CTG GCG AGC AAG GGC GCC 711 GAA GCC TCC GCC CGC CTG ATC CTC ACC GAG AGC GTG TTC TCG ATG GAC 759 GGC GAC CGC GCC GAC ATT GCC CGC CTG GCC GAG ATC GCC GCC CGC CAC 807 GAC GCA TTC CTG TTC GTG GAC GAA GCC CAT GCC ACC GGC GTG CTC GGC 855 CCC GGC GGC GCG GGC CTC TCG GCG GAA GTG CCC GGC GGG ATC GAC CTC 903 GTC ATG GGC ACC TTC AGC AAG GCG CTC GGC GGT TTC GGC GCC TAT GTC 951 GCC GGG TCA CAA GTG ATG ATC GAC TAC CTC GTC AAC GCG GCG AGC GGC 999 TTC ATC TTC ACC ACC GCC CCG CCG CCT GCC GTG CTG GGC GCC ATC GAC 1047 GCC GCG CTC GAC CTC GTG CCG GGC ATG GAT GCC GAG CGC GCC CAT CTT 1095 GCC GCG CTG GGT CAG CAG CTG CGC TCC GGC CTC GCC GCG CTC GGC ATC 1143 GAT CAC GGC GCA TCG AGC ACG CAG ATC GTC CCC GCC GTG ATC GGC GCG 1191 GAG GTC GCC GCG CTC GAC CTC TCC CGC AAG CTG GAA GAG CGC GGA CTG 1239 CTC GCT TCC GCG ATC CGC CCG CCC ACG GTG CCG CCC GGC ACC AGC CGC 1287 CTG CGC CTG GCG CTG CGC GCG ACC CAT GCG CCA AGC GAT ATC GAT GCC 1335 CTG CTG AAC GCG ATC GAG GCC TGC CGG TGA AGCTGCTTTT CGCCCATGGC 1385 TGGGGCTTCG ACCACACGTT CTG 1408

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドpJAβ2の構造と制限酵素地図を示
す。

【図２】プラスミドpSS305の構造と制限酵素地図を示
す。

【図３】プラスミドpSS304の構造と制限酵素地図を示
す。

【図４】プラスミドpSB001の構造と制限酵素地図を示
す。

【図５】プラスミドpSB002の構造と制限酵素地図を示
す。

【図６】プラスミドpSB003の構造と制限酵素地図を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】微生物を用いる醗酵法によるビオチンの製
造過程に於いて、ビオチンシンターゼ活性を有する酵素
をコードする遺伝子を含むプラスミドを有する大腸菌を
培養液に添加することを特徴とするビオチンの製造方
法。
【請求項２】微生物がスフィンゴモナス属に属する微生
物である請求項１記載のビオチンの製造方法。
【請求項３】微生物が、スフィンゴモナス属に属する微
生物由来のビオチン生合成に関与する遺伝子の中でデス
チオビオチンより上流の生合成経路の反応を触媒する活
性を有する酵素をコードする１以上の遺伝子を含むプラ
スミドを持つスフィンゴモナス属細菌である請求項１ま
たは２記載のビオチンの製造方法。
【請求項４】ビオチンシンターゼ活性を有する酵素をコ
ードする遺伝子が大腸菌由来の遺伝子である請求項１〜
３記載のビオチンの製造方法。
【請求項５】大腸菌が、ビオチン生合成に関与する大腸
菌由来の遺伝子の中で少なくともビオチンシンターゼ活
性を有する酵素をコードする遺伝子を誘導型プロモータ
ーの下流に持つプラスミドを有する大腸菌である請求項
１〜４記載のビオチンの製造方法。
【請求項６】大腸菌が、エシャリヒエ・コリJA221株ま
たはその変異株である請求項１〜５記載のビオチンの製
造方法。
【請求項７】大腸菌を連続的または半連続的に添加する
請求項１〜６記載のビオチンの製造方法。