JPH11276176A

JPH11276176A - Ｄｎａ断片増幅方法、微生物存在状態推定方法および有機系廃棄物状態推定方法

Info

Publication number: JPH11276176A
Application number: JP10087652A
Authority: JP
Inventors: Koichi Inoue; 高一井上
Original assignee: Sanyo Electric Co Ltd; Society for Techno Innovation of Agriculture Forestry and Fisheries
Current assignee: Sanyo Electric Co Ltd; Society for Techno Innovation of Agriculture Forestry and Fisheries
Priority date: 1998-03-31
Filing date: 1998-03-31
Publication date: 1999-10-12

Abstract

(57)【要約】【課題】複数の異なるＤＮＡから塩基配列の情報なし
に解析可能な量のＤＮＡ断片を増幅することができるＤ
ＮＡ断片増幅方法を提供することである。【解決手段】配列番号４１〜４３、４５〜５４、５６
〜５８、６０〜６４、６６〜６９、７１〜７８、８０〜
８２、８４〜８６、８９〜９１、９３、９５〜９７、１
００、１０３、１０６、１０７および１０９のいずれか
のプライマーを用いて、生ゴミ処理機の処理槽内または
土壌中から採取した複数の微生物に対し、ランダムＰＣ
Ｒ法を適用することにより、複数の微生物のＤＮＡ断片
を増幅する。増幅されたＤＮＡ断片を電気泳動法を用い
て分析する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡ断片増幅方
法、微生物存在状態推定方法および有機系廃棄物状態推
定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、家庭等から排出される有機系廃棄
物（いわゆる生ゴミ）等をコンポスト化（肥料化）する
生ゴミ処理機が活発に研究開発されている。生ゴミ処理
機では、細菌、原生動物等の微生物群が有機物を分解す
ることにより肥料が作製される。

【０００３】このような生ゴミ処理機によるコンポスト
化では、そのコンポスト化過程（有機物分解過程）にお
いて、温度等をモニタすることによりコンポスト化の度
合いを評価する。そして、その評価に基づき良質な肥料
が作製されるように生ゴミ処理機の状態を調節する。

【０００４】しかしながら、より良質な肥料を作製する
ためには、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物存在状
態（少なくとも微生物の種類）の情報が必要である。こ
の微生物存在状態の情報は、微生物により生ゴミの分解
を良好に制御するためにも必要である。また、作製され
た肥料の添加により土壌の改良を進める上では、土壌の
微生物存在状態を知ることも重要である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従来、微生物存在状
態、例えば細菌の存在状態の情報を得る方法としては、
個々の細菌を単離して生化学検査する方法等が用いられ
る。しかし、この方法は時間がかかる上に、単離の難し
い細菌については調べることが困難であった。

【０００６】一方、ＤＮＡを増幅する方法としてＰＣＲ
（Polymerase Chain Reaction;ポリメラーゼ連鎖反応）
法が用いられている。このＰＣＲ法は、増幅しようとす
るＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）の両端の塩基配列に相補な塩基
配列を有するプライマーおよび耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用い、熱変性工程、アニーリング（熱処理）工程お
よび伸長反応工程の３段階からなるサイクルを繰り返す
ことにより、鋳型ＤＮＡとほぼ同じＤＮＡ断片を増幅す
ることを可能にするものである。このＰＣＲ法を用いる
と、微量にしか存在しない細菌の１個のＤＮＡ中の所定
の断片を例えば１０万〜１００万倍に増幅することがで
きる。

【０００７】しかしながら、このＰＣＲ法を用いるため
には、鋳型ＤＮＡの少なくとも両端の塩基配列が既知で
あることが必要である。したがって、従来のＰＣＲ法で
は、生ゴミ処理機の内部で機能する微生物や土壌に存在
する微生物の種類および塩基配列が知られていないと、
それらの微生物のＤＮＡ断片を増幅することはできな
い。

【０００８】そこで、単一のプライマーで塩基配列の情
報なしに一種類のＤＮＡから同時に多量のＤＮＡ断片を
増幅するＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic Ｄ
ＮＡ）法もしくはＡＰ−ＰＣＲ（Arbitrarily Primed-P
olymerase Chain Reaction)法が提案されている。これ
らの方法では、ＰＣＲの反応時にプライマーのアニーリ
ング温度を下げ、さらに反応液中のマグネシウムイオン
濃度を上げることにより、プライマーの結合時の配列特
異性を下げる。すると、プライマーはミスマッチを伴っ
て微生物の染色体ＤＮＡに結合し、ＤＮＡ断片が複製さ
れる。

【０００９】これらのＲＡＰＤ法もしくはＡＰ−ＰＣＲ
法によれば、増幅しようとするＤＮＡの塩基配列の情報
がなくても、単一のプライマーにより何らかのＤＮＡ断
片が多量に増幅される。増幅されたＤＮＡ断片をゲル電
気泳動法により分離することによりＤＮＡフィンガープ
リントが得られる。このＤＮＡフィンガープリントを分
析することにより微生物の状態を解析することが可能と
なる。

【００１０】しかしながら、従来のＲＡＰＤ法もしくは
ＡＰ−ＰＣＲ法では、条件を適当に選択しても、プライ
マーの種類によっては非常に多くのＤＮＡ断片が増幅さ
れることになる。そのため、複数の微生物が存在する生
ゴミや土壌において個々の微生物の存在状態を解析する
ことは困難になる。

【００１１】本発明の目的は、複数の異なるＤＮＡから
塩基配列の情報なしに解析可能な量のＤＮＡ断片を増幅
することができるＤＮＡ断片増幅方法ならびにそれを用
いた微生物存在状態推定方法および有機系廃棄物状態推
定方法を提供することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段および発明の効果】本発明
に係るＤＮＡ断片増幅方法は、配列番号４１〜４３、４
５〜５４、５６〜５８、６０〜６４、６６〜６９、７１
〜７８、８０〜８２、８４〜８６、８９〜９１、９３、
９５〜９７、１００、１０３、１０６、１０７および１
０９のプライマーを用いて、複数の異なるＤＮＡに対
し、熱変性工程、プライマーのアニーリング工程および
ポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し
行うポリメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することによ
り、複数の異なるＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅することを
特徴とする。なお、ＤＮＡは、生物のＤＮＡのみならず
ＤＮＡ断片も含む。

【００１３】本発明に係るＤＮＡ断片増幅方法では、複
数の異なるＤＮＡに対して一度にポリメラーゼ連鎖反応
法を適用することにより、ＤＮＡの塩基配列の情報なし
に複数の異なるＤＮＡのうちのいくつかの異なるＤＮＡ
のＤＮＡ断片を増幅することが可能となる。特に、上記
の選定されたプライマーを用いることにより、解析可能
な量のＤＮＡ断片を増幅することができる。この場合、
増幅されたＤＮＡ断片の電気泳動像において１〜１０本
の明瞭な帯が現れる。したがって、その電気泳動像から
微生物存在状態を容易に推定することが可能となる。

【００１４】また、増幅されたＤＮＡ断片をクローニン
グしてＤＮＡプローブを作製し、ハイブリタイゼーショ
ン法により微生物の存在を確認することが可能になると
ともに微生物の存在量をより正確に測定可能となる。

【００１５】特に、ポリメラーゼ連鎖反応法の適用によ
り増幅されたＤＮＡ断片の電気泳動像において複数の異
なるＤＮＡのうち少なくとも１つのＤＮＡに対応する帯
が現れるようにポリメラーゼ連鎖反応の条件を設定する
ことを特徴とする。

【００１６】このように、増幅されたＤＮＡ断片の電気
泳動像において少なくとも１つのＤＮＡに対応する帯が
現れるようにポリメラーゼ連鎖反応の条件を設定するこ
とにより、電気泳動像から少なくとも１つの微生物の存
在状態を容易に推定することが可能となる。

【００１７】また、本発明に係るＤＮＡ断片増幅方法
は、複数の異なるＤＮＡに対し、熱変性工程、プライマ
ーのアニーリング工程およびポリメラーゼによる伸長反
応工程をこの順序で繰り返し行うポリメラーゼ連鎖反応
法を一度に適用することにより、複数の異なるＤＮＡの
ＤＡＮ断片を増幅する際に、ポリメラーゼ連鎖反応法の
適用により増幅されるＤＮＡ断片の電気泳動像において
現れる各ＤＮＡに対応する帯の数が数本以下となるよう
にプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応の条件を設定
することを特徴とする。

【００１８】この場合、増幅されたＤＮＡ断片の電気泳
動像において各ＤＮＡに対応する帯が多くとも数本しか
現れないので、電気泳動像から微生物の存在状態を容易
に推定することができる。

【００１９】また、増幅されたＤＮＡ断片をクローニン
グしてＤＮＡプローブを作製し、ハイブリタイゼーショ
ン法により微生物の存在を確認することが可能になると
ともに微生物の存在量をより正確に測定可能となる。

【００２０】特に、ポリメラーゼ連鎖反応の条件とし
て、反応溶液のマグネシウム濃度を１．５ｍＭ、Ｔａｑ
ポリメラーゼ濃度を０．０２５ｕｎｉｔ／μＬとし、ア
ニーリング工程におけるアニール温度を４５℃に、サイ
クル数を３５サイクルに設定することが好ましい。それ
により、解析可能な量のＤＮＡ断片を増幅することが可
能になる。

【００２１】特に、識別方法が電気泳動法である場合に
は、増幅されたＤＮＡ断片の電気泳動像において識別可
能な本数の帯が現れるので、電気泳動像から容易に対象
物中の微生物存在状態を推定することが可能となる。

【００２２】本発明に係る微生物存在状態推定方法は、
対象物中の微生物存在状態を推定する微生物存在状態推
定方法であって、対象物中の複数の異なる微生物のＤＮ
Ａに対し、上記ＤＮＡ断片増幅方法を用い、複数の異な
る微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅した後、増幅され
たＤＮＡ断片を識別方法により分類し、対象物中の微生
物存在状態を推定することを特徴とする。特に、識別方
法が、電気泳動法であってもよい。

【００２３】本発明に係る微生物存在状態推定方法にお
いては、対象物中の複数の異なる微生物のＤＮＡから塩
基配列の情報なしに解析可能な量のＤＮＡ断片が増幅さ
れるので、増幅されたＤＮＡ断片を識別方法により分類
することにより、微生物存在状態を容易に推定すること
が可能となる。

【００２４】本発明に係る有機系廃棄物状態推定方法
は、複数の微生物が混在してなる有機系廃棄物中の有機
物を微生物によって分解する有機物分解過程における有
機系廃棄物状態を推定する有機系廃棄物状態推定方法で
あって、有機系廃棄物中の複数の微生物のＤＮＡに対
し、上記ＤＮＡ断片増幅方法を用い、複数の異なる微生
物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅した後、増幅されたＤＮ
Ａ断片を識別方法により分類し、有機系廃棄物中の微生
物存在状態を推定し、この推定結果から有機系廃棄物状
態を推定することを特徴とする。特に、識別方法が、電
気泳動法であってもよい。

【００２５】本発明に係る有機系廃棄物状態推定方法に
おいては、有機系廃棄物中の複数の微生物のＤＮＡから
塩基配列の情報なしに解析可能な量のＤＮＡ断片が増幅
されるので、増幅されたＤＮＡ断片を識別方法により分
類することにより、有機系廃棄物中の微生物存在状態を
推定し、この推定結果から有機系廃棄物状態を容易に推
定することが可能となる。

【００２６】また、増幅されたＤＮＡ断片をクローニン
グしてＤＮＡプローブを作製し、ハイブリタイゼーショ
ン法により微生物の存在を確認することが可能になると
ともに微生物の存在量をより正確に測定可能となる。

【００２７】特に、識別方法が電気泳動法である場合に
は、増幅されたＤＮＡ断片の電気泳動像において識別可
能な本数の帯が現れるので、電気泳動像から容易に有機
系廃棄物状態を推定することができる。

【００２８】

【発明の実施の形態】以下、本発明に係るＤＮＡ断片増
幅方法、微生物存在状態推定方法および有機系廃棄物状
態推定方法の一例を説明する。

【００２９】本発明に係るＤＮＡ断片増幅方法では、特
定の塩基配列を有するプライマーを用いて未知の塩基配
列を有する複数の異なる微生物からＤＮＡ断片を連鎖反
応的に増幅する反応法を用いる。以下、この反応法を、
ランダムＰＣＲ（PolymeraseChain Reaction;ポリメラ
ーゼ連鎖反応) 法と呼ぶ。

【００３０】細菌の染色体ＤＮＡは８×１０⁵〜１０⁷
塩基からなるため、確率的には１０ ⁷塩基程度に１対結
合できるような長さのプライマーを用いると、１つの細
菌から１つのＤＮＡ断片を増幅することができる。しか
し、１つの細菌から増幅されるＤＮＡ断片の数は確率だ
けで定まるのではなく、プライマーの塩基配列によって
大きく影響される。本発明では、特定の塩基配列を有す
るプライマーを用いることにより、未知の塩基配列を有
する複数の異なる細菌から解析可能な量のＤＮＡ断片を
増幅することができる。

【００３１】本発明のＤＮＡ断片増幅方法で用いるラン
ダムＰＣＲ法では、従来のＰＣＲ法と同様に、次の３段
階の工程を繰り返し行う。ただし、ランダムＰＣＲ法で
は、後述するように、未知の塩基配列を有する複数の異
なる微生物に対して特定の塩基配列を有するプライマー
を用いることにより解析可能な量のＤＮＡ断片を増幅す
る。

【００３２】（１）熱変性工程ＤＮＡ（初期時）またはＤＮＡ断片を加熱変性し、１本
鎖（ＤＮＡ鎖）にする。

【００３３】（２）プライマーのアニーリング工程（プ
ライマーの結合工程）プライマーがＤＮＡ鎖の増幅領域の端に結合するように
熱処理を行う。

【００３４】（３）ポリメラーゼによる伸長反応工程
（ポリメラーゼによる複製工程）プライマーを起点としてポリメラーゼによって相補鎖を
合成し、２本鎖化する。

【００３５】上記（１）〜（３）の工程を１サイクルと
してこのサイクルを繰り返し行う。次に、ランダムＰＣ
Ｒ法を具体的に説明する。まず、複数の異なる微生物、
ポリメラーゼ連鎖反応用バッファ溶液、プライマー、耐
熱性の好熱菌ＤＮＡポリメラーゼ、および４種の基質と
なる５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＡＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）を含む反応溶液を
準備する。

【００３６】ここで、ＤＮＡポリメラーゼとは、４種の
５’デオキシリボヌクレオチド三リン酸を基質とし、鋳
型ＤＮＡに相補な塩基配列を有するＤＮＡ鎖の重合反応
を触媒する酵素である。ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮ
Ａ鎖の重合の方向性は５’から３’の方向である。ま
た、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼが作用するため
に不可欠な３’−ＯＨ基を末端に有するＤＮＡ断片（短
鎖オリゴヌクレオチド）である。本発明では、特定の塩
基配列および塩基長を有するプライマーを用いる。

【００３７】上記反応溶液に対して次のランダムＰＣＲ
法を適用する。第１のサイクルとして、上記反応溶液を
例えば９４℃で２分間保持する熱変性工程、上記反応溶
液を例えば３５℃で２分間保持するプライマーのアニー
リング工程、および上記反応溶液を例えば７２℃で３分
間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序
で行う。なお、本サイクルの熱変性工程は、長い完全Ｄ
ＮＡを１本鎖に完全に分離するために下記サイクルの熱
変性工程よりも長めに設定する。

【００３８】引続き、第２のサイクルとして、上記反応
溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記
反応溶液を例えば３５℃で２分間保持するプライマーの
アニーリング工程および上記反応溶液を例えば７２℃で
３分間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの
順序で例えば３３回繰り返す。

【００３９】最後に、第３のサイクルとして、上記反応
溶液を例えば９４℃で１分間保持する熱変性工程、上記
反応溶液を例えば３５℃で２分間保持するプライマーの
アニーリング工程および上記反応溶液を７２℃で１０分
間保持するポリメラーゼによる伸長反応工程をこの順序
で行う。なお、本サイクルのポリメラーゼによる伸長反
応工程は、最後に複製を完全化するために第１および第
２のサイクルのポリメラーゼによる伸長反応工程よりも
長めに設定する。

【００４０】ここで、上記第１のサイクル、第２のサイ
クルの第１回目のサイクル、および第２のサイクルの第
２回目のサイクルを図１〜図３を用いて説明する。な
お、図は模式的に示しており、ＤＮＡの１本鎖等はプラ
イマーと結合する部分の塩基配列を示している。

【００４１】図１〜図３では、ＧＧＣＴＴＣＧＡＡＴＣ
Ｇの塩基配列（配列番号69）を有するプライマーを用い
ている。なお、Ｔはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニ
ン、Ｃはシトシンを示す。

【００４２】図１（ａ）に示すように最初、上記反応溶
液中には複数の異なる微生物に含まれていた長いＤＮＡ
（完全ＤＮＡ）１が存在する。ここでは、１個の完全Ｄ
ＮＡに着目して説明する。

【００４３】最初に、図１（ｂ）に示すように、第１の
サイクルでは、第２および第３のサイクルの熱変性工程
より長い熱変性工程を行うことにより、上記長いＤＮＡ
１が加熱変性し、２本鎖が互いに離れ、２つの１本鎖
（ＤＮＡ鎖）２ａ，２ｂの状態になる。

【００４４】次に、図１（ｃ）に示すように、プライマ
ーのアニーリング工程でプライマー１１ａがその塩基配
列に適合する各１本鎖２ａ，２ｂの適合位置に配置（相
補な配列）するように結合する。ここで、適合位置とは
プライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基配列の位
置およびプライマーの塩基配列から見て結合すべき塩基
配列と類似の塩基配列の位置である。上記ランダムＰＣ
Ｒ法では、プライマーのアニーリング工程のアニール温
度を低く設定することにより、プライマーは、その塩基
配列と類似の塩基配列を有するＤＮＡ鎖の部分にも結合
する。すなわち、プライマーは、その塩基配列に完全に
相補な塩基配列を有する１本鎖の位置に結合することが
できるのみならず、多少のミスマッチを伴って１本鎖に
結合することもできる。なお、図１〜図３では、簡単の
ためにプライマーがその塩基配列から見て結合すべき塩
基配列の位置に結合する場合を図示している。

【００４５】続いて、図１（ｄ）に示すように、ポリメ
ラーゼにより伸長反応工程でポリメラーゼによって伸長
反応が起こり、１本鎖２ａ，２ｂにそれぞれ沿って１本
鎖２ｃ，２ｄが伸長して２本鎖化した鎖３ａ，３ｂが形
成される。

【００４６】第２のサイクルの１回目のサイクルでは、
第１のサイクルで２本鎖化した鎖３ａ，３ｂが熱変性工
程でそれぞれ１本鎖（ＤＮＡ鎖）２ａ，２ｃおよび１本
鎖（ＤＮＡ鎖）２ｂ，２ｄとなるが、ここでは、鎖３ａ
から分かれた１本鎖２ｃに着目して説明する。

【００４７】図２に示すように、熱変性工程で分離した
１本鎖２ｃには次のプライマーのアニーリング工程でプ
ライマー１１ｂが適合位置に配置するように結合する。
その後、ポリメラーゼによる伸長反応工程でポリメラー
ゼによって伸長反応が起こり、１本鎖２ｃに沿って１本
鎖２ｅが伸長して２本鎖化した鎖３ｄとなる。

【００４８】その後、図３に示すように、第２のサイク
ルの第２回目のサイクルでは、上記２本鎖化した鎖３ｄ
が熱変性工程でそれぞれ１本鎖２ｃ，２ｅとなるが、こ
こでは、鎖３ｄから分かれた１本鎖２ｅに着目して説明
する。

【００４９】図３に示すように、熱変性工程で分離した
１本鎖２ｅには、次のプライマーのアニーリング工程
で、同様に、プライマー１１ｃが適合位置に配置するよ
うに結合する。その後、ポリメラーゼによる伸長反応工
程でポリメラーゼによって伸長反応が起こり、１本鎖２
ｅに沿って１本鎖２ｆが伸長して２本鎖化した鎖（ＤＮ
Ａ断片）３ｅが形成される。

【００５０】このようにＤＮＡ断片が形成され、このＤ
ＮＡ断片からＤＮＡ断片が形成されるとともに他の同種
のＤＮＡからもＤＮＡ断片が形成され、同様の反応が連
鎖反応的に続くので、この方法によりＤＮＡ断片が増幅
される。

【００５１】上記のランダムＰＣＲにより増幅されたＤ
ＮＡ断片を異なる微生物ごとに分類するためにゲル電気
泳動法にかける。そして、電気泳動像のバンド（帯）を
解析することにより、微生物の存在状態を推定すること
ができる。また、時間をおいて採取した微生物に対して
上記のランダムＰＣＲ法を適用することによりＤＮＡ断
片を増幅し、増幅されたＤＮＡ断片を同様にゲル電気泳
動法にかける。そして、電気泳動像のバンドの状態の変
化を解析することにより、経時的な微生物存在状態の変
化を推定することができる。

【００５２】上記のＤＮＡ断片増幅方法を生ゴミ処理機
の処理槽内または土壌中から採取した複数の微生物に適
用することにより、生ゴミ処理機の処理槽内または土壌
中の微生物の存在状態を推定することができる。また、
時間をおいて同様に採取した生ゴミ処理機の処理槽内ま
たは土壌中の微生物の存在状態を調べることにより、生
ゴミ処理機の処理槽内または土壌中の経時的な微生物存
在状態の変化を推定することができる。さらに、生ゴミ
中の有機物の分解過程における有機物の分解状態を推定
することもできる。

【００５３】この結果に従って、生ゴミ処理機の処理槽
の条件を変えることにより、生ゴミの処理を良好に行え
るとともに、良好な肥料を作製することができる。

【００５４】

【実施例】次の方法で、本発明に係るＤＮＡ断片増幅方
法に用いる良質のプライマーを選定した。

【００５５】プライマーおよび標準試料（サンプル）検討するプライマーとして、ニッポンジーン製の２１６
種類のＤＮＡ Oligomerを用いた。また、プライマーを
選定するために表１に示す７つの細菌の染色体ＤＮＡを
標準試料として用いた。

【００５６】

【表１】

【００５７】表１に示すように、一般細菌の代表とし
て、Escherichia coli K12株（大腸菌）およびBacillus
subtilis natto I2株（納豆菌）を用いた。また、他の
５つの細菌として、生ゴミ処理機の処理槽内で生ゴミを
分解処理する細菌を用いた。これらの５つの細菌には、
それぞれNo.10、No.30、No.38、No.46 およびNo.103の番号
を付している。

【００５８】生ゴミ処理機の運転方法家庭用生ゴミ処理機である三洋電機株式会社製ＳＮＳ−
Ｔ１（外形寸法：５８０×４５０×７９５ｍｍ）を用
い、この生ゴミ処理機に取り付けられている排水口へエ
アポンプおよび空気量調整器を接続する改良を加えた。
この生ゴミ処理機を温度３０℃、相対湿度６０％のプレ
ハブ実験室に設置した。

【００５９】生ゴミ処理機の処理槽内に処理担体として
２５ｋｇ（含水率７０％）の木質チップ（平均粒度１．
５ｍｍの杉材）を入れた。処理槽内に野菜４５０ｇ、果
物３００ｇ、魚４０ｇ、肉３０ｇおよび米飯１８０ｇか
らなる１ｋｇの生ゴミを１日に１回ずつ週５回投入し、
生ゴミの投入後、生ゴミ処理機の攪拌羽根で処理槽内を
攪拌した。

【００６０】処理槽内の木質チップの含水率を３５〜４
５％に調節することにより良好な処理状態を保った。エ
アポンプからの通気の量を空気量調整器で調整すること
により含水率の微調整を行った。

【００６１】生ゴミ処理細菌の単離細菌培養用の寒天培地を表２の組成で作製した。

【００６２】

【表２】

【００６３】生ゴミ処理機を運転してから約９ヵ月経過
した後、処理槽内の木質チップを１０ｇ採取し、滅菌し
た０．８５％食塩水を９０ｍＬ加えて細菌が木質チップ
から十分に遊離するまで懸濁した。その懸濁液をさらに
１０^-6に希釈し、希釈した懸濁液の１００μＬを寒天培
地上に均一に接種した。３日間、３７℃で培養後、すべ
てのコロニーを新しい寒天培地に移し替えることで細菌
の単離を行った。

【００６４】単離したコロニーのうちコロニー形状の異
なる５つの細菌をＰＣＲ用標準試料とした。単離した細
菌には、上記のNo.10、No.30、No.38、No.46 およびNo.103
の番号を付した。細菌No.103は、生化学検査の結果、Pr
oteus mirabilis であることがわかっている。

【００６５】標準試料として用いる細菌の染色体ＤＮ
Ａの調整方法Escherichia coli K12株および Bacillus subtilis nat
to I2 株については、１８ｇ／Ｌ普通ブイヨン培地（栄
研Ｅ−ＭＣ３５）で１６時間培養した。生ゴミ処理機か
ら単離した５つの細菌は、表３の培地で１６時間培養し
た。

【００６６】

【表３】

【００６７】細菌の染色体ＤＮＡはCurrent Protocols
in Molecular Biology (publishedby Greene Publishin
g Associates and Wiley-Interscience) の2.4.1 〜2.
4.2に記載の“Preparation of Genomic DNA from Bacte
ria”の方法に従って調整した。

【００６８】ＰＣＲ条件の設定本発明に用いるランダムＰＣＲ法では、１種類の微生物
から多くのＤＮＡ断片が増幅されると、複数の微生物の
各々とＤＮＡ断片とを対応づけることが困難になる。そ
のため、増幅の選択性を上げて、増幅されるＤＮＡ断片
の数を少なくする必要がある。選択性を向上させるため
には、プライマーの長さ、反応溶液組成のマグネシウム
濃度、反応サイクルのアニール温度および反応サイクル
数が重要な要因になる。

【００６９】PE Applied Biosystemの PCR System 9700
および三洋電機株式会社製ＤＮＡ増幅器ＭＩＲ−Ｄ４０
を用いてＰＣＲ条件を設定した。

【００７０】塩基長１２ｂｐのプライマーとしてニッポ
ンジーン製のＤＮＡ Oligomer Ｈ81を用いてＰＣＲ条
件の検討を行った。この検討において、反応溶液の組成
は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ濃度を１０ｍＭ、ＫＣｌ濃度を５
０ｍＭとし、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴ
ＴＰの濃度を各２００μＭとした。その結果、マグネシ
ウム濃度の最適値は１．５ｍＭ、Ｔａｑポリメラーゼ濃
度の最適値は０．０２５ｕｎｉｔ／μＬであり、ＰＣＲ
サイクルのアニール温度の最適値は５５℃、サイクル数
の最適値は３５サイクルであることがわかった。プライ
マーの種類や設定条件の影響でＰＣＲ反応の効率が多少
変化する。これを考慮して、以下のプリマー選定実験で
は、選択性を少し落とすためにアニール温度を４５℃と
した。

【００７１】以下のプライマーの選定実験におけるラン
ダムＰＣＲに用いる反応溶液の組成を表４に示す。

【００７２】

【表４】

【００７３】表４において、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌのＴｒｉ
ｓは、Tris(hydroxymethyl)aminometaneの略である。ｄ
ＮＴＰｍｉｘはｄＡＴＰ(2'-デオキシアデノシン-5'-三
燐酸）、ｄＣＴＰ(2'-デオキシシチジン-5'-三燐酸) 、
ｄＧＴＰ(2'-デオキシグアノシン-5'-三燐酸) 、ｄＴＴ
Ｐ(2'-デオキシチミジン-5'-三燐酸) の等濃度混合溶液
である。反応溶液量は２０μＬとした。

【００７４】プライマーの選定実験におけるランダムＰ
ＣＲのサイクルを表５に示す。

【００７５】

【表５】

【００７６】プライマー選定実験１つのプライマーについて上記の７つの細菌を標準試料
として用いた７種類のランダムＰＣＲを行い、ランダム
ＰＣＲ後の反応溶液の５μＬを１．５％アガロースゲル
電気泳動法で分析した。電気泳動条件は、３．６Ｖ／ｃ
ｍ定電圧とした。電気泳動後、ゲルをエチジウムブロマ
イド染色し、波長２５４ｎｍの紫外線を照射したときの
エチジウムブロマイド蛍光像をインスタントフィルムで
撮影した。

【００７７】プライマーの選定電気泳動像から観測されるバンド（帯）の数をカウント
した。プライマー選定実験に用いた２１６種類のプライ
マー（配列番号１〜２１６）および電気泳動像から観測
されるバンド数（バンド総数）を表６〜表１３に示す。

【００７８】

【表６】

【００７９】

【表７】

【００８０】

【表８】

【００８１】

【表９】

【００８２】

【表１０】

【００８３】

【表１１】

【００８４】

【表１２】

【００８５】

【表１３】

【００８６】バンド数はプライマーごとに異なり、０〜
１１７の範囲に分布した。図４にバンド数６本ごとのプ
ライマー数の分布を示す。プライマーの多くはバンド数
の少ない方に偏った。

【００８７】本発明のＤＮＡ断片増幅方法では、できる
だけ電気泳動像におけるバンドの出現頻度の少ないプラ
イマーが必要である。図５にバンド数が１５本以下のプ
ライマーについてバンド数ごとのプライマーの数を示
す。図５から、バンド数が１〜１０本の範囲のプライマ
ー（配列番号４１〜１１３）は７３個（３４％）あり、
これらの７３個のプライマーが本発明のＤＮＡ断片増幅
方法に有用であると考えられる。７つの細菌から全く電
気泳動像におけるバンドが得られなかったプライマーは
４０個（１９％）あった。

【００８８】プライマーの長さが１２ｂｐ（塩基対）と
同じであるにもかかわらず、バンドの出現頻度はプライ
マーの種類によって大きく異なる。これは、プライマー
と鋳型ＤＮＡとのアフィニティ（親和性）の違いによる
ものである。アフィニティを決定する１つの指標として
ＧＣコンテンツ（ＧＣ含有率）がある。ＧＣコンテンツ
とは、４つの塩基Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの数の合計に対するＣ
とＧの数の合計が占める割合をいう。

【００８９】図６に２１６個のプライマーのＧＣコンテ
ンツに対するバンド数（バンド総数）を示す。上記の表
６〜表１３には各プライマーのＧＣコンテンツも示して
いる。図６に示すように、ＧＣコンテンツとバンド数と
の間には正の相関が見られ（相関係数＝０．５４）、Ｇ
Ｃコンテンツが高いほどバンド数が増加する傾向が確か
められた。

【００９０】しかし、同じＧＣコンテンツでも、バンド
数は広く分散しており、ＧＣコンテンツだけでは電気泳
動像のバンドの出現頻度が決まらないこともわかった。
これは、プライマーの塩基配列により鋳型ＤＮＡとのア
フィニティが大きく異なることを示している。したがっ
て、所望の増幅確率を有するプライマーを見い出すため
には、個々のプライマーをランダムＰＣＲ法により確認
することが必要となる。

【００９１】本実施例では、電気泳動像において明瞭な
増幅結果が得られたプライマーを良質プライマーとして
選定した。具体的には、電気泳動像においてバンド数が
１〜１０でかつ明瞭なバンドが現れた５１個のプライマ
ーを良質プライマーとして選定した。

【００９２】良質プライマーの配列番号は、４１〜４
３、４５〜５４、５６〜５８、６０〜６４、６６〜６
９、７１〜７８、８０〜８２、８４〜８６、８９〜９
１、９３、９５〜９７、１００、１０３、１０６、１０
７および１０９である。なお、これらの良質プライマー
は、表７および表８に＊印で示している。

【００９３】図７〜図３２に良質プライマーの電気泳動
像を示す。図７〜図３２において、Ｍは分子量マーカ
（λ/Hind III and φx174/Hae III）であり、１〜７は
表１に示した７つの細菌に対応する電気泳動像である。
８は細菌がない場合の電気泳動像である（コントロール
実験）。

【００９４】図７〜図３２に示すように、選定された良
質プライマーを用いてランダムＰＣＲ法を適用すると、
電気泳動像において明瞭なバンドが１〜９本現れる。し
たがって、この電気泳動像を分析することにより、微生
物の存在状態を容易に推定することができる。

【００９５】また、生ゴミ処理機の処理槽内または土壌
中から採取した微生物の存在状態を容易に推定すること
ができ、かつ生ゴミ処理機の処理槽内または土壌中の経
時的な微生物存在状態の変化を推定することもできる。
さらに、生ゴミ中の有機物の分解過程における有機物の
分解状態を推定することもできる。

【００９６】次に、本実施例のランダムＰＣＲ法により
得られたＤＮＡ断片をＤＮＡプローブとして用いて細菌
を検出する方法を説明する。ランダムＰＣＲ法で増幅さ
れたＤＮＡ断片を電気泳動法により分離し、そのＤＮＡ
断片を抽出精製した後、制限酵素処理によりブラントエ
ンド（平滑末端）に切断したベクターにクローニングす
る。このようにして得られたＤＮＡをコロニーハイブリ
ダイゼーション法、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーシ
ョン法、サザンハイブリタゼーション法等のＤＮＡプロ
ーブとして用い、増幅されたＤＮＡ断片の基となる細菌
を見い出すことができる。

【００９７】特に、土壌細菌の多くは単離が難しいとさ
れているが、本発明のランダムＰＣＲ法では、土壌に存
在する複数の細菌を検出することができる。そして、上
記のハイブリダイゼーション法を用いることにより細菌
の存在を確認することができ、単離のための培養条件を
見い出すために役立てることができる。

【００９８】

【配列表】

配列番号：1 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTGAGAAAA TA 12 配列番号：2 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCTTCAAAG AT 12 配列番号：3 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACAAAGAGAT AT 12 配列番号：4 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGGTGATAT TA 12 配列番号：5 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCTTCTCAT CT 12 配列番号：6 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTCTTCTAC AA 12 配列番号：7 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGAGACATAG TT 12 配列番号：8 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCCAGATATA TA 12 配列番号：9 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CACACTACTT AT 12 配列番号：10 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATGAGAAAGG AA 12 配列番号：11 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCAACACTT TC 12 配列番号：12 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGACTACAA TA 12 配列番号：13 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCATACATAT TG 12 配列番号：14 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GATACTGATG AT 12 配列番号：15 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGATTCTTAC TG 12 配列番号：16 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGCCCTTATT TA 12 配列番号：17 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGACTATGA AA 12 配列番号：18 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCAAGTATC CA 12 配列番号：19 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTGACCTAG TT 12 配列番号：20 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATTTGGATAG GG 12 配列番号：21 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GACTGCTATA CA 12 配列番号：22 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGGTACGGTA TA 12 配列番号：23 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TACTACTGTG GA 12 配列番号：24 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGGCTGTAGA AA 12 配列番号：25 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCTACACGAA GT 12 配列番号：26 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCAGATTTTC TG 12 配列番号：27 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCAACGTAC GT 12 配列番号：28 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTCCGTAATC AC 12 配列番号：29 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCTTACATAG AC 12 配列番号：30 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTCCAAATG TG 12 配列番号：31 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AAGTCGTTTG GG 12 配列番号：32 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTAGTATGGG AC 12 配列番号：33 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGTTCGAAC GA 12 配列番号：34 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTTTCCTAC GG 12 配列番号：35 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTCCCGTCTA TC 12 配列番号：36 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGCCTTACGG CA 12 配列番号：37 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCTATGGCAA CG 12 配列番号：38 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCTTGGAACT CG 12 配列番号：39 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCTGCTGACC GG 12 配列番号：40 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCAACTGGC CA 12 配列番号：41 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTCATTAAAG CT 12 配列番号：42 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TACACTTTTG AC 12 配列番号：43 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGGATCTTTG AC 12 配列番号：44 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCTCTTTTGG AA 12 配列番号：45 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCATCGTAC GT 12 配列番号：46 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TACGATATGG CT 12 配列番号：47 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GATCCAGTCT TT 12 配列番号：48 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGAATGTCCG TA 12 配列番号：49 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCGCAGTTAG AT 12 配列番号：50 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CAGTGGGAGT TT 12 配列番号：51 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCTATGGACC CT 12 配列番号：52 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTCATTCTGG GG 12 配列番号：53 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCGTCTTTTC TG 12 配列番号：54 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGGCCTATTG GC 12 配列番号：55 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTCATGCCTG GA 12 配列番号：56 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCTTGGCGAA GC 12 配列番号：57 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGCCTGTGGG CT 12 配列番号：58 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGAATTGGAC GA 12 配列番号：59 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTTGTCATGT GT 12 配列番号：60 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TACGTGGTAA CA 12 配列番号：61 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGACAAGTAA TG 12 配列番号：62 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TACCCTCAAG CT 12 配列番号：63 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTCGAGGATC GA 12 配列番号：64 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GACCTGCGAT CT 12 配列番号：65 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGGCCTCTTG GA 12 配列番号：66 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTTTCCCAG GA 12 配列番号：67 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCGTCCGGAG AT 12 配列番号：68 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CGCTTCGTAG CA 12 配列番号：69 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCTTCGAAT CG 12 配列番号：70 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GATGAGCTAA AA 12 配列番号：71 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGCAGGAAT AT 12 配列番号：72 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTTAGGTTAC GT 12 配列番号：73 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTGGATCTGA AT 12 配列番号：74 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCTATCCCAA CA 12 配列番号：75 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGACTACCG AA 12 配列番号：76 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GACAGCGTCC TA 12 配列番号：77 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTTGAGCGTA TT 12 配列番号：78 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTGAGATAG CA 12 配列番号：79 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGAGACGAT TA 12 配列番号：80 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GACGCCCATT AT 12 配列番号：81 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GACGGTTCTA CA 12 配列番号：82 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GATGGTCCGT TT 12 配列番号：83 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTCACCAACG AG 12 配列番号：84 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CAGGTGTGGG TT 12 配列番号：85 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATTGGTGCAG AA 12 配列番号：86 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AAGGCGTGTT TA 12 配列番号：87 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TATTGGGATT GG 12 配列番号：88 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AACATCTCCG GG 12 配列番号：89 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCATTGGCG AA 12 配列番号：90 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTGAGTAGTT GC 12 配列番号：91 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TACGCCGGAA TA 12 配列番号：92 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCTGAGGTAG CT 12 配列番号：93 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCCGCTTCAG CT 12 配列番号：94 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCTAAACCA CG 12 配列番号：95 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGAGCTGAAG TA 12 配列番号：96 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTGAGGATT CA 12 配列番号：97 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTCAAGCGTA CA 12 配列番号：98 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCTTTCCGAC GT 12 配列番号：99 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCCTTCGAGC AG 12 配列番号：100 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CAGGCCGAAG TC 12 配列番号：101 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AAGCCTATAC CA 12 配列番号：102 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CGACGATATG AT 12 配列番号：103 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCCCTTTTGG AC 12 配列番号：104 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTTTCGATC CA 12 配列番号：105 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGCACTGAAT CT 12 配列番号：106 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCCATCGAAA AA 12 配列番号：107 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGTACACGA AG 12 配列番号：108 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTTGAGGGAT GG 12 配列番号：109 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCCTGCCTCA CG 12 配列番号：110 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGAGGTGTAA AT 12 配列番号：111 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AAGCTGCAGC AA 12 配列番号：112 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCCTTCGTTA CG 12 配列番号：113 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGGGCTCTAG GC 12 配列番号：114 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTGCATAATC GT 12 配列番号：115 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCAGATATC AT 12 配列番号：116 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCCAAGCTAC CA 12 配列番号：117 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TAACAACCGA GC 12 配列番号：118 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CACAAGGAAC AT 12 配列番号：119 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCGGTGGGAA TA 12 配列番号：120 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATGGAGCAGG AA 12 配列番号：121 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTTCGGGAA TG 12 配列番号：122 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGCTCCCGA CA 12 配列番号：123 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTAACCTGG AC 12 配列番号：124 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCGTGGTTG TA 12 配列番号：125 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCGAGGGAG GA 12 配列番号：126 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCCGCCAGAG GA 12 配列番号：127 配列の長さ：12配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGACACACTG TC 12 配列番号：128 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGCACTACAA CA 12 配列番号：129 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CACTTCAACC AG 12 配列番号：130 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TATCCACCGC TC 12 配列番号：131 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGCCCACTAC GG 12 配列番号：132 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGACTGCTG AT 12 配列番号：133 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CAGGTGGGAC CA 12 配列番号：134 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TCCTGGGGCG TT 12 配列番号：135 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCAAGGGAT AT 12 配列番号：136 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCATTGCAAT CG 12 配列番号：137 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTTTTGTCAC CG 12 配列番号：138 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGATCCGACG GC 12 配列番号：139 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATGACTGTGC GA 12 配列番号：140 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCGTCGGTTC GA 12 配列番号：141 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTCCTGCTGT TG 12 配列番号：142 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTGAGGGGG GA 12 配列番号：143 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AAGGACACAA CA 12 配列番号：144 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACGGGTCGTA AC 12 配列番号：145 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTCGGACGTC CA 12 配列番号：146 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTGAGCAAC AA 12 配列番号：147 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CACACTCGTC AT 12 配列番号：148 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTCGCCTTAC CA 12 配列番号：149 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCGCGGAAT AT 12 配列番号：150 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGACCTGCTT CT 12 配列番号：151 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTGCCGGGAC CA 12 配列番号：152 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCGGTTATG AA 12 配列番号：153 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTGACCGATC CA 12 配列番号：154 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCTGGCGTAT CT 12 配列番号：155 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGACCTCCAT CG 12 配列番号：156 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCGAGGGCTG TA 12 配列番号：157 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCTGCGGGAG GA 12 配列番号：158 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AAGTGGTGGT AT 12 配列番号：159 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TATCCTACCG GC 12 配列番号：160 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGGCACCCTT CG 12 配列番号：161 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTCGACGGAC GT 12 配列番号：162 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGGAGAAAC GG 12 配列番号：163 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCTGGATTCG CA 12 配列番号：164 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTCACCGAT CC 12 配列番号：165 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCGCGGCTT AT 12 配列番号：166 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACCATCAAAC GG 12 配列番号：167 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCCGACTTG GC 12 配列番号：168 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAGTGGCAAC GT 12 配列番号：169 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCGCAGGGAC CA 12 配列番号：170 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTCAGGAAC AA 12 配列番号：171 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTCGGTCGTG AA 12 配列番号：172 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTGCAATTTG GC 12 配列番号：173 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTCACCACG CA 12 配列番号：174 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGGCTTCATC AC 12 配列番号：175 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCGTGGAATG AC 12 配列番号：176 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGAGGATGGC CC 12 配列番号：177 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCTTGGCATC GG 12 配列番号：178 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTTAGCCCCA AT 12 配列番号：179 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCATGGCCT TT 12 配列番号：180 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTGACGATG CA 12 配列番号：181 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTGGCCGGC AT 12 配列番号：182 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AAGCTGGGGG GA 12 配列番号：183 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATGGCTACTG GC 12 配列番号：184 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTGCCGGAG CA 12 配列番号：185 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTCAGCGATA CG 12 配列番号：186 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTGGTGGTA TC 12 配列番号：187 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTCGACGCAT CA 12 配列番号：188 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GACGGTTCAA GC 12 配列番号：189 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AAGCTGTGGG CT 12 配列番号：190 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCGGAGGAAC CA 12 配列番号：191 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCAGGAGGTG GT 12 配列番号：192 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGCGCGGCAA AA 12 配列番号：193 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACCACTCCCG CA 12 配列番号：194 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCGGCACAG GA 12 配列番号：195 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCCCCGTTAG CA 12 配列番号：196 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AAGGCGCGAA CG 12 配列番号：197 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTGACTGGT GG 12 配列番号：198 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CGCAGCCGAG AT 12 配列番号：199 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AAGAAGCAGG CG 12 配列番号：200 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTGTGGAAGC CA 12 配列番号：201 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GATGGATTTG GG 12 配列番号：202 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTCAGGCAC CA 12 配列番号：203 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TGCCTCGCAC CA 12 配列番号：204 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 AGCAGCGCCT CA 12 配列番号：205 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCCAGCTGTA CG 12 配列番号：206 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGAGGTCGAC CA 12 配列番号：207 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTCGGACGAA TA 12 配列番号：208 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGAGAGCGGA CG 12 配列番号：209 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGCGATTCTG CA 12 配列番号：210 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTGGGTGGAC AA 12 配列番号：211 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GTGCACGTAT GG 12 配列番号：212 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CGACGACGAC GA 12 配列番号：213 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ACTGGCCGAG GG 12 配列番号：214 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCGGTCAGCA CA 12 配列番号：215 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCAGCGCAC CA 12 配列番号：216 配列の長さ：12 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATGGCCGGTG GG 12

【図面の簡単な説明】

【図１】ランダムＰＣＲ法における第１のサイクル中の
過程を示す模式図である。

【図２】ランダムＰＣＲ法における第２のサイクルの１
回目のサイクル中の過程を示す模式図である。

【図３】ランダムＰＣＲ法における第２のサイクルの２
回目のサイクル中の過程を示す模式図である。

【図４】バンド数６本ごとのプライマー数の分布を示す
図である。

【図５】バンド数が１５本以下のプライマーについてバ
ンド数ごとのプライマーの数を示す図である。

【図６】２１６個のプライマーのＧＣコンテンツに対す
るバンド数を示す図である。

【図７】良質プライマーの電気泳動像を示す図である。

【図８】良質プライマーの電気泳動像を示す図である。

【図９】良質プライマーの電気泳動像を示す図である。

【図１０】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図１１】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図１２】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図１３】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図１４】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図１５】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図１６】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図１７】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図１８】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図１９】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図２０】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図２１】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図２２】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図２３】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図２４】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図２５】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図２６】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図２７】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図２８】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図２９】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図３０】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図３１】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【図３２】良質プライマーの電気泳動像を示す図であ
る。

【符号の説明】

１ＤＮＡ２ａ，２ｂ，２ｃ，２ｄ、２ｅ一本鎖３ａ，３ｂ，３ｃ，３ｄ，３ｅ二本鎖１１ａ，１１ｂ，１１ｃプライマー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号４１〜４３、４５〜５４、５６
〜５８、６０〜６４、６６〜６９、７１〜７８、８０〜
８２、８４〜８６、８９〜９１、９３、９５〜９７、１
００、１０３、１０６、１０７および１０９のいずれか
のプライマーを用いて、複数の異なるＤＮＡに対し、熱
変性工程、プライマーのアニーリング工程およびポリメ
ラーゼによる伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポ
リメラーゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、複
数の異なるＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅することを特徴と
するＤＮＡ断片増幅方法。
【請求項２】前記ポリメラーゼ連鎖反応法の適用によ
り増幅されたＤＮＡ断片の電気泳動像において前記複数
の異なるＤＮＡのうち少なくとも１つのＤＮＡに対応す
る帯が現れるようにポリメラーゼ連鎖反応の条件を設定
することを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ断片増幅方
法。
【請求項３】複数の異なるＤＮＡに対し、熱変性工
程、プライマーのアニーリング工程およびポリメラーゼ
による伸長反応工程をこの順序で繰り返し行うポリメー
ラゼ連鎖反応法を一度に適用することにより、複数の異
なるＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅する際に、ポリメラーゼ
連鎖反応法の適用により増幅されるＤＮＡ断片の電気泳
動像において現れる各ＤＮＡに対応する帯の数が数本以
下となるようにプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応
の条件を設定することを特徴とするＤＮＡ断片増幅方
法。
【請求項４】対象物中の微生物存在状態を推定する微
生物存在状態推定方法であって、前記対象物中の複数の異なる微生物のＤＮＡに対し、請
求項１、２または３記載のＤＮＡ断片増幅方法を用い、
複数の異なる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅した
後、増幅されたＤＮＡ断片を識別方法により分類し、前
記対象物中の微生物存在状態を推定することを特徴とす
る微生物存在状態推定方法。
【請求項５】前記識別方法は、電気泳動法であること
を特徴とする請求項４記載の微生物存在状態推定方法。
【請求項６】複数の微生物が混在してなる有機系廃棄
物中の有機物を微生物によって分解する有機物分解過程
における有機系廃棄物状態を推定する有機系廃棄物状態
推定方法であって、前記有機系廃棄物中の複数の微生物のＤＮＡに対し、請
求項１、２または３記載のＤＮＡ断片増幅方法を用い、
複数の異なる微生物のＤＮＡのＤＮＡ断片を増幅した
後、増幅されたＤＮＡ断片を識別方法により分類し、前
記有機系廃棄物中の微生物存在状態を推定し、この推定
結果から有機系廃棄物状態を推定することを特徴とする
有機系廃棄物状態推定方法。
【請求項７】前記識別方法は、電気泳動法であること
を特徴とする請求項６記載の有機系廃棄物状態推定方
法。